ШТАММ БАКТЕРИЙ Exiguobacterium mexicanum - ДЕСТРУКТОР НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2014 года по МПК C12N1/26 C02F3/34 B09C1/10 C12R1/01 C02F101/32 

Изобретение относится к области микробиологии. Предложен штамм бактерий Exiguobacterium mexicanum ВКПМ B-11011, обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат). Штамм может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур от +4 до +37°C.

Уровень техники

Известны штаммы Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus luteus, Micrococcus flavus (1. Клюшникова T.M., Смирнова Г.Ф., Куберская С.Л., Слабоспицкая А.Т., Залевский B.C., Касаткина Т.П., Елисеева Г.С. А.с. SU 1493666-А1. Способ очистки подсланцевых сточных вод от нефтепродуктов. Заявка 4280617, 09.07.1987. Опубл. 15.07.1989), Flavobacterium tirrennicum (2. Новожилова М.И., Попова Л.Е., Недоводиева Т.П., Каламкарова Л.И. А.с. SU 1409594. Штамм бактерий FLaVoBacreRIUM тIRReNIcUм, используемый для очистки подсланцевых и промышленных сточных вод от нефти и нефтепродуктов. Заявка 4066152, 24.03.1986. Опубл. 15.07.1988), которые могут разлагать углеводороды нефти. Недостатком вышеперечисленных штаммов является то, что они осуществляют деструкцию нефтепродуктов только в воде и не способны осуществлять очистку почвы от нефти.

Известны штаммы Pseudomonas putida 36 (3. Дядечко В.Н., Тосстокорова Л.Е., Морозова Т.Н. Штамм @ @ 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктова. А.с. СССР 1076446. Заявка 3474745, 22.07.1982. Опубл. 28.02.1984); Acinetronacter sp.НВ-1 (4. Жиркова Н.А., Холоденко В.П. ШТАММ БАКТЕРИЙ ACINETOBACTER SPECIES, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ. Патент РФ 2077579. Заявка 9404331, 06.12.1994. Опубл. 20.04.1997); Acinetronacter sp.JN-2 (5. Ушков С.Б., Ильинская Н.В. ШТАММ ACINETOBACTER SPECIES, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ. Патент РФ 2064017. Заявка 93009595, 23.02.1993. Опубл. 20.07.1996); Pseudomonas alcaligenes Е7 (6. Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А. ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS ALCALIGENES Е7, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ. Патент РФ 2134723. Заявка 98105707, 25.03.1998. Опубл. 20.08.1999) и Pseudomonas alcaligenes B-1 (7. Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А., Кобелев B.C., Акимова Н.А. ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS ALCALIGENES В-1, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ. Патент РФ 2133770. Заявка 98105709, 25.03.1998. Опубл. 27.07.1999). Недостатком штаммов является то, что они утилизируют нефть при сравнительно высоких температурах.

Большую эффективность в условиях низких положительных температур показал штамм Rhodococcus erythroplis Е-15 (8. Коронелли Т.В., Аракелян Э.И., Комарова Т.И., Ильинский В.В. СПОСОБ ОЧИСТКИ ПОЧВ ОТ НЕФТЯНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ. Патент РФ 2019527. Заявка 93017464, 3.04.1993. Опубл. 15.09.1994), но процесс биодеградации нефти протекает медленно и только при добавлении нитроаммофоски или нитроаммофоски и натриевой селитры.

В качестве прототипа служит штамм бактерий «Bacillus subtilis Колыма 7/2» (9. Неустроев М.П., Тарабукина Н.П., Неустроев М.М., Сазонов Н.Н., Парникова С.И., Степанова A.M. СПОСОБ ОЧИСТКИ МЕРЗЛОТНЫХ ПОЧВ ОТ НЕФТИ СПОРООБРАЗУЮЩИМИ БАКТЕРИЯМИ BACILLUS SUBTILIS. Патент РФ 2446900. Заявка 2010129158, 13.07.1010. Опубл. 13.07.2010), обладающий способностью снижать концентрацию нефти до 0,48%, то есть уровень нефти от 135143 мг/кг снижается до 645 мг/кг в течение 3 месяцев летнего периода. Однако штамм осуществляет деградацию только нефти и только в почве, в условиях модельного эксперимента и не способен осуществлять очистку воды от нефти и утилизировать нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат), в том числе в условиях широкого диапазона температур от +4 до +37°C.

Задачей изобретения является расширение номенклатуры штаммов, обладающих способностью утилизировать как нефть, так и нефтепродукты в относительно короткие сроки, в широком диапазоне температур от +4 до +37°C, которые можно использовать для очистки почв и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат).

Осуществление изобретения

Поставленная задача решена тем, что получен штамм Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 - деструктор нефти и нефтепродуктов, обладающий утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам, который может быть использован для очистки почв, загрязненных нефтью в широком диапазоне температур (от +4 до +37°C).

Штамм бактерий Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 выделен из нефтезагрязненной почвы линейной части магистрального нефтепровода «Восточная Сибирь - Тихий Океан» 4,038 км шлейфа «НПС - 21 «Сковородино» Пункт налива нефти», Амурская область, Сковородинский район, 13 июня 2010 года.

Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика (ВКПМ) (Москва, 1-й Дорожный пр., д.1) под регистрационным номером ВКПМ В-11011.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Морфолого-культуральные признаки.

Грамположительные палочки, размером 0,8-1,0 мкм. Подвижные. С перитрихиально расположенными жгутиками. В мазках располагаются скоплениями и попарно. Факультативные анаэробы. Спор и капсул не образуют.

На мясопептонном агаре (мас.%: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2) формируют влажные, грязно-желтого цвета колонии округлой формы. Через 1-2 суток рельеф колоний изменяется. Колонии становятся суховатыми, края неровные.

На среде Сабуро (мас.%: гидролизат рыбной муки - 1,0; панкреатический гидролизат казеина - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,2; натрия фосфат однозамещенный - 0,2; D-глюкоза - 4,0; агар - 1,0; вода дистиллированная - остальное; pH 6,0±3) образует крупные колонии желтовато-оранжевого цвета, максимальный диаметр которых составляет 0,5 см.

В мясопептонном бульоне (мас.%: ферментативный пептон - 1,0, натрий хлористый - 0,5, вода мясная - остальное; pH 7,0-7,2) вызывает диффузное помутнение.

На минеральной среде Мюнца с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, бензин) следующего состава: (мас.%) KNO₃ - 0,4; MgSO₄·7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂НРO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; агар - 2,0; нефть или нефтепродукты - 1,0; вода дистиллированная - остальное, pH - 7,2, в виде непрозрачных матовых грязно-желтых колоний, диаметром 0,1-0,3 см.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм растет при температуре от +4 до +37°C, лучше в аэробных условиях. В анаэробных условиях штамм сразу не погибает, но развивается медленнее. Оптимум роста от +20 до +30°C. Растет при pH 6,0-8,0. Растет в солевом бульоне с добавлением 0,1-2,0% NaCl. Штамм каталаза положителен, оксидаза отрицателен. Метаболизм окислительного типа. Биохимическая активность выражена слабо. Не усваивает многоатомные спирты. Слабо ферментирует глюкозу и сахарозу, другие углеводы не ферментирует. Не усваивает лизин и орнитин. Не потребляет цитрат и малонат натрия. Желатин не гидролизует. Крахмал не разлагает. Индоло отрицателен. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная. Фенилаланиндезоксаминаза отрицательная. Ферментирует бета-галактозидазу.

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный, не фитотоксичный (проверка проведена на белых мышах и семенах высших растений).

Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 10-14 дней) на скошенном мясопептонном агаре или на минеральной среде с нефтью и нефтепродуктами или храниться в лиофилизированном состоянии в ампулах при +4°C.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Выделение и культивирование штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011

Штамм Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 выделен из нефтезагрязненной почвы линейной части магистрального нефтепровода «Восточная Сибирь - Тихий Океан» 4,038 км шлейфа «НПС - 21 «Сковородино» Пункт налива нефти», Амурская область, Сковородинский район, 13 июня 2010 года.

Культивирование штамма проводили в минеральной среде Мюнца следующего состава (г/дм³): KNO₃ - 4,0; MgSO₄·7H₂O - 0,8; NaCl - 1,0; K₂HPO₄ - 1,4; KH₂PO₄ - 0,6; агар - 20,0; вода дистиллированная - 1,0 дм³; pH среды - 7,2. Для чего 1,0 г нефтезагрязненной почвы с вышеуказанного объекта вносили в 250 мл минеральной среды Мюнца. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали нефть, которую вносили в среду Мюнца в количестве 1000 мг на 1,0 дм³ среды. Инкубация проводилась в термостатируемых качалочных условиях на установке «УВМТ-12-250» при 200 об/мин и температуре +29±1°C. Рост бактерий наблюдали уже через 7-10 дней инкубации по образованию мутной беловатой эмульсии и исчезновению маслянистых пятен нефти.

Чистая культура бактерий была получена путем культивирования при вышеперечисленных условиях и многократных пересевов (более 10) накопительной культуры на чашки Петри с агаром из гидролизата рыбной муки (ГРМ-агар) с добавлением 1% глюкозы. Далее посевы инкубировали в стационарных условиях в термостате при +30°C. Через 48 часов на поверхности ГРМ-агара наблюдали появление грязно-желтых влажных колоний, которые по культурально-морфологическим и биохимическим признакам, а также по результатам проведенного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и ключевых фенотипических признаков согласно таксономическим описаниям, приведенным в Определителе Берги (10. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Book Review Int. J. of Syst. Bact.; July 1985, p.408), идентифицированы как штамм Exiguobacterium mexicanum. Пример 2. Приготовление бактериального изолята и препарата на основе клеток штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011

Изолированные колонии, полученные в примере 1, пересевают на скошенный мясопептонный агар и инкубируют 48 часов при температуре +30°C. Клетки смывают 0,9% раствором NaCl и готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см, с концентрацией 110 микробных клеток/см по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.

Для получения препарата готовят жидкую минеральную среду следующего состава (мас.%): KNO₃ - 0,4; MgSO₄·7H₂O - 008; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; агар - 2,0; вода дистиллированная - остальное; pH среды - 7,2 и культивируют в колбах на качалке в течение 48 часов, при температуре 29±1°C. Получают жидкую мутноватую смесь клеток штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 с титром не менее 1 млрд клеток/см³, которую можно использовать в качестве препарата для обработки почвы, загрязненной нефтью и нефтепродуктами.

Пример 3. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011

Клетки штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 со скошенного мясопептонного агара смывают 0,9% раствором NaCl, готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см³, с концентрацией 1×10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.

Полученный бактериальный изолят штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 культивируют в водной среде с минеральным составом, близким по составу к среде Мюнца (пример 1).

В колбочки объемом 200,0 см³ вносят по 100,0 см³ готовой минеральной среды и 1000 мг нефти. Колбы засевают клетками штамма до концентрации 1-109 клеток/ см³. В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтью и без бактерий для определения общих (естественных) потерь. Опыт проводят в трех повторностях. Колбы культивируют при температурах +4°C; +20°C; +30°C и +37°C в течение 7 суток.

Биодеградацию нефти и нефтепродуктов определяют спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-025» (11. ФР. 1.31.2007.03234 МВИ 01.02.117 Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-025»).

Данные эксперимента показывают, что в водной среде с минеральными компонентами предлагаемый штамм уже на 7-е сутки при температуре +4°C утилизирует 6,38-13,34% нефти и нефтепродуктов; при температуре +20°C - 24,62-54,60%; при температуре +30°C - 51,9-69,25%; при температуре +37°C - 57,78-81,46%, в зависимости от типа ксенобиотика (таблица 1).

Таблица 1 Степень утилизации нефти и нефтепродуктов штаммом Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 через 7 суток культивирования Вариант опыта t°C Ксенобиотик, мг/дм³ Срок +4 +20 +30 +37 Нефть до опыта 1000,0 1000,0 1000,0 1000,0 после опыта 936,2 502,4 481,0 422,2 % деструкции 6,38 49,76 51,9 57,78 Дизельное топливо до опыта 1000,0 1000,0 1000,0 1000,0 после опыта 902,0 454,8 333,3 185,4 % деструкции 9,8 54,60 66,67 81,46 Масло моторное до опыта 1000,0 1000,0 1000,0 1000,0 после опыта 866,6 753,8 400,6 398,2 % деструкции 13,34 24,62 59,94 60,18 Газовый конденсат до опыта 1000,0 1000,0 1000,0 1000,0 после опыта 923,6 533,9 307,5 296,6 % деструкции 7,64 46,61 69,25 70,36

Пример 4. Очистка воды от нефти с помощью клеток штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011

В эксикатор объемом 5,0 дм³ вносят 3,0 дм³ водопроводной воды, отстоявшейся в течение суток при комнатной температуре. В воду добавляют 30000 мг сырой неочищенной нефти и 30,0 см³ бактериального изолята штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 (по примеру 1), содержащего 1,0·10⁹ клеток/см³ суспензии. В качестве контроля используют воду в количестве 3,0 дм³ с добавлением 30000 мг нефти и без внесения микробной суспензии бактериального изолята.

Таблица 2 Деструкция нефти в воде штаммом Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 Вариант опыта Количество нефти до внесения клеток штамма, мг Количество нефти через 2 месяца после внесения клеток штамма, г Степень утилизации нефти, % Вода+нефть+клетки штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 30000 13443 55,19 Вода+нефть 30000 29334,6 2,21

Эксперимент проводят в течение 2-х месяцев, поддерживая температуру воды в интервале от +15 до +20°C.

Полученные результаты (таблица 2) показали, что в воде деструкция нефти под влиянием штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 за 2 месяца составила 55,19%. Деструкция в контрольной емкости существенно не изменилась.

Пример 5. Очистка почвы от нефти с помощью клеток штамма бактерий Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011

Эксперимент по очистке мерзлотной почвы, загрязненной нефтью, проведен в естественных условиях. Средняя температура почвы, в течение всего периода постановки эксперимента, на горизонте 20 см составляла +8°C; на горизонте 10 см - +14°C.

Препарат, полученный по примеру 3, содержащий культуру клеток штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011, с титром не менее 1 млрд клеток/см³ вносят в почву, загрязненную нефтью из расчета 1 литр препарата на 1 м³ нефтезагрязненной почвы. Почву тщательно перемешивают с помощью лопаты и экспонируют в естественных условиях в течение 2 месяцев.

Содержание нефтепродуктов в почве определяют гравиметрическим методом в соответствии с РД 52.18.647-2003. Методические указания определения массовой доли нефтепродуктов в почвах. Методика измерений гравиметрическим методом.

Таблица 3 Динамика деструкции нефти в почве, обработанной препаратом на основе штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 Вариант опыта Содержание нефти до внесения штамма, мг/кг Содержание нефти через 2 месяца после внесения штамма, мг/кг Деструкция нефти за 2 месяца, % Почва+нефть+клетки штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 34675 4517 86,97 Почва+нефть 13771 12762 7,32

Результаты исследований (таблица 3) показывают, что предлагаемый штамм Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 в течение 2 месяцев, при средней температуре почвы от +8 до +14°C, осуществляет деструкцию нефти на 86,97%, в то время как естественные потери нефти в мерзлотной почве, не обработанной препаратом, составили 7,32% (таблица 3).

Технико-экономическая эффективность

Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма является то, что он обладает высокой утилизирующей способностью по отношению как к нефти, так и к нефтепродуктам в относительно короткие сроки (от 7 суток до 2-х месяцев), в широком диапазоне температур от +4 до +37°C и может быть использован как для очистки почв, так и для очистки воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат).

Изобретение относится к области микробиологии. Предложен штамм бактерий Exiguobacterium mexicanum ВКПМ B-11011, обладающий способностью быстро утилизировать нефть, дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат. Штамм может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур от +4 до +37°C. 3 табл., 5 пр.

Штамм бактерий Exiguobacterium mexicanum - деструктор нефти и нефтепродуктов, депонированный под регистрационным номером ВКПМ B-11011.