Способ определения и прогнозирования молочной продуктивности крупного рогатого скота любого возраста Российский патент 2023 года по МПК A01K67/00 

Изобретение относится к селекции и генетике крупного рогатого скота и предназначено для раннего отбора животных с целью увеличения молочной продуктивности и увеличения сроков хозяйственно-полезного использования в популяциях крупного рогатого скота.

Известен способ прогнозирования молочной продуктивности у телок крупного рогатого скота мясного направления по комплексному генотипу GH + тиреоглобулин [1]. Недостатком этого метода является возраст животного в три месяца необходимый для взятия пробы, в нашем способе такого ограничения нет.

Известен способ определения продуктивности сельскохозяйственных животных по полиморфизму в гене LEP 528 С/Т. Способ предназначен для раннего отбора животных с целью увеличения массы тела в популяциях крупного рогатого скота мясного направления [2]. Недостатком этого метода является оценка животных только по одному полиморфизму одного гена, в нашем способе рассматривается как комплексное влияние генов (соматотропин + лептин) так и несколько полиморфных вариантов одного из генов SNP R25C и A80V лептина. Так же существенным отличием является ориентированность способа на скот молочного направления.

Предлагаемый способ основан на использовании комплексного генотипа SNP полиморфизмов гена соматотропина и лептина, связанных с повышенной молочной продуктивностью, для прогнозирования формирования хозяйственно-полезных признаков. Генетический потенциал КРС.

Способ позволяет проводить ранний отбор перспективных животных для молочного животноводства и принимать решение о целесообразности использования особей с желательными генотипами для осуществления селекционного процесса.

Данный способ включает в себя выделение ДНК из крови с дальнейшим генотипированием коров с помощью полимеразной цепной реакции с использованием праймеров и рестриктаз и определение комплексного генотипа

Материалы и методы

1.1 Выделение ДНК

Для исследований были отобраны пробы венозной крови у коров голштинизированной черно-пестрой породы, третьей лактации и старше, принадлежащие сельскохозяйственным предприятиям Свердловской области АО «Каменское» (93 головы) и АО «Агрофирма «Патруши» (60 голов). Эти животные исследованы по SNP GH и LEP (R25C, A80V). Полученные данные позволили разделить животных по комплексному генотипу. Были проанализированы физиологические и продуктивные показатели у генотипированных животных.

ДНК из цельной крови животных (n=157) выделяли при помощи набора Экстран-1 (Синтол, Россия) согласно инструкции.

Качество выделенной ДНК оценивали с помощью электрофореза в 3% агарозном геле.

1.2 Генотипирование

Реакционная смесь для проведения ПЦР-ПДРФ для SNP A80V была объемом 20 мкл и включала в себя 10×SE-буфер - 2 мкл, dNTP - 2,5 мкл, прямые и обратные праймеры - 0,6 мкл, Taq ДНК полимеразу - 0,7 мкл, деионизированную воду - 9,6 мкл и 4 мкл ДНК.

Для амплификации фрагментов генов лептина A80V использовали следующие праймеры:

A80V F: CAAGCAGGAAATAGGGAGTCATGG

A80V R: CTGGTGAGGATCTGTTGGTAGGTC

Размер ПЦР продукта 424 п.н.

Программа для ПЦР-ПДРФ генов лептина A80V: шаг 1 - 95°С - 3,5 мин, шаг 2 - 95°С - 30с, 65°С - 20с и 72°С - 30 с, количество циклов 27.

Затем следовал этап подготовки рестрикционной смеси объемом 20 мкл. В неё входят: амплификат - 5 мкл, буфер для рестрикции - 2 мкл, рестриктаза PspEI - 0,2 мкл, вода деионизированная - 12,8 мкл.

Рестрикционную смесь по полиморфизмам A80V выдерживали в термостате при температуре 37°С в течение 3-х часов.

В дальнейшем вносили продукты рестрикции с красителем в лунки 3% агарозного геля и помещали в камеру горизонтального электрофореза на 1 час с напряжением 100V. Результаты оценивали при помощи трансиллюминатора Gel Doc (BioRad, США).

Реакционная смесь для проведения ПЦР-ПДРФ реакции для SNP R25C была объемом 26,8 мкл и включала в себя 10×SE-буфер - 4 мкл, dNTP - 5 мкл, прямые и обратные праймеры - 1,4 мкл, Taq ДНК полимеразу - 1,4 мкл, деионизированную воду - 9,6 мкл и 4 мкл ДНК.

Для амплификации фрагментов генов лептина R25C использовали следующие праймеры:

R25C F: CCAGGGAGTGCCTTTCATTA

R25C R: GGTGTCATCCTGGACCTTCC

Размер ПЦР продукта 305 п.н.

Программа для ПЦР-ПДРФ генов лептина R25C: шаг 1- 95°С - 3,5 мин, шаг 2 - 95°С - 30с, 65°С - 20с и 72°С - 30 с, количество циклов 32.

Затем следовал этап подготовки рестрикционной смеси объемом 20 мкл. В неё входят: амплификат - 5 мкл, буфер для рестрикции - 2 мкл, рестриктаза Bsp13I - 0,2 мкл, вода деионизированная - 12,8 мкл.

Рестрикционную смесь по полиморфизму R25C выдерживали в термостате при температуре 50°С в течение 3-х часов. В дальнейшем вносили продукты рестрикции с красителем в лунки 3% агарозного геля и помещали в камеру горизонтального электрофореза на 1 час с напряжением 100V. Результаты оценивали при помощи трансиллюминатора Gel Doc.

Также в ходе исследования изучен полиморфизм (LV) гена соматотропина (GH), определенный с помощью ПЦР-ПДРФ анализа.

Для амплификации фрагментов гена соматотропина LV использовали следующие праймеры:

GH5F: 5′-GCT-GCT-CCT-GAG-GGC-CCT-TC-3′

GH5R: 5′-CAT-GAC-CCT-CAG-GTA-CGT-CTC-CG-3′

Реакционная смесь для проведения ПЦР-ПДРФ, объемом 25 мкл включала в себя 10×SE-буфер - 2,5 мкл, dNTP - 2,5 мкл, прямые и обратные праймеры - 0,6 мкл, Taq ДНК полимеразу - 0,7 мкл, деионизированную воду - 13,1 мкл и 5 мкл ДНК.

ПЦР программа: шаг 1- 95°С - 3 мин, шаг 2 - 95°С - 30с, 65°С - 30с и 72°С - 30 с, количество циклов 30, шаг 3 -72°С - 5мин.

В состав рестрикционной смеси объемом 27 мкл входят: амплификат -17 мкл, буфер для рестрикции -2,5 мкл, рестриктаза AluI - 1,5 мкл, вода деионизированная - 6 мкл.

Рестрикционную смесь по полиморфизму LV выдерживали в термостате при температуре 37°С в течение 3-х часов. Затем вносили продукты рестрикции с красителем в лунки 3% агарозного геля и помещали в камеру горизонтального электрофореза на 1 час с напряжением 100V. Результаты фиксировали при помощи трансиллюминатора Gel Doc.

Частоту встречаемости генотипов определяли по формуле:

p=n/N,

где р - частота определенного генотипа,

n - количество особей, имеющих определенный генотип, N - число особей.

Частоту отдельных аллелей определяли по формуле:

А=(2AA+AB): 2n B=(2BB+AB): 2n,

где А - частота аллеля A, B - частота аллеля В, n - общее число аллелей.

По закону Харди-Вайнберга рассчитывали ожидаемые результаты частот генотипов в исследуемой популяции. Полученные результаты в ходе научных исследований обработаны биометрическим методом с использованием стандартных программ.

Результаты были обработаны с использование методов вариационной статистики с использованием программного обеспечения IBM SPSS STATISTICS 23 (IBM, США).

При обработке результатов рассчитывали стандартную отклонения (Sx) и ошибку среднего значения (S).

Результаты

При исследовании связи комплексных генотипов с показателями удоя коров выявлено, что наивысший удой за первую, третью, последнюю законченную лактацию и пожизненный удой наблюдается у коров с комплексным генотипом LVRRAA, разница составляет 1100-2600 кг, а по пожизненной продуктивности доходит до 11000 кг.

Животные с комплексным генотипом LVRRAA имеют наивысший удой за дойный день, составляющий 25-35 кг.

Обобщая вышеизложенное можно сделать вывод о том, что животные, имеющие комплексный генотип LVRRAA более полно реализуют генетический потенциал и могут быть использованы для увеличения объемов производства молочной продукции. Так же важно определение комплексных генотипов у быков-производителей при их закреплении в стадах для ведения направленной селекции.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ определения и прогнозирования продуктивности сельскохозяйственных животных по комплексному генотипу соматотропин (GH) + лептин (R25C, A80V), включающий выделение ДНК из крови с дальнейшим генотипированием крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции с использованием праймеров и рестриктаз. Изобретение предназначено для раннего отбора животных с целью увеличения молочной продуктивности и увеличения сроков хозяйственно-полезного использования в популяциях крупного рогатого скота.

Способ определения и прогнозирования молочной продуктивности крупного рогатого скота любого возраста по комплексному генотипу соматотропин (GH) + лептин (R25C, A80V), включающий в себя выделение ДНК из крови с дальнейшим генотипированием коров с помощью полимеразной цепной реакции с использованием различных праймеров и рестриктаз и отбор животных носителей комплексного генотипа LVRRAA.