Способ формирования смешанной биоплёнки пародонтопатогенных анаэробных бактерий в условиях текучих сред in vitro Российский патент 2017 года по МПК C12N1/20 C12N11/02 

Описание патента на изобретение RU2619169C1

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии для формирования микробной биопленки в анаэробных условиях in vitro.

Известно, что бактерии, находящиеся в составе микробных сообществ и, в частности, биопленок, становятся менее доступными для действия различных внешних факторов, включая антибиотики, пестициды, биоциды и др. Процесс роста и формирования биопленок зависит от характеристики раствора, свойств носителя, состава популяции микроорганизмов и разнообразия адгезивных механизмов при использовании различных поверхностей.

Известны способы формирования биопленки in vitro в аэробных (но не анаэробных) условиях, которые предполагают нанесение планктонных форм в виде бактериальной взвеси на пластиковые или стеклянные поверхности, погруженные в жидкую (полужидкую) питательную среду или на плотной питательной среде, погруженной в жидкую среду (двухфазная питательная среда).

Так, например, из уровня техники известен способ моделирования образования биопленок холерных вибрионов в условиях эксперимента, включающий формирование биопленок на твердом носителе, отличающийся тем, что биопленку создают на покровных стеклах, установленных наклонно под углом 10-12° к вертикальной оси в количестве 8-9 штук, которые помещают между витками пружинообразного приспособления, размещенного внутри емкости объемом 100 мл, затем емкость заполняют экспериментальной средой в объеме 40-50 мл до полного погружения покровных стекол, добавляют в емкость суспензию холерных вибрионов и инкубируют при конечной концентрации холерных вибрионов в n×108 КОЕ/мл с доведением до минимального порога чувствительности 0,1 КОЕ/мл при комнатной температуре (Патент РФ №2559546 от 10.08.2015).

Известен способ определения способности микроорганизмов формировать биопленки на поверхности твердой фазы, включающий окрашивание сформировавшихся биопленок красителем с последующим экстрагированием связавшегося с биопленками красителя этиловым спиртом и оценкой интенсивности окрашивания спиртового раствора на фотометре, отличающийся тем, что в качестве твердой фазы используют биологический субстрат - измельченные и простерилизованные натуральные почечные камни различной химической природы (Патент РФ №2461631 от 20.09.2012).

Известен способ оценки взаимного влияния микроорганизмов методом совместного культивирования с контрольным высевом и определением численности тест-культуры и изучаемого штамма по количеству выросших колоний на плотной питательной среде (Семенов А.В. Характеристика антагонистической активности бактерий при межмикробных взаимодействиях. Дисс. к.м.н. Оренбург, 2009).

Известен способ оценки характера межмикробных взаимодействий, отличающийся тем, что тестируемые моно- и смешанные культуры микроорганизмов культивируют в лунках полистиролового планшета на LB-бульоне до формирования биопленки, осуществляют промывание сформированных биопленок, окрашивание в течение 45 мин в темноте красителем, в качестве которого используют 0,1% раствор генцианвиолета, трехкратное промывание биопленок с последующим высушиванием планшета, краситель элюируют спиртом и определяют оптическую плотность элюатов на спектрофотометре, усредненные показатели оптической плотности элюата из смешанных биопленок сравнивают с суммой показателей оптической плотности элюата из биопленок монокультур, и при отсутствии достоверных отличий делают вывод о нейтральном характере взаимодействия, если показатель для смешанной биопленки меньше суммы показателей монопленок, делают вывод об антагонистическом характере взаимодействия, если показатель для смешанной биопленки больше суммы показателей монопленок, делают вывод о синергическом характере в межмикробном взаимодействии (Патент РФ №2448161, 20.04.2012).

Все эти модели не позволяют воссоздать анаэробные условия и потому не пригодны для изучения пародонтопатогенной микрофлоры, которая по современным данным является этиологическим фактором пародонтита.

Весьма относительные условия анаэробиоза (отсутствия кислорода в среде) удалось создать при использовании полужидких редуцирующих сред, в частности, пулированной слюны, на которой были получены моно- и мультивидовые биопленки, растущие на гидроксиапатите (Guggenheim В et al., 2009). Инновационные подходы в искусственной слюне разработали Peyyala R. с соавторами (2012, 2013), которые применили подобные модели биопленок для демонстрации различий цитокинового и хемокинового ответов на различные бактериальные биопленки, а также М.Т. с соавт., 2013 - для выявления факторов патогенности у компонентов биопленки (Guggenheim В., Gmur R., Galicia J.C., Stathopoulou PG, Benakanakere MR, etal. (2009) In vitro modeling of host-parasite interactions: the 'subgingival' biofilmchallenge of primary human epithelial cells. BMC Microbiol 9: 280; Peyyala, R.; Kirakodu, S.S.; Novak, K.F.; Ebersole, J.L. Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses. Cytokine 2012, 58, 65-72; Peyyala R., Kirakodu S.S., Novak K.F., Ebersole J.L. Oral epithelial cell responses to multispecies microbial biofilms // J Dent. Res. - 2013. - Vol. 92, N 3. - 235-240; M.T., Paino A., Ihalin R. Environmental stimuli shape biofilm formation and the virulence of periodontal pathogens // Int. J. Mol. Sci. - 2013. - Vol. 14, N 8. - P. 17221-17237).

Однако во всех перечисленных способах моделирования биопленок отсутствует решение двух важнейших моментов, которые непосредственно связаны с патологией полости рта:

1. Биопленки в ротовой полости формируются при движении жидкой фазы, то есть в условиях текучей среды;

2. Возбудителями пародонтита являются анаэробные бактерии, а создание анаэробиоза не предусмотрено в предложенных моделях.

Одним из важнейших условий перехода планктонных бактерий из взвеси в биопленкообразующую колонию считается истощение среды. Однако, в естественных природных условиях (в том числе, в организме человека) биопленка формируется в условиях омывания жидкими секретами, то есть в условиях текучих сред. Это обеспечивает дифференцировку клеточных слоев биопленки и постоянный приток питательных веществ, и отток продуктов метаболизма. При патологии пародонта биопленка является смешанной (мультивидовой). Однако воссоздание этого условия было технически не выполнимо при попытке получения биопленки из анаэробных бактерий, ибо не удавалось обеспечить движение жидкости (питательной среды) в анаэростатах, используемых для культивирования анэробных бактерий, или создать необходимый температурный режим 37°С.

Задачей нашего изобретения является изучение межмикробных взаимоотношений в анаэробной биопленке, воссозданной в условиях in vitro при движении жидкой фазы среды.

Технический результат изобретения заключается в воссоздании модели микробной биопленки в анаэробных условиях in vitro при движении жидкой фазы среды.

Технический результат заключается в том, что способ формирования смешанной биопленки пародонтопатогенных анаэробных бактерий в условиях текучих сред in vitro осуществляется следующим образом, бактериальную взвесь из чистой культуры, разведенной в 0,1% полужидкой агаризованной среде - сердечно-мозговом бульоне (BHI, LIM или АС), содержащей 0,01% менадиона и 0,1% гемина - стимуляторов роста анаэробных бактерий, в концентрации 106-108 КОЕ/мл помещать на подложку из полимерных материалов (метилметакрилат, полиуретан, триацетат или плотную агаровую питательную среду) в замкнутой емкости, которая помещается в микроанаэростат с постоянным составом бескислородной газовой смеси, состоящей из 80% азота, 10% водорода, 10% углекислого газа, который в свою очередь помещается в шейкер-термостат, обеспечивающий возвратно-поступательные движения в заданном режиме, в диапазоне 60-120 движений в минуту при постоянной температуре культивирования биопленки 37°С; и при этом формирование смешанной биопленки осуществляется в несколько этапов, на начальном производится внесение микроба с высокой адгезивной активностью - Streptococcus sanguinis с последующим культивированием 48 часов, на следующем этапе проводят внесение микроба-промежуточного колонизатора - Fusobacterium nucleatum с культивированием 72 часа, и на заключительном этапе внесение микроба-пародонтопатогена Porphyromonas gingivalis (или Aggregatibacter actinomycetemcomitans, или Tannerella forsythia, или Prevotella intermedia, или их комбинации) с последующим культивированием в течение 5 суток для получения смешанной биопленки.

Преимущества данного способа - воспроизводимость, рост на биологически релевантных субстратах и средах, формирование биопленки в форме, похожей на зубной налет. При этом получается ограниченное число бактериальных видов (3-7), что позволяет при необходимости оценить вклад каждого вида в индукцию медиаторов воспаления, факторов патогенности или резистентности к антибиотикам.

Способ формирования смешанной биопленки пародонтопатогенных анаэробных бактерий в условиях текучих сред in vitro осуществляется следующим образом:

1. Помещают бактериальную взвесь чистой культуры - Str. sanguinis, разведенной 0,1% полужидкой агаризованной среде - сердечно-мозговом бульоне (BHI, LIM или АС), содержащей 0,01% менадиона и 0,1% гемина - стимуляторов роста анаэробных бактерий, в концентрации 106-108 КОЕ/мл на подложку из полимерных материалов в чашку Петри.

2. Полученная композиция устанавливается в микроанаэростат с постоянным составом бескислородной газовой смеси, состоящей из 80% азота, 10% водорода, 10% углекислого газа.

3. Микроанаэростат помещается в шейкер-термостат, обеспечивающий постоянную температуру культивирования монобиопленки 37°С и возвратно-поступательные движения в заданном режиме, в диапазоне 60-120 движений в минуту на 48 часов.

4. Добавляют к ранее культивированной монобиопленке бактериальную взвесь чистой культуры - F. nucleatum, разведенной в 0,1% полужидкой агаризованной среде - сердечно-мозговом бульоне (BHI, LIM или АС) 0,01% менадиона и 0,1% гемина - стимуляторов роста анаэробных бактерий в концентрации 106-108 КОЕ/мл на подложку из полимерных материалов в чашку Петри.

5. Полученная композиция устанавливается в микроанаэростат с постоянным составом бескислородной газовой смеси, состоящей из 80% азота, 10% водорода, 10% углекислого газа.

6. Микроанаэростат помещается в шейкер-термостат, обеспечивающий постоянную температуру культивирования биопленки разных видов 37°С и возвратно-поступательные движения в заданном режиме, в диапазоне 50-100 движений в минуту, на 72 часа. 4.

7. Добавляют к ранее культивированной биопленке, состоящей из двух видов бактерий, бактериальную взвесь чистой культуры пародонтопатогенного вида - P. gingivalis (или Aggregatibacter actinomycetemcomitans, или Tannerella forsythia, или Prevotella intermedia, или их комбинации), разведенной в 0,1% полужидкой агаризованной среде - сердечно-мозговом бульоне (BHI, LIM или АС), содержащей 0,01% менадиона и 0,1% гемина - стимуляторов роста анаэробных бактерий в концентрации 106-108 КОЕ/мл на подложку из полимерных материалов в чашку Петри.

8. Полученная композиция устанавливается в микроанаэростат с постоянным составом бескислородной газовой смеси, состоящей из 80% азота, 10% водорода, 10% углекислого газа.

9. Микроанаэростат помещается в шейкер-термостат, обеспечивающий постоянную температуру культивирования биопленки 37°С и возвратно-поступательные движения в заданном режиме, в диапазоне 60-120 движений в минуту, на 5 суток.

10. После получения смешанной (мультивидовой) биопленки от 3-х до 6-и видов на протяжении 1-2 месяцев проводят контроль ее жизнеспособности с использованием сканирующей электронной микроскопии.

КЛИНИЧЕСКИЙ ПРИМЕР 1

пп. 1-6, 8-10 - повторить, п. 7 - в качестве пародонтопатогена используют штамм Porphyromonas gingivalis.

КЛИНИЧЕСКИЙ ПРИМЕР 2

пп. 1-6, 8-10 - повторить, п. 7 - в качестве пародонтопатогена используют штамм Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

КЛИНИЧЕСКИЙ ПРИМЕР 3

пп. 1-6, 8-10 - повторить, п. 7 - в качестве пародонтопатогена используют штамм Tannerella forsythia.

КЛИНИЧЕСКИЙ ПРИМЕР 4

пп. 1-6, 8-10 - повторить, п. 7 - в качестве пародонтопатогена используют штамм Prevotella intermedia.

КЛИНИЧЕСКИЙ ПРИМЕР 5

пп. 1-6, 8-10 - повторить, п. 7 - в качестве пародонтопатогена используют смесь штаммов Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia и Prevotella intermedia.

Похожие патенты RU2619169C1

название год авторы номер документа
Способ формирования смешанной биопленки пародонтопатогенных анаэробных бактерий in vitro 2017
  • Сиукаева Тамара Нугзаровна
  • Мамедова Лима Аббасовна
  • Подойникова Мария Николаевна
  • Ефимович Ольга Ивановна
  • Царев Виктор Николаевич
  • Ипполитов Евгений Валерьевич
  • Подпорин Михаил Сергеевич
  • Царева Татьяна Викторовна
RU2661114C1
СПОСОБ ФОРМИРОВАНИЯ БИОПЛЕНКИ LACTOBACILLUS CASEI, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПАРОДОНТАЛЬНЫХ КАРМАНОВ, НА ИНЕРТНЫХ ПОВЕРХНОСТЯХ 2023
  • Гимранова Ирина Анатольевна
  • Газизуллина Гульнара Раилевна
  • Акмалова Гюзель Маратовна
  • Хакимова Лилия Ралисовна
  • Швец Дарья Юрьевна
  • Азнагулов Альфред Айсович
RU2819447C1
СПОСОБ ФОРМИРОВАНИЯ БИОПЛЕНКИ LACTOBACILLUS FERMENTUM, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПАРОДОНТАЛЬНЫХ КАРМАНОВ, НА ИНЕРТНЫХ ПОВЕРХНОСТЯХ 2023
  • Гимранова Ирина Анатольевна
  • Газизуллина Гульнара Раилевна
  • Акмалова Гюзель Маратовна
  • Хакимова Лилия Ралисовна
  • Швец Дарья Юрьевна
  • Азнагулов Альфред Айсович
RU2817419C1
Способ оценки прогрессирования хронического пародонтита и набор реагентов для его осуществления 2021
  • Царев Виктор Николаевич
  • Шеремет Ольга Константиновна
  • Николаева Елена Николаевна
  • Воронцова Нина Ивановна
  • Янушевич Олег Олегович
  • Балмасова Ирина Петровна
  • Шишова Юлия Александровна
  • Царева Татьяна Викторовна
  • Артемьева Анна Валерьевна
  • Васильева Ольга Владимировна
  • Ипполитов Евгений Валерьевич
  • Подпорин Михаил Сергеевич
  • Форсюк Дмитрий Анатольевич
  • Пономарева Анна Геннадиевна
RU2777783C1
Способ определения чувствительности облигатно-анаэробных микроорганизмов в биопленке к антимикробным средствам 2016
  • Ипполитов Евгений Валерьевич
  • Царев Виктор Николаевич
  • Подпорин Михаил Сергеевич
  • Царева Валентина Викторовна
  • Шишова Виктория Геннадьевна
  • Пономарева Анна Геннадиевна
RU2626183C1
Способ оценки обсемененности пародонта патогенными бактериями с применением полимеразной цепной реакции в реальном времени 2015
  • Шибаева Анна Валерьевна
  • Ребриков Денис Владимирович
  • Трубникова Елена Владимировна
  • Айвазова Регина Андрониковна
  • Сунцова Анастасия Юрьевна
  • Шевелев Алексей Борисович
  • Кудыкина Юлия Константиновна
  • Белоус Александр Сергеевич
  • Болдинова Елизавета Олеговна
  • Трофимов Дмитрий Юрьевич
RU2607046C2
СПОСОБЫ УХОДА ЗА ПОЛОСТЬЮ РТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ САХАРИДА В КАЧЕСТВЕ ПРЕБИОТИКА 2013
  • Стеттлер Ханс
  • Теугхелс Вим
  • Куиринен Марк
  • Бун Нико
RU2691408C2
НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК ПАРОДОНТОПАТОГЕННЫХ МИКРОБОВ Prevotella intermedia sensu stricto, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis ПРИ ПОМОЩИ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ 2005
  • Царев Виктор Николаевич
  • Николаева Елена Николаевна
  • Земляная Надежда Юрьевна
  • Воронцова Нина Ивановна
  • Шеремет Ольга Константиновна
  • Иванова Наталия Владимировна
RU2306341C1
Способ оценки состояния пародонта человека на устойчивость к развитию хронического генерализованного пародонтита на основании количественного определения бактерии-пародонтопротектора Streptococcus sanguinis методом ПЦР-РВ 2015
  • Шибаева Анна Валерьевна
  • Ребриков Денис Владимирович
  • Трубникова Елена Владимировна
  • Айвазова Регина Андраниковна
  • Сунцова Анастасия Юрьевна
  • Шевелев Алексей Борисович
  • Кудыкина Юлия Константиновна
  • Белоус Александр Сергеевич
  • Болдинова Елизавета Олеговна
  • Кузнецова Татьяна Владимировна
  • Трофимов Дмитрий Юрьевич
RU2621858C2
СПОСОБ ОДНОМОМЕНТНОЙ ЭЛИМИНАЦИИ ПАРОДОНТОПАТОГЕНОВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ИХ КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ ТИТРОВ И КЛИНИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ТКАНЕЙ ПАРОДОНТА 2018
  • Усманова Ирина Николаевна
  • Аль Кофиш Мохаммед Али Мохаммед
  • Галимова Ирина Александровна
  • Герасимова Лариса Павловна
  • Кабирова Миляуша Фаузиевна
  • Мирсаева Фания Зартдиновна
  • Усманов Ирек Рамимович
  • Туйгунов Марсель Маратович
  • Хуснаризанова Рауза Фазыловна
  • Шангареева Алия Ирековна
RU2679803C1

Реферат патента 2017 года Способ формирования смешанной биоплёнки пародонтопатогенных анаэробных бактерий в условиях текучих сред in vitro

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ формирования микробной анаэробной биопленки в условиях текучих сред in vitro. Способ включает три этапа: на первом этапе на подложку из полимерных материалов в замкнутой емкости вносят бактериальную взвесь чистой культуры Streptococcus sanguinis, на втором - Fusobacterium nucleatum, на третьем - Porphyromonas gingivalis, или Aggregatibacter actinomycetemcomitans, или Tannerella forsythia, или Prevotella intermedia и культивируют 48 ч, 72 ч, 120 ч соответственно. Бактериальную взвесь каждой чистой культуры разводят в 0,1% полужидкой агаризованной среде - сердечно-мозговом бульоне BHI, LIM или АС, содержащей 0,01% менадиона и 0,1% гемина, до концентрации 106-108 КОЕ/мл и культивируют в микроанаэростате, размещенном в шейкер-термостате, при 37°С. Изобретение обеспечивает воссоздание модели микробной анаэробной биопленки в условиях in vitro при движении жидкой фазы среды. 5 пр.

Формула изобретения RU 2 619 169 C1

Способ формирования смешанной биопленки пародонтопатогенных анаэробных бактерий в условиях текучих сред in vitro, включающий три этапа, причем на первом этапе на подложку из полимерных материалов в замкнутой емкости вносят бактериальную взвесь чистой культуры Streptococcus sanguinis, на втором - Fusobacterium nucleatum, на третьем - Porphyromonas gingivalis, или Aggregatibacter actinomycetemcomitans, или Tannerella forsythia, или Prevotella intermedia и культивируют 48 ч, 72 ч, 120 ч соответственно, при этом бактериальную взвесь каждой чистой культуры разводят в 0,1% полужидкой агаризованной среде - сердечно-мозговом бульоне BHI, LIM или АС, содержащей 0,01% менадиона и 0,1% гемина, до концентрации 106-108 КОЕ/мл, замкнутую емкость помещают в микроанаэростат с постоянным составом бескислородной газовой смеси, состоящей из 80% азота, 10% водорода, 10% углекислого газа, который в свою очередь помещается в шейкер-термостат, обеспечивающий возвратно-поступательные движения в диапазоне 60-120 движений в минуту, при температуре 37°С с получением смешанной биопленки.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2017 года RU2619169C1

COENYE T., HANS N.J
In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation.// J.Microbiol
Meth., 2010, N 83, 89-105
АФАНАСЬЕВА В.В
И ДР., Клинико-микробиологические аспекты формирования микробной биопленки на конструкционных материалах, используемых для починки и перебазировки съемных зубных протезов.// Российский стоматологический журнал, 2015, N 2, 44-46
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПОСОБНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ ФОРМИРОВАТЬ БИОПЛЕНКИ НА ПОВЕРХНОСТИ ТВЕРДОЙ ФАЗЫ 2011
  • Алексеева Наталья Валентиновна
  • Степанова Татьяна Валентиновна
  • Тиганова Ирина Глебовна
  • Толордава Этери Ромеовна
  • Романова Юлия Михайловна
  • Гинцбург Александр Леонидович
RU2461631C1
Станок для изготовления деревянных ниточных катушек из цилиндрических, снабженных осевым отверстием, заготовок 1923
  • Григорьев П.Н.
SU2008A1

RU 2 619 169 C1

Авторы

Ипполитов Евгений Валерьевич

Царев Виктор Николаевич

Арутюнов Сергей Дарчоевич

Степанов Александр Геннадьевич

Подпорин Михаил Сергеевич

Шишова Виктория Геннадьевна

Малазония Тамар Тайгеровна

Даты

2017-05-12Публикация

2015-11-20Подача