ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ РАКА Российский патент 2017 года по МПК C07K16/30 C12P21/08 C12N15/09 A61P35/00 A61K39/395 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новому применению антитела против CAPRIN-1 или его фрагмента в качестве лекарственного средства, такого как терапевтическое и/или профилактическое средство против рака.

Уровень техники

Рак является первой лидирующей причиной смертности. Указанное заболевание в настоящее время, главным образом, лечат, используя хирургическое вмешательство в сочетании с лучевой терапией и/или химиотерапией. Несмотря на разработку новых хирургических приемов и открытие новых противораковых средств в последние годы, существующее лечение раковой опухоли дает недостаточно хорошие результаты, за исключением некоторых типов раковой опухоли. В связи с недавними успехами в молекулярной биологии или иммунологии раковых опухолей были идентифицированы антитела, которые специфично взаимодействуют с раковой опухолью, раковые антигены, которые распознаются цитотоксическими T-клетками, гены, кодирующие такие раковые антигены и тому подобное, что привело к повышению вероятности разработки специфичной терапии раковых опухолей, нацеленной на раковые антигены (непатентная литература 1).

Для снижения неблагоприятной реакции на противораковую терапию желательно, чтобы пептиды, полипептиды или белки, распознаваемые в качестве антигенов раковой опухоли, почти не присутствовали в нормальных клетках, но присутствовали специфично в раковых клетках. В 1991 году Boon с соавторами (Ludwig Institute for Cancer Research, Belgium) выделили антиген меланомы человека MAGE1, узнаваемый CD8-позитивными T-клетками, способом клонирования кДНК на основе экспрессии с использованием аутологичных линий раковых клеток и реактивных по отношению к опухоли T-клеток (непатентная литература 2). Впоследствии появилось сообщение о способе SEREX (серологическая идентификация антигенов посредством основанного на экспрессии рекомбинантов клонирования), который включает в себя способ основанного на экспрессии клонирования генов для идентификации опухолевых антигенов, узнаваемых антителами, которые продуцируются in vivo в ответ на аутологичную раковую опухоль у пациента с раковой опухолью (непатентная литература 3 и патентная литература 1). Согласно такому способу были выделены некоторые раковые антигены, которые практически не экспрессируются в нормальных клетках, но специфично экспрессируются в раковой опухоли (непатентная литература 4-9). Кроме того, основанная на использовании части ракового антигена в качестве мишени клеточная терапия с использованием иммуноцитов, специфично взаимодействующих с раковыми антигенами, или специфичная по отношению к раковой опухоли иммунотерапия с использованием вакцин или тому подобного, содержащих раковые антигены, подвергаются клиническим испытаниям, нацеленным на некоторые выделенные раковые антигены.

Тем временем, в последние годы во всем мире появились различные лекарства для лечения раковых опухолей на основе антител, мишенью которых являются антигенные белки на раковых клетках. Такие лекарственные средства привлекли внимание, поскольку вследствие определенной эффективности в качестве специфичных для раковых опухолей терапевтических средств. Однако подавляющее большинство антигенных белков, которые являются мишенями лекарственных средств, также экспрессируются в нормальных клетках. В результате введения антител нормальные клетки, экспрессирующие антигены, а также раковые клетки повреждаются, приводя к неблагоприятной реакции. Таким образом, если можно будет идентифицировать антигены раковой опухоли, специфично экспрессируемые на поверхности раковых клеток, и можно будет использовать в качестве лекарственных средств антитела, нацеленные на антигены, то можно ожидать, что такие основанные на антителах лекарственные средства позволят осуществлять лечение с меньшими нежелательными реакциями.

Цитоплазматический ассоциированный с активацией и пролиферацией белок 1 (CAPRIN-1) известен как внутриклеточный белок, который экспрессируется при активации или клеточном делении покоящихся нормальных клеток, и образует цитоплазматические стрессовые гранулы с РНК в клетке, принимая участие в регуляции транспорта и трансляции мРНК. Было обнаружено, что указанный белок специфично экспрессируется на поверхности раковых клеток, и его исследуют в качестве мишени для основанных на антителах лекарственных средств, предназначенных для лечения раковой опухоли (патентная литература 2).

Список ссылок

Патентная литература

Патентная литература 1: патент США № 5698396.

Патентная литература 2: WO2010/016526.

Непатентная литература

Непатентная литература 1:

Tsuyoshi Akiyoshi, "Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy", 1997, Vol. 24, p. 55-519 (Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy Publishers Inc., Japan).

Непатентная литература 2: Bruggen P. et al., Science, 254: 1643-1647 (1991).

Непатентная литература 3: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11810-11813 (1995).

Непатентная литература 4: Int. J. Cancer, 72: 965-971 (1997).

Непатентная литература 5: Cancer Res., 58: 1034-1041 (1998).

Непатентная литература 6: Int. J. Cancer, 29: 652-658 (1998).

Непатентная литература 7: Int. J. Oncol., 14: 703-708 (1999).

Непатентная литература 8: Cancer Res., 56: 4766-4772 (1996).

Непатентная литература 9: Hum. Mol. Genet 6: 33-39, 1997.

Сущность изобретения

Техническая проблема

Целью настоящего изобретения является получение антитела, мишенью которого является CAPRIN-1, специфично экспрессируемый на поверхности раковых клеток, и которое обладает более высокой противоопухолевой активностью по сравнению с обычными антителами, и обеспечение его применения в качестве терапевтического и/или профилактического средства против раковой опухоли.

Решение проблемы

Настоящее изобретение имеет следующие характерные признаки:

настоящее изобретение относится к антителу или его фрагменту, который является иммунологически реактивным по отношению к неполному полипептиду CAPRIN-1, имеющему аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 5, или аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более высокую идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью, и фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики рака, содержащей антитело или его фрагмент в качестве активного ингредиента.

В указанном выше варианте раковая опухоль представляет собой рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак толстого кишечника, рак легкого, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичника, рак простаты, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфому, фибросаркому, мастоцитому или меланому.

В одном варианте антитело является моноклональным антителом или поликлональным антителом.

В другом варианте антитело представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или полиспецифичное антитело (например, биспецифичное антитело).

Настоящее описание охватывает содержание, включенное в описание и/или чертежи заявки на выдачу патента Японии № 2012-035238, на которой основан приоритет настоящей заявки.

Полезные эффекты изобретения

Антитело против CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению сильнее повреждает раковые клетки, чем обычные антитела против CAPRIN-1. Таким образом, антитело против CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению применимо для лечения или профилактики рака.

Описание вариантов осуществления изобретения

Антитело согласно настоящему изобретению представляет собой антитело, которое узнает и связывается с предварительно определяемым неполным полипептидом CAPRIN-1 и обладает противоопухолевой активностью. Более конкретно, антитело согласно настоящему изобретению представляет собой антитело, которое узнает (т.е. обладает иммунологической реактивностью) неполный полипептид белка CAPRIN-1 (неполный полипептид CAPRIN-1), состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в виде SEQ ID NO: 5, или аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более высокую, предпочтительно 85% или более высокую, более предпочтительно 90% или более высокую, еще более предпочтительно 95% или более высокую идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью. В настоящем изобретении было показано, что такое антитело проявляет противоопухолевую активность более сильную, чем обычное антитело против белка CAPRIN-1. Настоящее изобретение относится ко всем антителам, которые связываются с фрагментами белков CAPRIN-1, которые описаны выше, и проявляют противоопухолевую активность.

Антитело против CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению может быть антителом любого типа, которое может проявлять противоопухолевую активность, и включает, например, рекомбинантные антитела (например, синтетические антитела, полиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), гуманизированные антитела, химерные антитела и одноцепочечные антитела (scFv)), человеческие антитела и фрагменты таких антител (например, Fab, F(abʹ)₂ и Fv). Такие антитела и их фрагменты могут быть получены способами, общеизвестными специалистам в данной области. Желательно, чтобы антитело согласно настоящему изобретению обладало иммунологической реактивностью по отношению к белку CAPRIN-1 или его неполному полипептиду, т.е. связывалось (предпочтительно, специфично связывалось) с белком CAPRIN-1 в результате взаимодействия антиген-антитело. В данном контексте фраза «специфично связывающееся с белком CAPRIN-1» означает, что антитело специфично связывается с белком CAPRIN-1 и при этом по существу не связывается с другими белками. Антитело согласно настоящему изобретению предпочтительно представляет собой моноклональное антитело, но однако может быть и поликлональным антителом, при условии, что могут быть стабильно продуцированы гомогенные антитела. В том случае, когда субъектом для тестирования является человек, желательно человеческое антитело или гуманизированное антитело, чтобы избежать или подавить неблагоприятную реакцию.

Антитело против полипептида CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению можно оценивать в отношении его противоопухолевой активности, как описано ниже, исследуя ингибирование опухолевого роста in vivo, у несущего раковую опухоль животного или исследуя ex vivo присутствие или отсутствие опосредованной иммуноцитами- или комплементом цитотоксической активности, проявляемой антителом против опухолевых клеток, экспрессирующих полипептид.

Тестируемым субъектом, получающим лечение и/или профилактику раковой опухоли согласно настоящему изобретению является млекопитающее, такое как человек, домашнее животное, сельскохозяйственное животное или используемое в спорте животное, и предпочтительно человек.

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.

Получение антигена для получения антитела

Белки или их фрагменты, используемые в качестве сенсибилизирующих антигенов для получения антитела против CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению, не ограничены видами животных, служащих в качестве их источника, включая человека, собак, кошек, крупный рогатый скот, лошадей, мышей, крыс и цыплят. Однако белки или их фрагменты предпочтительно выбирают с точки зрения совместимости с исходными клетками, используемыми для слияния клеток. В общем, предпочтительны белки, полученные от млекопитающих. В частности, предпочтительны белки, полученные от человека. Например, когда CAPRIN-1 представляет собой CAPRIN-1 человека, можно использовать белки CAPRIN-1 человека, их неполные пептиды или клетки, экспрессирующие CAPRIN-1 человека.

Нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности CAPRIN-1 человека и их гомологи можно получить, например, войдя в систему GenBank (NCBI, USA) и используя такой алгоритм, как BLAST или FASTA (Karlin и Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993; и Altschul с соавторами, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).

В настоящем изобретении при указании нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 1 или 3) или аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 2 или 4) CAPRIN-1, целевой CAPRIN-1 представляет собой нуклеиновую кислоту или белок, состоящий из последовательности, имеющей от 70% до 100%, предпочтительно от 80% до 100%, более предпочтительно от 90% до 100%, еще более предпочтительно от 95% до 100%, например, от 97% до 100%, от 98% до 100%, от 99% до 100% или от 99,5% до 100% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью или аминокислотной последовательностью ORF или зрелого белка эталона (следует отметить, что аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4 при сравнении друг с другом отличаются аминокислотными остатками в положении 690 и после него). В данном контексте термин «идентичность последовательностей в %» означает количество в процентах (%) идентичных аминокислот (или оснований) от общего количества (включая количество пробелов) аминокислот (или оснований) при выравнивании двух последовательностей так, чтобы можно было добиться максимальной степени сходства или идентичности в случае введения или без введения пробелов.

Фрагмент, который содержит эпитоп (или антигенную детерминанту), который является минимальной единицей, узнаваемой антителом, и имеет длину в диапазоне от длины аминокислоты эпитопа до менее чем полной длины белка CAPRIN-1, можно использовать в качестве фрагмента белка CAPRIN-1. Эпитоп относится к полипептидному фрагменту, обладающему антигенностью или иммуногенностью у млекопитающих, предпочтительно у человека. Его минимальная единица состоит примерно из 7-12 аминокислот, например, 8-11 аминокислот. Фрагмент белка CAPRIN-1 для применения в препарате антитела согласно настоящему изобретению предпочтительно представляет собой фрагмент, который распознается антителом согласно настоящему изобретению и содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 5 (которая соответствует последовательности от положения 429 до положения 444 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или 4) или аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более высокую, предпочтительно 85% или более высокую, более предпочтительно 90% или более высокую, еще более предпочтительно 95% или более высокую идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью или содержит, по меньшей мере, эпитоп, состоящий примерно из 7-12 следующих друг за другом аминокислот, например, 8-11 следующих друг за другом аминокислот в любой из таких аминокислотных последовательностей.

Указанные выше белки CAPRIN-1 человека и полипептидные фрагменты, содержащие их неполные пептиды, могут быть синтезированы способами химического синтеза, например, способами на основе Fmoc (флуоренилметилоксикарбонил) и tBoc (трет-бутилоксикарбонил) (Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimentation Course in English) 1, the Japanese Biochemical Society ed., Protein Chemistry IV, Chemical Modification и Peptide Synthesis, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd. (Japan), 1981). Также такие полипептиды могут быть синтезированы обычными способами с использованием различных коммерчески доступных синтезаторов пептидов.

Альтернативно полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, могут быть получены с использованием способов генетического конструирования, известных в данной области (Sambrook et al., Molecular Cloning, the 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, the 3rd edition, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons; и т.д.) и введены в экспрессирующие векторы, которые затем вводят в клетки-хозяева так, что клетки-хозяева продуцируют полипептиды. Таким образом могут быть получены представляющие интерес белки CAPRIN-1 человека или их полипептиды.

Полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, могут быть легко получены способами генетической инженерии, известными в данной области, или обычными способами с использованием коммерчески доступных синтезаторов нуклеиновых кислот. Например, ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность гена CAPRIN-1 человека, может быть получена в ПЦР с использованием хромосомной ДНК человека или библиотеки кДНК в качестве матрицы и пары праймеров, сконструированных так, чтобы они были способны амплифицировать нуклеотидную последовательность. Условия реакции для данной ПЦР могут быть определены соответствующим образом. Примеры таких условий включают без ограничения 30 циклов, каждый из которых включает в себя стадии реакции при 94°C в течение 30 секунд (денатурация), 55°C в течение от 30 секунд до 1 минуты (отжиг) и 72°C в течение 2 минут (элонгация) с использованием термостабильной ДНК-полимеразы (например, полимеразы Taq или полимеразы Pfu) и Mg²⁺-содержащего буфера для ПЦР с последующей реакцией при 72°C в течение 7 минут. Способ ПЦР, условия и т.д. описаны, например, в Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, the 3rd edition, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons (в частности, глава 15).

Также могут быть получены подходящие зонды или праймеры на основе информации о нуклеотидных последовательностях генов CAPRIN-1 и аминокислотных последовательностей белков CAPRIN-1 и использованы, например, для скрининга библиотеки кДНК человека, чтобы выделить требуемую ДНК. Предпочтительно, такую библиотеку кДНК получают из клеток, органов или тканей, экспрессирующих белки CAPRIN-1. Примеры таких клеток или тканей включают клетки или ткани, полученные из раковых опухолей или опухолей, таких как рак семенников, лейкоз, рак молочной железы, лимфома, опухоль головного мозга, рак легкого, рак поджелудочной железы, рак толстого кишечника, рак почки, рак желудка, рак шейки матки, рак яичника, рак простаты, рак мочевого пузыря, рак пищевода, фибросаркома, мастоцитома или меланома. Такие способы, включая получение зондов или праймеров, конструирование библиотеки кДНК, скрининг библиотеки кДНК и клонирование представляющего интерес гена, известны специалистам в данной области и могут быть осуществлены согласно способам, описанным, например, Sambrook с соавторами (Molecular Cloning, the 2^nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989)) и Ausubel с соавторами (выше). ДНК, кодирующие белки CAPRIN-1 человека, и их неполные пептиды могут быть получены из полученной таким образом ДНК.

Клетки-хозяева, принимающие экспрессирующие векторы, могут представлять собой любую клетку, способную экспрессировать описанные выше полипептиды. Примеры прокариотических клеток включают без ограничения E. coli. Примеры эукариотических клеток включают без ограничения: клетки млекопитающих, такие как клетки почки обезьяны COS1, клетки яичника китайского хомячка CHO, линия клеток эмбриональной почки человека HEK293, линия клеток кожи эмбриона мыши NIH3T3, дрожжевые клетки, такие как почкующиеся дрожжевые клетки и делящиеся дрожжевые клетки, клетки тутового шелкопряда и яйцеклетки Xenopus.

В случае использования прокариотических клеток в качестве клеток-хозяев применяемые экспрессирующие векторы имеют начало, которое обеспечивает возможность репликации в прокариотических клетках, промотор, сайт связывания рибосомы, сайт множественного клонирования, терминатор, ген лекарственной резистентности, ген, комплементирующий ауксотрофность и т.д. Примеры экспрессирующих векторов для E. coli могут включать серию pUC, pBluescript II, системы экспрессии pET и системы экспрессии pGEX. ДНК, кодирующие описанные выше полипептиды, могут быть включены в такие экспрессирующие векторы, которыми затем трансформируют прокариотические клетки-хозяева с последующим культивированием получаемых трансформантов так, чтобы полипептиды, кодируемые ДНК, экспрессировались в прокариотических клетках-хозяевах. При этом полипептиды могут быть экспрессированы в виде слитых белков с другими белками.

В случае использования эукариотических клеток в качестве клеток-хозяев в качестве экспрессирующих векторов применяют экспрессирующие векторы для эукариотических клеток, имеющие промотор, область сплайсинга, сайт добавления поли(A) и т.д. Примеры таких экспрессирующих векторов могут включать векторы pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3 и pYES2. Подобно описанному выше случаю, ДНК, кодирующие указанные выше полипептиды, могут быть включены в такие экспрессирующие векторы, которыми затем трансформируют эукариотические клетки-хозяева с последующим культивированием получаемых трансформантов так, чтобы полипептиды, кодируемые ДНК, экспрессировались в эукариотических клетках-хозяевах. В случае использования таких экспрессирующих векторов как pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, или pEGFP-C1 полипептиды могут быть экспрессированы в виде различных слитых белков, меченых His-меткой (например, (His)₆ - (His)₁₀), FLAG-меткой, myc-меткой, HA-меткой, GFP или тому подобным.

Экспрессирующие векторы могут быть введены в клетки-хозяева с использованием хорошо известных способов, таких как электропорация, основанный на использовании фосфата кальция способ, основанный на липосомах способ, основанный на DEAE-декстране способ, микроинъекция, вирусная инфекция, липофекция и связывание с проникающими в клетки пептидами.

Представляющий интерес полипептид может быть выделен и очищен из клеток-хозяев с использованием сочетания способов разделения, известных в данной области. Примеры способов включают без ограничения обработку денатурирующим средством (например, мочевиной) или поверхностно-активным веществом, обработку ультразвуком, ферментативное расщепление, обессоливание, фракционирование и преципитацию в растворителях, диализ, центрифугирование, ультрафильтрацию, гель-фильтрацию, SDS-ПААГ, изоэлектрическое фокусирование, электрофорез, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию и обращенно-фазовую хроматографию.

Полученные таким образом антигены могут быть использованы в качестве сенсибилизирующих антигенов, как описано далее, для получения антитела согласно настоящему изобретению.

Структура антитела

Антитела (иммуноглобулины) обычно представляют собой гетеромультимерные гликопротеиды, каждый из которых содержит, по меньшей мере, две тяжелых цепи и две легких цепи. Иммуноглобулины, за исключением IgM, являются гетеротетрамерными гликопротеидами с молекулярной массой примерно 150 кД, каждый из которых состоит из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Обычно каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, хотя количество дисульфидных связей между тяжелыми цепями варьирует в разных изотипах иммуноглобулинов. Каждая тяжелая цепь или каждая легкая цепь также имеет внутрицепочечную дисульфидную связь. Каждая тяжелая цепь имеет вариабельный домен (VH-область) на одном конце, за которой следует несколько константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (VL-область) на одном конце и имеет одну константную область на другом конце. Константная область легкой цепи совмещена с первой константной областью тяжелой цепи, тогда как вариабельный домен легкой цепи совмещен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Особые области, называемые определяющими комплементарность областями (CDR) в вариабельных доменах антител проявляют специфичную вариабельность и придают специфичность связывания антителу. Части, относительно консервативные в вариабельных областях, называют каркасными областями (FR). Каждый из полных вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей содержат четыре FR, соединенные тремя CDR. Указанные три CDR называют CDRH1, CDRH2 и CDRH3 в указанном порядке, начиная с N-конца тяжелой цепи. Подобным образом, CDR называют CDRL1, CDRL2 и CDRL3 в легкой цепи. CDRH3 является наиболее важной для специфичности связывания антитела с его антигеном. Кроме того, CDR в каждой цепи удерживаются рядом друг с другом FR-областями и вносят вклад в образование участка связывания антигена в антителе вместе с CDR в другой цепи. Константные области непосредственно не вносят вклад в связывание антитело-антиген, но проявляют различные эффекторные функции, например, вовлечены в зависимую от антител клеточную цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, опосредованный связыванием с рецептором Fcγ, время полужизни/скорость клиренса, опосредованного неонатальным Fc-рецептором (FcRn), и зависимую от комплемента цитотоксичность (CDC), опосредованную компонентом C1q в каскаде комплемента.

Получение антитела

Анти-CAPRIN-1-антитело согласно настоящему изобретению означает антитело, обладающее иммунологической реактивностью по отношению к полноразмерному белку CAPRIN-1 или его фрагменту. В частности, анти-CAPRIN-1-антитело согласно настоящему изобретению представляет собой антитело, которое иммунологически связывается с неполным полипептидом белка CAPRIN-1 (неполным полипептидом CAPRIN-1), который является пептидом, состоящим из содержащей эпитоп аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, или полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более высокую, предпочтительно 85% или более высокую, более предпочтительно 90% или более высокую, еще более предпочтительно 95% или более высокую идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью. Предпочтительно антитело согласно настоящему изобретению узнает эпитоп, состоящий приблизительно из 7-12 следующих друг за другом аминокислот, например, 8-11 следующих друг за другом аминокислот, в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, или аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более высокую, предпочтительно 85% или более высокую, более предпочтительно 90% или более высокую, еще более предпочтительно 95% или более высокую идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью. Такое анти-CAPRIN-1-антитело согласно настоящему изобретению способно специфично связываться с полноразмерным белком CAPRIN-1. Антитело согласно настоящему изобретению может быть получено путем отбора антитела, которое иммунологически связывается с полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, или полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более высокую, предпочтительно 85% или более высокую, более предпочтительно 90% или более высокую, еще более предпочтительно 95% или более высокую идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью, согласно обычному способу из антител, получаемых с использованием белков CAPRIN-1 или их фрагментов в качестве антигенов.

В данном контексте «иммунологическая реактивность» означает свойство антитела связываться с антигеном CAPRIN-1 (полноразмерным белком CAPRIN-1 или его неполным полипептидом) in vivo. Благодаря такому связыванию с CAPRIN-1 антитело согласно настоящему изобретению осуществляет функцию повреждения (например, убивания, подавления или регрессии) опухолевых клеток. Антитело согласно настоящему изобретению может повреждать опухоль, например, рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак толстого кишечника (например, рак ободочной кишки), рак легкого, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичника, рак простаты, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфому, фибросаркому, мастоцитому или меланому посредством связывания с белком CAPRIN-1.

Антитело согласно настоящему изобретению может быть антителом любого типа. Примеры типов антител согласно настоящему изобретению включают моноклональные антитела, поликлональные антитела, синтетические антитела, полиспецифичные антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные антитела и фрагменты антител (например, Fab, F(abʹ)₂, и Fv). Также антитело представляет собой молекулу иммуноглобулина любого класса, например, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD, или IgY, или любого подкласса, например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 или IgA2.

Антитело может быть дополнительно модифицировано ацетилированием, формилированием, амидированием, фосфорилированием, пегилированием или тому подобным в дополнение к гликозилированию.

Далее будут показаны примеры получения различных антител.

Когда антитело согласно настоящему изобретению представляет собой моноклональное антитело, например, линию раковых клеток молочной железы SK-BR-3, экспрессирующих CAPRIN-1, вводят каждой мыши для иммунизации. Из мыши выделяют селезенку. После разделения клеток селезенки клетки сливают с клетками миеломы мыши. Отбирают клоны, продуцирующие антитела, обладающие ингибирующим рост раковых клеток действием, из полученных слитых клеток (гибридом). Альтернативно могут быть отобраны клоны, продуцирующие антитела, связывающиеся с полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, или полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более высокую идентичность последовательности с такой аминокислотной последовательностью. Можно выделять и культивировать гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, оказывающие ингибирующий рост раковых клеток, или гибридомы, продуцирующие моноклональное антитела против полипептида SEQ ID NO: 5 или тому подобного. Антитело согласно настоящему изобретению может быть получено в результате очистки из надосадка культуры согласно обычному способу аффинной очистки.

Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, могут быть получены, например, следующим образом: сначала животных иммунизируют сенсибилизирующими антигенами согласно способу, известному в данной области. Такой способ иммунизации обычно включает в себя внутрибрюшинную или подкожную инъекцию сенсибилизирующих антигенов млекопитающим. В частности, сенсибилизирующие антигены разбавляют или суспендируют в PBS (фосфатно-солевом буфере), физиологическом растворе или тому подобном, в соответствующем количестве и затем, при необходимости, смешивают с подходящим количеством обычного адъюванта, например, полного адъюванта Фрейнда. После эмульгирования полученную эмульсию вводят каждому млекопитающему несколько раз каждые 4-21 день. Альтернативно можно использовать подходящий носитель для иммунизации сенсибилизирующим антигеном.

После подтверждения повышения уровня требуемого антитела в сыворотке иммунизированного таким образом млекопитающего от такого млекопитающего получают иммуноциты и подвергают слиянию клеток. Предпочтительные примеры иммуноцитов, в частности, включают клетки селезенки.

Клетки миеломы млекопитающих используют в качестве исходной клетки-партнера для слияния с иммуноцитами. Различные линии клеток, известные в данной области, например, P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology и Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. и Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D.H. с соавторами, Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. с соавторами, Nature (1978) 276, 269-270), FO (deSt. Groth, S.F. с соавторами, J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G. с соавторами, Nature (1979) 277, 131-133), 240E-1 и 240E-W предпочтительно используют в качестве клеток миеломы.

Клеточное слияние между иммуноцитами и клетками миеломы можно осуществлять в основном согласно способу, известному в данной области, например, способом of Kohler и Milstein (Kohler, G. и Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Более конкретно, слияние клеток осуществляют, например, в присутствии стимулятора клеточного слияния в обычной питательной среде. Например, полиэтиленгликоль (ПЭГ) или вирус Сендай (HVJ) используют в качестве стимулятора слияния. При необходимости может быть добавлено вспомогательное вещество, такое как диметилсульфоксид, используемое для того, чтобы повысить эффективность слияния.

Соотношение между используемыми иммуноцитами и клетками миеломы может быть установлено произвольно. Например, количество иммуноцитов предпочтительно устанавливают так, чтобы оно было 1-10-кратным относительно клеток миеломы. Примеры среды, которую можно использовать при слиянии клеток, включают среду RPMI1640 и MEM, подходящую для роста линий клеток миеломы, а также обычную среду, применяемую для данного типа культуры клеток. Кроме того, можно использовать добавку сыворотки, такой как фетальная сыворотка теленка (FCS), в сочетании с такими средами.

Для слияния клеток иммуноциты и клетки миеломы хорошо перемешивают в предварительно определяемом количестве среды. Раствор ПЭГ (средняя молекулярная масса: например, примерно 1000-6000), предварительно нагретый примерно до 37°, обычно добавляют к смеси в концентрации 30-60% (масс./об.) и перемешивают для образования представляющих интерес гибридом. Затем процедуры последовательного добавления подходящей среды и удаления надосадка центрифугированием предпочтительно повторяют, чтобы удалить агенты для слияния клеток или тому подобное, что может быть неблагоприятным для роста гибридом.

Полученные таким образом гибридомы культивируют в обычной селективной среде, например, среде HAT (среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин) для селекции. Такое культивирование в среде HAT продолжают в течение периода времени (обычно от нескольких дней до нескольких недель), достаточного для гибели клеток (неслитых клеток), отличных от представляющих интерес гибридом. Затем гибридомы, продуцирующие представляющее интерес антитело, подвергают скринингу и клонируют в виде отдельных клонов обычным способом лимитирующего разведения.

Кроме такого получения гибридом с помощью иммунизации животных, отличных от человека антигенами гибридомы, продуцирующие человеческие антитела, обладающие требуемой активностью (например, ингибирующей рост клеток активностью) можно получить, сенсибилизируя лимфоциты человека, например, инфицированные вирусом EB лимфоциты человека, белками, экспрессирующими белки клетками или их лизатами in vitro и сливая сенсибилизированные лимфоциты с клетками миеломы, полученными от человека, способными непрерывно делиться, например, U266 (№ регистрации TIB196).

Полученные таким образом продуцирующие моноклональное антитело гибридомы можно субкультивировать в обычной среде, а также можно хранить в течение длительного периода времени в жидком азоте.

В частности, требуемые антигены или клетки, экспрессирующие требуемые антигены, используют в качестве сенсибилизирующих антигенов в иммунизации согласно обычному способу иммунизации. Получаемые иммуноциты сливают с родительскими клетками, известными в данной области, согласно обычному способу слияния клеток. Продуцирующие моноклональное антитело клетки (гибридомы) могут быть подвергнуты скринингу обычным способом скрининга для получения представляющего интерес антитела.

Другим примером антитела, которое можно использовать в настоящем изобретении, является поликлональное антитело. Поликлональное антитело может быть получено, например, следующим образом:

сыворотку получают из некрупных животных, таких как мыши, продуцирующие человеческие антитела мыши или кролики, иммунизированные природными белками CAPRIN-1 или рекомбинантными белками CAPRIN-1, экспрессируемыми в виде белков, слитых с GST или тому подобным, в микроорганизмах, таких как E. coli, или их неполными пептидами. Альтернативно сыворотка может быть получена от млекопитающих, иммунизированных фрагментами CAPRIN-1, служащими в качестве сенсибилизирующих антигенов, т.е. полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 5, или аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более высокую, предпочтительно 85% или более высокую, более предпочтительно 90% или более высокую, еще более предпочтительно 95% или более высокую идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью (предпочтительно, полипептидом, состоящим из любой из таких аминокислотных последовательностей), или полипептидом, содержащим эпитоп (предпочтительно, состоящим из эпитопа), состоящий примерно из 7-12 следующих друг за другом аминокислот, например, 8-11 следующих друг за другом аминокислот, из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, или аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более высокую, предпочтительно 85% или более высокую, более предпочтительно 90% или более высокую, еще более предпочтительно 95% или более высокую идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью. Полученную таким образом сыворотку можно очистить, используя, например, преципитацию сульфатом аммония, колонки с белком A или белком G, ионообменную хроматографию на DEAE или аффинные колонки, на которых связаны белки CAPRIN-1 или синтетические пептиды, чтобы получить поликлональные анти-CAPRIN-1-антитела. Поликлональное антитело согласно настоящему изобретению включает антитела, полученные от животных, продуцирующих человеческие антитела (например, мышей), иммунизированных белками CAPRIN-1.

В данном контексте, например, мыши KM mice (Kirin Pharma Co., Ltd./Medarex) и мыши Xeno (Amgen Inc.) известны как мыши, продуцирующие антитела человека (например, международные публикации № WO 02/43478 и WO 02/092812). Полные поликлональные антитела человека могут быть получены из крови путем иммунизации таких мышей белками CAPRIN-1 или их фрагментами. Альтернативно могут быть выделены клетки селезенки из мышей, иммунизированных таким образом, и слиты с клетками миеломы. Таким образом могут быть получены моноклональные антитела человека.

Антигены могут быть получены, например, согласно способу, в котором используют животные клетки (публикация патента Японии JP (Kohyo) No. 2007-530068 A), или способу, в котором используют бакуловирус (например, международная публикация № WO98/46777). Антигены, обладающие низкой иммуногенностью, могут быть связаны с иммуногенными макромолекулами, такими как альбумин, для иммунизации. Антигены можно вводить вместе с адъювантами для иммунизации.

Альтернативно, антитело согласно настоящему изобретению может быть получено в виде генетически рекомбинантного антитела, которое получают, используя методику рекомбинации генов, которая включает в себя: клонирование гена антитела из гибридом; включение гена антитела в соответствующие векторы; и введение векторов в хозяев (см., например, работу Carl, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, опубликованную в Великобритании Macmillan Publishers LTD, 1990). В частности, кДНК вариабельной области антитела (V-области) могут быть синтезированы с мРНК гибридом с использованием обратной транскриптазы. После получения ДНК, кодирующих представляющие интерес V-области антитела, ДНК лигируют с ДНК, кодирующими требуемые константные области антитела (C-области). Полученные продукты лигирования включают в экспрессирующие векторы. Альтернативно ДНК, кодирующие V-области антител, могут быть включены в экспрессирующие векторы, содержащие ДНК C-области антител. Такие ДНК вводят в экспрессирующие векторы так, чтобы они экспрессировались под контролем областей регуляции экспрессии, например, энхансера и промотора. Затем клетки-хозяева трансформируют полученными в результате экспрессирующими векторами и обеспечивают возможность экспрессировать антитела.

Анти-CAPRIN-1-антитело согласно настоящему изобретению предпочтительно является моноклональным антителом. Альтернативно, анти-CAPRIN-1-антитело согласно настоящему изобретению может представлять собой поликлональное антитело, генетически сконструированное антитело (химерное антитело, гуманизированное антитело и т.д.) или тому подобное.

Моноклональное антитело включает моноклональные антитела человека, моноклональные антитела животного, отличного от человека (например, моноклональные антитела мыши, крысы, кролика и цыпленка), химерные моноклональные антитела и тому подобные. Моноклональное антитело может быть получено при культивировании гибридом, полученных слиянием между клетками селезенки от млекопитающих, отличных от человека (например, мышей, продуцирующих антитела человека мышей, цыплят или кроликов), иммунизированных белками CAPRIN-1 или их фрагментами, и клетками миеломы. Химерное антитело является антителом, полученным в результате сочетания последовательностей, происходящих от разных животных, и представляет собой, например, антитело, состоящее из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи антитела мыши и константных областей тяжелой и легкой цепи антитела человека. Химерное антитело может быть получено с использованием способа, известного в данной области, который включает в себя, например: лигирование ДНК, кодирующих V-области антитела мыши, с ДНК, кодирующими C-области антитела человека; включение полученных в результате продуктов лигирования в экспрессирующие векторы; и введение векторов в хозяев так, чтобы они продуцировали антитела.

Моноклональные антитела, которые обладают иммунологической реактивностью по отношению к неполному полипептиду CAPRIN-1, состоящему из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, и оказывают противоопухолевое действие, получают способом, описанным ниже в примерах.

Гуманизированное антитело, также называемое реконструированным антителом человека, является сконструированным антителом. Гуманизированное антитело конструируют посредством прививки в определяющие комплементарность области антитела человека CDR антител, полученных от иммунизированного животного. Общий способ рекомбинации генов, используемый в данном случае, также известен.

В частности, синтезируют последовательности ДНК, сконструированные так, чтобы связать, например, CDR антитела мыши, кролика или цыпленка и каркасные области (FR) антитела человека, в ПЦР с использованием нескольких полученных олигонуклеотидов, имеющих концевые части, перекрывающиеся друг с другом. Полученные ДНК лигируют с ДНК, кодирующими константные области антитела человека. Затем полученные продукты лигирования включают в экспрессирующие векторы, которые затем вводят в хозяев для продуцирования антител, чтобы получить представляющее интерес антитело (см. публикацию заявки на выдачу европейского патента № EP239400 и международную публикацию № WO96/02576).

FR антитела человека, соединенные через CDR, выбирают так, чтобы определяющие комплементарность области образовывали соответствующий антигенсвязывающий участок. При необходимости аминокислоты в каркасных областях вариабельных областей антитела могут быть заменены так, чтобы определяющие комплементарность области полученного реконструированного антитела человека образовывали подходящий антигенсвязывающий участок (Sato K. с соавторами, Cancer Research 1993, 53: 851-856). Кроме того, такие FR могут быть заменены каркасными областями, полученными из различных антител человека другого класса или подкласса (см. международную публикацию № WO99/51743).

Аминокислоты в вариабельных областях (например, FR) или константных областях химерного антитела или гуманизированного антитела, полученного таким образом, могут быть заменены, например, другими аминокислотами.

Замена аминокислот представляет собой замену, например, менее чем 15, менее чем 10, 8 или меньше, 7 или меньше, 6 или меньше, 5 или меньше, 4 или меньше, 3 или меньше, или 2 или меньше аминокислот, предпочтительно 1-5 аминокислот, более предпочтительно 1 или 2 аминокислот. Антителом с заменами должно быть функционально эквивалентным антителу без замен. Замена желательно является консервативной аминокислотной заменой, которая представляет собой замену аминокислотами, сходными по свойствам, таким как заряд, боковые цепи, полярность и ароматичность. Аминокислоты можно классифицировать, относя их на основании сходных свойств, например, к: основным аминокислотам (аргинин, лизин и гистидин); кислым аминокислотам (аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота); незаряженным полярным аминокислотам (глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, цистеин и тирозин); неполярным аминокислотам (лейцин, изолейцин, аланин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин); разветвленным аминокислотам (лейцин, валин и изолейцин); и ароматическим аминокислотам (фенилаланин, тирозин, триптофан и гистидин).

Примеры модифицированных антител могут включать антитела, связанные с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ). В случае модифицированного антитела согласно настоящему изобретению, вещество, которое с ним связано, не ограничено. Чтобы получить такое модифицированное антитело, получаемое антитело может быть модифицировано химически. Способ такой модификации уже разработан в данной области.

В данном контексте, фраза «функционально эквивалентное» означает, что антитело, о котором идет речь, обладает биологической или биохимической активность, сходной с активностью антитела согласно настоящему изобретению, в частности, антитело, о котором идет речь, обладает функцией, приводящей к повреждению опухоли и по существу не вызывает неблагоприятной реакции в случае применения, например, у человека. Примеры такой активности могут включать ингибирующую рост клеток активность и активность в связывании.

Способ получения полипептида, функционально эквивалентного определенному полипептиду, который заключается во введении мутации в полипептид, хорошо известен специалистам в данной области. Например, специалисты в данной области могут соответствующим образом ввести мутацию в антитело согласно настоящему изобретению, используя сайт-специфичный мутагенез (Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ., and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer, W. and Fritz, HJ., (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492; and Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) или тому подобные способы, при этом получив антитело, функционально эквивалентное антителу согласно настоящему изобретению.

Антитело, которое узнает эпитоп белка CAPRIN-1 или полипептидного фрагмента CAPRIN-1, содержащего эпитоп, может быть получено способом, общеизвестным специалистам в данной области. Например, антитело может быть получено способом, который включает в себя определение эпитопа белка CAPRIN-1, узнаваемого получаемым анти-CAPRIN-1-антителом, оказывающим ингибирующим рост раковых клеток действием, обычным способом (например, способом картирования эпитопов или способом идентификации эпитопов), и получение антитела с использованием полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, входящую в состав эпитопов, в качестве иммуногена, или способом, который включает в себя определение эпитопа для получаемого антитела обычным способом и отбор антитела, которое узнает тот же самый эпитоп, что и эпитоп для анти-CAPRIN-1-антитела. В данном контексте «эпитоп» относится к полипептидному фрагменту, обладающему антигенностью или иммуногенностью у млекопитающих, предпочтительно, у человека. Его минимальная единица состоит приблизительно из 7-12 аминокислот, предпочтительно из 8-11 аминокислот.

Антитело согласно настоящему изобретению представляет собой антитело, обладающее иммунологической реактивностью по отношению к CAPRIN-1, антитело, которое специфично узнает CAPRIN-1, или антитело, которое специфично связывается с CAPRIN-1 и проявляет цитотоксическую активность, направленную против раковой опухоли, или оказывает ингибирующее рост опухоли влияние. Антитело предпочтительно представляет собой антитело, имеющее структуру, которая вызывает небольшое или не вызывает неблагоприятной реакции у животных-реципиентов. Примеры таких антител включают человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела (например, химерные антитела человека-мыши), одноцепочечные антитела и биспецифичные антитела в том случае, когда животными-реципиентами являются люди. Такие антитела имеют вариабельные области тяжелой и легкой цепей, полученные из антитела человека, или вариабельные области тяжелой и легкой цепей с определяющими комплементарность областями (CDR1, CDR2 и CDR3), полученными из антитела животного, отличного от человека, и каркасными областями (FR1, FR2, FR3 и FR4), полученными из антитела человека. Альтернативно, такие антитела представляют собой рекомбинантные антитела, имеющие вариабельные области тяжелой и легкой цепи, полученные из антитела животного, отличного от человека, и константные области тяжелой и легкой цепей, полученные из антитела человека. Антитело согласно настоящему изобретению предпочтительно имеет вид первых двух антител.

Такие рекомбинантные антитела могут быть получены следующим образом: ДНК, кодирующие моноклональные антитела (например, моноклональные антитела человека, мыши, крысы, кролика и цыпленка) против CAPRIN-1 человека, клонируют из продуцирующих антитела клеток, таких как гибридомы, и используют в качестве матриц в ОТ-ПЦР или тому подобной, чтобы получить ДНК, кодирующие вариабельные области легкой и тяжелой цепей антител. Соответствующие последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепей, соответствующие последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 в каждой области или соответствующие последовательности FR1, FR2, FR3 и FR4 в каждой области могут быть определены, например, на основе системы нумерации EU по Кабату (Kabat с соавторами. Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)).

Такую ДНК, кодирующую каждую вариабельную область, или ДНК, кодирующую каждую CDR, получают, используя способ рекомбинации генов (Sambrook с соавторами, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) или синтезатор ДНК. В данном контексте гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела человека, могут быть получены посредством иммунизации животных, продуцирующих антитела человека (например, мышей), с использованием CAPRIN-1 человека, и затем слияния клеток селезенки, вырезанной из иммунизированного животного, с клетками миеломы. Помимо этого, ДНК, кодирующие вариабельные и константные области легкой и тяжелой цепей антитела человека, получают, используя при необходимости способ рекомбинации генов или синтезатор ДНК.

В случае гуманизированного антитела ДНК, кодирующая гуманизированное антитело, может быть получена заменой последовательностей, кодирующих CDR, в ДНК, кодирующих вариабельные области легкой цепи или тяжелой цепи, полученные из антитела человека, соответствующими последовательностями, кодирующей CDR, из антитела, полученного от животного, отличного от человека (например, мыши, крысы или цыпленка).

В случае химерного антитела ДНК, кодирующие вариабельные области легкой или тяжелой цепей антитела, полученного от животного, отличного от человека (например, мыши, крысы, кролика или цыпленка), могут быть лигированы с ДНК, кодирующими константные области легкой или тяжелой цепей, полученными из антитела человека с получением ДНК, кодирующей химерное антитело.

Одноцепочечное антитело относится к антителу, содержащему вариабельные области тяжелой и легкой цепей, линейно связанные друг с другом линкером. ДНК, кодирующая одноцепочечное антитело, может быть получена лигированием ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи, ДНК, кодирующей линкер, и ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи. В данном контексте вариабельные области тяжелой и легкой цепей происходят из антитела человека или происходят из антитела человека, в котором только CDR заменены на CDR антитела, полученного от животного, отличного от человека (например, мыши, крысы, кролика или цыпленка). Линкер состоит из 12-19 аминокислот. Примеры линкера включают (G₄S)₃, состоящий из 15 аминокислот (G.B. Kim с соавторами, Protein Engineering Design и Selection 2007, 20 (9): 425-432).

Биспецифичное антитело (например, диантитело) относится к антителу, способному специфично связываться с двумя разными эпитопами. ДНК, кодирующая биспецифичное антитело, может быть получена лигированием, например, ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи A, ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи B, ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи B, и ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи A в указанном порядке (при условии, что ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи B, и ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи B, лигированы посредством ДНК, кодирующей линкер, который описан выше). В данном контексте все вариабельные области тяжелой и легкой цепей получены из антитела человека или получены из антитела человека, в котором только CDR отдельно заменены на CDR из антитела, полученного от животного, отличного от человека (например, мыши, крысы, кролика или цыпленка).

Полученные таким образом рекомбинантные ДНК могут быть включены в один или несколько подходящих векторов, которые затем вводят к клетки-хозяева (например, клетки млекопитающих, дрожжевые клетки и клетки насекомых) так, чтобы ДНК (ко)экспрессировались с получением рекомбинантных антител (P.J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; and J.W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS).

Примеры антитела согласно настоящему изобретению, полученного любым из способов, описанных выше, включают следующие антитела (a)-(i):

(a) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, состоящие из последовательностей SEQ ID NO: 8, 9 и 10, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, состоящие из последовательностей SEQ ID NO: 11, 12 и 13;

(b) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, состоящие из последовательностей SEQ ID NO: 8, 9 и 14, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, состоящие из последовательностей SEQ ID NO: 11, 12 и 13;

c) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 52, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 54;

d) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 18;

e) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 23;

f) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 25, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 23;

g) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, состоящие из последовательностей SEQ ID NO: 26, 27 и 28, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, состоящие из последовательностей SEQ ID NO: 30, 31 и 32 (например, антитело, в состав которого входит вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из последовательности SEQ ID NO: 29, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из последовательности SEQ ID NO: 33);

h) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, состоящие из последовательностей SEQ ID NO: 36, 37 и 38, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, состоящие из последовательностей SEQ ID NO: 40, 41 и 42 (например, антитело, в состав которого входит вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из последовательности SEQ ID NO: 39, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из последовательности SEQ ID NO: 43); и

i) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, состоящие из последовательностей SEQ ID NO: 46, 47 и 48, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, состоящие из последовательностей SEQ ID NO: 40, 41 и 42 (например, антитело, в состав которого входит вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из последовательности SEQ ID NO: 49, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из последовательности SEQ ID NO: 43).

В данном контексте аминокислотные последовательности, показанные в SEQ ID NO: 8, 9 и 10, соответствуют CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, вариабельной области тяжелой цепи антитела, полученного от кролика. Аминокислотные последовательности, показанные в SEQ ID NO: 11, 12 и 13, соответствуют CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, вариабельной области легкой цепи антитела, полученного от кролика. Аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 14, соответствует CDR3 вариабельной области тяжелой цепи антитела, полученного от кролика.

Также аминокислотные последовательности, показанные в SEQ ID NO: 26, 27 и 28, SEQ ID NO: 36, 37 и 38 или SEQ ID NO: 46, 47 и 48, соответствуют CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, вариабельной области тяжелой цепи, полученной из антитела мыши. Аминокислотные последовательности, показанные в SEQ ID NO: 30, 31 и 32 или SEQ ID NO: 40, 41 и 42, соответствуют CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, вариабельной области легкой цепи, полученной из антитела мыши.

Примеры гуманизированного антитела, химерного антитела, одноцепочечного антитела или биспецифичного антитела согласно настоящему изобретению включают следующие антитела (I)-(II), например, в форме (b):

(I)

антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 8, 9 и 14, соответственно, полученные из гуманизированного антитела каркасные области или аминокислотные последовательности с замененными в них частями и

вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 11, 12 и 13, соответственно, полученные из антитела человека каркасные области или аминокислотные последовательности с замененными в них частями; и

(II)

антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и константную область тяжелой цепи, полученную из антитела человека, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и константную область легкой цепи, полученную из антитела человека.

Последовательности константных и вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антитела человека доступны, например, из NCBI (USA; GenBank, UniGene, и т.д.). Например, можно назвать следующие последовательности: регистрационный № J00228 для константной области тяжелой цепи IgG1 человека; регистрационный № J00230 для константной области тяжелой цепи IgG2 человека; регистрационный № X03604 для константной области тяжелой цепи IgG3 человека; регистрационный № K01316 для константной области тяжелой цепи IgG4 человека; регистрационные №№ V00557, X64135, X64133 и т.д. для константной области κ легкой цепи человека; и регистрационные №№ X64132, X64134 и т.д. для константной области λ легкой цепи человека.

Предпочтительно такие антитела обладают цитотоксической активностью и поэтому могут оказывать противоопухолевое действие.

Указанные выше конкретные последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей и CDR в каждом антителе приведены только с целью иллюстрации. Очевидно, что антитело согласно настоящему изобретению не ограничено конкретными последовательностями. Получают гибридомы, способные продуцировать человеческие антитела и антитела животных, отличных от человека (например, мышиные антитела) против CAPRIN-1 человека, отличные от антител, описанных выше, и моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами, извлекают и оценивают как антитела, являющиеся (или не являющиеся) представляющими интерес антителами с использованием иммунологической связывающей активности против CAPRIN-1 человека и цитотоксической активности в качестве показателей. Таким образом идентифицируют представляющие интерес гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела. Затем из гибридом получают ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей представляющих интерес антител, и секвенируют, как описано выше. ДНК используют для получения разных антител.

Каждое из указанных выше антител может иметь замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот, в частности, в последовательности каркасной области и/или последовательности константной области, при условии, что антитело обладает такой специфичностью, благодаря которой оно может специфично узнавать CAPRIN-1. В данном контексте термин «несколько» означает предпочтительно 2-5, более предпочтительно 2 или 3.

Константа аффинности Ka (k_on/k_off) антитела согласно настоящему изобретению по отношению к белку CAPRIN-1 или его фрагменту предпочтительно составляет, по меньшей мере 10⁷ М^-1, по меньшей мере 10⁸ М^-1, по меньшей мере 5×10⁸ М^-1, по меньшей мере 10⁹ М^-1, по меньшей мере 5×10⁹ М^-1, по меньшей мере 10¹⁰ М^-1, по меньшей мере 5×10¹⁰ М^-1, по меньшей мере 10¹¹ М^-1, по меньшей мере 5×10¹¹ М^-1, по меньшей мере 10¹² М^-1, или по меньшей мере 10¹³ М^-1.

Антитело согласно настоящему изобретению может быть конъюгировано с противоопухолевым средством. Конъюгирование антитела с противоопухолевым средством можно осуществить через спейсер, имеющий группу (например, сукцинимидильную группу, формильную группу, 2-пиридилдитиогруппу, малеимидильную группу, алкоксикарбонильную группу или гидроксильную группу), взаимодействующую с аминогруппой, карбоксильной группой, гидроксильной группой, тиольной группой или тому подобной.

Примеры противоопухолевого средства включают следующие противоопухолевые средства, общеизвестные из литературы, и т.д.: паклитаксел, доксорубицин, даунорубицин, циклофосфамид, метотрексат, 5-фторурацил, тиотепа, бусульфан, импросульфан, пипосульфан, бензодопа, карбоквон, метуредопа, уредопа, алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид, триметилоломеламин, буллатацин, буллатацинон, камптотецин, бриостатин, каллистатин, криптофицин 1, криптофицин 8, доластатин, дуокармицин, элеутеробин, панкратистатин, саркодиктиин, спонгистатин, хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин, кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин, калихеамицин, динемицин, клодронат, эсперамицин, аклациномицин, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицин, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицин, дактиномицин, деторбицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, адриамицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицин C, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицин, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин, деноптерин, птероптерин, триметрексат, флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, андрогены (например, калустерон, пропионат дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан и тестолактон), аминоглютетимид, митотан, трилостан, фолиновая кислота, ацеглатон, гликозид альдофосфамида, аминолевулиновая кислота, энилурацил, амсакрин, бестрабуцил, бисантрен, эдатраксат, дефофамин, демеколцин, диазихон, элфорнитин, ацетат эллиптиния, эпотилон, этоглуцид, лентинан, лонидамин, мейтанзин, ансамитоцин, митогуазон, митоксантрон, мопиданмол, нитраэрин, пентостатин, фенамет, пирарубицин, лозоксантрон, подофиллиновая кислота, 2-этилгидразид, прокарбазин, разоксан, ризоксин, шизофиллан, спирогерманий, тенуазоновая кислота, триазиквон, роридин A, ангуидин, уретан, виндезин, дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол, пипоброман, гацитозин, доцетаксел, хлорамбуцил, гемцитабин, 6-тиогуанин, меркаптопурин, цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин, винбластин, этопозид, ифосфамид, митоксантрон, винкристин, винорелбин, новантрон, тенипозид, эдатрексат, дауномицин, аминоптерин, кселода, ибандронат, иринотекан, ингибитор топоизомеразы, дифторметилорнитин (DMFO), ретиноевая кислота, капецитабин и их фармацевтически приемлемые соли или производные.

В том случае, когда антитело конъюгируют с противоопухолевым средством, оценить, проявляет ли такое конъюгированное антитело противоопухолевую активность, можно способом, который заключается, например, в осуществлении взаимодействия полученного от мыши анти-CAPRIN-1-антитела одновременно со связанным с лекарственным средством вторым антителом, способным связываться с мышиным антителом, и оценке противоопухолевого действия на раковые клетки человека ex vivo. Такую оценку можно проводить, используя, например антитело против IgG человека, связанное с сапонином (Hum-ZAP (Advanced Targeting Systems, Inc.)).

Альтернативно антитело согласно настоящему изобретению можно вводить в сочетании с противоопухолевым средством, чтобы получить более высокий терапевтический эффект. Такой способ применим по отношению к пациенту с раковой опухолью, экспрессирующей CAPRIN-1, либо до, либо после хирургической операции. В частности, такой способ может быть применен после хирургической операции по поводу раковой опухоли, экспрессирующей CAPRIN-1, которую лечили обычным образом с использованием только противоопухолевого средства, чтобы достичь более высокого уровня профилактики рецидивов рака или более длительного периода выживания.

Примеры противоопухолевого средства, используемого при введении в сочетании с антителом согласно настоящему изобретению, также включают следующие противоопухолевые средства, общеизвестные в литературе и т.д.: паклитаксел, доксорубицин, даунорубицин, циклофосфамид, метотрексат, 5-фторурацил, тиотепа, бусульфан, импросульфан, пипосульфан, бензодопа, карбоквон, метуредопа, уредопа, алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид, триметилоломеламин, буллатацин, буллатацинон, камптотецин, бриостатин, каллистатин, криптофицин 1, криптофицин 8, доластатин, дуокармицин, элеутеробин, панкратистатин, саркодиктиин, спонгистатин, хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин, кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин, калихеамицин, динемицин, клодронат, эсперамицин, аклациномицин, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицин, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицин, дактиномицин, деторбицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, адриамицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицин C, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицин, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин, деноптерин, птероптерин, триметрексат, флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, калустерон, пропионат дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон, аминоглютетимид, митотан, трилостан, фолиновая кислота, ацеглатон, гликозид альдофосфамида, аминолевулиновая кислота, энилурацил, амсакрин, бестрабуцил, бисантрен, эдатраксат, дефофамин, демеколцин, диазихон, элфорнитин, ацетат эллиптиния, эпотилон, этоглуцид, лентинан, лонидамин, мейтанзин, ансамитоцин, митогуазон, митоксантрон, мопиданмол, нитраэрин, пентостатин, фенамет, пирарубицин, лозоксантрон, подофиллиновая кислота, 2-этилгидразид, прокарбазин, разоксан, ризоксин, шизофиллан, спирогерманий, тенуазоновая кислота, триазиквон, роридин A, ангуидин, уретан, виндезин, дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол, пипоброман, гацитозин, доцетаксел, хлорамбуцил, гемцитабин, 6-тиогуанин, меркаптопурин, цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин, винбластин, этопозид, ифосфамид, митоксантрон, винкристин, винорелбин, новантрон, тенипозид, эдатрексат, дауномицин, аминоптерин, кселода, ибандронат, иринотекан, ингибитор топоизомеразы, дифторметилорнитин (DMFO), ретиноевая кислота, капецитабин и их фармацевтически приемлемые соли (известные в данной области) или производные (известные в данной области). Из приведенных выше примеров особенно предпочтительно используют циклофосфамид, паклитаксел, доцетаксел и винорелбин.

Альтернативно, антитело согласно настоящему изобретению может быть связано с радиоактивным изотопом, общеизвестным из литературы и т.д., таким как, ²¹¹At, ¹³¹I, ¹²⁵I, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁵³Sm, ²¹²Bi, ³²P, ¹⁷⁵Lu, ¹⁷⁶Lu, ⁸⁹Sr, ⁶⁴Cu или ¹¹¹In (Hideo Saji, YAKUGAKU ZASSHI 128 (3) 323-332, 8 (2008), Jpn.). Желателен радиоактивный изотоп, эффективный при лечении или диагностике опухоли. Такой радиоактивный изотоп также включен в определение противоопухолевого средства согласно настоящему изобретению.

Идентификация эпитопа

Как показано в примерах ниже, антитело согласно настоящему изобретению связывается с эпитопом в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5. Один из примеров способа подтверждения эпитопа для антитела согласно настоящему изобретению включает способ, который заключается в иммобилизации эпитопа полипептида SEQ ID NO: 5 на планшете и оценке антитела в отношении его реактивности по отношению к такому эпитопу. В частности, эпитоп полипептида SEQ ID NO: 5 иммобилизуют посредством взаимодействия на планшете, на котором связаны электроноакцепторные функциональные группы, через спейсеры, такие как олигоэтиленгликоль. Антитело согласно настоящему изобретению можно подвергнуть взаимодействию с планшетом и оценке его реактивности по отношению к эпитопу посредством взаимодействия с меченым (например, меченым пероксидазой хрена (HRP)) вторым антителом, связывающимся с антителом согласно настоящему изобретению, т.е. может быть подтвержден эпитоп, с которым связывается антитело согласно настоящему изобретению. Эпитоп в полипептиде SEQ ID NO: 5, используемый для иммобилизации на планшете, представляет собой саму последовательность, содержащую, по меньшей мере, эпитоп последовательности SEQ ID NO: 5, или ее модифицированную часть (например, N-концевые или C-концевые остатки модифицированы несколькими произвольными аминокислотами или белком, таким как KLH или (поли)пептид, модифицированный белком MAP). Антитело согласно настоящему изобретению должно связываться только с любым из таких (поли)пептидов.

Хотя с другой стороны, антитело согласно настоящему изобретению может не взаимодействовать с полипептидом SEQ ID NO: 5, т.е. эпитоп может быть не подтвержден в указанном выше способе. В таком случае антитело подвергают взаимодействию с антигеном в условиях раствора, что облегчает связывание между антигеном и антителом. После получения комплекса антиген-антитело способом иммунопреципитации неполный полипептид, связанный с антителом, может быть отделен и исследован в отношении его аминокислотной последовательности, чтобы подтвердить эпитоп для антитела согласно настоящему изобретению. В данном контексте антиген представляет собой, например, полипептид SEQ ID NO: 5 как таковой или его модифицированную часть. Альтернативно, можно использовать даже белок CAPRIN-1, при условии что эпитоп, реактивный по отношению к антителу согласно настоящему изобретению, может быть подтвержден указанным выше способом.

Противоопухолевое действие

Противоопухолевое действие анти-CAPRIN-1-антитела, используемого в настоящем изобретении, на CAPRIN-1-экспрессирующие раковые клетки, по-видимому, вызвано следующим механизмом: опосредованной эффекторными клетками зависимой от антител клеточной цитотоксичностью (ADCC) и зависимой от комплемента цитотоксичностью (CDC) против CAPRIN-1-экспрессирующих клеток. Однако не следует считать, что такой механизм ограничивает объем настоящего изобретения.

Известно, что противоопухолевое действие, основанное на таком механизме, коррелирует с количеством молекул-мишеней, экспрессируемых на поверхности раковых клеток, с которыми антитело связывается (Niwa R., Clinical Cancer Research, 2005, Mar 15; 11 (6): 2327-2336). Количество молекул-мишеней, экспрессируемых на поверхности раковых клеток, можно оценить, используя существующий набор для анализа, позволяющий измерять количество молекул на клеточной поверхности. В частности, количество молекул-мишеней, с которыми антитело связывается, можно определить: осуществляя взаимодействие первых антител, таких как антитела против молекул-мишеней, с раковыми клетками; осуществляя взаимодействие флуоресцентно меченых антител против первых антител с шариками с известным количеством молекул для калибровочной кривой; и измерение средней интенсивности флуоресценции образцов, чтобы получить калибровочную кривую.

Таким образом, анти-CAPRIN-1-антитело, применимое в настоящем изобретении, можно оценить в отношении его активности, как конкретно описано в примерах ниже, анализируя активность в ADCC или CDC против CAPRIN-1-экспрессирующих раковых клеток ex vivo или оценивая количество молекул CAPRIN-1, экспрессированных на поверхности раковых клеток, используя анти-CAPRIN-1-антитело согласно настоящему изобретению в качестве первого антитела.

Анти-CAPRIN-1-антитело, применимое в настоящем изобретении, связывается с белком CAPRIN-1 на раковых клетках и оказывает противоопухолевое действие в результате своей активности. Таким образом, анти-CAPRIN-1-антитело согласно настоящему изобретению вероятно применимо для лечения или профилактики рака. В частности, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики рака, содержащей анти-CAPRIN-1-антитело в качестве активного ингредиента. Анти-CAPRIN-1-антитело, применяемое в целях введения в организм человека (терапия антителами), предпочтительно представляет собой человеческое антитело или гуманизированное антитело для уменьшения иммуногенности.

Анти-CAPRIN-1-антитело с более высокой аффинностью связывания по отношению к белку CAPRIN-1 на поверхности раковых клеток проявляет более сильную противоопухолевую активность. Таким образом, антитело согласно настоящему изобретению обладает более высокой аффинностью связывания по отношению к белку CAPRIN-1 и поэтому можно ожидать, что оно оказывает более сильное противоопухолевое действие. Соответственно антитело согласно настоящему изобретению подходит для фармацевтической композиции, предназначенной для лечения и/или профилактики рака. Такая высокая аффинность связывания антитела согласно настоящему изобретению предпочтительно составляет, по меньшей мере 10⁷ М^-1, по меньшей мере 10⁸ М^-1, по меньшей мере 5×10⁸ М^-1, по меньшей мере 10⁹ М^-1, по меньшей мере 5×10⁹ М^-1, по меньшей мере 10¹⁰ М^-1, по меньшей мере 5×10¹⁰ М^-1, по меньшей мере 10¹¹ М^-1, по меньшей мере 5×10¹¹ М^-1, по меньшей мере 10¹² М^-1 или по меньшей мере 10¹³ М^-1, в величинах константны ассоциации (константы аффинности) Ka (k_on/k_off), которая описана выше.

Связывание анти-CAPRIN-1-антитела с большим количеством молекул CAPRIN-1 на поверхности раковых клеток вызывает более сильную противоопухолевую активность. Желательно, чтобы количество молекул CAPRIN-1 в анализе с использованием анти-CAPRIN-1-антитела согласно настоящему изобретению составляло 10⁴ или больше, предпочтительно 10⁵ или больше на раковую клетку, с которой связывается антитело, чтобы ожидать противоопухолевый эффект. Опухоль (раковые клетки), имеющая большое количество молекул CAPRIN-1 на клеточной поверхности, особенно предпочтительна в качестве раковой опухоли для введения антитела согласно настоящему изобретению.

Связывание с экспрессирующей антиген клеткой

Способность антитела связываться с CAPRIN-1 может быть определена с применением анализа связывания, например, с использованием ELISA, Вестерн-блота, иммунофлуоресценции и проточно-цитометрического анализа, которые описаны в примерах.

Иммуногистохимическое окрашивание

Антитело, которое узнает CAPRIN-1, можно тестировать в отношении его реактивности к CAPRIN-1 иммуногистохимическим способом, хорошо известным специалистам в данной области, с использованием фиксированного параформальдегидом или ацетоном замороженного среза или фиксированного параформальдегидом залитого в парафин среза ткани, полученной от пациента во время хирургической операции или от животного, несущего ксенотрансплантат ткани, инокулированного линией клеток, экспрессирующих CAPRIN-1 либо спонтанно, либо после трансфекции.

Для иммуногистохимического окрашивания антитело, реактивное по отношению к CAPRIN-1, может быть окрашено различными способами. Например, антитело можно визуализировать посредством взаимодействия с конъюгированным с пероксидазой хрена антителом козы против Ig мыши, антителом козы против Ig кролика или антителом козы против Ig цыпленка.

Фармацевтическая композиция и способ лечения и/или профилактики рака

Мишень фармацевтической композиции в случае лечения и/или профилактики рака согласно настоящему изобретению особым образом не ограничена, при условии, что мишенью является раковая опухоль (клетки), экспрессирующая ген CAPRIN-1.

Термины «опухоль» и «раковая опухоль» в используемом в настоящем описании смысле означают раковую неоплазму и использованы взаимозаменяемо.

Целевой раковой опухолью в настоящем изобретении является раковая опухоль, экспрессирующая ген, кодирующий белок CAPRIN-1, и предпочтительно рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак толстого кишечника, рак легкого, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичника, рак простаты, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфому, фибросаркому, мастоцитому или меланому.

Конкретные примеры таких раковых опухолей включают без ограничения аденокарциному молочной железы, аденокарциному молочной железы комплексного типа, раковую смешанную опухоль молочной железы, внутрипротоковую папиллярную аденокарциному, аденокарциному легкого, плоскоклеточную раковую опухоль, мелкоклеточную раковую опухоль, крупноклеточную раковую опухоль, глиому, которая является опухолью нейроэпителиальной ткани, эпендимому, нейронную опухоль, эмбриональную нейроэктодермальную опухоль, невриному, нейрофиброму, менигиому, хронический лимфоцитарный лейкоз, лимфому, лимфому желудочно-кишечного тракта, лимфому пищеварительной системы, мелкоклеточную и среднеклеточную лимфому, рак слепой кишки, рак восходящей ободочной кишки, рак нисходящей ободочной кишки, рак поперечной ободочной кишки, рак сигмовидной ободочной кишки, рак прямой кишки, эпителиальную раковую опухоль яичника, герминому, опухоль из клеток стромы, протоковую карциному поджелудочной железы, инвазивную протоковую карциному поджелудочной железы, аденокарциному поджелудочной железы, ацинарно-клеточную карциному, аденосквамозную карциному, гиганто-клеточную опухоль, внутрипротоковую папиллярно-муцинозную неоплазму, муцинозную кистозную неоплазму, панкреатобластому, серозную цистаденокарциному, солидную псевдопапиллярную опухоль, гастриному, глюкагоному, инсулиному, множественную эндокринную неоплазму типа-1 (синдром Вермера), нефункциональную опухоль островковых клеток, соматостатиному и ВИПому.

Тестируемыми субъектами-реципиентами (пациентами) предпочтительно являются млекопитающие, например, млекопитающие, включая приматов, домашних животных, сельскохозяйственных животных и спортивных животных, и особенно предпочтительно люди, собаки и кошки.

В случае применения антитела согласно настоящему изобретению в виде фармацевтической композиции фармацевтическая композиция может быть приготовлена способом, общеизвестным специалистам в данной области. Например, фармацевтическая композиция может быть использована в форме парентеральной инъекции асептического раствора или суспензии в воде или любой другой фармацевтически приемлемой жидкости. Например, фармацевтическая композиция может быть приготовлена с использованием антитела, смешанного в стандартной лекарственной форме, которая требуется в общепринятой фармацевтической практике, в подходящем сочетании с фармакологически приемлемыми носителями или средами, в частности, стерилизованной водой, физиологическим раствором соли, растительным маслом, эмульгатором, суспендирующим средством, поверхностно-активным веществом, стабилизатором, корригентом, эксципиентом, носителем, консервантом связывающим веществом и т.д. Количество активного ингредиента в таком препарате определяют таким образом, чтобы получить подходящую дозу в предписанном диапазоне.

Асептическая композиция для инъекции может быть приготовлена согласно обычной фармацевтической практике с использованием такого наполнителя, как дистиллированная вода для инъекций.

Примеры водных раствором для инъекций включают физиологический раствор соли, изотоничные растворы, содержащие глюкозу и другие адъюванты, например, D-сорбит, D-маннозу, D-маннит и хлорид натрия. Такие растворы можно использовать в сочетании с подходящим солюбилизатором, например, спиртом (в частности, этанолом) или многоатомным спиртом (например, пропиленгликолем и полиэтиленгликолем) или неионогенным поверхностно-активным веществом, например, полисорбатом 80(TM) или HCO-60.

Примеры масляных растворов включают кунжутное масло и соевое масло. Такие растворы можно использовать в сочетании с бензилбензоатом или бензиловым спиртом в качестве солюбилизатора. Растворы затем могут быть смешаны с буфером (например, раствором фосфатного буфера и раствором натрий-ацетатного буфера), успокаивающим средством (например, гидрохлоридом прокаина), стабилизатором (например, бензиловым спиртом и фенолом) и антиоксидантом. Подходящие ампулы обычно заполняют полученными таким образом инъекционными растворами.

Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению вводят перорально или парентерально, предпочтительно парентерально. Конкретные примеры дозированных форм такой композиции включают инъекции, средства для интраназального введения, средства для введения через легкие и средства для чрезкожного введения. Примеры инъекций включают внутривенную инъекцию, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию и подкожную инъекцию, посредством которых фармацевтическую композицию можно вводить системно или местно.

Также способ введения может быть соответствующим образом выбран в зависимости от возраста, массы, пола, симптомов и т.д. пациента. Доза фармацевтической композиции, содержащей антитело или полинуклеотид, кодирующий антитело, может быть выбрана в диапазоне, например, от 0,0001 до 1000 мг/кг массы тела на дозу. Альтернативно доза может быть выбрана в диапазоне, например, от 0,001 до 100000 мг/организм пациента, хотя доза не обязательно ограничена указанными числовыми значениями. Несмотря на то, что доза и способ введения варьируют в зависимости от массы, возраста, пола, симптомов и т.д. пациента, специалисты в данной области могут соответствующим образом выбрать дозу и способ.

Фармацевтическую композицию, содержащую антитело согласно настоящему изобретению или его фрагмент, можно вводить тестируемому субъекту для лечения и/или профилактики рака, предпочтительно рака молочной железы, рака почки, рака поджелудочной железы, рака толстого кишечника, рака легкого, опухоли головного мозга, рака желудка, рака шейки матки, рака яичника, рака простаты, рака мочевого пузыря, рака пищевода, лейкоза, лимфомы, фибросаркомы, мастоцитомы или меланомы.

Настоящее изобретение, кроме того, охватывает способ лечения и/или профилактики рака, включающий в себя введение тестируемому субъекту фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению в сочетании с противоопухолевым средством, примеры которого приведены выше, или фармацевтической композицией, содержащей противоопухолевое средство. Антитело согласно настоящему изобретению или его фрагмент можно вводить тестируемому субъекту одновременно или отдельно от противоопухолевого средства. В случае раздельного введения такие фармацевтические композиции, любую из них, можно вводить первой или последней. Специалист может соответствующим образом выбрать интервалы между введениями доз, дозы, пути введения и количество доз. Формы дозирования отдельных лекарственных средств, которые необходимо ввести одновременно, также включают, например, фармацевтические композиции, каждая из которых приготовлена смешиванием антитела согласно настоящему изобретению или его фрагмента или противоопухолевого средства в фармацевтически приемлемом носителе (или среде). Приведенное выше описание назначения, приготовления препарата, путей введения, доз, раковой опухоли и т.д., касающихся фармацевтических композиций и лекарственных форм, содержащих антитело согласно настоящему изобретению, также применимо по отношению к любым описанным выше фармацевтическим композициям и лекарственным формам, содержащим противоопухолевое средство.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к сочетанию лекарственного средства для лечения и/или профилактики рака, содержащего фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению и фармацевтическую композицию, содержащую противоопухолевое средство, примеры которого приведены выше, и к способу лечения и/или профилактики рака, включающему в себя введение комбинированного лекарственного средства. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики рака, содержащей антитело согласно настоящему изобретению или его фрагмент и противоопухолевое средство вместе с фармакологически приемлемым носителем.

Полипептид и ДНК

Настоящее изобретение, кроме того, относится к ДНК, кодирующей антитело согласно настоящему изобретению или его фрагмент (связывающий фрагмент антитела). Такая ДНК может представлять собой ДНК, кодирующую тяжелую и/или легкую цепи антитела, или может представлять собой ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой и/или легкой цепей антитела. Такая ДНК также может представлять собой ДНК, кодирующую каждую или сочетание определяющих комплементарность областей антитела. Такая ДНК включает в себя, например, ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 8, 9 и 14, и ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи, содержащую нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11, 12 и 13, в случае антитела (b).

Определяющие комплементарность области (CDR), кодируемые ДНК, имеющей такие последовательности, служат в качестве областей, которые определяют специфичность антитела. Поэтому последовательности, кодирующие другие области (т.е. константные области и каркасные области) антитела, могут представлять собой последовательности, полученные из других антител. В данном контексте «другие антитела» также включают антитела, полученные из других организмов, отличных от человека, и предпочтительно антитела, полученные от человека с точки зрения снижения неблагоприятных реакций. В частности, в описанной выше ДНК области, кодирующие каждую каркасную область и каждую константную область в тяжелой и легкой цепях, предпочтительно содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие соответствующие аминокислотные последовательности, полученные из антитела человека, или их производное с частичной аминокислотной заменой.

Дополнительные примеры ДНК, кодирующей антитело согласно настоящему изобретению, включают ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, в случае антитела (b). В данном контексте нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16 представляет собой, например, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 15. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, представляет собой, например, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 17. В том случае, когда такая ДНК содержит область, кодирующую каждую из константных областей тяжелой и легкой цепей, такая область предпочтительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую полученную из антитела человека аминокислотную последовательность (аминокислотную последовательность каждой константной области тяжелой и легкой цепей).

Такие ДНК для антител могут быть получены, например, способами, описанными выше, или следующим способом: во-первых, получают суммарные РНК из гибридом, продуцирующих антитело согласно настоящему изобретению, используя коммерчески доступный набор для экстракции РНК, и синтезируют кДНК, используя обратную транскриптазу и случайные праймеры или тому подобные. Затем кДНК, кодирующие вариабельные области, амплифицируют в ПЦР, используя олигонуклеотидные праймеры для консервативных последовательностей каждой вариабельной области в известных генах тяжелой и легкой цепей антитела мыши и кролика. Последовательности, кодирующие константные области, могут быть получены с использованием ПЦР-амплификации известных последовательностей. Нуклеотидная последовательность ДНК может быть включена, например, в плазмиду или фаг для секвенирования и определена согласно обычному способу.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к следующим полипептидам и ДНК, имеющим отношение к антителу (a) или (i):

(i) полипептиду, выбранному из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 52 и 54, SEQ ID NO: 16 и 18, SEQ ID NO: 21 и 23, SEQ ID NO: 25 и 23, SEQ ID NO: 29 и 33, SEQ ID NO: 39 и 43, и SEQ ID NO: 49 и 43, и ДНК, кодирующей такой полипептид;

(ii) полипептиду CDR тяжелой цепи, выбранному из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 8, 9 и 10, SEQ ID NO: 8, 9 и 14, SEQ ID NO: 26, 27 и 28, SEQ ID NO: 36, 37 и 38 и SEQ ID NO: 46, 47 и 48, и ДНК, кодирующей такой полипептид; и

(iii) полипептиду CDR легкой цепи, выбранному из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 11, 12 и 13, SEQ ID NO: 30, 31 и 32 и SEQ ID NO: 40, 41 и 42, и ДНК, кодирующей такой полипептид.

Такие полипептиды и ДНК могут быть получены с использованием методики рекомбинации генов, которая описана выше.

Сущность настоящего изобретения

Аспекты настоящего изобретения, описанные выше, суммированы далее.

(1) Антитело или его фрагмент, который обладает иммунологической реактивностью по отношению к неполному полипептиду CAPRIN-1, состоящему из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, или аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более высокую идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью.

(2) Антитело или его фрагмент по п. (1), в котором антитело или его фрагмент обладает цитотоксической активностью против раковой клетки, экспрессирующей белок CAPRIN-1.

(3) Антитело или его фрагмент по п. (1) или (2), в котором антитело представляет собой моноклональное антитело или поликлональное антитело.

(4) Антитело или его фрагмент по любому из пп. (1)-(3), в котором антитело представляет собой человеческое антитело, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или полиспецифичное антитело.

(5) Антитело или его фрагмент по любому из пп. (1)-(4), в котором антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, состоящие из последовательностей SEQ ID NO: 8, 9 и 10 (CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно) и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, состоящие из последовательностей SEQ ID NO: 11, 12 и 13 (CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно) и обладает иммунологической реактивностью по отношению к белку CAPRIN-1.

(6) Антитело или его фрагмент по любому из п.п. (1)-(4), в котором антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, состоящие из последовательностей SEQ ID NO: 8, 9 и 14 (CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно), и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, состоящие из последовательностей SEQ ID NO: 11, 12 и 13 (CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно) и обладает иммунологической реактивностью по отношению к белку CAPRIN-1.

(7) Антитело или его фрагмент по п. (5), в котором антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 52, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 54, и обладает иммунологической реактивностью по отношению к белку CAPRIN-1.

(8) Антитело или его фрагмент по п. (5), в котором антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 23, и обладает иммунологической реактивностью по отношению к белку CAPRIN-1.

(9) Антитело или его фрагмент по п. (5), в котором антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 25, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 23, и обладает иммунологической реактивностью по отношению к белку CAPRIN-1.

(10) Антитело или его фрагмент по п. (6), в котором антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 18, и обладает иммунологической реактивностью по отношению к белку CAPRIN-1.

(11) Антитело или его фрагмент по любому из п.п. (1)-(4), в котором антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, состоящие из последовательностей SEQ ID NO: 26, 27 и 28 (CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно), и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, состоящие из последовательностей SEQ ID NO: 30, 31 и 32 (CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно), и обладает иммунологической реактивностью по отношению к белку CAPRIN-1.

(12) Антитело или его фрагмент по любому из п.п. (1)-(4), в котором антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, состоящие из последовательностей SEQ ID NO: 36, 37 и 38 (CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно), и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, состоящие из последовательностей SEQ ID NO: 40, 41 и 42 (CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно) и обладает иммунологической реактивностью по отношению к белку CAPRIN-1.

(13) Антитело или его фрагмент по любому из п.п. (1)-(4), в котором антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, состоящие из последовательностей SEQ ID NO: 46, 47 и 48 (CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно), и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, состоящие из последовательностей SEQ ID NO: 40, 41 и 42 (CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно), и обладает иммунологической реактивностью по отношению к белку CAPRIN-1.

(14) Антитело или его фрагмент по п. (11), в котором антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 29, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 33, и обладает иммунологической реактивностью по отношению к белку CAPRIN-1.

(15) Антитело или его фрагмент по п. (12), в котором антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 39, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 43, и обладает иммунологической реактивностью по отношению к белку CAPRIN-1.

(16) Антитело или его фрагмент по п. (13), в котором антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 49, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 43, и обладает иммунологической реактивностью по отношению к белку CAPRIN-1.

(17) Антитело или его фрагмент по любому из пп. (1)-(16), в котором антитело или его фрагмент конъюгированы с противоопухолевым средством.

(18) Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики рака, содержащая антитело или его фрагмент по любому из пп. (1)-(17) в качестве активного ингредиента.

(19) Фармацевтическая композиция по п. (18), в которой раковая опухоль представляет собой рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак толстого кишечника, рак легкого, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичника, рак простаты, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфому, фибросаркому, мастоцитому или меланому.

(20) Комбинированное лекарственное средство для лечения и/или профилактики рака, содержащее фармацевтическую композицию по п. (18) или (19) и фармацевтическую композицию, содержащую противоопухолевое средство.

(21) ДНК, кодирующая антитело или его фрагмент по любому из пп. (1)-(16).

(22) Способ лечения и/или профилактики рака, включающий в себя введение тестируемому субъекту антитела или его фрагмента по любому из пп. (1)-(17), фармацевтической композиции по п. (18) или (19) или комбинированного лекарственного средства по п. (20).

Примеры

Далее настоящее изобретение будет описано более конкретно со ссылкой на примеры. Однако не следует полагать, что объем настоящего изобретения ограничен указанными конкретными примерами.

Пример 1. Анализ экспрессии CAPRIN-1 в каждой ткани

Экспрессию гена CAPRIN-1 в нормальных тканях собаки и человека и различных линиях клеток исследовали в ОТ-ПЦР согласно примеру 1(4), описанному в WO2010/016526. В результате наблюдали высокую экспрессию такого гена в семенниках среди здоровых тканей собаки, при этом экспрессию наблюдали в тканях раковой опухоли молочной железы и аденокарциномы собаки. В результате такого же подтверждения экспрессии в тканях человека, экспрессию подтверждали только в семенниках из всех нормальных тканей, как и в случае гена CAPRIN-1 собаки. Напротив, выявляли экспрессию во многих типах линий раковых клеток, включая 8 линий клеток раковой опухоли молочной железы человека (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V и MRK-nu-1) и 4 линии клеток раковой опухоли поджелудочной железы (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1 и BxPc-3) среди раковых клеток. Полученные результаты демонстрируют, что CAPRIN-1 экспрессируется в линиях клеток раковой опухоли молочной железы и линиях клеток раковой опухоли поджелудочной железы, хотя его экспрессия не наблюдается в нормальных тканях, отличных от ткани семенников.

Пример 2. Получение мышиного моноклонального антитела против CAPRIN-1

(1) Получение мышиного анти-CAPRIN-1-антитела № 1

100 мкг белка CAPRIN-1 человека, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, который получен как описано в примере 3 в WO2010/016526, смешивали с равным количеством адъюванта MPL+TDM (производства Sigma-Aldrich Corp.). Такую смесь использовали в качестве раствора антигена для одной мыши. Раствор антигена вводили внутрибрюшинно каждой мыши Balb/c 6-недельного возраста (производства Japan SLC, Inc.). Затем осуществляли 7 бустер-иммунизаций каждую неделю, чтобы завершить иммунизацию. Через три дня после последней инъекции у каждой мыши вырезали селезенку и измельчали между двумя стерилизованными предметными стеклами. Процедуры промывки PBS(-) (производства Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) и удаления надосадка центрифугированием при 1500 об./мин в течение 10 минут повторяли три раза, получая клетки селезенки. Полученные клетки селезенки смешивали с клетками миеломы мышей SP2/0 (приобретены из ATCC) в соотношении 10:1. 200 мкл среды RPMI1640, содержащей 10% FBS, нагревали до 37°C и смешивали с 800 мкл ПЭГ1500 (производства Boehringer Ingelheim GmbH), и полученный таким образом раствор ПЭГ добавляли к смеси клеток, которую затем оставляли стоять в течение 5 минут для слияния клеток. После удаления надосадка центрифугированием при 1700 об./мин в течение 5 минут клетки суспендировали в 150 мл среды RPMI1640, содержащей 15% FBS с добавлением 2% эквивалента раствора HAT (производства Life Technologies, Inc./Gibco) (селективная среда HAT). Полученную суспензию инокулировали в пятнадцать 96-луночных планшетов (производства Thermo Fisher Scientific Inc./Nunc) в концентрации 100 мкл/лунку. Клетки селезенки и клетки миеломы сливали, культивируя при 37°C в течение 7 дней в условиях 5% CO₂, получая гибридомы.

Полученные гибридомы подвергали скринингу в отношении аффинности связывания антител, продуцируемых гибридомами, по отношению к белкам CAPRIN-1 в качестве показателя. Раствор 1 мкг/мл белков CAPRIN-1, полученных способом, описанным в примере 3 в WO2010/016526, добавляли в 96-луночный планшет в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли стоять при 4°C в течение 18 часов. Каждую лунку три раза промывали PBS-T. Затем добавляли 0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) (производства Sigma-Aldrich Corp.) в концентрации 400 мкл/лунку и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 3 часов. Раствор из каждой лунки отбрасывали и каждую лунку промывали три раза, используя 400 мкл PBS-T. Затем добавляли надосадок культуры каждой гибридомы, полученной как описано выше, в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 2 часов. Каждую лунку три раза промывали PBS-T. Затем добавляли HRP-меченые антитела против IgG (H+L) мыши (производства Invitrogen Corp.), разбавленные в 5000 раз в PBS, в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую лунку три раза промывали PBS-T. Затем добавляли раствор субстрата TMB (производства Thermo Fisher Scientific Inc.) в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли стоять в течение 15-30 минут, чтобы вызвать цветную реакцию. После развития окраски реакцию останавливали добавлением 1н серной кислоты в концентрации 100 мкл/лунку. Измеряли оптическую плотность при 450 нм и 595 нм, используя абсорбционный спектрометр. В результате отобрали несколько гибридом, продуцирующих антитела, имеющих высокую оптическую плотность.

Отобранные гибридомы добавляли в 96-луночный планшет при плотности 0,5 клеток/лунку и культивировали в планшете. Спустя одну неделю наблюдали гибридомы, образующие отдельные колонии в лунках. Клетки в таких лунках дополнительно культивировали и клонированные гибридомы подвергали скринингу в отношении аффинности связывания антител, продуцируемых гибридомами, с белками CAPRIN-1 в качестве показателя. В 96-луночный планшет добавляли раствор 1 мкг/мл белков CAPRIN-1, полученных способом, описанным в примере 3 в WO2010/016526 в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли стоять при 4°C в течение 18 часов. Каждую лунку три раза промывали PBS-T. Затем добавляли 0,5% раствор БСА в концентрации 400 мкл/лунку и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 3 часов. Раствор из каждой лунки отбрасывали и каждую лунку три раза промывали, используя 400 мкл PBS-T. Затем добавляли надосадок культуры каждой гибридомы, полученной как описано выше, в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 2 часов. Каждую лунку три раза промывали PBS-T. Затем добавляли HRP-меченые антитела против IgG (H+L) мыши (производства Invitrogen Corp.), разбавленные в 5000 раз в PBS в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли стоять при комнатной температуре на 1 час. Каждую лунку три раза промывали PBS-T. Затем добавляли раствор субстрата TMB (производства Thermo Fisher Scientific Inc.) в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли стоять в течение 15-30 минут, чтобы вызвать цветную реакцию. После развития окраски реакцию останавливали добавлением 1н серной кислоты в концентрации 100 мкл/лунку. Измеряли оптическую плотность при 450 нм и 595 нм, используя абсорбционный спектрометр. В результате получили 61 линию гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, реактивные по отношению к белкам CAPRIN-1.

Затем такие моноклональные антитела повергают скринингу в отношении антител, реактивных по отношению к поверхности клеток раковой опухоли молочной железы, экспрессирующих CAPRIN-1. В частности, 10⁶ клеток линии клеток раковой опухоли молочной железы человека MDA-MB-231V центрифугировали в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Добавляли 100 мкл надосадка культуры каждой гибридомы, полученной как описано выше, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывки PBS добавляли ФИТЦ-меченые антитела козы против IgG мыши (производства Invitrogen Corp.), разбавленные в 500 раз PBS, содержащим 0,1% FBS, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывки PBS измеряли интенсивность флуоресценции, используя FACSCalibur (Becton, Dickinson и Company). С другой стороны, такую же операцию, как описано выше, осуществляли, используя сыворотку каждой необработанной мыши Balb/c 6-недельного возраста, разбавленную в 500 раз средой для культивирования гибридом вместо антител, чтобы получить контроль. В результате отобрали одно моноклональное антитело мыши (мышиное анти-CAPRIN-1-антитело №1), имеющее более высокую интенсивность флуоресценции, чем в контроле, т.е. реактивное по отношению к поверхности клеток раковой опухоли молочной железы.

(2) Идентификация эпитопа CAPRIN-1, узнаваемого мышиным анти-CAPRIN-1-антителом №1

Реактивное по отношению к поверхности раковых клеток моноклональное антитело против CAPRIN-1 (мышиное анти-CAPRIN-1-антитело №1), полученное, как описано в пункте (1), использовали для идентификации узнаваемой при этом области эпитопа CAPRIN-1. Синтезировали 93 пептидных кандидата, каждый из которых состоит из 12-16 аминокислот аминокислотной последовательности белка CAPRIN-1 человека, и каждый растворяли в концентрации 1 мг/мл в ДМСО.

Каждый пептид растворяли в концентрации 30 мкг/мл в 0,1 М растворе натрий-карбонатного буфера (pH 9,6). Раствор добавляли в концентрации 100 мкл/лунку в 96-луночный планшет (производства Thermo Fisher Scientific Inc./Nunc, продукт №: 436006) и оставляли стоять в течение ночи при 4°C. Раствор из каждой лунки отбрасывали и добавляли раствор 10 мМ этаноламин/0,1 М натрий-карбонатный буфер (PH 9,6) в концентрации 200 мкл/лунку и оставляли стоять при комнатной температуре на 1 час. Затем раствор из каждой лунки отбрасывали и каждую лунку промывали дважды PBS, содержащим 0,5% твин 20 (PBST), получая планшет с иммобилизованным пептидом.

Надосадок культуры клеток, содержащий анти-CAPRIN-1-антитело №1, добавляли в концентрации 50 мкл/лунку в каждый планшет, полученный таким образом. После встряхивания при комнатной температуре в течение 1 часа раствор из каждой лунки отбрасывали и каждую лунку три раза промывали PBST. Затем добавляли раствор второго антитела, содержащий HRP-меченые антитела против IgG мыши (производства Invitrogen Corp.), разбавленные в 3000-4000 раз в PBST, в концентрации 50 мкл/лунку. Затем раствор из каждой лунки отбрасывали и каждую лунку промывали шесть раз в PBST.

Добавляли раствор субстрата TMB (производства Thermo Fisher Scientific Inc.) в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли стоять в течение 15-30 минуту, чтобы вызвать цветную реакцию. После развития окраски реакцию останавливали добавлением 1н серной кислоты в концентрации 100 мкл/лунку. Оптическую плотность измеряли при 450 нм и 595 нм, используя абсорбционный спектрометр.

В результате полипептид SEQ ID NO: 5 идентифицировали как неполную последовательность CAPRIN-1, узнаваемую мышиным анти-CAPRIN-1-антителом №1, полученным в примере 2(1).

(3) Получение мышиных анти-CAPRIN-1-антител №2 и №3

Таким же образом, как описано в предыдущем параграфе (1), слитый белок из полипептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, идентифицированного в параграфе (2), и белка-носителя KLH (гемоцианин морского блюдечка «замочная скважина») смешивали в качестве иммуногена с равным количеством адъюванта TiterMax Gold (зарегистрированная торговая марка) (CytRx Corp.) и полученную смесь вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мкг на инъекцию каждой мыши с 7-дневными интервалами. После 4 инъекций получали клетки селезенки от мыши через 3 дня после последней иммунизации и сливали с клетками миеломы мышей таким же образом, как описано в параграфе (1), получая гибридомы. Затем антитела, находящиеся в надосадках культур полученных гибридом, подвергали скринингу, используя в качестве показателя их реактивность по отношению к раствору 1 мкг/мл белка CAPRIN-1, приготовленному, как описано в примере 3 в WO2010/016526, и слитый белок из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 и белок носителя БСА использовали в качестве иммуногена. Раствор 1 мкг/мл белка CAPRIN-1, полученный как описано в примере 3 в WO2010/016526, и 30 мкг/мл слитого белка из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 и белка-носителя БСА добавляли в 96-луночный планшет в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли стоять при 4°C в течение 18 часов. Каждую лунку промывали PBS-T. Затем добавляли раствор Block Ace (DS Pharma Biomedical Co., Ltd) в концентрации 400 мкл/лунку и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 3 часов. Раствор из каждой лунки отбрасывали и каждую лунку промывали PBS-T. Затем добавляли надосадок культуры каждой гибридомы, полученной, как описано выше, в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 2 часов. Каждую лунку промывали PBS-T. Затем добавляли HRP-меченые антитела против IgG (H+L) мыши (производства Invitrogen Corp.), разбавленные в 5000 раз в PBS, в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую лунку промывали PBS-T. Затем добавляли раствор субстрата TMB (производства Thermo Fisher Scientific Inc.) в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли стоять в течение 5-30 минут, чтобы вызвать цветную реакцию. После развития окраски реакцию останавливали добавлением 1н серной кислоты в концентрации 100 мкл/лунку. Оптическую плотность измеряли при 450 нм и 595 нм, используя абсорбционный спектрометр. В результате, отобрали гибридомы, продуцирующие антитела, имеющие высокую оптическую плотность.

Отобранные гибридомы добавляли в 96-луночный планшет при плотности 0,3 клетки/лунку и культивировали в планшете. Спустя одну неделю наблюдали гибридомы, образующие отдельные колонии в лунках. Клетки в таких лунках дополнительно культивировали. Гибридомы, продуцирующие антитела против аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, получали таким же образом, как описано выше, используя аффинность связывания антител, продуцируемых клонированными гибридомами, против неполной последовательности CAPRIN-1 (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 5) в качестве показателя.

Моноклональные антитела, продуцируемые полученными гибридомами, подвергали скринингу в отношении антител, взаимодействующих с поверхностью раковых клеток молочной железы, экспрессирующих CAPRIN-1. В частности, 10⁶ клеток линии клеток раковой опухоли молочной железы человека MDA-MB-231V центрифугировали в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Добавляли 100 мкл надосадка культуры каждой гибридомы, полученной, как описано выше, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывки в PBS добавляли ФИТЦ-меченые антитела козы против IgG мыши (производства Invitrogen Corp.), разбавленные в 500 раз в PBS, содержащем 0,1% FBS, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывки в PBS измеряли интенсивность флуоресценции, используя FACSCalibur (Becton, Dickinson и Company). С другой стороны, такую же операцию, как описано выше, осуществляли, используя вместо антител образец, содержащий сыворотку каждой необработанной мыши Balb/c 6-недельного возраста, разбавленную в 500 раз средой для культивирования гибридом, и образец, подвергнутый взаимодействию только со вторыми антителами, в качестве негативного контроля. В результате, получили два моноклональных мышиных антитела (мышиные анти-CAPRIN-1-антитела №2 и №3), имеющие более высокую интенсивность флуоресценции, чем в негативном контроле, т.е. реактивные по отношению к поверхности раковых клеток молочной железы.

Полученные мышиные анти-CAPRIN-1-антитела №2 и №3 исследовали в отношении их специфичной реактивности по отношению к иммуногенному полипептиду, имеющему неполную последовательность CAPRIN-1 (аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5). Раствор, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, доведенный до концентрации 30 мкг/мл с использованием 0,1 М водного раствора карбоната натрия, и неполную последовательность CAPRIN-1, не содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, добавляли в 96-луночный планшет Immobilizer Amino для ELISA (Nunc/Thermo Fisher Scientific Inc.) в концентрации 100 мкг/мл и подвергали взаимодействию при 4°C в течение всей ночи и всего дня, чтобы связать пептиды с лунками. Добавляли 0,1 М водный раствор карбоната натрия, содержащего 10 мМ этаноламина, в каждую связанную с пептидом лунку и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Раствор в каждой лунке отбрасывали и затем каждую лунку промывали PBS-T. Затем в них добавляли раствор Block Ace в концентрации 400 мкл/лунку и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 3 часов. Раствор из каждой лунки отбрасывали и каждую лунку промывали PBS-T. Затем добавляли надосадок культуры, содержащий мышиные анти-CAPRIN-1-антитела №2 или №3 в концентрации 50 мкл/лунку и подвергали взаимодействию при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем каждую лунку промывали PBS-T. В них добавляли HRP-меченые антитела против IgG (H+L) мыши (производства Invitrogen Corp.), разбавленные в 5000 раз раствором Block Ace в концентрации 50 мкл/лунку и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую лунку осторожно промывали PBS-T. Затем в них добавляли раствор субстрата TMB (производства Thermo Fisher Scientific Inc.) в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли стоять в течение 5-30 минут, чтобы вызвать цветную реакцию. После развития окраски реакцию останавливали добавлением 1н серной кислоты в концентрации 100 мкл/лунку. Оптическую плотность измеряли при 450 нм и 595 нм, используя абсорбционный спектрометр. В результате, мышиные анти-CAPRIN-1-антитела №2 и №3 не взаимодействовали с неполной последовательностью CAPRIN-1, не содержащей аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, и специфично взаимодействовали только с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. Таким образом, было подтверждено, что полипептид SEQ ID NO: 5 содержит область эпитопа для мышиных моноклональных антител №2 и №3.

(4) Характеристика мышиных анти-CAPRIN-1-антител №1, №2 и №3

Амплифицированные фрагменты генов, кодирующих вариабельные области, получали из мышиных анти-CAPRIN-1-антител №1, №2 и №3, полученных в примерах 2(1) и 2(3), и анализировали в отношении их генных последовательностей и их аминокислотных последовательностей согласно способу, описанному в примере 5 в WO2010/016526. Полученная последовательность гена, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи мышиного анти-CAPRIN-1-антитела №1, показана в SEQ ID NO: 34 и его аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 29. Последовательность гена, кодирующая вариабельную область легкой цепи мышиного анти-CAPRIN-1-антитела №1, также показана в SEQ ID NO: 35, и его аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 33. Полученная последовательность гена, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи мышиного анти-CAPRIN-1-антитела №2, показана в SEQ ID NO: 44, и его аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 39. Последовательность гена, кодирующая вариабельную область легкой цепи мышиного анти-CAPRIN-1-антитела №2 показана в SEQ ID NO: 45, и его аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 43. Полученная в результате последовательность гена, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи мышиного анти-CAPRIN-1-антитела №3 дополнительно показана в SEQ ID NO: 50, и его аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 49. Последовательность гена вариабельной области легкой цепи мышиного анти-CAPRIN-1-антитела №3 показана в SEQ ID NO: 45, и его аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 43.

В частности, было подтверждено, что мышиное анти-CAPRIN-1-антитело №1 содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 29, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 33, при этом CDR1, CDR2 и CDR3 в вариабельной области тяжелой цепи состоят из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 26, 27 и 28, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 в вариабельной области легкой цепи состоят из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 30, 31 и 32, соответственно. Также было подтверждено, что мышиное анти-CAPRIN-1-антитело №2 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 39 и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 43, при этом CDR1, CDR2 и CDR3 в вариабельной области тяжелой цепи состоят из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 36, 37 и 38, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 в вариабельной области легкой цепи состоят из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 40, 41 и 42, соответственно. Кроме того, было подтверждено, что мышиное анти-CAPRIN-1-антитело №3 содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 49, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 43, при этом CDR1, CDR2 и CDR3 в вариабельной области тяжелой цепи состоят из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 46, 47 и 48, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 в вариабельной области легкой цепи состоят из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 40, 41 и 42, соответственно.

Пример 3. Получение поликлонального антитела против неполного полипептида CAPRIN-1, присутствующего на поверхности раковых клеток

Чтобы получить поликлональные антитела против неполных полипептидов CAPRIN-1, присутствующих на поверхности раковых клеток, синтезировали полипептид (полученный из CAPRIN-1 пептид, показанный в SEQ ID NO: 5), содержащий область эпитопа для анти-CAPRIN-1-антитела №1, полученного в примере 1(1), полипептид, имеющий область с номерами аминокислотных остатков 50-98 в аминокислотной последовательности CAPRIN-1 человека SEQ ID NO: 2, и полипептид, имеющий область с номерами аминокислотных остатков 233-305 последовательности SEQ ID NO: 2. 1 мг каждого из таких пептидов смешивали в качестве антигена с равным объемом раствора неполного адъюванта Фрейнда (IFA). Такую смесь вводили подкожно каждому кролику четыре раза каждые две недели. Затем собирали кровь, чтобы получить антисыворотку, содержащую каждое поликлональное антитело. Такую антисыворотку затем очищали, используя носитель белка G (производства GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.), и заменяли на PBS, получая поликлональные антитела против неполных полипептидов CAPRIN-1, присутствующих на поверхности раковых клеток. Кроме того, сыворотку кролика, который не получал антигена, очищали, используя носитель белка G, таким же образом, как описано выше, и использовали в качестве контрольных антител.

Пример 4. Анализ экспрессии белка CAPRIN-1 на поверхности мембраны раковых клеток с использованием поликлональных антител против неполных полипептидов CAPRIN-1

Затем 8 линий клеток раковой опухоли молочной железы человека (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V и MRK-nu-1), которые, как было подтверждено, имеют высокий уровень экспрессии гена CAPRIN-1, исследовали в отношении экспрессии белков CAPRIN-1 на клеточной поверхности. 5×10⁵ клеток каждой линии клеток раковой опухоли молочной железы человека, которые, как было подтверждено, имеют экспрессию гена, центрифугировали в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Добавляли 2 мкг (5 мкл) каждого из поликлональных антител против полученных из CAPRIN-1 пептидов (SEQ ID NO: 5), полученных как описано выше в примере 3, и 95 мкл PBS, содержащего 0,1% фетальной сыворотки теленка и перемешивали и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывки PBS полученный раствор перемешивали, добавляя 1 мкл меченых Alexa 488 антител козы против IgG кролика (производства Invitrogen Corp.) и 98 мкл PBS, содержащего 0,1% фетальной сыворотки теленка (FBS) и оставляли стоять в течение 30 часов на льду. После промывки PBS измеряли интенсивность флуоресценции, используя FACSCalibur (Becton, Dickinson и Company). С другой стороны, такую же операцию, как описано выше, осуществляли, используя контрольные антитела, полученные, как описано выше в примере 3, вместо поликлональных антител против полученных из CAPRIN-1 пептидов, получая контроль. В результате все раковые клетки, в которые добавляли анти-CAPRIN-1-антитела, имели интенсивность флуоресценции, повышенную, по меньшей мере, на 35% по сравнению с контролем. Результаты демонстрируют, что белки CAPRIN-1 экспрессируются на поверхности клеточной мембраны линий раковых клеток человека. Указанную выше степень повышения интенсивности флуоресценции выражали в виде степени повышения средней интенсивности флуоресценции (MFI) в каждой линии клеток и вычисляли согласно следующему выражению:

Степень повышения средней интенсивности флуоресценции (степень усиления интенсивности флуоресценции) (%) = ((MFI клеток, подвергнутых взаимодействию с анти-CAPRIN-1-антителами) - (контрольная MFI))/(контрольная MFI)×100

Также, измеряли интенсивность флуоресценции в 2 линиях клеток раковой опухоли почки (Caki-1 и Caki-2), линии клеток раковой опухоли мочевого пузыря (T24), линии клеток раковой опухоли яичника (SKOV3), 2 линиях клеток раковой опухоли легкого (QG56 и A549), линии клеток раковой опухоли простаты (PC3), линии клеток раковой опухоли шейки матки (SW756), линии клеток фибросаркомы (HT1080), 2 линиях клеток опухоли головного мозга (T98G и U87MG), линии клеток раковой опухоли желудка (MNK28), 3 линиях клеток раковой опухоли толстого кишечника (Lovo, DLD-1 и HCT-116) и 4 линиях клеток раковой опухоли поджелудочной железы (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1 и BxPC-3), используя описанный выше способ. В результате все раковые клетки имели интенсивность флуоресценции, по меньшей мере, на 35% выше, чем в контроле.

Как и в случае результатов, полученных, как описано выше, экспрессия белка CAPRIN-1 на поверхности мембраны раковых клеток также была подтверждена с использованием анти-CAPRIN-1-антитела №1, полученного в примере 2.

Пример 5. Получение химерного анти-CAPRIN-1-антитела человека-мыши

Фрагмент амплификации гена, содержащий ген вариабельной области тяжелой цепи мышиного анти-CAPRIN-1-антитела №1, полученного в примере 2, обрабатывали с обоих концов ферментами рестрикции, затем очищали и встраивали согласно обычному способу в вектор pcДНК4/myc-His (производства Invitrogen Corp.), уже имеющий генные вставки полученной из антитела мыши лидерной последовательности и константой области H-цепи IgG₁ человека, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. Также фрагмент амплификации гена, содержащий ген вариабельной области легкой цепи мышиного анти-CAPRIN-1-антитела №1 обрабатывали с обоих концов ферментами рестрикции, затем очищали и встраивали согласно обычному способу вектор pcДНК3.1/myc-His (производства Invitrogen Corp.), уже имеющий генные вставки полученной из антитела мыши лидерной последовательности и константной области L-цепи IgG₁ человека, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.

Затем рекомбинантный вектор, имеющий генную вставку вариабельной области тяжелой цепи мышиного анти-CAPRIN-1-антитела №1, и рекомбинантный вектор, имеющий генную вставку вариабельной области легкой цепи, вводили в клетки CHO-K1 (полученные из Riken Cell Bank). В частности, 2×10⁵ клеток CHO-K1 на лунку культивировали в 1 мл среды Хама F12 (производства Invitrogen Corp.), содержащей 10% FBS, в 12-луночном планшете для культивирования и промывали PBS(-). Затем добавляли 1 мл среды Хама F12, содержащей 10% FBS, на лунку. 250 нг каждого вектора, лизированного в 30 мкл OptiMEM (производства Invitrogen Corp.), смешивали с 30 мкл реагента для трансфекции Polyfect (производства Qiagen N.V.) и полученную смесь добавляли в каждую лунку. Клетки CHO-K1, котрансфицированные рекомбинантными векторами, культивировали в среде Хама F12, содержащей 10% FBS с добавлением 200 мкг/мл зеоцина (производства Invitrogen Corp.) и 200 мкг/мл генетицина (производства Roche Diagnostics K.K.), и затем высевали в 96-луночный планшет при плотности 0,5 клеток/лунку, чтобы получить линии клеток, стабильно продуцирующих химерное анти-CAPRIN-1-антитело №1 человека-мыши, имеющее вариабельные области мышиного анти-CAPRIN-1-антитела №1, полученного в примере 2. Такую же операцию осуществляли, используя мышиные анти-CAPRIN-1-антитела №2 и №3 вместо мышиного анти-CAPRIN-1-антител №1, получая линии клеток, стабильно продуцирующих любое из химерных моноклональных антител №2 и №3 человека-мыши, имеющее вариабельные области анти-CAPRIN-1-антител №2 и №3, соответственно, полученных в примере 2.

Полученные линии клеток культивировали в течение 5 дней во флаконах размером 150-см² при плотности 5×10⁵ клеток/мл, используя 30 мл бессывороточной среды OptiCHO (производства Invitrogen Corp.), получая надосадки культур, содержащие химерное анти-CAPRIN-1-антитело человека-мыши №1. Надосадки культур, содержащие любое из химерных анти-CAPRIN-1-антител №2 и №3 человека-мыши, также получали таким же способом, который описан выше.

Также получали линии клеток, стабильно продуцирующих сравнительные химерные антитела человека-мыши 1-26, в качестве сравнительных образцов таким же образом, как описано выше, соответственно, используя следующие сравнительные антитела: полученные от мыши моноклональные анти-CAPRIN-1-антитела, описанные в WO2010/016526 [сравнительное антитело 1, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 26 (описанную в указанной публикации; то же распространяется на приведенное ниже описание) и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 27; сравнительное антитело 2, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 28, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 29; сравнительное антитело 3, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 30, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 31; сравнительное антитело 4, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 32, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 33; сравнительное антитело 5, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 34, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 35; сравнительное антитело 6, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 36, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 37; сравнительное антитело 7, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 38, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 39; сравнительное антитело 8, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 40, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 41; сравнительное антитело 9, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 42, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 43; сравнительное антитело 10, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 44, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 45; и сравнительное антитело 11, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 46, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 47], моноклональные анти-CAPRIN-1-антитела, описанные в WO2011/096517 [сравнительное антитело 12, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 43 ((описанную в указанной публикации; то же распространяется на приведенное ниже описание), и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 47; и сравнительное антитело 13, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 43 и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: ], моноклональные анти-CAPRIN-1-антитела, описанные в WO2011/096528 [сравнительное антитело 14, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 43 (описанную в указанной публикации; то же распространяется на приведенное ниже описание), и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 47; сравнительное антитело 15, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 51, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 55; сравнительное антитело 16, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 59, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 63; сравнительное антитело 17, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 76, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 80; сравнительное антитело 18, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 84, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 88; и сравнительное антитело 19, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 92, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 96], моноклональное анти-CAPRIN-1-антитело, описанное в WO2011/096519 [сравнительное антитело 20, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 42 (описанную в указанной публикации; то же распространяется на приведенное ниже описание), и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 46], моноклональные анти-CAPRIN-1-антитела, описанные в WO2011/096533 [сравнительное антитело 21, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 43 (описанную в указанной публикации; то же распространяется на приведенное ниже описание), и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 51; сравнительное антитело 22, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 47, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 51; и сравнительное антитело 23, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 63, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 67], и моноклональные анти-CAPRIN-1-антитела, описанные в WO2011/096534 [сравнительное антитело 24, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 43 (описанную в указанной публикации; то же распространяется на приведенное ниже описание), и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 47; сравнительное антитело 25, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 43, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 51; и сравнительное антитело 26, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 63, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 67]. Каждую полученную линию клеток культивировали в течение 5 дней во флаконах размером 150 см² при плотности 5×10⁵ клеток/мл, используя 30 мл бессывороточной среды OptiCHO (производства Invitrogen Corp.), чтобы получить надосадки культуры, содержащие какое-либо из сравнительных химерных моноклональных антител человека-мыши 1-26.

Пример 6. Оценка экспрессии CAPRIN-1 на поверхности различных раковых клеток, выявляемая с использованием моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела

Затем 8 линий клеток раковой опухоли молочной железы человека (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V и MRK-nu-1), 2 линии клеток раковой опухоли почки (Caki-1 и Caki-2), линию клеток раковой опухоли мочевого пузыря (T24), линию клеток раковой опухоли яичника (SKOV3), 2 линии клеток раковой опухоли легкого (QG56 и A549), линию клеток раковой опухоли простаты (PC3), линию клеток раковой опухоли шейки матки (SW756), линию клеток фибросаркомы (HT1080), 2 линии клеток опухоли головного мозга (T98G и U87MG), линию клеток раковой опухоли желудка (MNK28), 3 линии клеток раковой опухоли толстого кишечника (Lovo, DLD-1 и HCT-116) и 4 линии раковой опухоли поджелудочной железы (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1 и BxPC-3), в которых было подтверждено наличие экспрессии гена CAPRIN-1, исследовали в отношении экспрессии в них белков CAPRIN-1 на клеточной поверхности с использованием надосадка культуры, содержащего мышиное анти-CAPRIN-1-антитело №1, полученное в примере 2. 10⁶ клеток каждой клеточной линии центрифугировали в отдельной микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Каждый надосадок культуры (100 мкл), содержащий антитело, добавляли в пробирку и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывки PBS добавляли ФИТЦ-меченые антитела козы против IgG (H+L) мыши (производства Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), разбавленные в PBS, содержащем 0,1% FBS, и оставляли стоять при 4°C в течение 30 минут. После промывки PBS измеряли интенсивность флуоресценции, используя FACSCalibur (Becton, Dickinson и Company). Используемый негативный контроль представлял собой клетки, которые подвергали взаимодействию только со вторыми антителами. В результате, мышиное анти-CAPRIN-1-антитело №1 проявляло реактивность, при этом интенсивность флуоресценции была, по меньшей мере, на 30% выше, чем интенсивность флуоресценции в негативном контроле. Мышиные анти-CAPRIN-1-антител №2 и №3 также давали такие же результаты, что и результаты в случае мышиного анти-CAPRIN-1-антитела №1. Кроме того, химерные анти-CAPRIN-1-антитела №1, №2 и №3 человека-мыши, полученные в примере 5, очищали согласно обычному способу с использованием Hitrap с белком A-сефарозой FF (производства GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.). После замены на PBS(-) каждый раствор фильтровали через 0,22-мкм-фильтр (производства Millipore Corp.) и затем оценивали реактивность по отношению к линиям раковых клеток. Результаты были такими же, как описанные выше результаты. При оценке химерных антител человека-мыши использовали ФИТЦ-меченые антитела козы против IgG (H+L) человека в качестве вторых антител. Полученный результат демонстрирует, что белки CAPRIN-1 экспрессируются на поверхности клеточной мембраны в линиях раковых клеток человека. Указанную выше степень повышения интенсивности флуоресценции выражали в виде степени повышения средней интенсивности флуоресценции (MFI) в каждой линии клеток и вычисляли согласно следующему выражению:

Степень повышения средней интенсивности флуоресценции (степень усиления интенсивности флуоресценции) (%) = ((MFI клеток, подвергнутых взаимодействию с анти-CAPRIN-1-антителами) - (контрольная MFI))/(контрольная MFI)×100

Пример 7. Противоопухолевая активность анти-CAPRIN-1-антитела, направленная против раковой клетки

Чтобы оценить каждое антитело против полученного из CAPRIN-1 пептида (SEQ ID NO: 5), в отношении силы его цитотоксичности против раковых клеток, экспрессирующих CAPRIN-1, определяли ADCC-активность. Для такой оценки использовали кроличьи поликлональные антитела против пептида (SEQ ID NO: 5), полученные в примере 3. Сходную оценку проводили, используя кроличьи поликлональные антитела против других, полученных из CAPRIN-1 человека пептидов (поликлональные антитела против последовательности аминокислотных остатков с номерами 50-98 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 CAPRIN-1 человека и кроличьи поликлональные антитела против последовательности аминокислотных остатков с номерами 233-305, которые получены в примере 3), в качестве антител для сравнения и полученные без обработки из нормальной сыворотки кролика контрольные антитела, полученные в примере 3, в качестве негативного контроля.

10⁶ клеток каждой из линий клеток: линии клеток раковой опухоли молочной железы человека MDA-MB-231V, линии клеток раковой опухоли толстого кишечника человека DLD-1, линии клеток раковой опухоли поджелудочной железы человека Capan-2 и линии клеток раковой опухоли легкого человека QG56, в которых, как было подтверждено, имеет место экспрессия CAPRIN-1, собирали в центрифужную пробирку объемом 50 мл, в которую затем добавляли 100 мккюри хрома-51 с последующей инкубацией при 37°C в течение 2 часов. Затем клетки три раза промывали средой RPMI1640, содержащей 10% фетальной сыворотки теленка, и добавляли при плотности 2×10³ клеток/лунку в каждый 96-луночный планшет с V-образным дном. Кроличьи поликлональные антитела против полученного из CAPRIN-1 человека пептида (SEQ ID NO: 5) и два типа кроличьих поликлональных антител против других полученных из CAPRIN-1 человека пептидов (кроличьи поликлональные антитела против последовательности аминокислотных остатков с номерами 50-98 в SEQ ID NO: 2 CAPRIN-1 человека и кроличьи поликлональные антитела против последовательности аминокислотных остатков с номерами 233-305), которые описаны выше, добавляли по отдельности в концентрации 1 мкг/лунку. Затем добавляли лимфоциты, выделенные из периферической крови человека или кролика согласно обычному способу, при плотности 4×10⁵ клеток/лунку и культивировали при 37°C в течение 4 часов в условиях 5% CO₂. После культивирования в надосадке культуры измеряли количество хрома (Cr)51, высвобождаемого из поврежденных раковых клеток, чтобы вычислить ADCC-активность кроличьих поликлональных антител против каждого полученного из CAPRIN-1 человека пептида, направленную против раковых клеток. В результате, все кроличьи поликлональные антитела, получаемые при иммунизации неполными пептидами CAPRIN-1 человека, имеющими аминокислотную последовательность из остатков аминокислот с номерами 50-98 или остатков аминокислот с номерами 233-305 в последовательности SEQ ID NO: 2 CAPRIN-1 человека, обладали активностью, составляющей менее чем 8% против линии клеток раковой опухоли молочной железы человека MDA-MB-231V, линии клеток раковой опухоли толстого кишечника человека DLD-1, линии клеток раковой опухоли поджелудочной железы человека Capan-2 и линии клеток раковой опухоли легкого человека QG56. Напротив, было подтверждено, что в группах с добавлением кроличьих поликлональных антител против полученного из CAPRIN-1 человека пептида (SEQ ID NO: 5) обладали 28% или более высокой цитотоксической активностью против всех линий раковых клеток. Негативные контрольные антитела имели активность, составляющую менее чем 5%, против всех раковых клеток. Полученные результаты продемонстрировали, что антитело против CAPRIN-1, показанное в SEQ ID NO: 5, проявляет высокую цитотоксическую активность, направленную против раковых клеток, экспрессирующих CAPRIN-1.

Такие результаты определения цитотоксической активности были получены: смешиванием антитела против CAPRIN-1, применяемого в настоящем изобретении, лимфоцитов и 2×10³ клеток каждой линии раковых клеток с включенным хромом-51, которые описаны выше; культивированием клеток в течение 4 часов; измерением после культивирования количества хрома-51, высвобождаемого в среду; и вычислением цитотоксической активности против каждой линии раковых клеток согласно следующему выражению *:

*Выражение: Цитотоксическая активность (%) = количество хрома-51, высвобождаемого из клеток-мишеней, к которым добавляли антитело против CAPRIN-1 и лимфоциты/количество хрома-51, высвобождаемого из клеток-мишеней, к которым добавляли 1 N хлористоводородную кислоту, × 100

Подобным образом химерные анти-CAPRIN-1-антитела человека-мыши №1, №2 и №3 против неполной последовательности (SEQ ID NO: 5) CAPRIN-1, полученные в примере 5, оценивали в отношении их цитотоксической активности против раковых клеток человека. Надосадок культуры каждой клеточной линии, продуцирующей любое из антител, очищали, используя Hitrap с белком A-сефарозой FF (производства GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.), согласно обычному способу. После замены на PBS(-) раствор фильтровали через 0,22-мкм-фильтр (производства Millipore Corp.). Полученное в результате антитело использовали для анализа активности. 10⁶ клеток каждой из клеточных линий: линии клеток раковой опухоли молочной железы человека MDA-MB-231V, линии клеток раковой опухоли толстого кишечника человека DLD-1, линии клеток раковой опухоли поджелудочной железы человека Capan-2 и линии клеток раковой опухоли легкого человека QG56 собирали в центрифужную пробирку объемом 50 мл, в которую затем добавляли 100 мккюри хрома-51 с последующей инкубацией при 37°C в течение 2 часов. Затем клетки три раза промывали средой RPMI1640, содержащей 10% FBS и добавляли при плотности 2×10³ клеток/лунку в каждый 96-луночный планшет с V-образным дном, получая клетки-мишени. Добавляли каждое из очищенных антител (химерные анти-CAPRIN-1-антитела человека-мыши №1, №2 и №3) и сравнительных химерных моноклональных антител человека-мыши 1-26, полученных в примере 5, в концентрации 0,75 мкг/лунку. Популяцию клеток, содержащую NK-клетки человека, выделяли, используя обычный способ, из лимфоцитов периферической крови человека, полученных обычным способом. Популяцию клеток, содержащую NK-клетки человека, которую использовали для такой оценки, получали следующим образом: мононуклеарные клетки периферической крови человека, выделенные с использованием раствора для гравитационного разделения Histopaque для отделения мононуклеарных клеток периферической крови (Sigma-Aldrich Corp.), подвергали взаимодействию с мечеными флуоресцентным красителем ФИТЦ антителами (антителом против CD3 человека, антителом против CD20 человека, антителом против CD19 человека, антителом против CD11c человека или антителом против HLA-DR человека (Becton, и Dickinson и Company)), и популяцию клеток, содержащую NK-клетки, неокрашенные антителами, отделяли в качестве эффекторных клеток, используя сортировщик клеток (FACS Vantage SE (Becton, и Dickinson и Company)) или набор для выделения NK-клеток человека (производства Miltenyi Biotec K.K.). Выделенную популяцию клеток, содержащую NK-клетки, добавляли в планшет при плотности 2×10⁵ клеток/лунку и культивировали при 37°C в течение 4 часов в условиях 5% CO₂. После культивирования измеряли количество хрома-51, высвобождаемого из поврежденных клеток-мишеней в надосадок культуры, чтобы вычислить цитотоксическую активность каждого анти-CAPRIN-1-антитела против раковых клеток. В качестве негативного контроля использовали клетки, к которым добавляли антитела для контроля изотипа. В результате, используемые антитела контрольного изотипа обладали цитотоксической активностью, составляющей менее 5%, против всех линий раковых клеток, и используемые сравнительные химерные моноклональные антитела человека-мыши 1-26 обладали цитотоксической активностью, составляющей менее 5%, против MDA-MB-231V, менее 10% против DLD-1, менее 10% против Capan-2 и менее 10% против QG56. Напротив, химерные анти-CAPRIN-1-антитела человека-мыши №1, №2 и №3 обладали цитотоксической активностью, составляющей 20% или больше против MDA-MB-231V, 25% или больше против DLD-1, 35% или больше против Capan-2 и 30% или больше против QG56. Подобным образом, используемые антитела контрольного изотипа и используемые сравнительные антитела 1-26 обладали цитотоксической активностью, составляющей менее чем 4% против других раковых клеток, линий клеток раковой опухоли молочной железы T47D, Hs578T, BT-20, SK-BR-3, MCF7 и MRK-nu-1, линии клеток глиомы T98G, линии клеток раковой опухоли легкого A549, линии клеток раковой опухоли почки Caki-1, линии клеток раковой опухоли шейки матки SW756, линии клеток раковой опухоли мочевого пузыря T24, линии клеток раковой опухоли желудка MKN28, линии клеток раковой опухоли толстого кишечника SW480, линии лейкозных клеток AML5 и линии клеток лимфомы Ramos. Напротив, подтвердили, что химерные анти-CAPRIN-1-антитела человека-мыши №1, №2 и №3 обладали 12% или более высокой цитотоксической активностью против указанных линий клеток. Полученные результаты показали, что антитела против полученного из CAPRIN-1 пептида, представленные в SEQ ID NO: 5, повреждают CAPRIN-1-экспрессирующие раковые клетки в результате своей ADCC-активности, и продемонстрировали, что химерные анти-CAPRIN-1-антитела человека-мыши №1, №2 и №3 проявляют более высокую цитотоксическую активность против раковых клеток человека, чем сравнительные антитела 1-26.

Такие результаты определения цитотоксической активности были получены: смешиванием антитела против CAPRIN-1, применяемого в настоящем изобретении, лимфоцитов (популяции клеток, содержащей NK-клетки) и 2×10³ клеток каждой линии раковых клеток с включенным хромом-51, которые описаны выше; культивированием клеток в течение 4 часов; измерением после культивирования количества хрома-51, высвобождаемого в среду; и вычислением цитотоксической активности против каждой линии раковых клеток согласно следующему выражению *:

*Выражение: Цитотоксическая активность (%) = количество хрома-51, высвобождаемого из клеток-мишеней, к которым добавляли антитело против CAPRIN-1 и лимфоциты (популяцию клеток, содержащую NK-клетки)/количество хрома-51, высвобождаемого из клеток-мишеней, к которым добавляли 1н хлористоводородную кислоту, × 100

Пример 8. Количество молекул CAPRIN-1 на поверхности различных раковых клеток, узнаваемых анти-CAPRIN-1-антителом №1

Линию клеток раковой опухоли молочной железы человека (MDA-MB-231V), линию клеток раковой опухоли почки (Caki-1), линию клеток раковой опухоли мочевого пузыря (T24), линию клеток раковой опухоли яичника (SKOV3), линию клеток раковой опухоли легкого (QG56 и A549), линию клеток раковой опухоли поджелудочной железы (Capan-2), линию клеток раковой опухоли простаты (PC3), линию клеток раковой опухоли шейки матки (SW756), линию клеток фибросаркомы (HT1080), линию клеток опухоли головного мозга (T98G), линию клеток раковой опухоли желудка (MKN28), линии клеток раковой опухоли толстого кишечника (Lovo и DLD-1), линию клеток лейкоза (AML5) и линию клеток лимфомы (Ramos) исследовали, используя набор для анализа количества молекул «QIFIKIT» (производства Dako Japan Inc.) для определения количества молекул CAPRIN-1 на клеточной поверхности, узнаваемых мышиными анти-CAPRIN-1-антителами №1, №2 и №3. Подобным образом, количество молекул CAPRIN-1 на поверхности различных указанных раковых клеток также исследовали, используя сравнительные моноклональные анти-CAPRIN-1-антитела 1-26, полученные в примере 5.

Согласно протоколу, прилагаемому к набору, каждое антитело (анти-CAPRIN-1-антитела №1 и сравнительные антитела 1-26) разбавляли до 5 мкг/мл (конечная концентрация) в PBS и полученное разведение добавляли к каждой линии клеток и давали возможность взаимодействовать в течение 30 минут. После промывки PBS к каждой линии клеток добавляли флуоресцентно меченые антитела против IgG мыши, прилагаемые к набору, в качестве вторых антител вместе с калибровочными шариками, вложенными в набор, и оставляли стоять в течение 45 минут на льду. Каждую клеточную линию и калибровочные шарики промывали PBS. Затем измеряли интенсивность флуоресценции, используя FACSCalibur (Becton, Dickinson и Company), получая значение средней интенсивности флуоресценции (среднее). Также значение средней интенсивности флуоресценции (среднее) получали в таком же анализе, как описано выше, для сравнительных антител. В качестве негативного контроля использовали клетки, подвергнутые взаимодействию с антителами изотипического контроля, и также получали среднее значение. Каждое среднее значение интенсивности флуоресценции (среднее) использовали для вычисления количества молекул согласно протоколу, прилагаемому к набору. В результате, количество молекул CAPRIN-1 на поверхности различных раковых клеток, узнаваемых мышиными анти-CAPRIN-1-антителами №1, №2 и №3 и сравнительными антителами 12-26 составляло 10⁵ или больше на клетку в случае всех исследованных линий раковых клеток человека. С другой стороны, количество молекул, узнаваемых сравнительными антителами 1-11 было меньше 10⁵ на клетку.

Пример 9. Получение моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела с использованием кролика

(1) Получение кроличьего моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №1

300 мкг антигенного белка (белка CAPRIN-1 человека) смешивали в равном количестве с полным адъювантом Фрейнда. Полученную смесь использовали в качестве раствора антигена для кролика. Смесь антигена с неполным адъювантом Фрейнда использовали для бустер-иммунизаций. Раствор антигена вводили внутрибрюшинно каждому кролику 7-недельного возраста. Затем осуществляли 7 бустер-иммунизаций каждые 4 недели, чтобы завершить иммунизацию. Через четыре дня после последней инъекции селезенку кролика вырезали и измельчали между двумя простерилизованными предметными стеклами. Процедуры промывки PBS(-) (производства Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) и удаления надосадка центрифугированием при 1500 об./мин в течение 10 минут повторяли три раза, получая клетки селезенки. Полученные клетки селезенки смешивали с клетками миеломы кролика в соотношении 5:1. 200 мкл среды IMDM, содержащей 10% FBS, нагревали до 37°C и смешивали с 800 мкл ПЭГ1500 (производства Boehringer Ingelheim GmbH) и полученный таким образом раствор ПЭГ добавляли к смеси клеток, которую затем оставляли стоять в течение 5 минут для слияния клеток. После удаления надосадка центрифугированием при 1700 об./мин в течение 5 минут клетки суспендировали в 300 мл среды IMDM, содержащей 10% FBS, с добавлением 2% эквивалента раствора HAT (производства Life Technologies, Inc./Gibco) (селективная среда HAT). Полученную суспензию инокулировали в тридцать 96-луночных планшетов (производства Thermo Fisher Scientific Inc./Nunc) в концентрации 100 мкл/лунку. Клетки селезенки и клетки миеломы кролика сливали, культивируя при 37°C в течение 7 дней в условиях 5% CO₂, получая гибридомы.

Полученные гибридомы подвергали скринингу, используя реактивность антител, продуцируемых гибридомами, в качестве показателя. Раствор 1 мкг/мл белка CAPRIN-1 добавляли в 96-луночный планшет в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли стоять при 4°C в течение 18 часов. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем в них добавляли 0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) (производства Sigma-Aldrich Corp.) в концентрации 400 мкл/лунку и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 3 часов. Раствор из каждой лунки отбрасывали и каждую лунку промывали три раза, используя 400 мкл PBS-T. Затем в них добавляли надосадок культуры каждой гибридомы, полученной как описано выше, в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 2 часов. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем в них добавляли HRP-меченые антитела против Ig кролика, разбавленные в 5000 раз в PBS, в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем в них добавляли раствор субстрата TMB (производства Thermo Fisher Scientific Inc.) в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли стоять в течение 15-30 минут, чтобы вызвать цветную реакцию. После развития окраски реакцию останавливали добавлением 1н серной кислоты в концентрации 100 мкл/лунку. Измеряли оптическую плотность при 450 нм и 595 нм, используя абсорбционный спектрометр. В результате отобрали несколько гибридом, продуцирующих антитела, имеющих высокую оптическую плотность.

Отобранные гибридомы добавляли в 96-луночный планшет при плотности 0,5 клеток/лунку и культивировали в планшете. Спустя одну неделю наблюдали гибридомы, образующие отдельные колонии в лунках. Клетки в таких лунках дополнительно культивировали и клонированные гибридомы подвергали скринингу реактивности антител, продуцируемых гибридомами, в отношении белков CAPRIN-1 в качестве показателя. В 96-луночный планшет добавляли раствор 1 мкг/мл белка CAPRIN-1 в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли стоять при 4°C в течение 18 часов. Каждую лунку три раза промывали PBS-T. Затем в них добавляли 0,5% раствор БСА в концентрации 400 мкл/лунку и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 3 часов. Раствор из каждой лунки отбрасывали и каждую лунку три раза промывали, используя 400 мкл PBS-T. Затем добавляли надосадок культуры каждой гибридомы, полученной как описано выше, в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 2 часов. Каждую лунку три раза промывали PBS-T. Затем добавляли HRP-меченые антитела против IgG кролика, разбавленные в 5000 раз в PBS, в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли стоять при комнатной температуре на 1 час. Каждую лунку три раза промывали PBS-T. Затем добавляли раствор субстрата TMB (производства Thermo Fisher Scientific Inc.) в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли стоять в течение 15-30 минут, чтобы вызвать цветную реакцию. После развития окраски реакцию останавливали добавлением 1н серной кислоты в концентрации 100 мкл/лунку. Измеряли оптическую плотность при 450 нм и 595 нм, используя абсорбционный спектрометр. В результате получили несколько линий гибридом, продуцирующих кроличьи моноклональные антитела, реактивные по отношению к белкам CAPRIN-1.

Затем такие кроличьи моноклональные антитела, реактивные по отношению к белкам CAPRIN-1, повергали скринингу в отношении антител, реактивных по отношению к поверхности раковых клеток, экспрессирующих CAPRIN-1. В частности, 2×10⁵ клеток каждой из линий: линии клеток раковой опухоли молочной железы человека MDA-MB-231V и линии клеток раковой опухоли легкого человека QG56, центрифугировали в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Добавляли 100 мкл надосадка культуры каждой гибридомы, полученной как описано выше, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывки PBS добавляли ФИТЦ-меченые антитела против IgG (H+L) кролика или меченые Alexa 488 антитела против IgG (H+L) кролика, разбавленные в 100 раз в PBS(-), содержащем 0,05% FBS, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывки PBS измеряли интенсивность флуоресценции, используя FACSCalibur (Becton, Dickinson и Company). С другой стороны, такую же операцию, как описано выше, осуществляли, используя среду для культивирования гибридом, чтобы получить образец для негативного контроля. В результате отобрали одно моноклональное анти-CAPRIN-1-антитело кролика (кроличье моноклональное анти-CAPRIN-1-антитело №1), имеющее более высокую интенсивность флуоресценции, чем в негативном контроле, т.е. реактивное по отношению к поверхности раковых клеток MDA-MB-231 и QG56, экспрессирующих CAPRIN-1.

Затем идентифицировали эпитоп CAPRIN-1, узнаваемый отобранным кроличьим моноклональным анти-CAPRIN-1-антителом №1. Синтезировали 93 выбранных в качестве кандидатов пептидов, каждый из которых состоит из 12-16 аминокислот аминокислотной последовательности белка CAPRIN-1 человека, и каждый из них растворяли в концентрации 1 мг/мл в ДМСО. Каждый пептид растворяли в концентрации 30 мкг/мл в 0,1 М растворе натрий-карбонатного буфера (pH 9,6). Раствор добавляли в концентрации 100 мкл/лунку в 96-луночный планшет (производства Thermo Fisher Scientific Inc./Nunc, продукт №: 436006) и оставляли стоять в течение ночи при 4°C. Раствор из каждой лунки отбрасывали и в них добавляли раствор 10 мМ этаноламина/0,1 М натрий-карбонатного буфера (рH 9,6) в концентрации 200 мкл/лунку и оставляли стоять при комнатной температуре на 1 час. Затем раствор из каждой лунки отбрасывали и каждую лунку промывали дважды PBS, содержащим 0,5% твин 20 (PBST), получая планшет с иммобилизованным пептидом. Для подтверждения того, что белки CAPRIN-1 иммобилизованы на лунках данного планшета, получали другой планшет согласно способу, описанному выше. Кроличье моноклональное анти-CAPRIN-1-антитело №1 в концентрации 0,1 мкг/мл, очищенное обычным способом, добавляли по 50 мкл/лунку в каждый планшет. После встряхивания при комнатной температуре в течение 1 часа раствор из каждой лунки отбрасывали и каждую лунку промывали три раза PBST. Затем в них добавляли раствор второго антитела, содержащий HRP-меченые антитела против IgG кролика, разбавленные в 3000-4000 раз в PBST, в концентрации 50 мкл/лунку. Затем раствор из каждой лунки отбрасывали и каждую лунку промывали шесть раз PBST. В них добавляли раствор субстрата TMB (производства Thermo Fisher Scientific Inc.) в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли стоять в течение 15-30 минут, чтобы вызвать цветную реакцию. После развития окраски реакцию останавливали добавлением 1н серной кислоты в концентрации 100 мкл/лунку. Оптическую плотность измеряли при 450 нм и 595 нм, используя абсорбционный спектрометр. В результате, кроличье моноклональное анти-CAPRIN-1-антитело (кроличье моноклональное анти-CAPRIN-1-антитело №1) проявляло реактивность только по отношению к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 5, из всех 93 пептидов, синтезированных в виде неполных последовательностей CAPRIN-1, и не проявляло реактивности ни к каким другим полипептидам. Также кроличье моноклональное анти-CAPRIN-1-антитело №1 специфично проявляло реактивность по отношению к белку CAPRIN-1. Полученный результат демонстрирует, что эпитоп для кроличьего моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №1, находится в полипептиде SEQ ID NO: 5.

Затем получали амплифицированные фрагменты генов, кодирующих вариабельные области, из кроличьего моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №1, полученного как описано выше, и анализировали в отношении их генных последовательностей и их аминокислотных последовательностей согласно способу, описанному в примере 5 в WO2010/016526. В частности, экстрагировали мРНК из гибридомы, продуцирующей кроличье моноклональное анти-CAPRIN-1-антитело №1. Гены вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) такого антитела получали в ОТ-ПЦР, используя праймеры, специфичные для последовательностей вариабельных областей кролика. Для секвенирования такие гены клонировали в векторах pCR2.1 (производства Invitrogen Corp.). Генные последовательности областей VH и VL в каждой плазмиде, полученной при клонировании, определяли, используя прямой праймер M13 и обратный праймер M13 и флуоресцентный секвенатор.

В результате, было подтверждено, что полученное кроличье моноклональное анти-CAPRIN-1-антитело №1 содержит вариабельную область тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 52, при этом CDR1, CDR2 и CDR3 в вариабельной области тяжелой цепи состоят из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 8, 9 и 10, соответственно, и вариабельную область легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 54, при этом CDR1, CDR2 и CDR3 в вариабельной области легкой цепи состоят из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 11, 12 и 13, соответственно.

(2) Получение химерного анти-CAPRIN-1-антитела №1 человека-кролика

Ген, показанный в виде последовательности SEQ ID NO: 51, для экспрессии вариабельной области тяжелой цепи кроличьего моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №1, полученного как описано выше, и ген, показанный в виде последовательности SEQ ID NO: 53, для экспрессии вариабельной области его легкой цепи, встраивали в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, имеющий вставку гена константной области тяжелой цепи IgG1 человека, и в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, имеющий вставку гена константной области легкой цепи IgG1 человека, соответственно. Полученные два рекомбинантных экспрессирующих вектора вводили в клетки млекопитающих согласно обычному способу, получая надосадок культуры, содержащий гуманизированное кроличье анти-CAPRIN-1-антитело (химерное анти-CAPRIN-1-антитело человека-кролика №1).

(3) Антигенная специфичность, реактивность по отношению к раковой клетке и противоопухолевая активность химерного анти-CAPRIN-1-антитела человека-кролика №1

Надосадок культуры, содержащий химерное анти-CAPRIN-1-антитело человека-кролика №1, полученного в примере 9(2), очищали согласно обычному способу, используя Hitrap с белком A-сефарозой FF (производства GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.). После замены на PBS(-) раствор фильтровали через 0,22-мкм-фильтр (производства Millipore Corp.) и затем оценивали в отношении его антигенной специфичности, реактивности по отношению к раковым клеткам и противоопухолевого действия.

Сначала химерное анти-CAPRIN-1-антитело человека-кролика №1 исследовали таким же образом, как описано в примере 9(1), в отношении специфичности его взаимодействия с белком CAPRIN-1 и полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 в качестве эпитопа для кроличьего моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №1. В результате подтвердили, что химерное анти-CAPRIN-1-антитело человека-кролика №1 обладает специфичностью взаимодействия с белком CAPRIN-1 и полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, как в случае с кроличьим моноклональным анти-CAPRIN-1-антителом №1.

Затем химерное анти-CAPRIN-1-антитело человека-кролика №1 исследовали в отношении его реактивности к белкам CAPRIN-1 на клеточной поверхности 9 линий клеток раковой опухоли молочной железы человека (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231, MRK-nu-1 и MDA-MB-468), 3 линий клеток раковой опухоли почки (Caki-1, Caki-2 и ACHN), линии клеток раковой опухоли мочевого пузыря (T24), 3 линий клеток раковой опухоли яичника (SKOV3, IGROV1 и OVCAR3), 2 линий клеток раковой опухоли легкого (QG56 и A549), линий клеток раковой опухоли простаты (PC3 и DU-145), линии клеток раковой опухоли шейки матки (SW756), линии клеток фибросаркомы (HT1080), 2 линий клеток опухоли головного мозга (T98G и U87MG), линии клеток раковой опухоли желудка (MNK28), 3 линий клеток раковой опухоли толстого кишечника (Lovo, DLD-1 и HCT-116), 4 линий клеток раковой опухоли поджелудочной железы (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1 и BxPC-3), линии лейкозных клеток AML5 и линии клеток лимфомы Рамос, для которых было подтверждено наличие экспрессии гена CAPRIN-1. 10⁶ клеток каждой линии клеток центрифугировали в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Каждый надосадок культуры клеток (100 мкл), содержащий антитело, добавляли в пробирку и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывки PBS добавляли меченые Alexa 488 антитела козы против IgG (H+L) человека (производства Invitrogen Corp.), разбавленные в 100 раз в PBS, содержащем 0,1% FBS, и оставляли стоять при 4°C в течение 60 минут. После промывки PBS(-) измеряли интенсивность флуоресценции, используя FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). В качестве негативного контроля использовали клетки, которые взаимодействовали только со вторыми антителами. В результате, химерное анти-CAPRIN-1-антитело человека-кролика №1 проявляло реактивность с интенсивностью флуоресценции, по меньшей мере, на 30% более высокой, чем в негативном контроле. Данные показали, что часть белка CAPRIN-1, показанная в виде последовательности SEQ ID NO: 5, экспрессируется на поверхности клеточной мембраны линий раковых клеток человека. Указанную выше степень усиления интенсивности флуоресценции выражали в виде степени повышения средней интенсивности флуоресценции (MFI) в каждой линии клеток и вычисляли согласно следующему выражению:

Степень повышения средней интенсивности флуоресценции (степень усиления интенсивности флуоресценции) (%) = ((MFI клеток, подвергнутых взаимодействию с анти-CAPRIN-1-антителами) - (контрольная MFI))/(контрольная MFI)×100

Затем ген, показанный в виде последовательности SEQ ID NO: 51, для экспрессии вариабельной области тяжелой цепи кроличьего анти-CAPRIN-1-антитела №1, и ген, показанный в виде последовательности SEQ ID NO: 53, для экспрессии вариабельной области его легкой цепи, встраивали в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, имеющий вставку гена константной области тяжелой цепи IgG1 мыши, и в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, имеющий вставку гена константной области легкой цепи IgG1 мыши, соответственно. Полученные два рекомбинантных экспрессирующих вектора вводили в клетки млекопитающих согласно обычному способу, получая надосадок культуры, содержащий химерное моноклональное анти-CAPRIN-1-антитело мыши-кролика №1, которое затем очищали таким же образом, как описано для получения очищенного химерного моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела мыши-кролика №1. Полученное химерное моноклональное анти-CAPRIN-1-антитело мыши-кролика №1 использовали для измерения количества молекул с последовательностью SEQ ID NO: 5 на раковых клетках человека, узнаваемых химерным анти-CAPRIN-1-антителом человека-кролика №1, используя коммерчески доступный набор для анализа «QIFIKIT» (производства Dako Japan Inc.). В результате, линия лейкозных клеток AML5 и линия клеток лимфомы Рамос имели 10⁵ молекул на клетку. Другие линии раковых клеток человека имели 10⁵ или больше молекул на клетку.

Затем химерное анти-CAPRIN-1-антитело человека-кролика №1 оценивали в отношении его противоопухолевой активности против раковых клеток человека, экспрессирующих CAPRIN-1. 10⁶ клеток каждой из линий клеток раковой опухоли молочной железы человека MDA-MB-231V, MCF7 и SK-Br-3, линии клеток раковой опухоли толстого кишечника человека DLD-1, линии клеток раковой опухоли поджелудочной железы человека Capan-2, линии клеток раковой опухоли легкого человека QG56, линии клеток раковой опухоли почки Caki-2, линии клеток раковой опухоли яичника SKOV3, линий клеток раковой опухоли простаты PC3 и DU-145, линии клеток опухоли головного мозга T98G, линии клеток раковой опухоли желудка MKN28, линии лейкозных клеток AML5 и линии клеток лимфомы Рамос собирали в центрифужную пробирку объемом 50 мл, в которую затем добавляли 100 мккюри хрома 51 с последующей инкубацией при 37°C в течение 2 часов. Затем клетки три раза промывали средой RPMI1640, содержащей 10% FBS, получая клетки-мишени. Очищенное химерное анти-CAPRIN-1-антитело человека-кролика №1 и сравнительные химерные моноклональные антитела человека-мыши 1-26, полученных в примере 5, добавляли в 96-луночный планшет с V-образным дном в конечной концентрации 5 мкг/мл. Затем NK-клетки человека выделяли из лимфоцитов периферической крови человека, полученных согласно обычному способу и добавляли при плотности 2×10⁵ клеток/лунку. Используемые NK-клетки человека выделяли с применением набора для отделения NK-клеток (производства Miltenyi Biotec K.K.) из мононуклеарных клеток периферической крови человека, выделенных с использованием раствора для гравитационного разделения Histopaque для отделения мононуклеарных клеток периферической крови (Sigma-Aldrich Corp.). NK-клетки смешивали при плотности 2×10³ клеток/лунку с мишенью и каждым антителом, добавленным в 96-луночный планшет с V-образным дном и культивировали при 37°C в течение 4 часов в условиях 5% CO₂. После культивирования измеряли количество хрома 51, высвобождаемого из поврежденных клеток-мишеней в надосадок культуры, чтобы вычислить цитотоксическую активность каждого анти-CAPRIN-1-антитела против раковых клеток. В качестве негативного контроля использовали клетки, к которым добавляли антитела для контроля изотипа. В результате, используемые антитела контрольного изотипа обладали цитотоксической активностью, составляющей менее 6%, против всех линий раковых клеток, и используемые сравнительные химерные моноклональные антитела человека-мыши 1-26 обладали цитотоксической активностью, составляющей менее 5%, против MDA-MB-231V, менее 8% против MCF7 и SK-Br-3, менее 10% против линии клеток раковой опухоли толстого кишечника человека DLD-1, менее 8% против линии клеток раковой опухоли поджелудочной железы человека Capan-2, менее 5% против линии клеток раковой опухоли легкого человека QG56, менее 11% против линии клеток раковой опухоли почки Caki-2, менее 12% против линии клеток раковой опухоли яичника SKOV3, менее 10% против линий клеток раковой опухоли простаты PC3 и DU-145, менее 7% против линии клеток опухоли головного мозга T98G, менее 12% против линии клеток раковой опухоли желудка MKN28 и менее 3% против линии лейкозных клеток AML5 и линии клеток лимфомы Рамос. Напротив, химерное анти-CAPRIN-1-антитело человека-кролика №1 проявляло противоопухолевую активность, составляющую 23%, против MDA-MB-231V, 38% против MCF7, 23% против SK-Br-3, 28% против линии клеток раковой опухоли толстого кишечника человека DLD-1, 35% против линии клеток раковой опухоли поджелудочной железы человека Capan-2, 25% против линии клеток раковой опухоли легкого человека QG56, 23% против линии клеток раковой опухоли почки Caki-2, 24% против линии клеток раковой опухоли яичника SKOV3, 18% против линии клеток раковой опухоли простаты PC3, 20% против DU-145, 15% против линии клеток опухоли головного мозга T98G, 20% против линии клеток раковой опухоли желудка MKN28 и 9% против линии лейкозных клеток AML5 и линии клеток лимфомы Рамос. Полученные результаты показали, что химерное анти-CAPRIN-1-антитело человека-кролика №1 против полученного из CAPRIN-1 пептида, показанного в SEQ ID NO: 5, проявляет противоопухолевую активность против CAPRIN-1-экспрессирующих раковых клеток благодаря своей ADCC-активности, и также показали, что химерное анти-CAPRIN-1-антитело человека-кролика №1 проявляет более сильную цитотоксическую активность против раковых клеток человека, чем цитотоксическая активность сравнительных антител 1-26.

Такие результаты определения цитотоксической активности были получены: смешиванием антитела против CAPRIN-1, применяемого в настоящем изобретении, NK-клеток и 2×10³ клеток каждой линии раковых клеток с включенным хромом 51, которые описаны выше; культивированием клеток в течение 4 часов; измерением после культивирования количества хрома 51, высвобождаемого в среду; и вычислением цитотоксической активности против каждой линии раковых клеток согласно следующему выражению *:

*Выражение: Цитотоксическая активность (%) = количество хрома-51, высвобождаемого из клеток-мишеней, к которым добавляли антитело против CAPRIN-1 и лимфоциты (NK-клетки)/количество хрома-51, высвобождаемого из клеток-мишеней, к которым добавляли 1н хлористоводородную кислоту, ×100 (из таких количеств хрома 51 вычитали количества спонтанно высвобождаемого хрома 51)

(4) Противоопухолевая активность анти-CAPRIN-1-антитела №1, конъюгированного с противоопухолевым средством

Анти-CAPRIN-1-антитело, конъюгированное с противоопухолевым средством, проверяли в отношении его действия в следующем исследовании: антитело против IgG человека, связанное с сапорином в качестве модельного лекарственного противоопухолевого средства (Hum-ZAP (Advanced Targeting Systems, Inc.)), использовали для оценки того, может ли конъюгат химерного анти-CAPRIN-1-антитела человека-кролика № 1 и Hum-ZAP оказывать противоопухолевое действие на линии раковых клеток. Сапорин оказывает убивающее клетки действие только в том случае, когда он включен в клетки.

Каждую из линий: линию клеток раковой опухоли молочной железы человека SK-BR-3, линию клеток раковой опухоли поджелудочной железы человека Capan-2 и клетки раковой опухоли простаты человека PC-3, высевали в среду RPMI, содержащую 10% FBS, в 96-луночный планшет при плотности 5×10² клеток/лунку. В то же время добавляли химерное анти-CAPRIN-1-антитело человека-кролика №1 или IgG1-антитело человека для изотипического контроля в качестве первого антитела в конечной концентрации 300 нг/мл. Затем добавляли Hum-ZAP в качестве второго антитела в конечной концентрации 300 нг/мл, и клетки культивировали при 37°C в течение 5 дней. После 5-дневного культивирования измеряли оптическую плотность, используя набор для подсчета клеток Kit-8 (Dojindo Laboratories) и устройство для считывания микропланшетов, чтобы оценить рост клеток.

В результате, средняя оптическая плотность (O.D.), полученная с использованием антитела для изотипического контроля, составляла 0,77 в случае SK-Br-3, 1,93 в случае Capan-2 и 2,01 в случае PC-3, тогда как средняя оптическая плотность, полученная с использованием химерного анти-CAPRIN-1-антитела человека-кролика №1, составляла 0,34 в случае SK-Br-3, 1,62 в случае Capan-2 и 1,62 в случае PC-3. Полученные результаты продемонстрировали, что конъюгат химерного анти-CAPRIN-1-антитела человека-кролика № 1 и связанного с сапорином антитела против IgG человека включался в раковые клетки при связывании химерного анти-CAPRIN-1-антитела человека-кролика №1 с CAPRIN-1 на поверхности мембраны раковой клетки с проявлением опосредованной сапорином противоопухолевой активности.

(5) Получение гуманизированных анти-CAPRIN-1-антител №1, №2 и №3

Затем получали гуманизированное кроличье анти-CAPRIN-1-антитело №1. На основе информации об аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи кроличьего моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №1, подтвержденной в примере 9(2), конструировали нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 15 так, чтобы с нее можно было экспрессировать вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 16), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 8, 9 и 14, соответственно, и каркасные области, полученные из последовательностей антител человека. Такую нуклеотидную последовательность встраивали в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, имеющий вставку гена константной области тяжелой цепи IgG1 человека. Подобным образом конструировали нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 17 так, чтобы с нее можно было экспрессировать вариабельную область легкой цепи (SEQ ID NO: 18), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 11, 12 и 13, соответственно, и каркасные области, полученные из последовательностей антител человека. Такую нуклеотидную последовательность встраивали в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, имеющий вставку гена константной области легкой цепи IgG1 человека. Два полученных рекомбинантных экспрессирующих вектора вводили в клетки млекопитающих согласно обычному способу, получая надосадок культуры, содержащий гуманизированное кроличье анти-CAPRIN-1-моноклональное антитело №1 (гуманизированное анти-CAPRIN-1-антитело №1).

На основе информации об аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи кроличьего моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №1 также конструировали нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 20 так, чтобы с нее можно было экспрессировать вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 21), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 8, 9 и 10, соответственно, и каркасные области, полученные из последовательностей антител человека. Такую нуклеотидную последовательность встраивали в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, имеющий вставку гена константной области тяжелой цепи IgG1 человека. Подобным образом конструировали нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 22 так, чтобы с нее можно было экспрессировать вариабельную область легкой цепи (SEQ ID NO: 23), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 11, 12 и 13, соответственно, и каркасные области, полученные из последовательностей антител человека. Такую нуклеотидную последовательность встраивали в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, имеющий вставку гена константной области легкой цепи IgG1 человека. Два полученных рекомбинантных экспрессирующих вектора вводили в клетки млекопитающих согласно обычному способу, получая надосадок культуры, содержащий гуманизированное кроличье анти-CAPRIN-1-моноклональное антитело №2 (гуманизированное анти-CAPRIN-1-антитело №2).

На основе информации об аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи кроличьего моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №1 далее конструировали нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 24 так, чтобы с нее можно было экспрессировать вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 25), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 8, 9 и 10, соответственно, и каркасные области, полученные из последовательностей антител человека. Такую нуклеотидную последовательность встраивали в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, имеющий вставку гена константной области тяжелой цепи IgG1 человека. Подобным образом конструировали нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 22 так, чтобы с нее можно было экспрессировать вариабельную область легкой цепи (SEQ ID NO: 23), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 11, 12 и 13, соответственно, и каркасные области, полученные из последовательностей антител человека. Такую нуклеотидную последовательность встраивали в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, имеющий вставку гена константной области легкой цепи IgG1 человека. Два полученных рекомбинантных экспрессирующих вектора вводили в клетки млекопитающих согласно обычному способу, получая надосадок культуры, содержащий гуманизированное кроличье анти-CAPRIN-1-моноклональное антитело №3 (гуманизированное анти-CAPRIN-1-антитело №3).

(6) Антигенная специфичность, реактивность по отношению к раковой клетке и противоопухолевая активность гуманизированного моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела

3 полученных таким образом гуманизированных антитела (гуманизированные моноклональные анти-CAPRIN-1-антитела №1-№3) оценивали в отношении их реактивности по отношению к CAPRIN-1 таким же образом, как описано в примере 9(3). В результате, такие антитела обладают реактивностью по отношению к белку CAPRIN-1, пептиду эпитопа, показанному в SEQ ID NO: 5, и различным раковым клеткам на том же уровне что и химерное моноклональное анти-CAPRIN-1-антитело человека-кролика №1. Указанные 3 гуманизированных моноклональных анти-CAPRIN-1-антитела дополнительно оценивали в отношении их противоопухолевой активности против различных раковых клеток (линий клеток раковой опухоли молочной железы человека MDA-MB-231, MCF7 и SK-Br-3, линий клеток раковой опухоли толстого кишечника человека DLD-1, линий клеток раковой опухоли поджелудочной железы человека Capan-2, линии клеток раковой опухоли легкого человека QG56, линии клеток раковой опухоли почки Caki-2, линии клеток раковой опухоли яичника SKOV3, линий клеток раковой опухоли простаты PC3 и DU-145, линии клеток опухоли головного мозга T98G, линии клеток раковой опухоли желудка MKN28, линии клеток раковой опухоли поджелудочной железы Capan-2, линии лейкозных клеток AML5 и линии клеток лимфомы Рамос) таким же образом, как описано в примере 9(3). В результате, все антитела проявляли противоопухолевую активность на таком же уровне, что и химерное моноклональное анти-CAPRIN-1-антитело человека-кролика №1.

Промышленная применимость

Антитело согласно настоящему изобретению применимо для лечения и/или профилактики рака.

Все публикации, патенты и заявки на выдачу патентов, цитированные в настоящем описании, включены в настоящую публикацию в виде ссылки в полном объеме.

Настоящее изобретение относится к антителу, мишенью которого является антигенный белок раковой опухоли, специфично экспрессируемый на поверхности раковых клеток. Описано антитело или его фрагмент, которые обладают иммунологической реактивностью по отношению к неполному полипептиду CAPRIN-1, состоящему из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 5. Также описана фармацевтическая композиция для лечения или профилактики рака, содержащая данное антитело или его фрагмент в качестве активного ингредиента. Также представлен способ лечения или профилактики рака, включающий использование данного антитела или его фрагмента. Изобретение может быть применено в терапевтическом или профилактическом средстве против рака. 5 н. и 20 з.п. ф-лы, 9 пр.

1. Антитело или его фрагмент, которые связываются с белком CAPRIN-1 и обладают иммунологической реактивностью по отношению к неполному полипептиду CAPRIN-1, состоящему из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 5, где указанное антитело получено иммунизацией животного указанным полипептидом.

2. Антитело или его фрагмент по п. 1, где антитело или его фрагмент обладают цитотоксической активностью, направленной против раковой клетки, экспрессирующей белок CAPRIN-1.

3. Антитело или его фрагмент по п. 1 или 2, в котором антитело представляет собой моноклональное антитело или поликлональное антитело.

4. Антитело или его фрагмент по п. 1, в котором антитело представляет собой человеческое антитело, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или полиспецифичное антитело.

5. Антитело или его фрагмент по п. 1, в котором антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, состоящие из аминокислотных последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 8, 9 и 10 (CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно), и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, состоящие из аминокислотных последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 11, 12 и 13 (CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно).

6. Антитело или его фрагмент по п. 5, в котором антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 52, и вариабельную области легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 54.

7. Антитело или его фрагмент по п. 5, в котором антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 23.

8. Антитело или его фрагмент по п. 5, в котором антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 25, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 23.

9. Антитело или его фрагмент по п. 1, в котором антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, состоящие из аминокислотных последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 8, 9 и 14 (CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно), и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, состоящие из аминокислотных последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 11, 12 и 13 (CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно).

10. Антитело или его фрагмент по п. 9, в котором антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 18.

11. Антитело или его фрагмент по п. 1, в котором антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 26, 27 и 28 (CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно), и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 30, 31 и 32 (CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно), и обладает иммунологической реактивностью по отношению к белку CAPRIN-1.

12. Антитело или его фрагмент по п. 8, в котором антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 29, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 33.

13. Антитело или его фрагмент по п. 1, в котором антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 36, 37 и 38 (CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно), и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 40, 41 и 42 (CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно), и обладает иммунологической реактивностью по отношению к белку CAPRIN-1.

14. Антитело или его фрагмент по п. 13, в котором антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 39, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 43.

15. Антитело или его фрагмент по п. 1, в котором антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 46, 47 и 48 (CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно), и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 40, 41 и 42 (CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно), и обладает иммунологической реактивностью по отношению к белку CAPRIN-1.

16. Антитело или его фрагмент по п. 15, в котором антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 49, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 43.

17. Антитело или его фрагмент по п. 1, в котором антитело или его фрагмент конъюгированы с противоопухолевым средством.

18. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики рака, содержащая антитело или его фрагмент по любому из пп. 1-17 в качестве активного ингредиента.

19. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики рака, содержащая эффективное количество антитела или его связывающего фрагмента, которые связываются с белком CAPRIN-1 и обладают иммунологической реактивностью по отношению к неполному полипептиду CAPRIN-1, состоящему из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 5.

20. Фармацевтическая композиция по п. 19, где антитело или его связывающий фрагмент обладает цитотоксической активностью, направленной против раковой клетки, экспрессирующей белок 120 CAPRIN-1.

21. Фармацевтическая композиция по п. 19, где антитело представляет собой моноклональное антитело или поликлональное антитело.

22. Фармацевтическая композиция по п. 19, где антитело представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или полиспецифичное антитело.

23. Фармацевтическая композиция по п. 18 или 19, в которой раковая опухоль представляет собой рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак толстого кишечника, рак легкого, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичника, рак простаты, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфому, фибросаркому, мастоцитому или меланому.

24. Комбинированное лекарственное средство для лечения или профилактики рака, содержащее фармацевтическую композицию по любому из пп. 18-23 и фармацевтическую композицию, содержащую противоопухолевое средство.

25. Способ лечения или профилактики рака, включающий в себя введение тестируемому субъекту антитела или его фрагмента по любому из пп. 1-17, фармацевтической композиции по любому из пп. 18-23 или комбинированного лекарственного средства по п. 24.