СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АУТОСОМАЛЬНО-ДОМИНАНТНОЙ ОПТИЧЕСКОЙ НЕЙРОПАТИИ Российский патент 2013 года по МПК C12Q1/68 C12N15/00 

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для диагностики этиологии оптической нейропатии с целью последующего прогнозирования течения заболевания зрительного нерва и прогноза для потомства пробанда.

Уровень техники

Аутосомно-доминантная оптическая нейропатия (ОН) - наследственное заболевание зрительного нерва, встречающееся с частотой 1:12000-1:50000 населения. Впервые заболевание клинически было описано в 1896 году, но только в 2000 году идентифицированы некоторые мутации гена ОРА1, ответственные за аутосомно-доминантную ОН (Alexander С., Votruba M., Pesch U.E., et al. ОРА1, encoding a dynamin-related GTPase, is mutated in autosomal dominant optic atrophy linked to chromosome 3q28. // Nat Genet, 2000. - Vol.26. -P.211-215; Delettre C., Lenaers G., Griffbin J.M., et al. Nuclear gene ОРА1, encoding a mitochondrial dynamin-related protein, is mutated in dominant optic atrophy. // Nat Genet, 2000. - Vol.26. - P.207-10).

Заболевание характеризуется медленно прогрессирующим двусторонним снижением остроты зрения в первые десять лет жизни, у некоторых с незаметным, субклиническим началом, что может приводить к отсроченному или позднему выявлению частичной атрофии зрительного нерва. Прогрессирование заболевания может быть весьма вариабельным: от умеренной потери остроты зрения, которая стабилизируется в юности, до медленно, но постоянно прогрессирующего снижения зрения, возможны случаи с внезапными, ступенчатыми уменьшениями показателей визометрии. Описаны также случаи впервые замеченного резкого снижения зрения в результате аутосомно-доминантной ОН у людей пожилого возраста (Nochez Y., Arsene S.,Gueguen N., et al. Acute and late-onset optic atrophy due to a novel ОРА1 mutation leading to a mitochondrial coupling defect. // Mol.Vis., 2009. - Vol.15. - P.598-608).

Таким образом, дифференциальная диагностика аутосомно-доминантной ОН по клинической картине затруднена. Несмотря на то что клинические характеристики этого заболевания имеют свои особенности, однако специфичность их подчас условна, подобные изменения могут встречаться и при ОН другого генеза. Однако определение этиологии заболевания глаза важно не только для офтальмологического, но и терапевтического и неврологического прогноза, так как аутосомно-доминантная ОН может сопровождаться неврологической и системной патологией. Кроме того, диагностика данного заболевания важна для осуществления корректного лечения, последующего прогнозирования течения заболевания зрительного нерва и определения прогноза для потомства.

Постановка диагноза аутосомно-доминантной ОН основывается на результатах молекулярно-генетического исследования в сочетании с данными анамнеза, клинических и морфофункциональных данных -ЧАЗН (Yu-Wai-Mana P., Griffiths P.G.„ Chinnery P.F. Mitochondrial optic neuropathies - Disease mechanisms and therapeutic strategies. // Prog. Retin. Eye. Res., 2011. - Vol.30. - P.81-114).

Для выявления и дифференциальной диагностики ОН способ исследования должен быть максимально безопасным для пациента и с высокой степенью информативности.

Известен способ диагностики ОН с помощью компьютерной статической периметрии с выявлением центральных и центро-цекальных скотом. Однако таким способом выявляются изменения поля зрения, свойственные ОН различной этиологии (Kedar S., Ghate D., Corbett J.J. Visual fields in neuro-ophthalmology. // Indian J. Ophthalmol., 2011. - Vol.59. - P.103-109).

Известен способ определения ОН с помощью оптической когерентной томографии, при которой оценивается средняя толщина ретинального слоя нервных волокон в перипапиллярной зоне и отдельно в 4 квадрантах. Однако выявляемые этим способом признаки частичной атрофии зрительного нерва могут быть свойственны ОН различной этиологии. Кроме того, в начале заболевания они могут не определяться данным способом исследования (Longmuir R., Lee A.G., Boldt H.C. Optical Coherence Tomography (OCT) in Neuroophthalmology: A Clinical Perspective // Neuro-Ophthalmology. - 2008. - Vol.32. - P.115-125).

Известен способ диагностики ОН с помощью электрофизиологических методов, определения зрительных вызванных потенциалов. Однако это исследование также не позволяет идентифицировать этиологию заболевания (Holder G.E. Electrophysiological assessment of optic nerve disease // Eye. - 2004. - Vol.18. - P.1133-1143).

Известен способ выявления наследственной ОН с помощью выявления классических симптомов и семейного анамнеза (Newman N.J., Biousse V. Hereditary optic neuropathies. // Eye. - 2004. - Vol.18. - P.1144-1160). Однако наследственный характер заболевания часто не представляется возможным подтвердить, так как реконструкция расширенных родословных у пациентов зачастую затруднена. Это приводит к тому, что большой процент наследственных ОН представлен спорадическими случаями.

Известен способ молекулярно-генетической диагностики наследственной ОН, в основе которой лежит мультиплексная проба-зависимая лигазная реакция с последующей амплификацией. Однако данный способ позволяет выявить лишь основные мутации, регистрируемые при митохондриальной наследственной ОН Лебера (Man P.Y.W., Tumbull D. M., Chinnery P. F. Leber hereditary optic neuropathy. // J.Med. Genet, 2002. - Vol.39. - P.162-169).

Таким образом, существующие способы диагностики аутосомно-доминантной ОН требуют совершенствования, так как не позволяют выявить этиологию заболевания и являются лишь вспомогательными методами.

Ближайшим аналогом предлагаемого изобретения является способ того же назначения, включающий молекулярно-генетическое исследование ядерной ДНК для выявления 230 мутаций гена ОРА1, ответственных за аутосомно-доминантную ОН (полимеразная цепная реакция, сиквенс, электрофорез) (http://lbbma.univ-angers.fr/eOPA1). Молекулярно-генетическое исследование ядерной ДНК является самым надежным, однако на настоящий момент выявлен не весь спектр возможных мутаций, связанных с аутосомно-доминантной ОН. Однако способ является весьма дорогостоящим из-за высокой цены праймера (теста) для определения мутации. В России подобные исследования не проводились.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является определение этиологии ОН наследственного генеза.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность дифференцированной диагностики ОН с дальнейшей возможностью прогнозирования течения заболевания у пробанда, прогноза для потомства пробанда и осуществление корректного лечения.

Технический результат достигается за счет определения мутаций в гене ОРА1 с помощью молекулярно-генетических методов исследования.

Аутосомно-доминантная ОН может быть заподозрена на основании совокупности данных анамнеза заболевания и наследственного анамнеза: медленно прогрессирующее двустороннее снижение остроты зрения, как правило, в молодом возрасте, наличие родственников пробанда с частичной атрофией зрительного нерва. Дополнительные методы исследования помогают выявить характерные для наследственного заболевания зрительного нерва признаки. Исследование цветового зрения по таблицам Рабкина (Ишихара) выявляет различной степени дисхроматопсию; поле зрения характеризуется наличием центральных или центроцекальных скотом. Электрофизиологические методы исследования показывают снижение лабильности аксиального пучка зрительного нерва и увеличение латентности Р100 ЗВКП на вспышку или паттерн. Оптическая когерентная томография демонстрирует истончение слоя нервных волокон различной степени выраженности, преимущественно с височной стороны. А также проводят ряд дополнительных методов, которые позволяют исключить другую, не наследственную этиологию ОН. Однако при анализе результатов проведенных вышеперечисленных методов исследования мы можем лишь предположить наследственный характер заболевания. Для подтверждения наследственной природы необходимо провести ряд молекулярно-генетических методов исследования: полимеразная цепная реакция (ПЦР), сиквенс, электрофорез. При соответствии генетических данных клиническим можно диагностировать аутосомно-доминантную ОН.

Нами было проведено генетическое исследование, которое позволило обнаружить ранее неизвестную мутацию в гене ОРА1.

Способ осуществляют следующим образом. У больного, у которого заподозрена на основании совокупности данных анамнеза заболевания и наследственного анамнеза аутосомно-доминантная ОН, проводят исследование ядерной ДНК, выделенной из крови.

ПЦР проводят с помощью набора праймеров, дизайн которых осуществлялся в лаборатории ДНК-диагностики МГНЦ РАМН. Синтез - в ООО «Евроген», Москва (см. таблицу). ПЦР 28 экзона гена ОРА1 и фланкирующих его интронных последовательностей проводят на программируемом термоциклере МС2 производства фирмы "ДНК-технология" (Россия) с использованием ДНК-полимеразы Biotaq ("БиоМастер"). Реакцию проводят в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1х буфер (67 мМ Tris-HCl, 16.6 мМ (NH₄)₂SO₄, 0.01% Twin-20, 4 mM MgCl₂), 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 1.5 единицы термофильной ДНК-полимеразы, 20-30 мкл минерального масла.

Реакцию проводят в следующем режиме: первоначальная денатурация при 95°С - 5 минут, затем 34 цикла смены температур: денатурация 94°С - 45 секунд, отжиг 60°С - 45 секунд, элонгация цепи 72°С - 45 секунд; заключительная элонгация 72°С - 7 минут. Для проведения ПЦР используется режим точной регуляции. Определение нуклеотидной последовательности проводят методом прямого автоматического секвенирования на приборе фирмы - «Applied Biosystems» согласно протоколу фирмы-производителя.

Выявление мутации c.2850delT в экзоне 28 гена ОРА1 позволяет диагностировать аутосомно-доминантную ОН.

Пример 1. Пациент Л. 54 года, наблюдается с жалобами на низкое зрение обоих глаз и диагнозом врожденная ЧАЗН длительное время. Из истории заболевания известно, что зрение начало ухудшаться в детском возрасте, снижение зрения происходило безболезненно, постепенно и одновременно на обоих глазах. Способность к чтению без специальных средств коррекции для слабовидения потерял в возрасте 33 лет. Из семейного анамнеза известно, что у отца пациента наблюдались похожие проблемы со зрением.

На момент осмотра: Vis OD=0,04, с коррекцией=0,08; Vis OS=0,02 с коррекцией=0,06. При исследовании цветового зрения по таблицам Рабкина отмечается дисхроматопсия тяжелой степени. При офтальмоскопии определяется двусторонняя бледность дисков зрительных нервов (ДЗН), преимущественно с височной стороны.

Пациент прошел дополнительные методы обследования. По данным компьютерной статической периметрии (периметр «Octopus 900») выявлены двусторонние центроцекальные скотомы с высокой степенью депрессии световой чувствительности. Оптическая когерентная томография (ретинотомограф ОСТ Stratus 3000) обнаружила выраженное истончение слоя нервных волокон сетчатки по среднему показателю на 56% соответственно, а также темпорального, верхнего, нижнего и назального квадрантов соответственно на 48%, 28%, 54% и 35% по сравнению с возрастной нормой. Отмечены значительное истончение сетчатки в фовеолярной зоне, уменьшение макулярного объема. При проведении электрофизиологических методов исследования («Tomey", ЕР-1000 Multifocal, электроофтальмометр «Lametesk») отмечено умеренное снижение лабильности аксиального пучка зрительного нерва и увеличение латентности Р100 ЗВКП на вспышку.

По данным магнитно-резонансной томографии головного мозга и орбит патологических изменений не выявлено. Пациент соматически здоров, в неврологическом статусе не найдено отклонений от нормы.

Учитывая анамнез заболевания, наследственный анамнез, данные дополнительных методов исследования, была заподозрена наследственная этиологии ОН. Проведено молекулярно-генетическое исследование. В ядерной ДНК, выделенной из крови больных, была выявлена мутация c.2850delT (p.950Gly>Glu) в экзоне 28, ранее не описанная, что подтверждает генетическую природу заболевания, а именно наличие у больного аутосомно-доминантной ОН. Это делеция одного нуклеотида, в результате которой происходит сдвиг рамки считывания и образование стоп-кодона в другом месте, а в белке приводит к замене данного аминокислотного остатка и изменению терминального участка белка. Мутация c.2850delT (p.950Gly>Glu) выявлена в гене ОРА1, для которого показана связь с заболеванием аутосомно-доминантной ОН, выявлена у пациента с типичной клинической картиной аутосомно-доминантной ОН. Другие мутации гена ОРА1 у пациента не были обнаружены. Подобная мутация отсутствовала на образцах здоровых контролей.

Таким образом, предлагаемый способ диагностики посредством клинического и молекулярно-генетического исследования позволил верифицировать генез заболевания пациента - установить аутосомно-доминантную ОН. Согласно выявленному заболеванию пациенту назначено соответствующее лечение, включающее нейропротекторные, ноотропные средства, препараты, стимулирующие метаболические процессы, рекомендовано периодическое наблюдение офтальмолога, а также, учитывая возможность возникновения неврологической симптоматики при аутосомно-доминантной ОН, указано на необходимость консультации у невролога. Кроме того, рекомендовано пройти молекулярно-генетическое обследование детям и родственникам пациента по отцовской линии с целью выявления наличия соответствующей мутации, а также с целью прогнозирования заболевания у будущего потомства обращаться в медико-генетическое консультирование.

Таким образом, предложенный способ дифференциальной диагностики выявляет наследственную этиологию ОН, что дает возможность последующего прогнозирования течения заболевания зрительного нерва, позволяет рекомендовать пациенту адекватные способы лечения. Данный способ диагностики позволяет также определять прогноз для потомства пробанда и осуществлять пренатальную профилактику рождения детей с данным заболеванием, выявлять наличие мутации у потомков пробанда до начала клинических проявлений заболевания с дальнейшей постановкой на учет к офтальмологу для периодического диспансерного наблюдения, лечения, проведения разъяснительных мероприятий с рекомендациями по изменению образа жизни и ограничению влияния провоцирующих факторов на усугубление течения наследственного заболевания.

Изобретение относится к генной диагностике офтальмологических расстройств и предназначено для диагностики аутосомно-доминантной оптической нейропатии. Проводят молекулярно-генетическое исследование ядерной ДНК, выделенной из крови. Выявляют мутацию c.2850delT в экзоне 28 гена ОРА1 в сочетании с клинической картиной, характеризующейся медленным прогрессирующим снижением остроты зрения, дисхроматопсией, центральной или центро-цекальной скотомой, что позволяет диагностировать аутосомно-доминантную ОН. Способ обеспечивает возможность дифференцированной диагностики заболевания зрительного нерва с дальнейшим прогнозированием течения оптической нейропатии и прогноза для потомства пробанда. 1 табл., 1 пр.

Способ диагностики аутосомно-доминантной оптической нейропатии, включающий молекулярно-генетическое исследование ядерной ДНК, отличающийся тем, что при наличии клинической картины, характеризующейся медленным прогрессирующим снижением остроты зрения, дисхроматопсией, центральной или центро-цекальной скотомой, и выявлении мутации c.2850delT в экзоне 28 гена ОРАl диагностируют аутосомно-доминантную оптическую нейропатию.