АНАЛИЗ СОДЕРЖАНИЯ ФИБРИНОГЕНА Российский патент 2017 года по МПК G01N33/53 

Область применения изобретения

Настоящее изобретение по существу относится к иммунологическому анализу для детекции фибриногена в присутствии тромбина.

Предпосылки создания изобретения

Кровь представляет собой жидкую ткань, включающую эритроциты, лейкоциты, форменные элементы крови и тромбоциты, растворенные в жидкой фазе. Жидкой фазой является плазма, которая включает кислоты, липиды, растворенные электролиты и белки. Особым белком, присутствующим в жидкой фазе, является фибриноген. При кровотечении фибриноген взаимодействует с тромбином (ферментом) для образования нерастворимого фибринового сгустка.

В самых различных ситуациях животные, включая людей, могут страдать кровотечениями, связанными с ранами или хирургическими процедурами. В некоторых ситуациях кровотечение является сравнительно слабым, и нормальных функций свертывания крови вместе с применением простых приемов первой помощи оказывается достаточно. В других ситуациях может наблюдаться существенное кровотечение. В данных ситуациях обычно требуется специализированное оборудование и материалы, а также обученный персонал для оказания необходимой помощи.

Для решения описанных выше проблем были разработаны материалы для контроля чрезмерного кровотечения. Топические абсорбируемые гемостатические средства (TAH) широко используются в хирургической практике. TAH включают продукты на основе различных тканых или нетканых полотен или губок, как правило, полученных из по меньшей мере частично рассасывающихся материалов, варьирующихся от натуральных до синтетических полимеров и их комбинаций, включая сополимеры на основе лактида-гликолида, такие как полиглаклин 910, окисленная целлюлоза (ОЦ), окисленная регенерированная целлюлоза (ОРЦ), желатин, коллаген, хитин, хитозан и т.п. Для улучшения гемостатических характеристик каркасы на основе указанных выше материалов можно комбинировать с факторами свертывания крови биологического происхождения, такими как тромбин и/или фибриноген.

В ряде гемостатических составов, которые в настоящее время доступны в продаже или находятся в процессе разработки, используют лиофилизированный фибриноген, часто в комбинации с лиофилизированным тромбином, причем гемостатические составы применяют в виде сухого порошка, полужидкой пасты, жидкого состава или необязательно помещают на опорный каркас, такой как абсорбируемый тканевой каркас.

Ряд ссылок на уже известный уровень техники относится к анализу плазмы крови для определения содержания фибрина и фибриногена и смежным анализам, а также к разработке моноклональных антител (mAB) и моноклональных антител, направленных против продуктов разложения фибриногена. В таких ссылках на уже известный уровень техники описаны анализы, где в образце отсутствует тромбин (или присутствует только его неактивный предшественник протромбин); они не применимы к сухим лиофилизированным белкам, представляющим интерес; в них отсутствуют стадии растворения и/или стадии инактивации тромбина.

В статье «Useful laboratory tests for studying thrombogenesis in acute cardiac syndromes», Fareed et al., Clinical Chemistry, 44 (8, Ч. 2):1845-53, 1998 г., описано использование антител к фибринопептиду A (FpA) при ИФА и радиоиммунологических анализах в клинической практике, что является обычным вариантом применения антител к FpA как маркера тромбоза (внутрисосудистых сгустков крови).

В статье «Fibrin detected in plasma of patients with disseminated intravascular coagulation by fibrin-specific antibodies consists primarily of high molecular weight factor XIIIa-crosslinked and plasmin-modified complexes partially containing fibrinopeptide A», Pfitzner et al., Thrombosis & Haemostasis, 78(3):1069-78, 1997 г., утверждается, что образцы плазмы, полученные от пациентов с активным тромбообразованием, оценивали с помощью различных антител (включая антитело к фибринопептиду A) для определения характеристик фибриногена и фибрина в комплексах сгустков. Исходным материалом образцов была плазма.

В статье «The conversion of fibrinogen to fibrin: recombinant fibrinogen typifies plasma fibrinogen», Gorkun et al., Blood, 89(12):4407-14, 1997 г., описано использование ВЭЖХ для количественного определения FpA, выделяемого из двух форм фибриногена. Исходным материалом образцов была жидкость (плазма).

В статье «Isolation and characterization of the fibrin intermediate arising from cleavage of one fibrinopeptide A from fibrinogen», Shainoff et al., Journal of Biological Chemistry, 271(39):24129-37, 1996 г., описано исследование «альфа-профибрина» (мономера фибрина с одним выделяемым фибринопептидом A в отличие от обычно выделяемых двух фибринопептидов FpA) и его способность к полимеризации. Для определения возможного расщепления FpA использовали моноклональное антитело, направленное против FpA. Исходным материалом был раствор, содержащий фибриноген, фибрин или промежуточные соединения.

В статье «A monoclonal antibody, specific for human fibrinogen, fibrinopeptide A-containing fragments and not reacting with free fibrinopeptide», Koppert et al., Blood, 66(3):503-7, 1985 г., описано производство моноклонального антитела к FpA.

В статье «Monoclonal antibodies to different neo-epitopes on fibrinogen and fibrin degradation products», Amiral et al., Blood Coagul Fibrinolysis, октябрь 1990 г.; 1(4-5):447-52, описана попытка разработки различных моноклональных антител, специфичных в отношении неоэпитопов, образующихся во время разложения фибрина или фибриногена, которые классифицируются по трем классам реакционной способности: D и D-димер, D-димер и ранний фибриноген и продукты разложения фибрина. Данные моноклональные антитела использовали для разработки латексного анализа на предметном стекле и методик ИФА. Были получены два типа анализов цитратной плазмы: анализы, специфичные в отношении продуктов, связанных с фибрином, и анализы, предназначенные для оценки совокупности продуктов разложения фибрина или фибриногена.

В статье «A monoclonal antibody-based quantitative enzyme immunoassay for the determination of plasma fibrinogen concentrations», Hoegee-de Nobel et al., Thromb Haemost, 22 декабря 1988 г.; 60(3):415-8, описан количественный иммуноферментный анализ на основе моноклональных антител, предназначенный для определения концентрации фибриногена в плазме, и приводится описание таких иммунологических анализов для определения фибринопептида А фибриногена, с помощью которых невозможно обнаружить продукты разложения фибриногена.

В статье «Comparison of several mouse and rat monoclonal antibodies against human fibrinogen», Marecek et al., Hybridoma, декабрь 1996 г.; 15(6):423-7, представлено описание шести моноклональных антител к человеческому фибриногену. Предметом изучения служили моноклональные антитела мыши против последовательных эпитопов на иммунодоминантном D-домене фибриногена. Они вступали в перекрестную реакцию со всеми молекулами, содержащими D-домен [продукты разложения фибрина, фибрин(огена)].

В патенте США № 7790410 B2 описан способ проверки потенциального материала на гемосовместимость, включающий: (1) приведение потенциального материала в контакт с фибриногеном; (2) приведение потенциального материала, описанного на стадии (1), в контакт с тромбином; определение присутствия или количественного содержания продукта расщепления фибриногена, описанного на стадии (2); и определение гемосовместимости потенциального материала на основании присутствия или количественного содержания продукта расщепления фибриногена.

В патенте США № 6074837 описан конкурентный иммунологический анализ, предназначенный для определения содержания фибрина и продуктов разложения фибрина в образце; причем указанный иммунологический анализ включает отдельное приведение указанного образца и положительного контроля с известной концентрацией фибрина и продуктов разложения фибрина в контакт с меченым антителом, которое специфически связывается с указанными фибрином и продуктами разложения фибрина; отделение связанного меченого антитела от несвязанного меченого антитела после подходящего периода инкубации; измерение количества связанной метки и сравнение измеренного количества связанной метки в прореагировавшем образце с измеренным количеством связанной метки в прореагировавшем положительном контроле для определения присутствия или количества указанного фибрина и продуктов разложения фибрина в указанном образце, причем усовершенствование включает применение модифицированного фибриногена в качестве указанного фибрина и продуктов разложения фибрина в указанном положительном контроле. Дополнительно в ссылке описан иммунологический сэндвич-анализ для определения содержания фибрина и продуктов разложения фибрина в образце; причем указанный иммунологический анализ включает покрытие лунок титрационного микропланшета первым антителом, которое специфически связывается с указанным фибрином, указанными продуктами разложения фибрина и мономером фибрина; приведение указанного образца и положительного контроля с известной концентрацией фибрина или мономера фибрина в контакт с разными лунками указанного титрационного микропланшета; удаление любого несвязанного образца или положительного контроля из соответствующей лунки; приведение каждой лунки в контакт c меченым антителом к первому антителу; измерение количества любой связанной метки в каждой лунке и сравнение измеренного количества связанной метки в лунках, содержащих образец, с измеренным количеством связанной метки в лунках, содержащих положительный контроль, для определения присутствия или количества указанных фибрина и продуктов разложения фибрина в образце, причем усовершенствование включает применение модифицированного фибриногена в качестве указанного фибрина или мономера фибрина в указанном положительном контроле, причем модифицированный фибриноген получают способом, включающим следующие стадии: (1) частичное восстановление фибриногена с концентрацией от 3 до 25 микромолей с помощью восстановителя из расчета 0,25 миллимоля на один наномоль указанного фибриногена при температуре 30-40°C в условиях, исключающих денатурацию, и в отсутствие двухвалентных катионов в течение 0,5-1,5 часов; затем (2) блокирование тиольных групп любого свободного цистеина, образованного на стадии (1), посредством взаимодействия продукта, полученного на стадии (1), с блокатором, который не вызывает осаждения продукта, полученного на стадии (2); затем (3) взаимодействие продукта, полученного на стадии (2), с коагулирующим ферментом в физиологическом буферном растворе в отсутствие двухвалентных катионов для высвобождения фибринопептидов A и B; и (4) прерывание активности указанного коагулирующего фермента.

В патенте США № 5876947 описана стабильная клеточная линия, идентифицированная как P10 и зарегистрированная в ATCC Accession за № HB-12398, которая продуцирует моноклональное антитело, которое специфически связывается с эпитопом, определяемым специфической последовательностью аминокислот. Кроме того, дополнительно описано моноспецифическое антитело или его фрагмент, который специфически связывается с эпитопом, присутствующим в фибриногене, а именно фибринопептидом B, или des-Arg-фибринопептидом B.

В патенте США № 4438209 описан конкурентный способ радиоиммунологического анализа для определения концентрации фибринопептида A в плазме, где, во-первых, выполняют забор образца крови, тромбин в указанном образце подавляют ингибирующим количеством ингибитора тромбина и отделяют плазму от указанного образца, и, во-вторых, в условиях радиоиммунологического конкурентного связывания образец указанной плазмы приводят в контакт с достаточным количеством антитела к фибринопептиду A и радиоактивно меченым фибринопептидом A, после чего антитело, связавшееся с фибринопептидом A, отделяют от несвязанного фибринопептида A и измеряют радиоактивность; усовершенствование включает применение в качестве ингибитора тромбина, ингибитора, выбранного из группы, состоящей из D-фенилаланил-L-пропил-L-N-[2(1-хлор-7-гуанидогептан-2-она)], его кислотно-аддитивной соли соляной кислоты; его кислотно-аддитивной соли фтороводородной кислоты, его кислотно-аддитивной соли уксусной кислоты и его кислотно-аддитивной соли лимонной кислоты.

В Европейской патентной публикации № EP 345811 A2 описана гибридома, секретирующая моноклональное антитело, специфическое в отношении человеческого фибринопептида A, но не взаимодействующее ни с интактным фибриногеном, ни с фрагментами человеческого фибриногена, содержащего фибринопептид A. Дополнительно в ссылке описан способ определения свободного FpA, включающий (a) иммобилизацию моноклонального антитела, причем указанное моноклональное антитело соответствует п. 1, (b) приведение иммобилизированного моноклонального антитела, полученного на стадии (a), в контакт с меченым пептидом hFPA или его меченым фрагментом, или его Tyr-производным и образцом плазмы, и (c) выполнение анализа для определения метки.

В патенте США № 5817768 описано моноспецифическое антитело, которое связывается с эпитопом субэлемента α_E фибриногена, причем указанное моноспецифическое антитело продуцируется клеточной линией гибридомы, выбранной из группы, состоящей из клеточной линии гибридомы, идентифицированной как № 3-10, клеточной линии гибридомы, идентифицированной как № 29-1, и клеточной линии гибридомы № 148-B.

В патенте PCT № WO2007/030571 A2 описана идентификация целевых молекул, характерных для заболевания, а также разработка реагентов, применяемых для визуализации и диагностических анализов, специфических в отношении данных молекул. В нем описаны способы и реагенты, предназначенные для идентификации молекулярных мишеней, специфических для заболевания или болезненного состояния, способы визуализации, которые могут применяться, разработка специфических молекулярных реагентов для визуализации, клиническая валидация реагентов для визуализации и клинические показания для молекулярной визуализации. В ссылке заявлен реагент для визуализации, специфичный в отношении мишени, который включает аффинный агент, соединенный с визуализирующим агентом, причем указанный аффинный агент специфически связывается с биологической молекулой, причем экспрессия указанной биологической молекулы является прогностическим признаком заболевания или болезненного состояния.

В патенте PCT № WO 2007/030531 описана идентификация целевых молекул, характерных для заболевания, а также разработка визуализирующих реагентов и диагностических анализов, специфических в отношении данных молекул. В нем описаны способы и реагенты, предназначенные для идентификации молекулярных мишеней, специфических для заболевания или болезненного состояния, способы визуализации, которые могут применяться, разработка специфических молекулярных реагентов для визуализации, клиническая валидация реагентов для визуализации и клинические показания для молекулярной визуализации. В ссылке заявлен реагент для визуализации, специфический в отношении мишени, который включает антитело, соединенное с визуализирующим агентом, поддающимся детекции с помощью магнитного резонанса, причем указанное антитело специфически связывается с глипиканом-3, причем экспрессия глипикана-3 является прогностическим признаком рака печени.

В опубликованной заявке на патент США № 20110053193 описан способ определения активности или функциональности либо первого реакционного компонента, либо второго реакционного компонента в непрореагировавшей примеси первого реакционного компонента и второго реакционного компонента; причем способ включает стадии (a) обратимого ингибирования первого реакционного компонента для получения смеси, имеющей инактивированный первый реакционный компонент и второй реакционный компонент; (b) добавления к смеси известного количества второго реакционного компонента при оценке активности первого реакционного компонента или известного количества первого реакционного компонента при оценке активности второго реакционного компонента; (c) обратимой активации первого реакционного компонента; (d) взаимодействия первого реакционного компонента со вторым реакционным компонентом, который изначально присутствует в примеси, а также с известным количеством второго реакционного компонента, либо взаимодействия первого реакционного компонента со вторым реакционным компонентом, который изначально присутствует в примеси, а также с известным количеством первого реакционного компонента; и (e) определения активности или функциональности первого или второго реакционного компонента, изначально присутствующего в примеси.

Гемостатические пластыри или прокладки, содержащие лиофилизированные тромбин и фибриноген, необязательно расположенные на абсорбируемых каркасах, нуждаются в анализе, предполагающем количественную оценку состояния активации биологических компонентов (т.е. определение того, превратился ли фибриноген в фибрин). Поскольку фибриноген и тромбин спонтанно взаимодействуют при гидратации, воздействие влаги на гемостатическую прокладку может вызвать преждевременную активацию биологических компонентов (до наложения на место кровотечения) и потенциально повлиять на общую стабильность и эффективность прокладки. В настоящее время устройства доставки фибринового герметика, которые позволяют нанести смесь растворов фибриногена и тромбина на рану для гемостаза или закрытия ткани, нуждаются в испытаниях для непосредственной оценки степени превращения фибриногена в фибрин. Одна цель работы заявителей заключалась в разработке надежного анализа, предназначенного для измерения скорости реакции и степени превращения фибриногена в фибрин, а также измерения количества интактного фибриногена в присутствии тромбина.

Изложение сущности изобретения

Вкратце, настоящее изобретение относится к способу детекции интактного фибриногена, включающему стадии: получения образца, содержащего по меньшей мере некоторое количество фибриногена, необязательно превращенного по меньшей мере частично в фибрин, и необязательно содержащего тромбин; растворения образца в растворе растворителя и ингибирования активности тромбина; переноса части указанного образца на мембрану, связывающую белок, после необязательного ДСН-ПААГ-электрофореза; взаимодействия фибриногена с первичным моноклональным антителом, способным связываться с фрагментом фибринопептида A; и детекции количества интактного фибриногена в образце посредством определения количества связанного первичного моноклонального антитела.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу детекции интактного фибриногена, включающему стадии: получения образца, содержащего по меньшей мере некоторое количество фибриногена, необязательно превращенного по меньшей мере частично в фибрин, и необязательно содержащего тромбин; растворения образца в растворе растворителя, который ингибирует активность тромбина; переноса части указанного образца в гель и выполнения электрофореза указанной части; переноса фракции указанной части образца из указанного геля на мембрану, связывающую белок, и иммобилизации фибриногена на указанной мембране; выполнения по меньшей мере одной стадии блокирования указанной мембраны; взаимодействия фибриногена, иммобилизированного на указанной мембране, с первичным моноклональным антителом, способным связываться с фрагментом фибринопептида A, для образования комплекса фибриноген-антитело; выполнения по меньшей мере одной стадии промывки указанной мембраны для удаления любого несвязанного первичного моноклонального антитела; взаимодействия указанного моноклонального антитела, образовавшего комплекс фибриноген-антитело, с вторичным антителом, имеющим маркер; выполнения по меньшей мере одной стадии промывки указанной мембраны для удаления любого несвязанного вторичного антитела, имеющего маркер; и детекции количества интактного фибриногена в образце посредством определения количества маркера.

В альтернативном варианте осуществления фибриноген, иммобилизированный на указанной мембране, взаимодействует с первичным моноклональным антителом, способным связываться с фрагментом фибринопептида B, для образования комплекса фибриноген-антитело.

Образец может содержать неизвестное количество интактного фибриногена. Образец может быть твердым, жидким или полужидким веществом. Образец может содержать лиофилизированные фибриноген и тромбин.

В данном способе можно использовать ДСН-ПААГ-электрофорез и/или вестерн-блоттинг, либо дот-блоттинг. Первичное моноклональное антитело, способное связываться с фрагментом фибринопептида A, может представлять собой клон 1F7. В альтернативном варианте осуществления первичное моноклональное антитело способно связываться с фрагментом фибринопептида B. Фибринопептиды A и B расщепляются в результате ферментативного действия тромбина на N-концах цепей Aα и Bβ фибриногена соответственно. Данные пептиды состоят из 16 и 14 аминокислот, которые имеют молекулярную массу 1536,6 дальтон и 1570,6 дальтон соответственно. Вторичное антитело, имеющее маркер, представляет собой козье антитело к IgG мыши, конъюгированное с щелочной фосфатазой.

Стадия детекции количества интактного фибриногена в образце посредством определения количества маркера можно выполнить путем инкубации мембраны, связывающей белок, с субстратом для щелочной фосфатазы.

Маркер может представлять собой электрохимически определяемый маркер, колориметрически определяемый маркер, рентгенологически определяемый маркер, маркер, определяемый магнитным способом, или флуоресцентный маркер.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу оценки эффективности или стабильности гемостатического устройства, содержащего по меньшей мере один биологический компонент, который представляет собой фибриноген; причем способ включает сравнение количества интактного фибриногена в образце, который получен в соответствии с описанным выше способом, и порогового значения интактного фибриногена.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу детекции интактного фибриногена, включающему стадии: получения образца, содержащего по меньшей мере некоторое количество фибриногена, необязательно превращенного по меньшей мере частично в фибрин, и необязательно содержащего тромбин; растворения образца в растворе растворителя, который ингибирует активность тромбина; нанесения части указанного образца на мембрану, связывающую белок, и иммобилизации фибриногена на указанной мембране; выполнения по меньшей мере одной стадии блокирования указанной мембраны и удаления фибринопептида А, отщепленного от фибриногена, входящего в состав мембраны для дот-блоттинга; взаимодействия фибриногена, иммобилизированного на указанной мембране, с первичным моноклональным антителом, способным связываться с фрагментом фибринопептида A, для образования комплекса фибриноген-антитело; выполнения по меньшей мере одной стадии промывки указанной мембраны для удаления любого несвязанного первичного моноклонального антитела; взаимодействия указанного моноклонального антитела, образовавшего комплекс фибриноген-антитело, с вторичным антителом, имеющим маркер; выполнения по меньшей мере одной стадии промывки указанной мембраны для удаления любого несвязанного вторичного антитела, имеющего маркер; и детекции количества интактного фибриногена в образце посредством определения количества маркера.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу детекции интактного фибриногена, включающему стадии: получения образца, содержащего по меньшей мере некоторое количество фибриногена, необязательно превращенного по меньшей мере частично в фибрин, и необязательно содержащего тромбин; растворения образца в растворе растворителя, который ингибирует активность тромбина; переноса части указанного образца на мембрану, связывающую белок, и иммобилизации фибриногена на указанной мембране; выполнения по меньшей мере одной стадии промывки и одной стадии блокирования указанной мембраны и удаления фибринопептида А, отщепленного от фибриногена, входящего в состав мембраны для дот-блоттинга; взаимодействия фибриногена, иммобилизированного на указанной мембране, с первичным моноклональным антителом, способным связываться с фрагментом фибринопептида A, для образования комплекса фибриноген-антитело; и детекции количества интактного фибриногена в образце посредством определения количества первичного моноклонального антитела, образующего связанный комплекс фибриноген-антитело.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 схематически представлена структура фибриногена.

На фиг. 2 схематически представлено превращение фибриногена в фибрин.

На фиг. 3 представлено изображение нитроцеллюлозной мембраны после проведения вестерн-блоттинга.

На фиг. 4 представлено изображение геля, окрашенного кумасси синим сразу после переноса белка из геля на нитроцеллюлозную мембрану.

На фиг. 5 представлено изображение нитроцеллюлозной мембраны после выполнения дот-блоттинга.

На фиг. 6 представлен график, отражающий линейную зависимость между концентрациями фибриногена и интенсивностью окрашивания.

На фиг. 7 представлена блок-схема обладающего признаками изобретения способа вестерн-блоттинга.

На фиг. 8 представлена блок-схема обладающего признаками изобретения способа дот-блоттинга.

Подробное описание изобретения

Фибриноген является белком-предшественником матрицы сгустка крови. Он имеет молекулярную массу 340000 дальтон и состоит из 3 пар неидентичных полипептидных цепей (Aα, Bβ и γ), соединенных вместе дисульфидными связями. Фибриноген имеет трехузловую структуру: два идентичных концевых глобулярных D-домена и центральный глобулярный E-домен. Все данные домены соединены суперскрученными α-спиралями, как схематически показано на фиг. 1, где FpA и FpB обозначают фибринопептиды A и B соответственно.

В обычных условиях кровь содержится в непрерывной сети сосудов, выстланных клетками эндотелия. Поверхность клеток эндотелия, обращенная в просвет сосуда, образует «гемосовместимый» барьер, который ингибирует спонтанную коагуляцию крови и адгезию тромбоцитов. Однако при нарушении целостности эндотелиальной выстилки запускается ряд биохимических реакций, направленных на прекращение кровотечения. Сразу после повреждения поврежденный сосуд сокращается таким образом, что кровь отводится от места повреждения. Процесс коагуляции запускается путем связывания специфических плазменных белков и тромбоцитов с субэндотелиальными структурами, образовавшимися в результате нарушения целостности эндотелиальной выстилки. Поврежденные клетки эндотелия также запускают процесс коагуляции путем высвобождения тканевого фактора, представляющего собой комплекс белка и фосфолипида. Сразу после начала коагуляции происходит «каскадная» активация ферментов, в результате которой в месте повреждения образуется сгусток крови, насыщенный тромбоцитами, или гемостатическая «пробка».

Представлена ссылка на следующую публикацию, полностью включенную в настоящий документ путем ссылки: AP DeAnglis и GS Retzinger, «Fibrin(ogen) and Inflammation: Current Understanding and New Perspectives», Clinical Immunology Newsletter (1999 г.) 18, 111-118.

Критически важной стадией образования сгустка крови является катализируемое тромбином превращение фибриногена в фибрин. Чтобы произошло такое превращение, собственно тромбин должен образоваться из своего неактивного предшественника - протромбина - с помощью ферментативного комплекса, вырабатывающегося в процессе коагуляции. Тромбин, являющийся серин-протеазой, гидролизует специфические аргинин-глициновые связи, размещенные на N-концах полипептидных цепей Aα и Bβ фибриногена, что способствует высвобождению из белка двух пар отрицательно заряженных белковых фрагментов, которые называются фибринопептидами A и B. Данные пептиды составляют только 2% от общей массы фибриногена. Высвобождение фибринопептидов изменяет заряд E-домена с отрицательного на положительный, способствуя взаимодействиям данного домена с отрицательно заряженными D-доменами других молекул фибрина. Взаимодействия мономеров фибрина друг с другом приводят к спонтанной сборке мономеров фибрина в полушахматном порядке, как схематически показано на фиг. 2. Специфическое соединение мономеров фибрина, которое происходит при полимеризации фибрина, является результатом нековалентных взаимодействий между комплементарными участками полимеризации, называемыми выступами и впадинами, в E- и D-доменах мономеров фибрина. Первоначально при сборке полимера фибрина образуется протофибрилла - длинный олигомер фибрина, имеющий толщину двух молекул. Со временем протофибриллы соединяются латерально, образуя группы протофибрилл, которые в дальнейшем объединяются в более крупные фибриновые волокна. Процесс сборки протофибрилл приводит к образованию взаимосвязанной сети фибриновых волокон, расположенных в характерном полушахматном порядке.

Превращение фибриногена в фибрин является критически важной стадией гемостаза, включающим катализируемое тромбином отщепление от фибриногена фибринопептидов A и B, что приводит к образованию мономера фибрина, который в дальнейшем превращается в полимер фибрина. Измерение степени превращения фибриногена в фибрин в присутствии тромбина представляет собой сложную задачу, так как в обычных условиях фермент спонтанно гидролизует фибриноген в фибрин. Количество фибриногена можно измерить только в том случае, если белок находится в растворенном состоянии. Если белки будут растворены в достаточной степени, тромбин будет спонтанно превращать фибриноген в фибрин, препятствуя измерению первоначального фибриногена.

Цели

Цель настоящего изобретения заключается в получении способа, который позволяет измерить степень превращения фибриногена в фибрин в исходном материале, состоящем из обезвоженного фибриногена и/или фибрина, далее упоминаемых как порошки фибриногена/фибрина и тромбина.

Дополнительная цель настоящего изобретения состоит в обеспечении способа, который позволяет измерить степень потенциального преждевременного превращения фибриногена в фибрин в исходном материале, состоящем из обезвоженных порошков фибриногена/фибрина и тромбина. Спонтанное образование фибрина предотвращают путем ингибирования тромбина во время растворения.

Дополнительная цель настоящего изобретения заключается в получении способа, который можно использовать для оценки скорости и степени реакции между фибриногеном и тромбином в жидких составах, содержащих два белка.

Другая цель настоящего изобретения заключается в получении способа, который можно использовать для оценки биохимической реакции между фибриногеном и тромбином для оптимизации жидких составов или эффективности смешивания (применительно к жидким составам фибринового герметика и специализированным наконечникам для смешивания).

Другая дополнительная цель настоящего изобретения заключается в получении способа, при котором для измерения количества фибриногена и фибрина используют растворение белков. Для предотвращения спонтанного образования фибрина во время приготовления образца растворение белков осуществляется в оптимизированных условиях, в которых при гидратации происходит немедленная инактивация тромбина. Процедура приготовления образца должна предотвращать/минимизировать любое образование фибрина таким образом, чтобы можно было определить количество фибриногена в исходном образце.

Дополнительная цель настоящего изобретения заключается в получении способа, который может иметь диагностическое и клиническое применение для идентификации присутствия фибриногена и дифференцирования фибриногена и фибрина в случае присутствия одновременно двух белков. Депонирование фибриногена и фибрина является важным признаком многих болезненных состояний, например, воспаления, атеросклероза, опухолей, тромбоэмболии и т.п. Присутствие и/или относительные количества фибриногена и фибрина можно использовать в качестве диагностических или прогностических критериев.

Обзор способа

В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения лиофилизированные фибриноген и тромбин растворяют перед выполнением или в ходе проведения обладающего признаками изобретения анализа содержания интактного фибриногена. Чтобы избежать превращения фибриногена в фибрин при растворении, необходимо инактивировать тромбин сразу же после гидратации. Чтобы измерить количество фибриногена, смесь белков можно разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ-электрофорез) и перенести в виде пятен на мембрану, связывающую белок (например, нитроцеллюлозную, поливинилиденфторидную мембрану). В альтернативном варианте осуществления смесь белков можно нанести непосредственно на мембрану. Используя антитело к FpA или FpB, на мембране можно обнаружить интактный фибриноген, однако при превращении исходного интактного фибриногена в фибрин (путем отщепления фибринопептида от фибриногена) белок не будет обнаружен на мембране. Данный обладающий признаками изобретения способ позволяет оценить степень превращения фибриногена в фибрин и применим к любой смеси фибриногена/фибрина и тромбина.

Кроме того, стадия растворения белка, необходимая для изменения количества фибриногена, может привести к спонтанной реакции между фибриногеном и тромбином и, следовательно, препятствовать точному измерению любой реакции до растворения образца. Авторы изобретения обнаружили, что специфические условия растворения подавляют активность тромбина, в то же время не препятствуя растворению белков. Обладающие признаками изобретения реагенты/условия, способствующие растворению, включают ингибитор тромбина, высокую концентрацию моющего средства и восстановителя в комбинации с высокой температурой.

Аналитический способ измерения степени превращения фибриногена в фибрин, описанный в настоящем изобретении, является методом иммуноблоттинга, в котором используют антитело, специфическое в отношении части молекулы фибриногена, подвергающейся гидролизу и расщеплению ферментом тромбином. С помощью данного антитела обнаруживают образец, содержащий фибриноген, в то время как полностью прореагировавший образец, содержащий только фибрин, невозможно обнаружить с помощью данного антитела. В частично прореагировавшем образце будет получен промежуточный ответ, который можно оценить количественно с помощью метода иммуноблоттинга.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения способ детекции (интактного) фибриногена включает стадию растворения и стадию иммуноблоттинга.

Стадия растворения предусматривает растворение образца при одновременном подавлении активности тромбина.

Стадия иммуноблоттинга предусматривает: перенос или нанесение образцов на мембрану; необязательный ДСН-ПААГ-электрофорез; стадию блокирования; взаимодействие фибриногена, иммобилизированного на мембране, с первичным моноклональным антителом; стадию промывки для удаления непрореагировавшего первичного антитела; взаимодействие моноклонального антитела с вторичным антителом, имеющим маркер; стадию промывки для удаления непрореагировавшего вторичного антитела; и детекцию количества интактного фибриногена посредством определения количества маркера.

Гемостатическая прокладка, содержащая лиофилизированные фибриноген и тромбин.

Гемостатическая прокладка, содержащая лиофилизированные фибриноген и тромбин на абсорбируемом каркасе, которую использовали при экспериментальном испытании, составляющем предмет настоящего изобретения, далее упоминается как фибриногенсодержащая прокладка. Фибриногенсодержащая прокладка состоит из композитной структуры, включая слои Vicryl^® (полиглактин 910) и ОРЦ (окисленной регенерированной целлюлозы). Слой Vicryl^® покрыт порошками человеческого фибриногена и тромбина в обезвоженном, непрореагировавшем состоянии. Когда продукт накладывают на место кровотечения, белки гидратируются, что приводит к превращению фибриногена в фибрин и образованию сгустка фибрина. Образование фибрина на поверхности ткани способствует гемостазу и адгезии к ткани. Очень важно, чтобы до наложения на ткань белки оставались в непрореагировавшем состоянии. Преждевременное превращение фибриногена в фибрин (активация до применения продукта) из-за воздействия воды при производстве или хранении может оказывать негативное влияние на эффективность и стабильность продукта.

Патент США № 7666803, выданный Shetty et al., под названием «Армированная абсорбируемая многослойная ткань для применения в медицинских устройствах» полностью включен в настоящий документ во всех отношениях путем ссылки и описывает многослойную ткань, включающую первое абсорбируемое нетканое полотно и второе абсорбируемое тканое или трикотажное полотно, включающее окисленные полисахариды.

Опубликованная заявка на патент США № 2006/0088589 A1 под названием «Способ получения абсорбируемого гемостатического средства», Gorman et al., полностью включена в настоящий документ во всех отношениях путем ссылки и описывает способ получения раневой повязки, охарактеризованной в указанном способе, который включает: суспендирование порошка тромбина и/или фибриногена в жидком перфторированном углеводороде-носителе, в котором они не растворимы, и нанесение полученной суспензии на первое абсорбируемое нетканое полотно.

Опубликованная заявка на патент США № 2009/0246238A1, поданная Gorman et al., под названием «АРМИРОВАННАЯ АБСОРБИРУЕМАЯ МНОГОСЛОЙНАЯ ГЕМОСТАТИЧЕСКАЯ РАНЕВАЯ ПОВЯЗКА» полностью включена в настоящий документ во всех отношениях путем ссылки и описывает способ получения многослойной раневой повязки, имеющей первое абсорбируемое нетканое полотно, один или более вторых абсорбируемых тканых или трикотажных полотен, тромбин и/или фибриноген, включающий следующие стадии: (a) обжатие волокон абсорбируемого полимера или пряжи в диапазоне от приблизительно 3,9 до 11,8 сгибов на сантиметр (приблизительно 10-30 загибов на дюйм); (b) разрезание извитых волокон или пряжи по длине штапельного волокна в диапазоне от приблизительно 0,25 до 6,4 см (приблизительно 0,1-2,5 дюйма); (c) прочесывание штапельного волокна для образования первого абсорбируемого нетканого полотна с одновременным поддержанием влажности в диапазоне приблизительно 20-60% при комнатной температуре, составляющей приблизительно от 15 до 24°C; (d) прикрепление первого абсорбируемого нетканого полотна ко второму абсорбируемому тканому или трикотажному полотну; (e) нанесение тромбина и/или фибриногена на первое абсорбируемое нетканое полотно.

Фибриногенсодержащие прокладки, полученные в соответствии с описанием в указанных выше ссылках, использовали при проведении экспериментов, соответствующих практике применения настоящего изобретения. Многослойный матричный компонент фибриногенсодержащей прокладки состоит из трикотажного защитного слоя, выполненного из ОРЦ, который прикреплен к слою нетканых волокон полиглактина 910 (PG910). При производстве волокна PG910 вводят в войлок посредством кардования и пришивают иглопробивным способом к защитному слою ОРЦ для получения многослойной матрицы.

Биологические компоненты фибриногенсодержащей прокладки предпочтительно представляют собой лиофилизированные формы человеческого фибриногена и человеческого тромбина. Они содержат биологически активные компоненты, фибриноген и тромбин соответственно, а также другие эксципиенты. Композиции человеческого фибриногена и человеческого тромбина, наносимые на фибриногенсодержащую прокладку, содержат 2-20 мг/см² фибриногена и 1-150 МЕ/см² тромбина.

Помимо измерения степени превращения фибриногена в фибрин в смеси обезвоженных фибриногена и тромбина настоящий способ можно использовать для измерения степени превращения фибриногена в фибрин в жидком составе, содержащем фибриноген и тромбин. Примерами таких составов являются доступные в продаже фибриновые герметики, состоящие из концентрированных растворов фибриногена и тромбина, которые наносят на место кровотечения одновременно, но по отдельности, для остановки кровотечения. Когда два раствора белков хорошо смешаны, фибриноген быстро превращается в фибрин. Измерение скорости и степени образования фибрина является сложной задачей из-за быстроты образования фибрина и нерастворимости полученного фибринового сгустка. Для оценки степени смешивания жидкостей можно использовать различные методы, однако с помощью данных методов невозможно биохимически оценить степень превращения фибриногена в фибрин. При помощи метода иммуноблоттинга, описанного в настоящем документе, можно определить относительные количества фибриногена и фибрина, присутствующих в смеси фибринового герметика.

Фибриновый герметик (человеческий) EVICEL^® производства компании Johnson & Johnson Wound Management, г. Сомервилл, штат Нью-Джерси, поставляется в виде набора, содержащего BAC2 (55-85 мг/мл фибриногена) и тромбин (800-1200 МЕ/мл человеческого тромбина). BAC2 представляет собой стерильный раствор с pH 6,7-7,2, по существу состоящий из концентрата человеческого фибриногена. Состав раствора BAC2: концентрат человеческого фибриногена (55-85 мг/мл); гидрохлорид аргинина, глицин, хлорид натрия, цитрат натрия, хлорид кальция и вода для инъекций. Тромбин представляет собой стерильный раствор с pH 6,8-7,2, который содержит очищенный человеческий тромбин. Состав раствора тромбина: человеческий тромбин (800-1200 МЕ/мл); хлорид кальция, человеческий альбумин, манит, ацетат натрия и вода для инъекций.

Настоящий обладающий признаками изобретения способ может иметь и другое диагностическое и клиническое применение, направленное на дифференцировку фибриногена и фибрина в случаях, когда присутствуют два белка, или на измерение относительных количеств фибриногена и фибрина в смеси. Таким образом, настоящий способ позволяет оценить степень превращения фибриногена в фибрин и применим для любой смеси фибриногена/фибрина и тромбина.

Стадия растворения

В одном варианте осуществления настоящего изобретения образцы, содержащие тромбин и фибриноген/фибрин в обезвоженных и/или жидких составах, подвергают растворению.

Обладающий признаками изобретения растворитель включает высокую концентрацию моющего средства и восстановителя (4% додецилсульфата натрия (SDS) и 500 мМ дитиотреитола (DTT)), прямой ингибитор тромбина (например, 200 мг/мл Pefabloc^® SC) в комбинации с высокой температурой (95°C). В результате, тромбин инактивируется и не может выступать катализатором образования фибрина. Следовательно, тромбин и фибриноген могут существовать в растворенной форме в одном и том же растворе без какого-либо взаимодействия.

После растворения выполняют оценку белков методами электрофореза и иммуноблоттинга.

Стадия иммуноблоттинга

Чтобы оценить степень превращения фибриногена в фибрин, разные образцы необязательно подвергали ДСН-ПААГ-электрофорезу с последующим проведением вестерн-блоттинга или дот-блоттинга. Для детекции использовали моноклональное антитело [клон 1F7], специфическое в отношении фибринопептида A фибриногена.

Моноклональное антитело [клон 1F7] к фибринопептиду A

В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения в обладающем признаками изобретения анализе используют моноклональное антитело [клон 1F7] к фибринопептиду A (FpA), присутствующему в интактной (непрореагировавшей) молекуле фибриногена.

Моноклональное антитело получили от компании Abcam Inc. (г. Кембридж, штат Массачусетс) и проанализировали с помощью электрофореза и ИФА.

В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения присутствие FpA используют как индикатор для детекции интактного фибриногена. Фибриноген, полностью превратившийся в фибрин, невозможно обнаружить с помощью данного антитела в связи с отсутствием FpA.

В образце, содержащем смесь иммобилизированных фибриногена и фибрина, антитело будет связываться только с иммобилизированным интактным фибриногеном.

Препараты для испытания, используемые для анализа, обладающего признаками изобретения

Ниже в описании представлены подробные данные о композиции и приготовлении препаратов или образцов для испытания, которые использовали в экспериментальных примерах, демонстрирующих проведение анализа, обладающего признаками изобретения. Конкретные препараты или образцы для испытания перечислены ниже в таблицах 1 и 2.

Чтобы оценить степень превращения фибриногена в фибрин, различные образцы, содержащие белок в состоянии, варьирующем от интактного фибриногена до фибрина (продукта реакции), а также контрольные образцы испытывали с помощью методов вестерн-блоттинга и прямого дот-блоттинга. Для детекции использовали моноклональное антитело, специфическое в отношении фибринопептида A фибриногена [клон 1F7].

Исходный материал, использованный для приготовления препаратов для испытания, включал доступные в продаже очищенный фибриноген, тромбин в большой концентрации и компоненты фибриногена, полученные из доступного в продаже фибринового герметика, а также включал фибриногенсодержащую прокладку производства компании Ethicon, Inc., как описано выше.

Непрореагировавшие образцы включали очищенный фибриноген, фибриногенсодержащий компонент фибринового герметика и биологический порошок, экстрагированный из обезвоженной фибриногенсодержащей прокладки. Полностью прореагировавшие образцы включали свернувшийся жидкий фибриновый герметик и порошок, экстрагированный из фибриногенсодержащей прокладки, который подвергли полной гидратации для образования сгустка. Частично прореагировавший образец включал порошок, экстрагированный из фибриногенсодержащей прокладки, который подвергли воздействию ограниченного объема водной среды.

Все образцы, не содержавшие тромбин, растворили в водном растворе (растворяющем буферном растворе) при температуре 95°C, содержащем Трис-HCl в конечной концентрации 0,1 М, 20 мг/мл буферного раствора SDS и 7,7 мг/мл DTT в качестве восстановителя, для достижения концентрации фибриногена приблизительно 10 мг/мл.

Все образцы, содержавшие тромбин, растворили в описанном выше растворяющем буферном растворе, который также содержал Pefabloc^® SC (4-(2-аминоэтил)бензолсульфонил фторидгидрохлорид) в конечной концентрации 2 мг/мл, применяемый в данном случае в качестве ингибитора тромбина и доступный в продаже от компании Fluka, Sigma-Aldrich (г. Сент-Луис, штат Миссури), для минимизации любой активности тромбина во время приготовления образца.

Образцы приготовили следующим образом. Для каждого образца приготовили растворяющий буферный раствор и нагрели его до температуры 95°C. Затем растворяющий буферный раствор добавили в сосуд, содержащий обезвоженный белок или раствор белка для достижения концентрации фибриногена/фибрина приблизительно 10 мг/мл. Полученную смесь перемешали вручную и оставили при температуре 95°C до полного восстановления и растворения белков (до 3 часов).

Образец очищенного фибриногена (≥95% фибриногена, способного к свертыванию) получили от компании Enzyme Research Laboratories (г. Саут-Бенд, штат Индиана) и растворили в растворяющем буферном растворе (как описано выше) для достижения концентрации фибриногена приблизительно 10 мг/мл.

В некоторых испытаниях использовали фибриноген, содержащийся в фибриновом герметике EVICEL^® (BAC2). Концентрация фибриногена составила 55-85 мг/мл; в состав также входили другие белки и эксципиенты, включая фибронектин, альбумин, гидрохлорид аргинина, глицин, хлорид натрия и цитрат натрия.

Кроме того, в некоторых испытаниях использовали тромбин, содержащийся в фибриновом герметике EVICEL^®. Активность тромбина составила 800-1200 МЕ/мл, в состав также входили хлорид кальция, человеческий альбумин, манит и ацетат натрия.

Для приготовления образца фибриноген, содержащийся в фибриновом герметике, растворили при температуре 95°C в растворяющем буферном растворе с Трис-HCl в конечной концентрации 0,1 М, 20 мг/мл буферного раствора SDS и 7,7 мг/мл DTT для достижения концентрации фибриногена приблизительно 10 мг/мл.

Образец сгустка фибринового герметика готовили путем одновременного смешивания в пробирке для испытания равных объемов фибриногена и тромбина, содержащихся в EVICEL^®, и инкубации образца при оптимальной физиологической температуре (например, 37°C) до 2 часов для обеспечения полного образования фибринового сгустка. Затем полностью свернувшуюся смесь растворили в растворяющем буферном растворе для достижения концентрации фибриногена/фибрина приблизительно 10 мг/мл, как описано выше.

Порошок лиофилизированного белка экстрагировали из обезвоженных образцов фибриногенсодержащей прокладки путем встряхивания ткани, покрытой фибриногеном и тромбином, в растворителе (метилперфторпропиловый эфир) с последующим выпариванием растворителя. Часть данного порошка подвергали гидратации в водной среде (200 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, pH 7,4) и инкубации при оптимальной физиологической температуре (например, 37°C) до 2 часов для обеспечения полного образования фибринового сгустка. Затем полученный сгусток растворили в растворяющем буферном растворе для достижения концентрации фибриногена/фибрина приблизительно 10 мг/мл, как описано выше.

Образцы фибриногенсодержащей прокладки, подвергшиеся воздействию указанной температуры и влажности (25°C/относительная влажность 60%), готовили следующим образом. Образцы фибриногенсодержащей прокладки расположили в камере с искусственным микроклиматом при температуре 25°C и относительной влажности 60% и выдерживали в течение 1 часа или 24 часов. Затем образцы фибриногенсодержащей прокладки необязательно подвергали вакуумной сушке, после чего из них экстрагировали порошок, как описано выше. Экстракт порошка растворяли в растворяющем буферном растворе для достижения концентрации фибриногена приблизительно 10 мг/мл, как описано выше.

Образцы фибриногенсодержащей прокладки также подвергали частичному свертыванию путем гидратации в ограниченном объеме водной среды (200 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, pH 7,4) для образования фибринового сгустка; затем образцы необязательно подвергали вакуумной сушке. Затем порошок экстрагировали и растворяли в растворяющем буферном растворе для достижения концентрации фибриногена/фибрина приблизительно 10 мг/мл, как описано выше.

Препарат для испытания «буферный раствор для обработки образца» содержал только растворяющий буферный раствор, как описано выше.

Пример 1. Иммунологический анализ вестерн-блоттинга

Испытанные образцы пронумерованы в таблице 1. После растворения до концентрации фибриногена/фибрина приблизительно 10 мг/мл образцы дополнительно разбавили растворяющим буферным раствором для оптимизации концентраций белков в образце для проведения ДСН-ПААГ-электрофореза. Затем образцы загрузили в полиакриламидный гель с 4-12% SDS с конечным количеством фибриногена/фибрина, указанным в таблице 1. Затем белки подвергли гель-электрофорезу с помощью стандартных лабораторных методик. ДСН-ПААГ-электрофорез проводился при напряжении 125 Вольт до тех пор, пока фронт красителя не достиг нижней границы геля. После электрофореза белки перенесли на мембрану, связывающую белок (например, нитроцеллюлозную мембрану), с помощью стандартных лабораторных методик.

Для предотвращения неспецифического связывания после переноса мембрану подвергли инкубации в блокирующем растворе (например, растворе, содержащем казеин и/или моющее средство, что характерно для данной области). Затем нитроцеллюлозную мембрану промыли и подвергли инкубации при температуре окружающей среды в растворе моноклонального антитела (первичное антитело, [клон 1F7]) со специфической аффинностью к фибринопептиду A человеческого фибриногена.

Мембрану промыли буферным раствором для отмывания антител (например, физиологическим раствором, содержащим моющее средство, что характерно для данной области) для удаления любого несвязанного антитела, после чего подвергли инкубации в растворе вторичного антитела (доступных в продаже козьих антител к IgG мыши, конъюгированных с щелочной фосфатазой) и снова промыли буферным раствором для отмывания антител для удаления любого несвязанного антитела.

Визуализацию характера исчерченности выполняли путем инкубации нитроцеллюлозной мембраны в доступном в продаже субстрате для щелочной фосфатазы.

На фиг. 3 представлено изображение нитроцеллюлозной мембраны после выполнения процедуры вестерн-блоттинга. В таблице 1 представлены данные о дорожках при вестерн-блоттинге исследованных образцов, а также результаты исследования с интерпретацией характера исчерченности.

ТАБЛИЦА 1
Информация о загрузке исследуемых образцов при вестерн-блоттинге и результаты Дорожка Описание образца Количество загруженного фибриногена/
фибрина (мкг) Интерпретация результатов 1 Молекулярная масса маркера Нет данных Нет данных 2 Очищенный фибриноген 1,25 Фибриноген, обнаруженный в образце очищенного фибриногена 3 Фибриногенсодержащий компонент фибринового герметика 1,25 Фибриноген, обнаруженный в образце фибриногенсодержащего компонента фибринового герметика 4 Фибриногенсодержащий компонент фибринового герметика 0,63 Фибриноген, обнаруженный в образце фибриногенсодержащего компонента фибринового герметика 5 Свернувшийся фибриновый герметик 0,50 В образце свернувшегося фибринового герметика фибриноген не обнаружен 6 Порошок, экстрагированный из обезвоженной фибриногенсодержащей прокладки 2,13 Фибриноген, обнаруженный в порошке, экстрагированном из образца обезвоженной фибриногенсодержащей прокладки 7 Гидратированный порошок, экстрагированный из фибриногенсодержащей прокладки 2,13 В гидратированном порошке, экстрагированном из образца фибриногенсодержащей прокладки, фибриноген не обнаружен 8 Порошок, экстрагированный из фибриногенсодержащей прокладки после 1 часа пребывания во влажной среде 2,13 Фибриноген, обнаруженный в образце порошка, экстрагированного из фибриногенсодержащей прокладки после 1 часа пребывания во влажной среде 9 Порошок, экстрагированный из фибриногенсодержащей прокладки после 24 часов пребывания во влажной среде 2,13 Фибриноген, обнаруженный в образце порошка, экстрагированного из фибриногенсодержащей прокладки после 24 часов пребывания во влажной среде 10 Порошок, экстрагированный из частично свернувшейся фибриногенсодержащей прокладки 2,13 Промежуточный уровень фибриногена (сравнительно более слабый характер исчерченности), обнаруженного в образце порошка, экстрагированного из фибриногенсодержащей прокладки, которую подвергали воздействию ограниченного объема водной среды

Данные, представленные на фиг. 3 и в таблице 1, указывают на то, что фибриноген успешно обнаружили в образцах, содержащих образцы несвернувшегося фибриногена, т.е. фибриноген обнаружили в очищенном фибриногене (дорожка 2), фибриногенсодержащем компоненте доступного в продаже фибринового герметика (дорожки 3, 4), а также в экстрактах порошков обезвоженной и увлажненной фибриногенсодержащей прокладки (дорожки 6, 8, 9). Фибриноген не обнаружили в полностью свернувшихся образцах, т.е. в образце свернувшегося фибринового герметика (дорожка 5) и в гидратированном порошке, экстрагированном из фибриногенсодержащей прокладки (дорожка 7). Промежуточный уровень фибриногена (отразившийся в сравнительно более слабом характере исчерченности) обнаружили в порошке, экстрагированном из образцов фибриногенсодержащей прокладки, подвергшейся воздействию ограниченного объема водной среды (дорожка 10). Никакой существенной разницы в характере исчерченности между обезвоженными и увлажненными (25°C/60% относительной влажности, до 24 часов) экстрактами порошков фибриногенсодержащей прокладки не наблюдали, что указывает на то, что при данных условиях в фибриногенсодержащей прокладке не отмечали какого-либо существенного превращения фибриногена в фибрин.

После переноса белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану гель окрашивали кумасси синим, используя стандартные лабораторные методики для подтверждения присутствия белка на всех дорожках. Изображение геля, демонстрирующее детекцию белка на всех дорожках, представлено на фиг. 4. На дорожках, где при вестерн-блоттинге не обнаружили фибриноген, т.е. в свернувшемся фибриновом герметике (дорожка 5) и в порошке, экстрагированном из фибриногенсодержащей прокладки, которую подвергали полной гидратации (дорожка 7), были выявлены α-цепь и β-цепь фибриногена. На дорожках, где при вестерн-блоттинге обнаружили фибриноген, т.е. в очищенном фибриногене (дорожка 2), фибриногенсодержащем компоненте фибринового герметика (дорожки 3, 4) и порошке, экстрагированном из фибриногенсодержащей прокладки (дорожки 6, 8, 9), были выявлены Aα-цепь и Bβ-цепь фибриногена.

Пример 2. Иммунологический дот-блоттинг

На основе процедуры иммунологического дот-блоттинга было разработано экспресс-исследование для обнаружения фибриногена. Стадия гель-электрофореза, который является частью процедуры описанного выше вестерн-блоттинга, не выполняют; методика основана на том, что крупные белки, присутствующие в образце, адсорбируются на мембране, тогда как небольшие молекулы, такие как FpA, вымываются до начала обработки антителом к FpA. Затем выполняли аналогичную процедуру иммуноблоттинга в соответствии с описанием ниже.

Исследованные образцы пронумерованы в таблице 2. На нитроцеллюлозной мембране, связывающей белок, начертили матрицу с квадратами размером 1,5 см × 1,5 см. После растворения подходящий объем (например, 2 мкл) образца или контрольного материала нанесли в центр каждого квадрата. Образцу или контролю дали полностью высохнуть на мембране. Затем для предотвращения неспецифического связывания нитроцеллюлозную мембрану подвергли инкубации в блокирующем растворе.

Мембрану промыли и затем подвергли инкубации при температуре окружающей среды в растворе моноклонального антитела (первичное антитело, [клон 1F7]) со специфической аффинностью к части фибринопептида A человеческого фибриногена (аналогично процедуре вестерн-блоттинга, описанной выше); после этого ее промыли буферным раствором для удаления любого несвязанного антитела. Затем мембрану подвергли инкубации в растворе вторичного антитела в течение 1 часа (аналогично процедуре вестерн-блоттинга), а после этого промыли буферным раствором для удаления любого несвязанного антитела. После этого мембрану подвергали инкубации в присутствии доступного в продаже субстрата для щелочной фосфатазы (аналогично процедуре вестерн-блоттинга) до тех пор, пока пятна не стали достаточно интенсивными для визуализации (например, 5-30 минут); затем мембрану промыли для прекращения реакции.

После этого методом оптической денситометрии выполняли количественную оценку размера и интенсивности окрашенной зоны, а также оценивали взаимосвязь с концентрацией фибриногена.

На фиг. 5 представлено изображение нитроцеллюлозной мембраны после выполнения процедуры дот-блоттинга (цифры соответствуют номерам образцов в соответствии с нумерацией, указанной в таблице 2). В таблице 2 представлены описания образцов, количество загруженного белка фибриногена/фибрина, оптическая плотность окрашенных зон на мембране в соответствии с данными денситометрии и результаты исследования, интерпретирующие наблюдаемые структуры. Оптическая плотность выражается числом по шкале яркости в диапазоне от 0, что соответствует совершенно черному цвету (высокое содержание фибриногена), до 255, что соответствует белому цвету (отсутствие фибриногена).

ТАБЛИЦА 2
Информация о загрузке исследуемых образцов при дот-блоттинге и результаты Образец/контроль Количество загруженного фибриногена/фибрина (мкг) Оптическая плотность Результаты детекции 1. Буферный раствор для обработки образца 0 223 При использовании буферного раствора для обработки образца окрашивание не обнаружено 2. Холост. проба Нет данных 232 При использовании холостой пробы окрашивание не обнаружено 3. Гидратированный порошок, экстрагированный из фибриногенсодержащей прокладки 0,850 238 В экстракте порошка из полностью влажной и свернувшейся фибриногенсодержащей прокладки фибриноген не обнаружен 4. Гидратированный порошок, экстрагированный из фибриногенсодержащей прокладки 0,425 236 В экстракте порошка из полностью влажной и свернувшейся фибриногенсодержащей прокладки фибриноген не обнаружен 5. Гидратированный порошок, экстрагированный из фибриногенсодержащей прокладки 0,213 230 В экстракте порошка из полностью влажной и свернувшейся фибриногенсодержащей прокладки фибриноген не обнаружен 6. Экстракт порошка из обезвоженной фибриногенсодержащей прокладки 0,850 178 Фибриноген обнаружен 7. Экстракт порошка из обезвоженной фибриногенсодержащей прокладки 0,425 193 Фибриноген обнаружен 8. Экстракт порошка из обезвоженной фибриногенсодержащей прокладки 0,213 222 Фибриноген обнаружен 9. Экстракт порошка из обезвоженной фибриногенсодержащей прокладки 0,106 231 Фибриноген обнаружен 10. Экстракт порошка из обезвоженной фибриногенсодержащей прокладки 0,053 224 Фибриноген обнаружен 11. Порошок, экстрагированный из фибриногенсодержащей прокладки после 1 часа пребывания во влажной среде 0,425 185 Фибриноген обнаружен 12. Порошок, экстрагированный из фибриногенсодержащей прокладки после 24 часов пребывания во влажной среде 0,425 192 Фибриноген обнаружен 13. Порошок, экстрагированный из образцов частично свернувшейся фибриногенсодержащей прокладки 0,425 217 Фибриноген обнаружен 14. Порошок, экстрагированный из образцов полностью свернувшейся фибриногенсодержащей прокладки 0,425 233 При анализе полностью свернувшейся фибриногенсодержащей прокладки фибриноген не обнаружен 15. Холост. проба Нет данных 226 При использовании холостой пробы окрашивание не обнаружено

На фигуре 6 представлен график, демонстрирующий взаимосвязь между концентрациями фибриногена и интенсивностью окрашивания. Значения оптической плотности по шкале яркости на мембране для дот-блоттинга графически представили как логарифмическую функцию концентрации белка (фибриногена) в образце. Как показано в таблице 2, анализ образцов 6-9 выполняли с количеством загруженного фибриногена/фибрина в диапазоне от 0,850 до 0,106 мкг. Интенсивность окрашивания фибриногена была пропорциональна количеству фибриногена в образце (r²=0,96).

Анализ данных, представленных на фиг. 5-6 и в таблице 2, указывает на то, что интенсивность окрашивания фибриногена была пропорциональна количеству интактного фибриногена в образце. При использовании буферного раствора для обработки образца или холостой пробы (образцы 1, 2 и 15) не наблюдали существенного окрашивания; также фибриноген не обнаружили в гидратированном порошке, экстрагированном из фибриногенсодержащей прокладки, при подготовке которой биологический порошок подвергли полной гидратации (образцы 3-5), или при анализе полностью свернувшейся фибриногенсодержащей прокладки (образец 14). Фибриноген обнаружили в экстрактах порошка обезвоженной фибриногенсодержащей прокладки (образцы 6-10), в образцах фибриногенсодержащей прокладки, подвергавшейся воздействию влажности в течение 1 ч (образец 11) или 24 ч (образец 12), а также в порошке, экстрагированном из образца частично свернувшейся фибриногенсодержащей прокладки (образец 13).

Блок-схема способа

На фиг. 7 и 8 представлены блок-схемы обладающего признаками изобретения способа для вестерн-блоттинга и дот-блоттинга соответственно.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения способ детекции интактного фибриногена с помощью вестерн-блоттинга включает следующие стадии: a) растворение образца и ингибирование тромбина; b) выполнение ДСН-ПААГ-электрофореза; c) перенос образца на мембрану, связывающую белок; d) стадия блокирования; e) взаимодействие фибриногена, иммобилизированного на мембране, с первичным моноклональным антителом; f) стадия промывки для удаления несвязанного первичного антитела; g) взаимодействие моноклонального антитела с вторичным антителом, имеющим маркер; h) стадия промывки для удаления непрореагировавшего несвязанного вторичного антитела; и i) детекция количества интактного фибриногена путем определения количества маркера.

В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения способ детекции интактного фибриногена с помощью дот-блоттинга включает следующие стадии: a) растворение образца и ингибирование тромбина; b) нанесение образца на мембрану, связывающую белок; c) стадия блокирования; d) взаимодействие фибриногена, иммобилизированного на мембране, с первичным моноклональным антителом; e) стадия промывки для удаления несвязанного первичного антитела; f) взаимодействие моноклонального антитела с вторичным антителом, имеющим маркер; g) стадия промывки для удаления несвязанного вторичного антитела; и h) детекция количества интактного фибриногена посредством определения количества маркера.

Хотя в описанных выше примерах представлены некоторые варианты осуществления настоящего изобретения, их следует рассматривать не как ограничение объема настоящего изобретения, а как дополнительное средство для полного описания настоящего изобретения.

Группа изобретений относится к области биохимии и медицины и касается иммунологических способов детекции интактного фибриногена, включающих стадии: a) получения образца, содержащего по меньшей мере некоторое количество фибриногена, необязательно превращенного по меньшей мере частично в фибрин, и необязательно содержащего тромбин; b) растворения образца в растворе растворителя, который ингибирует активность тромбина; c) переноса/нанесения части указанного образца на мембрану, связывающую белок, после необязательного ДСН-ПААГ-электрофореза; d) взаимодействия фибриногена с первичным моноклональным антителом, способным связываться с фрагментом фибринопептида A или фрагментом фибринопептида В; и e) детекции количества интактного фибриногена в образце посредством определения количества связанного первичного моноклонального антитела. Группа изобретений включает также способы оценки эффективности или стабильности гемостатического устройства, включающие использование заявленных способов детекции интактного фибриногена. Группа изобретений обеспечивает использование заявленных способов в качестве диагностических или прогностических критериев с высокой точностью. 5 н. и 22 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 табл., 2 пр.

1. Способ детекции интактного фибриногена, включающий стадии:

a) получения образца, содержащего по меньшей мере один белок, представляющий собой фибриноген;

b) растворения образца в растворе растворителя, который ингибирует активность тромбина;

c) переноса части указанного образца в гель и выполнения электрофореза указанной части;

d) переноса фракции указанной части образца из указанного геля на мембрану, связывающую белок, и иммобилизации фибриногена на указанной мембране;

e) выполнения по меньшей мере одной стадии блокирования указанной мембраны;

f) взаимодействия фибриногена, иммобилизированного на указанной мембране, с первичным моноклональным антителом, способным связываться с фрагментом фибринопептида А или с фрагментом фибринопептида В, для образования комплекса фибриноген-антитело;

g) выполнения по меньшей мере одной стадии промывки указанной мембраны для удаления любого несвязанного первичного моноклонального антитела;

h) взаимодействия указанного моноклонального антитела, образовавшего комплекс фибриноген-антитело, с вторичным антителом, имеющим маркер;

i) выполнения по меньшей мере одной стадии промывки указанной мембраны для удаления любого несвязанного вторичного антитела, имеющего маркер; и

j) детекции количества интактного фибриногена в образце посредством определения количества маркера.

2. Способ по п. 1, в котором фибриноген превращен по меньшей мере частично в фибрин и образец содержит тромбин.

3. Способ по п. 1, в котором указанный образец содержит неизвестное количество интактного фибриногена.

4. Способ по п. 1, в котором указанный образец является твердым, жидким или полужидким веществом.

5. Способ по п. 1, в котором указанный образец содержит лиофилизированные фибриноген и тромбин.

6. Способ по п. 1, в котором указанный способ включает ДСН-ПААГ-электрофорез и вестерн-блоттинг.

7. Способ по п. 1, в котором указанное первичное моноклональное антитело, способное связываться с фрагментом фибринопептида А, является клоном 1F7.

8. Способ по п. 1, в котором указанное первичное моноклональное антитело способно связываться с фрагментом фибринопептида В на фибриногене.

9. Способ по п. 1, в котором указанное вторичное антитело, имеющее маркер, представляет собой козье антитело к IgG мыши, конъюгированное с щелочной фосфатазой.

10. Способ по п. 1, в котором указанную стадию детекции количества интактного фибриногена в образце посредством определения количества маркера выполняют путем инкубации мембраны, связывающей белок, с субстратом для щелочной фосфатазы.

11. Способ по п. 1, в котором указанный маркер представляет собой электрохимически определяемый маркер, колориметрически определяемый маркер, рентгенологически определяемый маркер, маркер, определяемый магнитным способом, или флуоресцентный маркер.

12. Способ оценки эффективности или стабильности гемостатического устройства, содержащего по меньшей мере один биологический компонент, который представляет собой фибриноген; причем способ включает детекцию уровня интактного фибриногена в образце, причем образец получен при изготовлении и/или хранении устройства с использованием способа детекции интактного фибриногена по п. 1, и сравнение указанного уровня с пороговым значением интактного фибриногена.

13. Способ детекции интактного фибриногена, включающий стадии:

a) получения образца, содержащего по меньшей мере один белок, представляющий собой фибриноген;

b) растворения образца в растворе растворителя, который ингибирует активность тромбина;

c) нанесения части указанного образца на мембрану, связывающую белок, и иммобилизации фибриногена на указанной мембране;

d) выполнения по меньшей мере одной стадии блокирования указанной мембраны и удаления фибринопептида А, отщепленного от фибриногена, содержащегося на указанной мембране;

e) взаимодействия фибриногена, иммобилизированного на указанной мембране, с первичным моноклональным антителом, способным связываться с фрагментом фибринопептида А или с фрагментом фибринопептида В, для образования комплекса фибриноген-антитело;

f) выполнения по меньшей мере одной стадии промывки указанной мембраны для удаления любого несвязанного первичного моноклонального антитела;

g) взаимодействия указанного моноклонального антитела, образовавшего комплекс фибриноген-антитело, с вторичным антителом, имеющим маркер;

h) выполнения по меньшей мере одной стадии промывки указанной мембраны для удаления любого несвязанного вторичного антитела, имеющего маркер; и

i) детекции количества интактного фибриногена в образце посредством определения количества маркера.

14. Способ по п. 13, в котором фибриноген превращен по меньшей мере частично в фибрин и образец содержит тромбин.

15. Способ по п. 13, в котором указанный образец содержит неизвестное количество интактного фибриногена.

16. Способ по п. 13, в котором указанный образец является твердым, жидким или полужидким веществом.

17. Способ по п. 13, в котором указанный образец содержит лиофилизированные фибриноген и тромбин.

18. Способ по п. 13, в котором указанное первичное моноклональное антитело, способное связываться с фрагментом фибринопептида А, является клоном 1F7.

19. Способ по п. 13, в котором указанное первичное моноклональное антитело способно связываться с фрагментом фибринопептида В на фибриногене.

20. Способ по п. 13, в котором указанное вторичное антитело, имеющее маркер, представляет собой козье антитело к IgG мыши, конъюгированное с щелочной фосфатазой.

21. Способ по п. 13, в котором указанную стадию детекции количества интактного фибриногена в образце выполняют посредством инкубации мембраны, связывающей белок, с субстратом для щелочной фосфатазы.

22. Способ по п. 13, в котором указанный маркер представляет собой электрохимически определяемый маркер, колориметрически определяемый маркер, рентгенологически определяемый маркер, маркер, определяемый магнитным способом, или флуоресцентный маркер.

23. Способ оценки эффективности или стабильности гемостатического устройства, содержащего по меньшей мере один биологический компонент, который представляет собой фибриноген; причем способ включает детекцию уровня интактного фибриногена в образце, причем образец получен при изготовлении и/или хранении устройства с использованием способа детекции интактного фибриногена по п. 13, и сравнение указанного уровня с пороговым значением интактного фибриногена.

24. Способ детекции интактного фибриногена, включающий стадии:

a) получения образца, содержащего по меньшей мере один белок, представляющий собой фибриноген;

b) растворения образца в растворе растворителя, который ингибирует активность тромбина;

c) переноса части указанного образца на мембрану, связывающую белок, и иммобилизации фибриногена на указанной мембране;

d) выполнения по меньшей мере одной стадии промывки и одной стадии блокирования указанной мембраны и удаления фибринопептида А, отщепленного от фибриногена, содержащегося на указанной мембране;

e) взаимодействия фибриногена, иммобилизированного на указанной мембране, с первичным моноклональным антителом, способным связываться с фрагментом фибринопептида А или с фрагментом фибринопептида В, для образования комплекса фибриноген-антитело; и

f) детекции количества интактного фибриногена в образце посредством определения количества первичного моноклонального антитела, образующего связанный комплекс фибриноген-антитело.

25. Способ по п. 24, в котором фибриноген превращен по меньшей мере частично в фибрин и образец содержит тромбин.

26. Способ по п. 24, в котором указанную стадию (f) детекции количества интактного фибриногена в образце выполняют стадиями:

a) выполнения по меньшей мере одной стадии промывки указанной мембраны для удаления любого несвязанного первичного моноклонального антитела;

b) взаимодействия указанного моноклонального антитела, образовавшего комплекс фибриноген-антитело, с вторичным антителом, имеющим маркер;

c) выполнения по меньшей мере одной стадии промывки указанной мембраны для удаления любого несвязанного вторичного антитела, имеющего маркер; и

d) детекции количества интактного фибриногена в образце посредством определения количества маркера.

27. Способ по п. 24, в котором указанное первичное моноклональное антитело конъюгировано с маркером, причем указанный маркер представляет собой электрохимически определяемый маркер, колориметрически определяемый маркер, рентгенологически определяемый маркер, маркер, определяемый магнитным способом, или флуоресцентный маркер, причем указанную стадию (f) детекции количества интактного фибриногена в образце выполняют посредством определения количества маркера.