ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS ALCALIGENES B-1, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 1999 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12N1/20 C12R1/38 

Изобретение относится к области микробиологии и касается получения нового штамма бактерий, который может быть использован для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.

Известен штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa РАО, содержащий плазмиды Cam, Oct, Nah, Sal, которые утилизируют отдельные углеводороды из состава нефти (патент США N 3813316, кл. 195-28, 1974 г.). Недостатком его является нестабильность и потеря плазмид из клеток бактерий.

Известны штаммы Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus luteus. Micrococcus flavus (авт. св. SU N 1493666-A1, 1987 г.), Flavobactenum tirrenmcum(авт. св. SU N 1409594, 1988 г.), которые могут разлагать углеводороды нефти. Недостатком вышеперечисленных штаммов является то, что они осуществляют деструкцию нефтепродуктов только в воде и не способны осуществлять очистку почвы от нефти.

Известны штаммы Acinetobacter sp. НВ-1 (патент RU N 2077579, 1994 г.) и Acinetobacter sp. JN-2 (патент RU 2064017, 1993). Недостатком штаммов является то, что они утилизируют нефть только при высоких температурах.

Наиболее близким к предлагаемому является штамм бактерий Pseudomonas putida 36 (авт. св. СССР N 1076446, С 12 N 15/00, 1984 г.), обладающий высокими характеристиками по биодеградации нефти и нефтепродуктов. Однако недостатком этого штамма является то, что он утилизирует нефтепродукты лишь на 30 сутки при сравнительно высокой температуре (28 - 30^oC).

Задачей изобретения является получение штамма бактерий, обладающего высокой утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам в относительно короткие сроки в различных диапазонах температур, который может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтепродуктами и солями тяжелых металлов.

Предлагаемый штамм Pseudomonas alcaligenes B-l выделен из нефтезагрязненной почвы Архангельской области. Штамм депонирован Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов, коллекционный номер ВКПМ В-7529.

Предлагаемый штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Грамотрицательные подвижные палочки 2-3 х 0,5 мкм, имеют зеленый флюоресцирующий пигмент. На мясо-пептонном агаре (МПА) образуются плоские, прозрачные колонии диаметром до 5 мм. В мясо-пептонном бульоне (МПБ) растет в виде пленки и равномерного помутнения.

Культура растет на минеральной среде, используя в качестве единственного источника углерода нефть, нефтепродукты и отдельные углеводороды нефти.

Физиолого-биохимические признаки. Аэроб, оксидазоположительный, каталазоположительный, растет в температурном диапазоне от 10 до 41^oC, оптимум 28^oC. Источником углерода служат ацетат, цитрат, сукцинат, аланин, аргинин. Аргининдигидролаза есть, денитрификация отсутствует, не восстанавливает нитраты, гидролизует желатин, но не крахмал и поли -β- оксибутират. В дополнительных факторах роста не нуждается. Фенилаланин не дезаминирует, уреазной активностью не обладает, растет на среде Симмонса, есть лецитиназа.

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный (проверка проведена на белых мышах).

Генетические особенности. Культура устойчива к стрептомицину, полимиксину, пенициллину, рифампицину. Устойчива к ионам тяжелых металлов: Mn (II), Pb, Zn, Mo, Fe - 100 мг/л, Ni - 10 мг/л, Cr (IV), Cr (VII) - 50 мкг/л.

Условия хранения: в лиофилизированном виде в ампулах при 4^oC. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 2 недели) на минеральной среде 8E с нефтью и нефтепродуктами, а также на полноценной среде.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Pseudomonas alcaligenes В-1 выращивают на минеральной среде 8E следующего состава, г/л: (NH₄)₂HPO₄,- 0,5; KH₂PO₄ - 0,7; NaCl - 0,5; MgS0₄•7H₂O - 0,8; дистиллированная вода - 1 л; pH 7,2. В качестве единственного источника углерода добавляют 1% ксенобиотика. В колбочки на 100 мл вносят по 30 мл минеральной среды и отдельно в каждую колбочку 300 мг нефти, мазута и керосина. Колбочки засевают клетками предлагаемого штамма до концентрации 1•10⁷ кл/мл. Аналогично засевают колбочки с отдельно взятым нефтепродуктом клетками штамма P. putida 36. В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтепродуктом и без бактерий для определения общих (естественных) потерь. Опыт проводят в трех повторностях. Колбы культивируют на качалке при 200 об/мин, 28^oC в течение 10 дней. Биодеградацию определяют на газовом хромотографе. Данные эксперимента представлены в таблице (см. в конце описания) и показывают, что предлагаемый штамм уже на пятый день при 28^oC утилизирует нефть, мазут и керосин соответственно на 51,0%, 35,5%, 83,0%.

Пример 2. Предлагаемый штамм выращивают аналогично примеру 1, только культивирование проводят при 20^oC. Результаты представлены в таблице.

Пример 3. В колбочки на 100 мл вносят по 30 мл минеральной среды 8E и 1 % смеси углеводородов нефти (нафталин, тетрадекан, пентадекан, гексадецен, фенилдекан, пристан). Колбы инфицируют исследуемой культурой в концентрации 1•10⁷ кл/мл. Контрольную колбу оставляют неинфицированной. Культивирование проводят на качалке при 200 об/мин, 20^oC в течение 5 дней. Обработку результатов проводят на газовом хроматографе. Результаты показывают, что биодеградация указанных углеводородов прошла на 83,3%, 55,5%, 60,4%, 59,0%, 71,0% и 65,6% соответственно.

Пример 4. В колбы на 100 мл вносят по 30 мл минеральной среды E8, 300 мл нефти, 10 мг/л солей Mn, Pb, Zn, Mo, Fe, Ni и Cr - 50 мкг/л и клетки предлагаемого штамма до концентрации 1•10⁷ кл/мл. Контролем служит колба, в которую вносят нефть и клетки бактерий. Опыт проводят в трех повторностях. Культивируют колбы на качалке при 28^oC при 200 об/мин в течение 5 дней. Результаты опыта показывают, что в колбе с солями металлов и без них клетки предлагаемого штамма утилизируют нефть на 51%.

Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма является то, что он на пятые сутки утилизирует нефть, мазут и керосин, а также углеводороды нефти на 51 - 83% при температуре 20 - 28^oC. Штамм устойчив к ионам тяжелых металлов: Mn, Pb, Zn, Mo, Fe, Ni, Cr, что расширяет диапазон его применения при очистке территорий от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.

Выделен новый штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes В-1 из нефтезагрязненной почвы Архангельской области. Штамм депонирован в ВКПМ под N В-7529. Данный штамм утилизирует нефть, мазут, керосин, нафталин, пентадекан, тетрадекан, гексадецен, фенилдекан, пристан уже на 5 день при 20-30^oС. Штамм устойчив к ионам тяжелых металлов: Mn, Pb Zn, Mo, Fe, Ni, Cr. Штамм эффективно осуществляет биодеградацию углеводородов в широком диапазоне концентраций. 1 табл.

Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes В-1, депонирован в ВКПМ В-7529, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.