Способ лечения глаукомной оптической нейропатии посредством трансплантации 3D-клеточной культуры мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток лимба Российский патент 2017 года по МПК A61F9/00 A61K35/28 A61P27/02 

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии и трансплантологии, а также к области биологии, а именно клеточной биологии, и может быть использовано для лечения глаукомной оптической нейропатии.

В настоящее время все больше литературных данных накапливается о том, что первичная открытоугольная глаукома - мультифакториальное нейродегенеративное заболевание, характеризующееся прогрессирующей оптиконейропатией, патологическими изменениями полей зрения и гибелью ганглиозных клеток сетчатки (ГКС).

Известно, что внутриглазное давление (ВГД) является наиболее существенным и статистически значимым фактором риска возникновения глаукомных изменений. Существующие на сегодня методы лечения глаукомы направлены на снижение ВГД, однако в ряде крупных многоцентровых исследований убедительно показано, что глаукомный процесс продолжает прогрессировать и на фоне стабилизированного ВГД. Результатом этих исследований стала разработка новых подходов к лечению и профилактике прогрессирования глаукомного нейродегенеративного процесса.

На сегодня известно, что основным патофизиологическим механизмом гибели ГКС при глаукомной оптической нейропатии является апоптоз. Среди факторов апоптоза ГКС особо выделяют нарушение аксонального транспорта нейротрофических факторов, обусловленное компрессией аксонов ганглиозных клеток сетчатки ламинарными перегородками решетчатой пластинки (Волков В.В. Глаукома при псевдонормальном давлении: Руководство для врачей. - М.: Медицина, 2001. - с. 114-122). Имеются данные о том, что при эмбриональном развитии сетчатки выживают те ганглиозные клетки, аксоны которых контактируют с латеральными коленчатыми телами, где происходит стимуляция ГКС нейротрофическими факторами (Rait J. The prevention of ganglion cell suicide in primary open angle glaucoma // Asian J Ophthalmol. - 1998. - Vol. 1, №2. - P 3-8; Guerin M.B., McKernan D.P., O'Brien C.J., Cotter T.G. Retinal ganglion cells: dying to survive // Int. J. Dev. Biol. - 2006. - Vol. 50, №2. - P. 665-674). ГКС, которые не получили стимуляцию вышеназванными факторами, подвергаются апоптозу.

Нейротрофические факторы (НТФ) представляют собой семейство крупных полипептидов, регулирующих выживание, развитие и функцию нейронов. По данным литературы наиболее значимыми факторами в патогенезе глаукомной оптической нейропатии (ГОН) являются фактор роста нервов (ФРН) и нейротрофический фактор головного мозга (НФГМ)

Известен способ нейропротекции, заключающийся в применении глазных капель, содержащих ФРН (Патент № ЕР 1161256 В1) и НФГМ (Патент № US 2012258916 А1).

Было обнаружено, что применение ФРН в форме глазных капель, в концентрации от 200 до 500 мкг/мл, увеличивает уровень нейротрофина во всех тканях глаза, в том числе и в сетчатке, что было подтверждено методами авторадиографии и иммуноферментного анализа (Lambiase A., Tirassa Р., Micera A., et al. Pharmacokinetics of Conjunctivally Applied Nerve Growth Factor in the Retina and Optic Nerve of Adult Rat // Investigative ophthalmology & visual science. - 2005. - Vol. 46, №10. - P. 3800-3806). Офтальмологические препараты, содержащие НФГМ в концентрациях, по меньшей мере, 15 мкг/мкл предотвращают изменения в сетчатке, связанные с повышенным внутриглазным давлением на модели глаукомы. Возможность применения НТФ в виде глазных капель имеет значительное преимущество по сравнению с инвазивными методами лечения, требующими неоднократных повторных инъекций, что значительно повышает риск таких осложнений, как поражение анатомических структур глаза, инфекционные осложнения, кровоизлияния, перфорация глаза, что приводит к нецелесообразности терапии из-за инверсии соотношения риск / польза.

Однако капельная система доставки характеризуется противоречивыми результатами, обусловленными необходимостью длительных, многократных инсталляций, и зависит от комплаентности пациента.

В настоящее время в регенеративной медицине изучены свойства мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК) и широко разрабатываются подходы к их применению в лечении различных заболеваний. Так установлено, что ММСК имеют высокий уровень секреторной активности и способны продуцировать НТФ. Кроме того, известно, что ММСК лимба имеют фенотип, сходный с ММСК костного мозга, и могут использоваться в клинике при лечении заболеваний глаз.

Известен способ лечения атрофии зрительного нерва посредством трансплантации аутологичных стволовых клеток, описанный в патенте РФ №2428956, при котором аутологичный клеточный материал в виде суспензии мононуклеаров костного мозга, содержащей ММСК пациента в концентрации от 100000 до 1000000 клеток в мл раствора-носителя, вводят парабульбарно в объеме 1 мл, в субтеноновое пространство - 1-4 мл, в субарахноидальное пространство - 0,1-0,3 мл. При этом для достижения терапевтического эффекта необходимо многократное дробное введение через каждые 1-2 часа до 10 раз в сутки. Таким образом, данная процедура является достаточно трудоемким процессом.

Ближайшим аналогом того же назначения является способ лечения атрофии зрительного нерва посредством трансплантации аутологичных стволовых клеток, описанный в патенте РФ №2375019, при котором выполняют витрэктомию по стандартной методике, удаляют заднюю гиалоидную мембрану, с помощью интравитреального ножа с носовой стороны диска зрительного нерва выполняют радиальную оптическую нейротомию, в образовавшийся канал с помощью иглы 32G вводят 0,05 мл 2D культуру аутологичных ММСК костного мозга пациента. Однако недостатками этого метода является техническая сложность и высокий риск осложнений, нивелирующих ожидаемый положительный эффект терапии.

Одним из недостатков ближайшего аналога является использование 2D-клеточных культур. Известно, что при 2D-культивировании естественные условия клеточного микроокружения воспроизводятся не в полной мере, что оказывает отрицательное влияние на их биологические функции (Baraniak P.R., McDevitt Т.С. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential // Cell Tissue Res. - 2012. - Vol. 347. - №3. - P. 701-711). Культивирование ММСК в 2D может изменить их нормальное физиологическое поведение и привести к потере пролиферативной активности и возможности дифференцироваться с течением времени (Park Е., Patel A.N. Changes in the expression pattern of mesenchymal and pluripotent markers in human adipose-derived stem cells // Cell Biol Int. - 2010. - Vol. 34. - P. 979-984; Baer P.C., Griesche N., Luttmann W., et al. Human adipose-derived mesenchymal stem cells in vitro: evaluation of an optimal expansion medium preserving sternness // Cytotherapy. - 2010. - Vol. 12. - P. 96-106).

Сохранение межклеточных взаимодействий является одним из самых важных условий для полноценного функционирования клеток, так как с помощью его поддерживается высокая степень стабильности функционирования генома, то есть поддерживается нормальный уровень жизнедеятельности клеток. Наиболее эффективной и максимально приближенной по свойствам и организации к естественной тканевой системе может быть система 3D-культуры, представленная сферическими конгломератами.

Установлено, что культивирование в 3D-системах способствует сохранению фенотипа клеток и поддержанию их потенциала к дифференцировке и секреции, что обеспечивает длительную и стабильную выработку нейротрофических факторов.

Задачей изобретения является разработка способа лечения глаукомной оптической нейропатии посредством трансплантации 3D-клеточной культуры ММСК лимба.

Техническим результатом предполагаемого изобретения является улучшение и стабилизация зрительных функций, противоапоптотическое действие, предупреждение вовлечения в процесс апоптоза интактных ГКС за счет длительной и стабильной секреции нейротрофических факторов 3D-клеточными сфероидами ММСК.

Технический результат достигается тем, что в способе лечения глаукомной оптической нейропатии, включающем использование ММСК, согласно изобретению ММСК получают из аллогенных фрагментов лимба кадаверных глаз человека, создают их них 3D-клеточные сфероиды, которые в дозе от 250 до 500 сфероидов, по 1000 клеток в каждом сфероиде в 1 мл стерильного 0,9% NaCl вводят парабульбарно однократно.

Концентрация сфероидов составляет от 250 до 500 сфероидов, что обусловлено технологией создания сфероидов (256 лунок в агарозном планшете), а также зависит от степени выраженности глаукомной оптической нейропатии. Более высокая концентрация сфероидов является нежелательной ввиду возможного проапоптотического действия чрезмерно высокого уровня НТФ.

Количество клеток в сфероиде не может быть более 1000 клеток, так как известно, что сфероиды из большего количества клеток имеют низкую жизнеспособность и не может быть менее 1000 клеток из-за незначительного терапевтического эффекта.

3D-клеточная культура ММСК, полученная из аллогенных фрагментов лимба кадаверных глаз человека, способна секретировать нейротрофические факторы, в частности НТФ и НФГМ на протяжении длительного времени.

Изобретение осуществляется следующим образом. Из глазных яблок доноров-трупов выделяют фрагменты лимба по предложенной ранее методике (Патент РФ №2475218 от 20.02.2013 г.). Изолированные кусочки лимба переносят в культуральные флаконы с площадью дна 25 мм², культивирование осуществляют в полной ростовой среде, содержащей DMEM/F12, L-глутамин, HEPES, пенициллин, стрептомицин, амфотерицин В, инсулин, дексаметазон и фетальную бычью сыворотку при следующем соотношении компонентов на 1000 мл раствора: HEPES одномолярный 22,0 мл, L-глутамин 0,58 г, пенициллин 250000 единиц, стрептомицин 200,0 мг, амфотерицин В 1,4 мг, инсулин «Хумулин регулар» 0,88 мл, дексаметазон с молярностью 10^-8 - 1,1 мл, эмбриональная телячья сыворотка 100,0 мл, DMEM/F12 (1:1) остальное.

Культивирование осуществляют при стандартных условиях (5% CO₂, 37°С), смену среды проводят каждые 3 дня. Сфероиды создают из культуры ММСК четвертого пассажа с использованием 256-луночных агарозных планшетов (3D Petri Dishes, Microtissue, США), посевная концентрация - 1000 клеток в лунке. Культивирование сфероидов осуществляют в течение 7 дней, что способствует нарастанию секреции ФРН и НФГМ. Перед использованием сфероиды ММСК отмывают в среде Хэнкса. Полученные сфероиды в концентрациях от 250 до 500 сфероидов (по 1000 клеток в сфероиде) в 1 мл стерильного 0,9% NaCl вводят парабульбарно однократно.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Пациент В., 65 лет.

Диагноз: OD - первичная открытоугольная IIa оперированная глаукома; OS - первичная открытоугольная IIa глаукома.

Из анамнеза: страдает в течение 7 лет, 2 года назад проведено оперативное лечение: OD - микроинвазивная непроникающая глубокая склерэктомия. В настоящее время получает консервативную терапию.

Status localis: острота зрения: OD 0,1 с коррекцией sph+1,5д=0,5; OS 0,1 с коррекцией sph+2,0д=0,4; поле зрения: OD - сужение поля зрения с носовой стороны на 20°; OS - сужение поля зрения с носовой стороны на 25°; фовеальная чувствительность: OU 24 дБ.

OU - передний отрезок субатрофия радужки, начальные помутнения в кортикальных слоях хрусталика; глазное дно: OU - диск зрительного нерва бледно-розового цвета деколорирован с височной стороны, глаукоматозная экскавация - 0,7.

Пациент пролечен по предложенному способу, при этом ему ввели 500 сфероидов, по 1000 клеток в каждом сфероиде.

Острота зрения через 1 месяц после лечения:

OD 0,2 с коррекцией sph+1,5д=0,6; OS 0,2 с коррекцией sph+2,0д=0,5; поле зрения: OD - сужение поля зрения с носовой стороны на 15°; OS - сужение поля зрения с носовой стороны на 20°; фовеальная чувствительность: OU 28 дБ.

Пример 2. Пациент С., 59 лет.

Диагноз: OU Первичная открытоугольная IIa глаукома.

Из анамнеза: страдает в течение 5 лет. В настоящее время получает консервативную терапию.

Status localis: острота зрения: OD 0,1 с коррекцией sph - 2,25д=0,4; OS 0,1 с коррекцией sph - 2,0д=0,6; поле зрения: OD - сужение поля зрения с носовой стороны на 20°; OS - сужение поля зрения с носовой стороны на 15°; фовеальная чувствительность: OU 27 дБ. Передний отрезок без патологии.

Глазное дно: OU диск зрительного нерва бледно-розового цвета деколорирован с височной стороны, глаукоматозная экскавация 0,6.

Пациент пролечен по предложенному способу, при этом ему ввели 250 сфероидов, по 1000 клеток в каждом сфероиде.

Острота зрения через 1 месяц после лечения:

OD 0,1 с коррекцией sph - 2,25д=0,5; OS с коррекцией 0,1 sph - 2,0д=0,6; поле зрения: OD - сужение поля зрения с носовой стороны на 15°; OS - сужение поля зрения с носовой стороны на 10°; фовеальная чувствительность: OU 29 дБ.

Срок наблюдения составил 12 месяцев. Полученные результаты во всех случаях оставались стабильными на протяжении всего периода наблюдения.

Таким образом, данные примеры наглядно иллюстрируют высокую эффективность предлагаемого способа лечения. Данный способ прост в применении и может выполняться в широкой сети офтальмологических клиник.

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии и трансплантологии, и может быть использовано для лечения глаукомной оптической нейропатии. Способ включает использование мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК), которые получают из аллогенных фрагментов лимба кадаверных глаз человека. Из этих клеток создают 3D-клеточные сфероиды по 1000 клеток в каждом сфероиде. В дозе от 250 до 500 сфероидов в 1 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида вводят парабульбарно однократно. Способ позволяет улучшить и стабилизировать зрительные функции, оказать противоапоптотическое действие, предупредить вовлечение в процесс апоптоза интактных ганглиозных клеток сетчатки за счет длительной и стабильной секреции нейротрофических факторов 3D-клеточными сфероидами ММСК. 2 пр.

Способ лечения глаукомной оптической нейропатии, включающий использование мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК), отличающийся тем, что ММСК получают из аллогенных фрагментов лимба кадаверных глаз человека, создают их них 3D-клеточные сфероиды, которые в дозе от 250 до 500 сфероидов, по 1000 клеток в каждом сфероиде, в 1 мл стерильного 0,9% NaCl вводят парабульбарно однократно.