СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННОЙ ОПТИЧЕСКОЙ НЕЙРОПАТИИ ЛЕБЕРА Российский патент 2017 года по МПК A61B5/00 

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для диагностики наследственной оптической нейропатии Лебера (НОНЛ) с целью последующего прогнозирования течения заболевания у пробанда и назначения корректной терапии.

Уровень техники

При НОНЛ развивается значительное двустороннее безболезненное снижение зрения у лиц молодого и среднего возраста вследствие гибели ганглиозных клеток сетчатки и последующей атрофии зрительного нерва. Клиническая картина НОНЛ имеет свои характерные особенности, однако подобные изменения могут встречаться при оптических нейропатиях другого генеза. В то же время определение этиологии заболевания глаз важно не только для офтальмологического, но терапевтического и неврологического прогноза, так как НОНЛ может сопровождаться неврологической и системной патологией. Кроме того, диагностика заболеваний важна для осуществления корректного лечения, последующего прогнозирования течения заболевания зрительного нерва и определения прогноза для потомства.

Патогенез НОНЛ базируется на дисфункции митохондрий, обусловленной мутациями мтДНК. В митохондриях нарушается выработка энергии в форме молекул АТФ, повышается продукция активных форм кислорода, изменяются процессы митофагии. Все это приводит к апоптозу ганглиозных клеток сетчатки и, как следствие, выраженному снижению зрения.

Комплекс I (НАДН-дегидрогеназа) - самый крупный компонент дыхательной цепи митохондрий (КДЦМ), он представлен 45 белковыми субъединицами, 38 из которых кодируются ядерным, а 7 - митохондриальным геномом (Carroll J., Fearnley I.M., Skehel J.M., et al. Bovine Complex I Is a Complex of 45 Different Subunits. J. Biol. Chem. 2006 Sep 5; 281(43):32724-7). I КДЦМ участвует в передаче электронов от НАДН к убихинону (коэнзим Q) и в поддержании мембранного потенциала митохондрий за счет прокачивания протонов из матрикса в межмембранное пространство. Ранее был доказан дефект I КДЦМ у больных с НОНЛ (Baracca A., Solaini G., Sgarbi G., et al. Severe Impairment of Complex I-Driven Adenosine Triphosphate Synthesis in Leber Hereditary Optic Neuropathy Cybrids. Arch Neurol. 2005 May 1; 62(5):730).

Для выявления и дифференциальной диагностики НОНЛ способ исследования должен быть максимально безопасным для пациента и обладать высокой степенью информативности.

Известен способ диагностики НОНЛ с помощью компьютерной статической периметрии с выявлением центральных и центро-цекальных скотом. Однако таким способом выявляются изменения поля зрения, свойственные оптическим нейропатиям различной этиологии (Kedar S., Ghate D., Corbett J.J. Visual fields in neuro-ophthalmology. // Indian J. Ophthalmol., 2011. - Vol. 59. - P. 103-109).

Известен способ диагностики НОНЛ с помощью электрофизиологических методов с определением зрительных вызванных потенциалов (ЗВП). Однако это исследование также не позволяет идентифицировать этиологию заболевания (Holder G.E. Electrophysiological assessment of optic nerve disease // Eye. - 2004. - Vol. 18. - P. 1133-1143).

Известен способ выявления НОНЛ с помощью обнаружения классических симптомов и семейного анамнеза (Newman N.J., Biousse V. Hereditary optic neuropathies. // Eye. - 2004. - Vol. 18. - P. 1144-1160). Однако наследственный характер заболевания часто не представляется возможным подтвердить, так как реконструкция расширенных родословных у пациентов зачастую затруднена, а заболевание отличается неполной пенетрантностью. Это приводит к тому, что большой процент НОНЛ представлен спорадическими случаями.

Известен способ молекулярно-генетической диагностики НОНЛ, в основе которой лежат мультиплексная проба-зависимая лигазная реакция с последующей амплификацией и полимеразная цепная реакция. Однако данный способ позволяет выявить лишь основные мутации, регистрируемые при НОНЛ. Расширенные исследования митохондриальной ДНК - дорогостоящие методы, выполняются на высокотехнологичном оборудовании специалистами, которые должны обладать большим опытом, навыками и знаниями (Man P.Y.W., Turnbull D. М., Chinnery P. F. Leber hereditary optic neuropathy. // J. Med. Genet., 2002. - Vol. 39. - P. 162-169).

НОНЛ может быть заподозрена на основании анамнеза заболевания и наследственного анамнеза: внезапно возникшее двустороннее снижение остроты зрения, наличие родственников пробанда с частичной атрофией зрительного нерва. Дополнительные методы исследования помогают выявить характерные для наследственного заболевания зрительного нерва признаки. Исследование цветового зрения по таблицам Рабкина (Ишихара) выявляет различной степени дисхроматопсию; поле зрения характеризуется наличием центральных или центроцекальных скотом. Электрофизиологические методы исследования показывают снижение лабильности аксиального пучка зрительного нерва и увеличение латентности P100 ЗВКП на вспышку или паттерн. Оптическая когерентная томография (ОКТ) демонстрирует истончение слоя нервных волокон сетчатки (СНВС) различной степени выраженности, преимущественно с височной стороны. Ряд дополнительных методов позволяет исключить другую, не наследственную этиологию ОН. Для подтверждения наследственной природы возможно проведение молекулярно-генетического исследования - мультиплексной проба-зависимой лигазной реакции с последующей амплификацией и полимеразной цепной реакции. Однако при этом выявляют лишь основные мутации, регистрируемые при НОНЛ.

Таким образом, существующие способы диагностики НОНЛ требуют совершенствования, так как не позволяют во всех случаях выявить этиологию заболевания.

Известен способ того же назначения, включающий биохимические исследования на культуре фибробластов кожи пациентов для определения нарушения функционирования отдельных компонентов дыхательной цепи митохондрий (Ye, F. and Hoppel, C.L. Measuring oxidative phosphorylation in human skin fibroblasts // Anal. Biochem., 2013. - Vol. 437, №1. - P. 52-58).

Однако этот способ диагностики митохондриальных нарушений является технически сложно выполнимым, дорогостоящим, зависящим от уровня подготовки персонала и качества используемых реагентов.

Ближайшим аналогом предлагаемого способа является способ диагностики НОНЛ, включающий клинические и цитологические исследования и получение из кожи пациента культуры фибробластов плотностью 5000-10000 клеток на см², окрашивание митохондриальным потенциалзависимым флюоресцентным красителем TMRE до конечной концентрации 25 нМ, измерение в культуре интенсивности флюоресценции митохондрий до и через 30 мин после добавления олигомицина до конечной концентрации 10 мкМ. При увеличении интенсивности флюоресценции митохондрий не более чем на 7% или снижении диагностируют НОН (2566271, 20.10.2015). Однако этот способ диагностики митохондриальных нарушений является технически непростым, зависящим от уровня подготовки персонала и оснащенности лаборатории.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является детекция активности I КДЦМ, основанная на особенностях токсического действия параквата, для подтверждения наследственной этиологии оптической нейропатии.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение точности диагностики заболевания для осуществления корректного лечения, прогнозирования течения заболевания у пробанда, прогноза для родственников и потомства пробанда, а также упрощение и удешевление способа, ускорение процесса диагностики и возможность использования метода на большом количестве клеточных линий.

Технический результат достигается за счет токсического действия параквата (N,N'-диметил-4,4'-дипиридилия дихлорида), гербицида, широко применяемого в научных исследованиях для индукции окислительного стресса в клетках.

У млекопитающих токсичное действие напрямую связано с активностью комплекса I, за счет которого дикатион параквата PQ²⁺ восстанавливается в митохондриях в монокатион-радикал PQ⁺ и приобретает способность взаимодействовать с кислородом с образованием супероксида водорода (Fukushima Т., Yamada K., Isobe A., et al. Mechanism of cytotoxicity of paraquat. I. NADH oxidation and paraquat radical formation via complex I. Exp. Toxicol. Pathol. 1993 Oct; 45(5-6):345-9; Cochemé H.M., Murphy M.P. Complex I is the major site of mitochondrial superoxide production by paraquat. J. Biol. Chem. 2008 Jan 25; 283(4): 1786-98). Постоянное поддержание окислительного стресса в присутствии параквата происходит за счет того, что при восстановлении параквата НАД(Ф)Н-дегидрогеназным комплексом образуется радикал PQ⁺ , который немедленно вступает в реакцию с кислородом, в результате получается супероксид и PQ²⁺, способный вновь восстанавливаться с образованием PQ^+.. При дисфункции I КДЦМ у пациентов с НОНЛ восстановление параквата до его радикальной формы происходит в гораздо меньших объемах, что проявляется в более высокой устойчивости фибробластов пациентов к цитотоксическому действию параквата по сравнению с фибробластами здорового контроля. В предлагаемом способе при исследовании культуры фибробластов пациентов, в отличие от ближайшего аналога, не проводят затратное по времени и количеству используемых реагентов изучение мембранного потенциала.

Функции митохондрий были исследованы новым способом, позволяющим обнаружить отклонения показателей от контрольных значений у пациентов с НОНЛ, а также в группе пациентов с неверифицированным генетическим дефектом.

Для флуориметрического определения клеточной гибели использовали реагент CellTiterBlue® (Promega), который содержит краситель резазурин, проникающий внутрь клеток и восстанавливающийся внутри живых метаболически активных клеток, в флуоресцентный резоруфин. В результате восстановления цвет красителя меняется. Для определения количества живых клеток CellTiterBlue® добавляли в клеточную культуру и инкубировали при 37°C в течение 5 часов (время инкубации было подобрано экспериментально и связано с низкой метаболической активностью фибробластов), после чего измеряли флуоресцентный сигнал резоруфина (флуоресценцию резофурина измеряли при λ_ex=560 нм, λ_em=590 нм) (FluoroskanAscent, Thermo).

В качестве модели для изучения клеточных процессов использовали фибробласты кожи (Robinson В.Н., Petrova-Benedict R., Buncic J.R., Wallace D.C. Nonviability of Cells with Oxidative Defects in Galactose Medium: A Screening Test for Affected Patient Fibroblasts // Biochem. Med. Metab. Biol. - 1992. - Vol. 48. - P. 122-126). Нарушение функции митохондрий при НОНЛ имеют место не только в нейронах, но и в других тканях, при этом клетки кожи наиболее удобны для забора и последующего изучения, они могут быть относительно легко рекультивированы в случае необходимости.

Материалом для исследования служили фибробласты кожи пациентов с неверифицированным диагнозом (Пример 1), пациентов с НОНЛ (Примеры 2 и 3), а также здоровых людей группы контроля.

При анализе полученных данных выявлено различие в окрашивании клеток здоровых людей и клеток пациентов с НОНЛ.

Отличие в окрашивании отражает количество живых фибробластов в клеточной культуре, которое достоверно выше у пациентов с клиническим диагнозом НОНЛ, т.к. из-за дефекта I КДЦМ токсическое действие параквата не реализуется. Таким образом, предлагаемый способ может быть использован для диагностики НОНЛ.

Способ осуществляют следующим образом. У больного, у которого заподозрена НОНЛ на основании совокупности клинических данных, осуществляют биопсию кожи.

Для забора биопсии кожи проводят обработку небольшого участка кожи, например, с внутренней стороны предплечья (примерно 3 см в диаметре) анестезирующей мазью («ЭМЛА»). Через 20 мин после местной анестезии обрабатывают участок спиртовой салфеткой (или спиртом). При помощи стерильного офтальмологического пинцета проводят зажим кожи. Одноразовым скальпелем срезают участок кожи (размером, примерно, с булавочную головку, диаметр ~ 0,5 см).

Полученный биоптат кожи помещают в питательную среду, содержащую DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки («Биолот», Россия). Далее производят ферментативную обработку коллагеназой (0,4 мкг на 1 мл среды) и инкубируют в термостате на 37°C 16 часов. После ресуспензирования пипеткой промывают средой (для отделения коллагена). Далее полученный субстрат помещают на культуральный матрас с питательной средой (DMEM с глютамином, 20% сыворотка крупного рогатого скота, пенициллин 100 мкг/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, гентамицин), клетки выращивают по стандартной методике для адгезивных клеток (Hayflick L., Moorhead P. The serial cultivation of human diploid cell strains // Exp. Cell Res. - 1961. - Vol. 25. - P. 585-621).

Культуры инкубируют в термостате при 37°C в течение двух-трех недель до полного заполнения клетками площади матраса, периодически сменяя культуральную среду.

Для снятия клеток с подложки при пересаживании в течение 2-3 минут обрабатывают культуру раствором, содержащим 0,68 мМ Na-ЭДТА и 0,125% трипсина в PBS (8,1 мМ Na2HPO4; 1,45 мМ KH2PO4; 0,11 М NaCl; 3,42 мМ KCl, pH 7,4), после чего добавляют 5 мл стерильной среды DMEM. Клетки суспендируют пипетированием. Около 1-2 мл суспензии клеток переносят в чашки Петри с 3-4 мл среды DMEM. Для экспериментов клетки выращивают на стерильных покровных стеклах в течение суток. Клетки плотностью 5000 -10000 клеток на 1 см² (всего 50000-100000 клеток на площади 10 см²) инкубируют при температуре 37°C во влажной атмосфере с 5%-ным содержанием CO₂. Для приготовления растворов и сред используют дистиллированную воду, очищенную на системе Milli-Q (Millipore, США).

Клетки рассаживают на 96-луночный планшет, в зависимости от количества изучаемых линий может быть использовано несколько планшетов, на каждом из которых 20 лунок занято клетками контроля. В каждую лунку помещают 100 мкл суспензии фибробластов (2-5×10³ клеток). На следующий день к клеткам добавляют паракват в концентрации 0,25; 0,5; 0,75 и 1 мМ (по 4 лунки на каждую концентрацию для всех тестируемых культур клеток) или 5 мМ (по 6 повторов для каждой культуры клеток). Для получения статистически значимого результата и минимизации технических ошибок на каждую концентрацию отводят 4 или, соответственно, 6 лунок, в том числе в 4, соответственно, в 6 лунок, паракват не добавляют. Таким образом, на каждую клеточную линию отводится 24, соответственно, 12 лунок. Через 48 часов для концентрации параквата 0,25; 0,5; 0,75 и 1 мМ и через 24 часа для концентрации параквата 5 мМ, в течение которых проявляется цитотоксическое действие параквата, определяют количество выживших клеток в культурах. Клеточную гибель можно определять различными способами, например, с помощью реагента CellTiterBlue® (Promega), который содержит краситель резазурин, превращающийся при попадании в живые клетки в резоруфин. Через 5 часов инкубации при температуре 37°C измеряют флуоресцентный сигнал резоруфина (λ_ex=560 нм; λ_cm=590 нм) (FluoroskanAscent, Thermo), оценивая тем самым количество живых фибробластов. Результаты, полученные в форме таблицы MicrosoftExcel, усредняют по 4 лункам. Для каждой из исследуемых культур результаты нормируют на значения флуоресценции в лунках, не обработанных паракватом (Пример 1, 2).

Для определения устойчивости клеточных культур к действию параквата для каждой культуры рассчитывают IC50, т.е. определяют концентрацию параквата, при которой происходит гибель 50% клеток (Пример 2). Увеличение значения IC50 для тестируемой культуры, по сравнению с контрольной более чем в 2 раза, дает основание для установления диагноза НОНЛ.

Выживаемость культуры пациента сравнивают с выживаемостью фибробластов здоровых людей. В случае более высокой устойчивости исследуемой культуры по сравнению с нормой (отличие более чем на 50% при любой использованной концентрации параквата) диагностируют НОНЛ.

Цитотоксичность различных соединений зависит от плотности клеточной культуры. Для параквата эта зависимость сравнительно слабо выражена, однако в случае использования концентрации параквата 5 мМ плотность сравниваемых культур необходимо тщательно контролировать (что является дополнительной сложностью при тестировании большого количества различных культур клеток). Использование нескольких концентраций параквата более надежно, так как позволяет снизить влияние плотности клеток на результаты тестирования.

Пример 1

Пациент С, 19 лет, обратился с жалобами на резкое двустороннее безболезненное снижение зрения, которое возникло 2 месяца назад. Со слов пациента, у родственников похожих заболеваний не было, также он отрицал наличие острых и хронических заболеваний, возможность токсического воздействия алкоголя, курения или лекарственных средств.

На момент осмотра острота зрения составила OD - 0,04, OS - 0,04; на глазном дне: OD - диск зрительного нерва (ДЗН) монотонный, границы четкие, а:в=1,5:2, OS - ДЗН бледно-розовый, границы четкие, а:в=1,5:2, OU - в макулярной зоне и на периферии без особенностей. На обоих глазах выявлена выраженная дисхроматопсия, центро-цекальная скотома по данным компьютерной периметрии. По данным ОКТ имело место увеличение толщины перипапиллярного СНВС в верхне-височном квадранте и истончение комплекса ганглиозных клеток (КГК) сетчатки макулярной зоны, что характерно для ранней стадии НОНЛ. Выявлено изменение электрофизиологических показателей в виде увеличения латентности пика P100 (ЗВП на вспышку) и значительного снижения проводимости зрительного нерва, а также снижение уровня критической частоты слияния мельканий (КЧСМ). Патологических изменений на МРТ головного мозга и орбит не обнаружено.

У пациента была заподозрена НОНЛ, он был направлен на генетическое исследование.

Поиск трех наиболее частых мутаций мтДНК, характерных для НОНЛ (m.11778G>A, m.3460G>A, m.14484Т>С), не выявил их наличия. В результате расширенного анализа с полным секвенированием мтДНК была обнаружена нуклеотидная замена тимина на цитозин в позиции 3472 мтДНК в гомоплазмическом состоянии, которая ранее не была отнесена к первичным или кандидатным мутациям, приводящим к развитию НОНЛ. На генетическое исследование была отправлена сестра пациента, которая не имеет каких-либо клинических или субклинических признаков заболевания. У нее также была найдена замена мтДНК в позиции 3472.

Для подтверждения или исключения митохондриальной природы было проведено биохимическое исследование фибробластов кожи пробанда и его сестры. Было выявлено, что клетки с заменой m.3472Т>С значительно более устойчивы к действию параквата (клетки окрашивались флюоресцентным красителем), что указывает на сниженную активность комплекса I, характерную для митохондриальной патологии (Фиг. 1. Цитотоксическое действие параквата на фибробласты, полученные из биопсии кожи здорового контроля, а также пробанда и его сестры (N=3, *р<0.05). Каждая из исследуемых линий клеток нормируется на свой контроль, принятый за 100% (т.е. на интенсивность флуоресценции резоруфина в лунках с клетками, не обработанных паракватом).

Данное исследование подтверждает наследственную природу заболевания пациента С. и патологический характер замены m.3472Т>С.

Таким образом, предлагаемый способ диагностики посредством биохимического исследования позволил подтвердить наследственный генез заболевания.

Согласно выявленному заболеванию пациенту назначено соответствующее лечение, включающее антиоксидантные, нейропротекторные препараты, препараты, стимулирующие метаболические процессы, рекомендовано периодическое наблюдение офтальмолога, а также, учитывая возможность возникновения неврологической симптоматики при НОНЛ, указано на необходимость консультации у невролога. Пациенту даны рекомендации по изменению образа жизни и ограничению влияния некоторых лекарственных препаратов и других провоцирующих факторов на усугубление течения наследственного заболевания.

Пример 2

Женщина Ц., 25 лет, из контрольной группы, соматически здорова. Данные офтальмологического обследования соответствуют норме. Было проведено цитологическое исследование фибробластов кожи, в результате которого была выявлена низкая устойчивость культуры клеток к параквату, добавленному в концентрации от 0,1 до 1 мМ, что характерно для нормы (Фиг. 2. Цитотоксическое действие параквата на фибробласты, полученные из биопсии кожи здорового контроля, а также пациента с НОНЛ (m.3460G>A), Фиг. 3. Цитотоксическое действие параквата на фибробласты, полученные из биопсии кожи здорового контроля, а также пациента с НОНЛ. Каждая из исследуемых линий клеток нормируется на свой контроль принятый за 100% (т.е. на интенсивность флуоресценции резоруфина в лунках с клетками, не обработанных паракватом). На основании полученных кривых рассчитали концентрации параквата, вызывающие гибель 50% клеток (IC50). Для контрольной культуры IC50=125 мкМ, для исследуемого пациента IC50=120 мкМ, для пациента с верифицированной мутацией мтДНК m.3460G>A IC50=500 мкМ.

Как видно из фиг. 2 и 3, устойчивость исследуемой культуры фибробластов не отличалась от контрольной группы и значительно отличалась от культуры пациента с НОНЛ и с установленной мутацией (m.3460G>A).

Пример 3

Пациент Т., 31 год, направлен из Клиники Нервных болезней для консультации по поводу двустороннего безболезненного снижения зрения, возникшего полгода назад. За полгода до снижения зрения появились жалобы на чувство жжения и кожного зуда в нижних конечностях. На МРТ головного мозга структурной патологии не выявлено.

На момент осмотра острота зрения составила OD - 0,015 н/к, OS - 0,01 н/к, на глазном дне: OU - ДЗН бледный за счет височной половины, границы четкие, а:в=1,5:2, в макулярной зоне и на периферии без особенностей. На обоих глазах выявлена выраженная дисхроматопсия, центроцекальная скотома по данным компьютерной периметрии. По данным ОКТ имело место увеличение толщины перипапиллярного СНВС в верхневисочном квадранте и истончение КГК сетчатки макулярной зоны, что характерно для ранней стадии НОНЛ. Выявлено изменение электрофизиологических показателей в виде увеличения латентности пика P100 (ЗВП на вспышку) и значительного снижения проводимости зрительного нерва, а также снижение уровня КЧСМ.

У пациента была заподозрена НОНЛ, он был направлен на генетическое исследование.

В ходе молекулярно-генетического анализа была обнаружена самая частая мутация мтДНК, характерная для НОНЛ (m.11778G>A). Так как патогенность мутации не вызывает сомнений, было проведено биохимическое исследование фибробластов кожи пациента более быстрым способом с использованием высокой концентрации параквата (5 мМ). Клетки пациента продемонстрировали большую устойчивость к действию параквата, нежели контрольные культуры, что указывает на сниженную активность комплекса I, характерную для митохондриальной патологии (Фиг. 4. Цитотоксическое действие 5 мМ параквата (время инкубации с паракватом 24 часа) на фибробласты, полученные из биопсии кожи здоровых контролей, а также пациентов с НОНЛ (в скобках указана позиция в мтДНК, в которой была обнаружена мутация). Каждая из исследуемых линий клеток нормируется на свой контроль, принятый за 100% (т.е. на интенсивность флуоресценции резоруфина клетками в лунках без добавления параквата).

Таким образом, предлагаемый способ диагностики с помощью параквата позволил подтвердить наследственный генез заболевания в более короткие сроки.

Предложенный способ дифференциальной диагностики идентифицирует НОНЛ, что способствует более точному прогнозу течения заболевания зрительного нерва и позволяет рекомендовать пациенту адекватные способы лечения. Кроме того, основываясь на наследственном характере заболевания, детям и родственникам пациента по материнской линии дается рекомендация пройти молекулярно-генетическое обследование с целью выявления наличия соответствующей мутации и прибегнуть к медико-генетическому консультированию с целью прогнозирования заболевания у будущего потомства. Данный способ диагностики позволяет определять наличие митохондриальной патологии у потомства пробанда до начала клинических проявлений заболевания с дальнейшей постановкой на учет к офтальмологу для периодического диспансерного наблюдения, лечения, проведения разъяснительных мероприятий с рекомендациями по изменению образа жизни и ограничению влияния провоцирующих факторов на возникновение наследственного заболевания.

Изобретение относится к офтальмологии и предназначено для диагностики наследственной оптической нейропатии Лебера. В культуру фибробластов плотностью 2-5×10³ клеток в объеме 100 мкл добавляют паракват в концентрации 0,25-1,0 мМ и выдерживают 48 часов или в концентрации 5 мМ и выдерживают 24 часа, затем окрашивают красителем резазурином, определяют количество живых фибробластов по изменению флуоресцентного сигнала резазурина и при наличии 50% и более количества живых фибробластов по сравнению с фибробластами здоровых людей диагностируют наследственную оптическую нейропатию Лебера. Способ обеспечивает повышение точности диагностики заболевания для осуществления корректного лечения, прогнозирования течения заболевания у пробанда, прогноза для родственников и потомства пробанда, а также упрощение и удешевление способа, ускорение процесса диагностики и возможность использования метода на большом количестве клеточных линий. 4 ил., 3 пр.

Способ диагностики наследственной оптической нейропатии Лебера, включающий клинические и цитологические исследования с культурой фибробластов кожи пациента, отличающийся тем, что в культуру фибробластов плотностью 2-5×10³ клеток в объеме 100 мкл добавляют паракват в концентрации 0,25-1,0 мМ и выдерживают 48 часов или в концентрации 5 мМ и выдерживают 24 часа, затем окрашивают красителем резазурином, определяют количество живых фибробластов по изменению флуоресцентного сигнала резазурина и при наличии 50% и более количества живых фибробластов по сравнению с фибробластами здоровых людей диагностируют наследственную оптическую нейропатию Лебера.