Штамм Nocardia coeliaca ARC12 ВКПМ Ас-1990 - деструктор нефти и нефтепродуктов Российский патент 2017 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 C12R1/01 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии, экологии, охране окружающей среды и представляет собой новый бактериальный штамм Nocardia coeliaca ARC 12 ВКПМ Ас-1990, обладающий способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов. Штамм может быть использован для очистки акваторий водоемов, береговой линии, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, при температуре от +4 до +20°C и солености 30 г/л.

Уровень техники

Известен штамм Rhodococcus sp.-деструктор нефтяных углеводородов (патент РФ №2518349, приоритет 11.04.2013, опубл. 10.06.2014). Данный штамм показал высокую степень деструкции углеводородов при температуре +30°C. Однако данный штамм не способен производить утилизацию углеводородов при низких температурах.

Известен штамм Pseudomonas alcaligenes В-1 (патент РФ 2133770, приоритет 25.03.1998, опубл. 27.07.1999). Недостатком данного штамма также является то, что он не утилизирует нефтезагрязнения при низких температурах.

Известен штамм Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 (патент РФ №2523584, приоритет 2013-03-27, опубл. 20.07.2014). Штамм может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур от +4 до +37°C. Недостатком штамма является то, что он не способен утилизировать нефтезагрязнения при высокой солености воды до 30 г/л.

Наиболее близким аналогом является штамм Rhodococcus erythropolis, депонирован под регистрационным номером ВКМ Ac-2613D (патент РФ 2553336 20.08.2013, опубл. 10.06.2015). Штамм используется для очистки пресноводных, солоноватоводных и морских объектов и донных отложений. Микроорганизм обеспечивает деструкцию нефти в водных объектах при температуре от +2 до +25°C и солености до 2,7%. Недостатком изобретения является то, что штамм утилизирует углеводороды в условиях, богатых по питательным веществам (в состав среды входит пептон 5 г/л и сахароза 15 г/л). В реальных условиях утилизации углеводородных загрязнений количество питательных веществ значительно снижено.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является получение бактериального штамма, способного осуществлять деструкцию нефти и нефтепродуктов при температуре от +4 до +20°C и солености 30 г/л.

Поставленная задача решается тем, что получен штамм Nocardia coeliaca ARC 12 ВКПМ Ас-1990, способный осуществлять деструкцию нефти и нефтепродуктов, который может быть использован для очистки акваторий водоемов, береговой линии, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, при температуре от +4 до +20°C и солености 30 г/л.

Штамм выделен из портовой зоны города Мурманск 3 июня 2014 года. Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика (ВКПМ, Москва, 1-й Дорожный пр., д. 1) под регистрационным номером ARC 12 ВКПМ АС-1990.

Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик, а также на основании изучения последовательности гена 16S рРНК.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки

Колонии светло-розовые, округлые, блестящие, гладкие, выпуклые, с ровным краем, однородной структуры, мягкой консистенции, размеры около 1,5-2,5 мм. Неподвижные вытянутые палочки, размером 0,5-1,2 мкм. Окраска по Граму положительная.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм растет при температуре от +4 до +20°C, в аэробных условиях. Оптимум роста от +4 до +10°C. Растет при pH 4,0-8,0. Растет на плотных и жидких питательных средах с содержанием NaCl 30 г/л. Способен расти в жидкой среде с углеводородами в качестве единственного источника углерода и энергии.

Штамм поддерживается пересевами 1 раз в 14 дней на плотной питательной среде modPCA следующего состава (г/л): K₂HPO₄ - 1,5; KH₂PO₄ - 0,75; MgSO₄ - 1,0; (NH₄)₂SO₄ - 4,0; NaCl - 30; гидролизат казеина - 5,0; дрожжевой экстракт - 2,5; D-глюкоза - 1,0; агар - 14; pH – 7,0, или жидкой питательной среде №1 следующего состава (г/л): K₂HPO₄ - 1,5; KH₂PO₄ - 0,75; MgSO₄ - 1,0; (NH₄)₂SO₄ - 4,0; NaCl - 30; гидролизат казеина - 0,5; дрожжевой экстракт - 0,1; pH – 7,0. В жидкой питательной среде в качестве углеводородного субстрата использовали смесь товарной нефти Возейского месторождения (плотность 37,9° API, сернистость 0,66%, характеризуется как тяжелая, вязкая, с высоким содержанием смол и асфальтенов) и дизельного топлива в соотношении 1:1 по объему.

Также штамм может храниться при +6±2°C в лиофилизированном состоянии с использованием сухого обезжиренного молока в качестве защитной среды.

Осуществление изобретения

Пример 1. Выделение и культивирование Nocardia coeliaca ARC 12 ВКПМ Ас-1990

Штамм выделен из образцов грунта береговой линии порта города Мурманск 3 июня 2014 года. Образец грунта массой 5±2 г вносили в 100 мл питательной среды №1. Культивирование проводили при температуре +4°C, на орбитальном шейкере (130 об/мин). Время культивирования 7 суток. Полученную накопительную культуру вносили в количестве 10 мл в 100 мл питательной среды №1. Было проведено не менее 30 пассажей накопительной культуры. Выделение штамма из накопительной культуры проводили на среде modPCA, полученную чистую культуру далее культивировали на среде №1.

Пример 2. Исследование нефтеокисляющей активности Nocardia coeliaca ARC 12 ВКПМ Ас-1990

Штамм, выращенный на жидкой питательной среде №1, вносили в качестве инокулята в 100 мл питательной среды №1. В качестве контроля была использована питательная среда без добавления культуры. После проведения культивирования при температуре +4°C, 130 об/мин в течение 7 суток проводилась экстракция углеводородов гексаном согласно ГОСТ 31953-2012, хроматографическая оценка убыли углеводородов проводилась на приборе , оснащенном микрокапиллярной колонкой DB-1ms, газ-носитель - гелий, расход газа - 39 мл/мин, детектор - ПИД, температура детектора - 320°C. Измерения проводили в условиях температурного градиента в термостате от 60 до 320°C. Результаты анализа были обработаны при помощи программного обеспечения OpenLAB CDS (Agilent).

Суммарная убыль для среднекипящей и высококипящей фракции составляла не менее 50% за 7 суток культивирования при температуре +4°C и солености среды 30 г/л.

Пример 3. Способ производства препарата на основе Nocardia coeliaca ARC 12 ВКПМ Ас-1990

Штамм Nocardia coeliaca ARC 12 ВКПМ Ас-1990, выращенный на среде PCA при температуре +4°C в течение 7 суток, вносят в жидкую питательную среду следующего состава (г/л): K₂HPO₄ - 1,5; KH₂PO₄ - 0,75; MgSO₄ - 1,0; (NH₄)₂SO₄ - 4,0; NaCl - 30; гидролизат казеина - 5,0; дрожжевой экстракт - 2,5; D-глюкоза - 1,0; pH – 7,0. Далее культивируют при температуре +10°C на орбитальном шейкере в течение 3 суток до конечного титра 10⁹ КОЕ/мл. В полученную суспензию клеток в питательной среде вносят защитную среду (сухое обезжиренное молоко в количестве 10%). Далее полученную жидкую биомассу замораживают и обезвоживают методом лиофилизации. Полученную сухую биомассу штамма Nocardia coeliaca ARC 12 ВКПМ Ас-1990 смешивают с питательным премиксом (сухое обезжиренное молоко) в соотношении 1:10.

Таким образом, получен штамм, способный осуществлять деструкцию нефти и нефтепродуктов при температуре +4°C и солености 30 г/л.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Nocardia coeliaca ARC 12 обладает нефтеокисляющей способностью. Штамм Nocardia coeliaca депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ Ас-1990. Штамм может быть использован для очистки акваторий водоемов, береговой линии, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, при температуре от +4 до +20°C и солености 30 г/л. Изобретение позволяет повысить степень деструкции нефти в водоемах с повышенной соленостью при широких диапазонах температур. 3 пр.

Штамм Nocardia coeliaca ARC 12 ВКПМ Ac-1990 для деструкции нефти и нефтепродуктов в водной среде при температуре от +4 до +20°С и солености 30 г/л.