СПОСОБ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ОТБОРА МОЛОЧНЫХ КОЗ Российский патент 2017 года по МПК A01K67/02 

Изобретение относится к области удовлетворения жизненных потребностей человека. Может быть использовано в области сельского хозяйства и ветеринарии при селекции сельскохозяйственных животных с целью проведения раннего отбора козлят для молочного животноводства, для принятия решения о целесообразности использования козлов-производителей.

Известен способ [1] отбора животных по признакам, наследуемым по механизму родительского импринтинга. Способ предусматривает анализ образца генетического материала, взятого от свиньи, на присутствие локуса количественных признаков (QTL), локализованного в ограниченном участке генетического материала (а именно, в хромосоме 2). Недостатком способа [1] является то, что он применим только для отбора свиней и неприменим для отбора коз. Из-за недостатка способ [1] имеет весьма ограниченную область применения.

Известен [2] способ определения генетического потенциала крупного рогатого скота (далее по тексту - КРС) по качеству молока. Недостатком способа [2] является то, что исследование проведено и способ применим только для КРС. Влияния специфических для КРС генов на показатели молочной продуктивности коз не подтверждено. Вследствие недостатка область применения [2] ограничена отбором КРС. Поэтому способ [2] не применим к мелкому рогатому скоту (далее по тексту - МРС), в том числе к козам.

Наиболее близким по существу заявляемого изобретения, прототипом, является [3]. Недостатком известного способа [3] является ограниченность анализируемой базы данных лишь одним геном. Из-за существенной ограниченности базы данных (количество анализируемых генов = 1) для анализа, результат применения прототипа не обладает удовлетворительной для практики животноводства достоверностью. Отбор животных на основе применения прототипа с малодостоверным результатом существенно ухудшает качество тестирования и последующего на основе тестирования отбора мелкого рогатого скота, в частности коз, с необходимыми качествами, например удойностью, жирностью молока и иными качественными характеристиками, например качества шерсти, морозоустойчивостью, устойчивостью к инфекционным заболеваниям.

Целью предлагаемого изобретения является повышение качества отбора особей животных, например козлят и козлов-производителей, обладающих необходимыми жизненными показателями и производимой ими продукции.

Цели достигают генетическим отбором молочных коз для получения приплода с необходимыми свойствами. Отбор заключается в заборе и транспортировке в лабораторию образца биологической жидкости животного, выделении и анализе ДНК, установлении генотипов тестируемых особей по однонуклеотидному полиморфизму генов POU1F1, BLG и weaver с последующим рестрикционным анализом, разделении и визуализации продуктов ПЦР-ПДРФ и отборе животного с сочетанием генотипов генов weaver/BLG/POU1F1 для дальнейшего использования в молочном производстве и селекционной работе.

Заявляемое изобретение осуществляют, например, следующим путем.

Для получения приплода с необходимыми свойствами выбирают животных для последующего получения их приплода. Выбирают стадо животных. Поголовье животных из стада последовательно или одновременно тестируют, например до 100 голов - единовременно, более 100 голов - поэтапно.

Для тестирования от каждой особи, без предварительной подготовки животного, в чистую пробирку, например пробирки Eppendorf, получают образец биологической жидкости, например крови или слюны, в количестве 1000 мкл. Полученный образец транспортируют в лабораторию. При наличии возможности образец анализируют после получения. При потребности анализа множества образцов пробы замораживают, например при температуре минус 20°С. Далее из образцов известным способом [4] выделяют ДНК.

Выделение ДНК

ДНК из венозной крови выделяют, например с помощью набора реактивов ДНК экспресс (производства НПФ «Литех», г. Москва) согласно протоколу фирмы-производителя. К образцу крови в пробирке Eppendorf добавляют равный объем лизирующего раствора и пробирку помещают в программируемый твердотельный/водяной термостат с температурой плюс 98°С на 15 мин. После этого образец крови в пробирке Eppendorf центрифугируют, например на 14000 об/мин, в течение 5 мин. По завершении центрифугирования получают препарат ДНК в лизирующем растворе. Полученный препарат ДНК можно хранить в течение длительного времени, например при температуре минус 20°С, в течение до 5 лет.

Далее образец ДНК анализируют, например с использованием полимеразной цепной реакции (далее по тексту - ПЦР) [5].

Постановка ПЦР

Анализ образцов ДНК для установления генотипов тестируемых особей по однонуклеотидному полиморфизму генов POU1F1, бета-лактоглобулина (далее по тексту - BLG), и Taql-полиморфизму гена weaver проводят методом ПЦР на программируемом термоциклере со встроенной функцией нагрева крышки (например - MyCycler, BioRad, США), с использованием олигонуклеотидных праймеров с последующим ферментативным анализом.

При использовании амплификатора без функции нагрева крышки во избежание испарения реакционной смеси на поверхность реакционной смеси наносят 25 мкл минерального масла, например вазелиновое.

ПЦР проводят в пробирках типа Eppendorf объемом 0.2 мл или 0.6 мл для постановки ПЦР. Общий объем реакционной смеси составляет 20 мкл, содержит однократный буферный раствор для используемого фермента, 25 мМ MgCl₂; 1 единицу фермента Taq-ДНК полимеразы; 0.25 мМ дезоксинуклеотидтрифосфатов, 0.5 мкМ каждого из праймеров, 25 нг раствора анализируемой ДНК.

Условия ПЦР (температура отжига), используемые эндонуклеазы рестрикции и размеры получаемых в ходе ПЦР и последующего рестрикционного анализа фрагментов приведены в Таблице 1.

Разделение и визуализация продуктов ПЦР

Качество продуктов ПЦР оценивают с помощью метода гель-электрофореза [6], например 3% агарозный гель, трис-боратный буферный раствор для электрофореза, напряженность поля 15 V/см, длительность 45 мин). Далее продукты ПЦР подвергают энзиматической модификации, например разрезанию при помощи ферментов участков ДНК в определенной нуклеотидной последовательности (далее по тексту - ПДРФ-анализ) с помощью специфичных для каждого из исследуемых генов эндонуклеаз рестрикции согласно условиям фирмы-производителя (ООО «СибЭнзим», г. Новосибирск).

Продукты ПДРФ-анализа для выявления соответствующих генотипов анализируют известным методом электрофореза в агарозном геле [5], например с 3% агарозы, в течение 40 мин, в режиме постоянного тока 75 мА. Объем вносимых проб 25 мкл. В качестве буферного раствора для электрофореза используют, например, трис-боратный буфер. Для определения молекулярного веса продуктов рестрикции используют маркерную лестницу ДНК-фрагментов определенного размера, например от 100 до 10000 пар нуклеотидов (реагенты производства ООО «СибЭнзим», г. Новосибирск). Результат электрофоретического разделения и последующего определения размера ДНК-фрагментов по одному из исследуемых полиморфизмов, например полиморфизм Taql гена weaver показан на Фиг. 1, где дорожка 1 - маркер молекулярного веса pUC19/Mspl; дорожки 3, 5, 7, 9, 11, 12 - генотип Т1Т1; дорожки 2, 4, 6, 10, 13-15 - генотип Т1Т2, дорожка 8 - генотип Т2Т2.

Определяют генотипы по каждому гену (согласно Таблице 1) и сочетания генотипов по трем генам weaver, BLG, POU1F1, возможные варианты сочетания которых приведены в Таблице 2.

Сравнивают выявленные у животных сопряженные генотипы с генотипами, определяющими повышенное или пониженное содержание жира и белка в молоке согласно данным, приведенным в Таблице 3.

Опытами заявителя установлено, что при выявлении у одного животного сочетания генотипов T2T2/S1S2/D1D2 и T2T2/S2S2/D1D1 качество, например жирность и белковость, козьего молока наивысшая. При выявлении у конкретного животного такого сочетания генотипов принимают решение о целесообразности использования этого животного с данным сочетанием генотипов в молочном производстве и селекционной работе.

Предлагаемое изобретение имеет существенные преимущества при отборе МРС, например - коз для производства молока. По заявляемому способу анализ выполняют с использованием трех генов, то есть с использованием втрое большей, по сравнению с прототипом, базы данных. Известно [7], что увеличение объема анализируемой информации повышает достоверность и точность результатов анализа. Сказанное справедливо и в отношении заявляемого изобретения, когда отбор животных выполняют на основе анализа трех генов (weaver/ BLG/ POU1F1), тогда как по прототипу аналогичный отбор производят на основе анализа одного гена (weaver). Применение заявляемого способа в области сельскохозяйственной деятельности существенно повысит достоверность результатов отбора и будет способствовать повышению рентабельности содержания отобранных животных, например используемых для получения неаллергенного козьего молока для детей.

Генетический потенциал МРС оценивают путем ДНК-тестирования (ПЦР-ПДРФ метод) генотипов животных по Ddel-маркеру гена POU1F1, Sacll-маркеру гена BLG и Taql-маркеру гена weaver и выявлении сопряженных генотипов, определяющих повышенное или пониженное содержание жира и белка в молоке, согласно разработанному перечню генотипов. Применение заявляемого способа отбора животных позволяет проводить ранний отбор перспективных козлят для молочного животноводства и принимать решение о целесообразности использования козлов-производителей до появления у них лактирующего потомства, а также осуществлять подбор пар в селекционной работе по улучшению молочных пород.

Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.

Способ отбора имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками данного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.

Заявленное техническое решение можно осуществить в сельскохозяйственном производстве, в деятельности ветеринарных организаций, в животноводстве посредством использования известных стандартных технических устройств и оборудования. Это соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям.

Использованные источники

1. Патент РФ RU №2262229. Способ отбора животных по признакам, наследуемым по механизму родительского импринтинга. МПК А0167/02, C12Q 1/68. Приоритет от 16.12.1998. Опубл. 20.10.2005.

2. Патент РФ RU №2317704. Способ определения генетического потенциала крупного рогатого скота по качеству молока. МПК А0167/02, C12Q 1/68. Приоритет от 06.06.2006. Опубл. 27.02.2008.

3. Патент CN 101871006 А. Приоритет от 05.02.2010. Опубл. 27.10.2010. Single nucleotide polymorphism of weaver gene of milk goats and detection method thereof.

4. Boom R. Rapid and simple method of purification nucleic acid / Sol CJ, Salimans МММ, Jansen CJ, Wertheim van Dillen PME, Van Der Noorda J. et al. // J Clin Microbiol - 1990. - Vol. 25. - P. 495-503.

5. Аскарова A.H. ПЦР в анализе генома. - Казань, 2000. - 33 с.

6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Пер. с англ. яз. под ред. А.А. Баева и К.Г. Скрябина - М., Мир, 1984. - 479 с.

7. Вейр Б. Анализ генетических данных. - М.: Мир, 1995. - 400 с.

Изобретение относится к области селекции сельскохозяйственных животных. Способ предусматривает забор и транспортировку в лабораторию образца биологической жидкости животного, выделение и анализ ДНК, установление генотипов тестируемых особей по однонуклеотидному полиморфизму генов POU1F1, BLG и weaver с последующим рестрикционным анализом, разделением и визуализацией продуктов ПЦР-ПДРФ и отборе животного с сочетанием генотипов генов weaver/BLG/POU1F1 для дальнейшего использования в молочном производстве и селекционной работе. Применение заявляемого способа в области сельскохозяйственной деятельности существенно повышает достоверность результатов отбора. 1 ил., 3 табл.

Способ генетического отбора молочных коз для получения приплода с необходимыми свойствами, заключающийся в заборе и транспортировке в лабораторию образца биологической жидкости животного, выделении и анализе ДНК, установлении генотипов тестируемых особей по однонуклеотидному полиморфизму генов weaver, BLG и POU1F1 с последующим рестрикционным анализом, разделении и визуализации продуктов ПЦР-ПДРФ и отборе животного с сочетанием генотипов генов weaver/BLG/POU1F1 для дальнейшего использования в молочном производстве и селекционной работе.