Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу детекции рака с использованием CAPRIN-1 в качестве опухолевого маркера. Предшествующий уровень техники
Рак занимает лидирующее место по причине смертности. В настоящее время, основным способом лечения этого заболевания является хирургическая операция в комбинации с лучевой терапией и/или химиотерапией. Благодаря успехам, уже достигнутым в области медицины, рак, в зависимости от его типа, может быть надежно излечим, если он был обнаружен на ранней стадии. Поэтому необходимо разработать способ детекции рака, который не причиняет ни физического, ни материального ущерба больному, страдающему раком, и который мог бы быть осуществлен с помощью рутинных тестов.
В последнее время, широкое распространение получили методы анализа опухолевых продуктов, таких как опухолевые маркеры. Термин «опухолевые продукты» означает, например, опухолеассоциированные антигены, ферменты, специфические белки, метаболиты, онкогены, онкогенные продукты и гены-супрессоры опухоли. В качестве опухолевых маркеров, которые могут быть использованы для диагностики некоторых видов рака, являются канцероэмриональный антиген СЕА, гликопротеин СА19-9, антиген PSA, специфичный для предстательной железы, кальцитонин (пептидный гормон, продуцируемый в щитовидной железе) и т.п. Однако, для многих видов рака, опухолевые маркеры, которые могли бы быть использованы для диагностики рака, еще не обнаружены. Кроме того, подавляющее большинство уже известных опухолевых маркеров присутствуют в физиологических жидкостях лишь в очень небольших количествах (порядка пг/мл), а поэтому, для детектирования этих маркеров требуются высокочувствительные аналитические методы или какие-либо специальные методы. В таких случаях, разработка новых методов диагностики рака, позволяющих проводить в высокой степени чувствительные и простые тесты на рак различных типов откроет новую эру в детекции рака различных типов.
С другой стороны, несмотря на последние достижения в разработке новых хирургических технологий или новых противораковых средств, существующие способы лечения рака пока не дают удовлетворительных положительных результатов. Это обусловлено тем, что для многих видов рака не существует эффективных методов диагностики рака за исключением некоторых видов рака. По этой причине, эти раковые заболевания невозможно детектировать на ранней стадии.
Последние достижения в области молекулярной биологии или иммунологии рака, позволили идентифицировать антитела, специфически реагирующие с раковыми антигенами, и разработать молекулярные лекарственные средства для нацеливания на раковые антигены, ассоциированные со злокачественной трансформацией или прогрессированием рака и т.п., что дало возможность улучшить прогноз конкретного ракового заболевания после терапии, нацеленной на раковые антигены. В частности, было разработано множество терапевтических антител для лечения рака, нацеленных на антигенные белки, присутствующие на раковых клетках, и такие антитела могут быть использованы для лечения рака. Эти терапевтические антитела представляют особый интерес для специалистов, поскольку они являются достаточно эффективными в качестве терапевтических лекарственных средств для лечения рака. Однако, подавляющее большинство антигенных белков, на которые нацелены эти лекарственные средства, также экспрессируются и в нормальных клетках. В результате введения антител, раковые клетки, а также нормальные клетки, экспрессирующие эти антигены, разрушаются, что приводит к нежелательным побочным эффектам. Кроме того, эффективность лечения рака у различных пациентов в значительной степени варьируется, что обусловлено различной этиологией у различных пациентов, страдающих раком. Так, например, эффективность хирургической операции, химиотерапии или лучевой терапии широко варьируется с точки зрения исхода лечения и прогноза ракового заболевания в зависимости от стадии его развития. Известно, что различные индивидуумы имеют разную чувствительность к одному и тому же противораковому терапевтическому лекарственному средству, что обусловлено индивидуальными различиями пациентов. Это означает, что определенное лекарственное средство является эффективным для одних пациентов и неэффективным для других пациентов.
Таким образом, возможность введения некоторых терапевтических лекарственных средств пациентам, страдающим раком, определяют путем предварительного измерения экспрессии генов или белков, ассоциированных с развитием заболевания у пациентов, и последующего проведения анализа на эффективность конкретного лекарственного средства у пациента, у которого экспрессируются данный ген или белок. В частности, присутствие ракового антигена в образце, например в сыворотке или ткани, взятых у пациента, страдающего раком, определяют в соответствии со стандартной клинической практикой с применением метода анализа на ген или белок, ассоциированный с конкретным видом рака. Затем определяют эффективность введения терапевтического лекарственного средства, специфичного к раковому антигену. Так, например, раковые ткани, взятые из толстой кишки пациента, страдающего раком, анализируют методом иммуногистохимического окрашивания с использованием EGFR (рецептора эпидермального фактора роста), называемого «EGFRpharm (Dako, an Agilent Technologies Company)», в целях предсказания эффективности лекарственного средства Erbitux® для лечения рака толстой кишки. Затем определяют эффективность введения Erbitux. Альтернативно, раковые ткани, взятые у пациентки с раком молочной железы, анализируют методом иммуногистохимического окрашивания с использованием Her2 «HercepTest» в целях предсказания эффективности лекарственного средства герцептина (Herceptin) для лечения рака молочной железы. После этого определяют эффективность введения герцептина.
В некоторых случаях, животные-компаньоны, которые рассматриваются их хозяевами как члены семьи, часто ведут такой же образ жизни, как и их хозяева. А поэтому, по раковым заболеваниям животных-компаньонов можно с уверенностью предсказать, что их хозяева имеют высокий риск развития рака в будущем.
Известно, что возраст собак, которые являются типичными животными-компаньонами, в 7 раз короче человеческого возраста. Сообщалось, что в настоящее время в Японии число собак составляет приблизительно 6,7 миллиона, а в США - приблизительно 17,64 миллиона. Обычно, собакам вводят вакцины против бешенства, а также комбинированные вакцины, такие как пятивалентные, семивалентные или восьмивалентные вакцины, которые способствуют снижению смертности от высоколетальных инфекций, включая собачью парвовирусную инфекцию; инфекцию, вызывающую чуму собак; вирусную инфекцию, вызывающую собачий парагрипп (собачий кашель); инфекцию, вызываемую собачьим аденовирусом типа 2 (собачий кашель); собачий инфекционный гепатит; собачью коронавирусную инфекцию и лептоспироз. Поэтому, в среднем, продолжительность жизни домашних собак является более высокой, и по оценкам специалистов, собаки-компаньоны, достигшие возраст 7 лет или более, составляют 35,5% от общего числа собак. У собак, как и у людей, смертность от рака, гипертензии и сердечнососудистых заболеваний постоянно возрастает. В настоящее время, в США ежегодно регистрируется гибель приблизительно 4 миллиона собак от рака. Существует мнение, что в Японии, 1,6 миллионов собак, вероятно, страдают некоторыми видами опухолей. Однако, тщательное обследование животных-компаньонов, в отличие от людей, проводится не очень часто. По этой причине, такое заболевание обнаруживается слишком поздно. В большинстве случаев, хозяева домашних собак обнаруживают у них симптомы только тогда, когда опухоль становится достаточно крупной, и лишь после этого приводят животное в ветеринарную клинику. Если такая крупная опухоль являются злокачественной, то для лечения такой опухоли уже слишком поздно проводить даже хирургическое лечение (например, хирургическую операцию) или консервативное лечение с использованием противораковых средств или т.п. Опухоли, которые были подтверждены ветеринаром как злокачественные, обычно подвергают лечению противораковыми средствами без хирургической операции. Даже в случае проведения хирургической операции необходимо обезопасить иссеченные края или принять срочные меры во время проведения хирургической операции, такие как меры по предотвращению гематогенного или клеточного метастазирования во время операции. При этом, желательно, чтобы лечение противораковыми средствами было проведено сразу после хирургической операции, после чего, через короткие интервалы времени необходимо также проводить наблюдение за животным. Таким образом, медикаментозное лечение с использованием терапевтических лекарственных средств является жизненно необходимым для лечения животных-компаньонов, страдающих раком. Если будет разработан способ детектирования, осуществляемый посредством анализа на гены или белки, ассоциированные с некоторыми видами рака, то это позволит проводить более эффективное лечение, чем лечение уже известными способами, и такой способ лечения животных будет предпочтительным как для хозяев животных, так и для ветеринаров.
Цитоплазматический белок 1 (CAPRIN-1), ассоциированный с пролиферацией клеток, представляет собой внутриклеточный белок, который, как известно, экспрессируется после активации или деления нормальных покоящихся клеток, и в условиях стресса образует цитоплазматические гранулы с внутриклеточными РНК, участвующими в регуляции транспорта и трансляции мРНК. Кроме того, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что CAPRIN-1 экспрессируется на высоком уровне на мембранной поверхности раковых клеток молочной железы, а антитела против CAPRIN-1 обладают сильным противоопухолевым действием на раковые клетки молочной железы (патентный документ 1). В другом документе сообщается, что экспрессия CAPRIN-1 в образце, взятом у пациента, может быть измерена с использованием антитела, связывающегося с белком CAPRIN-1, экспрессируемым на клеточной поверхности, что, тем самым, позволяет детектировать рак и определить степень его злокачественности (патентный документ 2). В частности, имеется сообщение о том, что плазматический мембранный белок CAPRIN-1 может служить в качестве мишени для лечения рака или т.п. Как упоминалось выше, из-за индивидуальных различий пациентов, страдающих раком, необходимо определить наличие CAPRIN-1 в образце, взятом у пациента, страдающего раком, для оценки эффективности введения терапевтического лекарственного средства, нацеленного на CAPRIN-1, например, антитела. Тем не менее, пока еще не существует каких-либо данных о способе детектирования CAPRIN-1, позволяющих разработать такое специфическое терапевтическое лекарственное средство, а также не существует каких-либо реагентов для детектирования рака в образце, взятом у пациента, страдающего раком.
Список цитируемой литературы
Патентные документы:
Патентный документ 1: WO 2010/016526
Патентный документ 2: WO 2010/016527
Описание сущности изобретения
Техническая проблема
Целью настоящего изобретения является разработка способа обнаружения рака, который может быть применен для диагностики рака. Другой целью настоящего изобретения является разработка способа обнаружения рака, который включает определение присутствия и уровня экспрессии CAPRIN-1 в образце, взятом у пациента, страдающего раком, для определения эффективности введения пациенту, страдающему раком, лекарственного средства, нацеленного на CAPRIN-1, а также разработка лекарственного средства и набора для диагностики рака.
Способы решения данной проблемы
В результате проведения тщательных исследований, авторами настоящего изобретения были получены кДНК, кодирующие белки, связывающиеся с антителами, присутствующими в сыворотке, взятой из организма с раковой опухолью, методом SEREX с использованием библиотеки кДНК, выделенных из яичек собак, и в сыворотке собак с раковой опухолью, и на основе этих кДНК были также получены собачьи белки CAPRIN-1, имеющие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 и 14. На основе человеческих генов, гомологичных полученным генам, авторами настоящего изобретения были также продуцированы человеческие белки CAPRIN-1, имеющие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 2 и 4. Затем, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что гены, кодирующие CAPRIN-1, специфически экспрессируются в яичках собак и человека, соответственно, и в злокачественных раковых клетках (см. описанный ниже пример 1), и что моноклональные антитела, продуцированные с использованием рекомбинантных полипептидов в качестве антигенов, содержащих аминокислотные последовательности CAPRIN-1, могут связываться с CAPRIN-1 в различных раковых тканях и разрушать раковые клетки, имеющие на своей поверхности CAPRIN-1. В результате этого, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что CAPRIN-1 может быть использован в качестве мишени для лечения рака. Авторами настоящего изобретения было также обнаружено, что CAPRIN-1 может быть специфически детектирован в образцах, взятых у пациента, страдающего раком, с использованием вышеупомянутых моноклональных антител. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу детектирования рака в биологическом образце, где указанный способ включает измерение уровня экспрессии CAPRIN-1. Кроме того, авторами настоящего изобретения был разработан способ детектирования CAPRIN-1 в образце, взятом у пациента, страдающего раком, и измерения уровня экспрессии этого белка с помощью иммунологического анализа, проводимого с использованием любого из вышеупомянутых моноклональных антител, например, с помощью ELISA-анализа сыворотки, взятой у пациента, страдающего раком, и/или методом иммуногистохимического окрашивания раковых тканей. В результате проведения анализа образца раковой опухоли указанным способом, авторами настоящего изобретения было также обнаружено, что применение лекарственного средства, нацеленного на CAPRIN-1, может оказаться эффективным, если у данного пациента наблюдается высокий уровень экспрессии CAPRIN-1. И исходя из этих результатов было разработано настоящее изобретение.
Настоящее изобретение относится к способу детектирования рака, который осуществляют в биологическом образце, где указанный способ включает детектирование CAPRIN-1 в образце и измерение количества этого CAPRIN-1. Настоящее изобретение также относится к способу диагностики, в целях определения возможности применения терапевтического лекарственного средства против CAPRIN-1, где указанный способ включает измерение уровня экспрессии CAPRIN-1 в ткани до введения терапевтического лекарственного средства против CAPRIN-1 для того, чтобы определить, можно ли пациенту, страдающему раком, вводить терапевтическое лекарственное средство, нацеленное на CAPRIN-1, например, антитело, и предсказать эффективность такого введения. Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству или к набору для диагностики рака, которые содержат антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые способны вступать в реакцию с антигеном CAPRIN-1, или его антигенсвязывающий фрагмент.
В частности, настоящее изобретение включает следующие аспекты.
(1) Способ детектирования рака, включающий измерение уровня экспрессии CAPRIN-1 в биологическом образце посредством реакции «антиген-антитело» с использованием антитела, обладающего иммунологической реактивностью с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63.
(2) Способ детектирования рака по п. (1), где измеряемый CAPRIN-1 представляет собой (а) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в любой последовательности SEQ ID NO: с четными номерами от SEQ ID NO: 2 до 30 в списке последовательностей; или (b) полипептид, имеющий последовательность, которая на 85% или более идентична последовательности полипептида CAPRIN-1.
(3) Способ детектирования рака по п. (1) или (2), где указанный биологический образец представляет собой образец, взятый у человека, собаки или кошки.
(4) Способ детектирования рака по любому из п.п. (1)-(3), где указанный биологический образец представляет собой образец, взятый у собаки, и где измеряемый CAPRIN-1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 или 14.
(5) Способ детектирования рака по любому из п.п. (1)-(3), где указанный биологический образец представляет собой образец, взятый у человека, и где измеряемый CAPRIN-1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 или 4.
(6) Способ детектирования рака по любому из п.п. (1)-(5), где уровень экспрессии измеряемого CAPRIN-1, превышающий уровень экспрессии CAPRIN-1 у здорового индивидуума, указывает на наличие раковой опухоли, являющейся мишенью для антитела, используемого в качестве терапевтического лекарственного средства для лечения рака.
(7) Способ детектирования рака по любому из п.п. (1)- (6), где измерение уровня экспрессии CAPRIN-1 осуществляют методом иммунологического анализа.
(8) Способ детектирования рака по п. (7), где метод иммунологического анализа представляет собой ELISA и/или метод иммуногистохимического окрашивания.
(9) Способ детектирования рака по любому из п.п. (1)-(8), где указанный образец представляет собой физиологическую жидкость, ткань или клетку.
(10) Способ детектирования рака по любому из п.п. (1)-(9), где указанный рак представляет собой по меньшей мере одно раковое заболевание, выбранное из группы, состоящей из рака молочной железы, опухоли головного мозга, рака пищевода, рака желудка, рака легкого, рака печени, рака почки, рака щитовидной железы, рака селезенки, рака поджелудочной железы, рака толстой кишки, рака кожи, рака яичника, рака матки, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря, рака яичка, остеосаркомы и фибросаркомы.
(11) Способ детектирования рака по любому из п.п. (1)-(10), где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой моноклональное антитело, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 70, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или антигенсвязывающий фрагмент этого антитела.
(12) Лекарственное средство или набор для диагностики рака, содержащие антитело, обладающее иммунологической реактивностью с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63, или антигенсвязывающий фрагмент этого антитела.
(13) Лекарственное средство или набор для диагностики рака по п. (12), где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой моноклональное антитело, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 70, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или антигенсвязывающий фрагмент этого антитела.
(14) Способ отбора терапевтического лекарственного средства, специфичного для индивидуума, для лечения рака, где указанный способ включает измерение уровня экспрессии CAPRIN-1 в биологическом образце с использованием антитела, обладающего иммунологической реактивностью с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63, или антигенсвязывающего фрагмента этого антитела и, если уровень экспрессии статистически значимо превышает уровень экспрессии у здорового индивидуума, отбор лекарственного средства, нацеленного на CAPRIN-1, как терапевтического лекарственного средства для лечения рака, подходящего для его введения индивидууму, у которого был взят биологический образец.
(15) Способ отбора терапевтического лекарственного средства, специфичного для индивидуума, для лечения рака по п. (14), где указанное лекарственное средство, нацеленное на CAPRIN-1, представляет собой антитело, обладающее иммунологической реактивностью с CAPRIN-1, или его антигенсвязывающий фрагмент.
В настоящей заявке испрашивается приоритет заявки на патент Японии No. 2012-160751, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Преимущественные эффекты настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к новому способу детекирования рака, включающему измерение уровня экспрессии CAPRIN-1 в образце, взятом у пациента, страдающего раком. Как конкретно описано ниже в примерах, антитела, полученные с использованием рекомбинантных полипептидов в качестве антигенов, продуцированных на основе аминокислотной последовательности CAPRIN-1 (также называемого белком каприном-1), специфически реагируют с CAPRIN-1 в сыворотке или в тканях пациентов, страдающих раком. Кроме того, как описано ниже в примерах, сам белок CAPRIN-1 специфически экспрессируется на высоком уровне в различных раковых тканях. Поэтому, для детекции рака может быть определено присутствие и уровень экспрессии CAPRIN-1 в образце, взятом у пациента с раком. Кроме того, наличие или отсутствие чувствительности к лекарственному средству, нацеленному на CAPRIN-1, такому как терапевтическое лекарственное средство, а именно, антитело, может быть предварительно определено для выбора пациента, который будет восприимчив к такому терапевтическому лекарственному средству. В частности, присутствие и уровень экспрессии CAPRIN-1 могут быть предварительно определены путем введения лекарственного средства согласно изобретению пациенту, страдающему раком, для проведения более эффективного лечения с использованием антитела против CAPRIN-1.
Краткое описание графического материала
[Фигура 1] На фигуре 1 представлена диаграмма, на которой проиллюстрированы паттерны экспрессии CAPRIN-1-кодирующего гена в нормальных тканях и в опухолевых клеточных линиях. На панели для сравнения 1 представлены паттерны экспрессии гена, кодирующего белок CAPRIN-1. На панели для сравнения 2 представлены паттерны экспрессии гена GAPDH. На самой верхней панели представлены результаты, полученные для нормальных тканей собаки. На левой средней панели представлены результаты, полученные для тканей рака молочной железы собак. На правой средней панели представлены результаты, полученные для клеточных линий рака молочной железы человека. На самой нижней панели представлены результаты, полученные для различных клеточных линий рака человека.
Описание вариантов осуществления изобретения
Способ детектирования рака согласно изобретению включает детектирование CAPRIN-1 в биологическом образце и измерение уровня экспрессии CAPRIN-1. Измерение уровня экспрессии CAPRIN-1 в образце, взятом у пациента, страдающего раком, может быть осуществлено, например, с помощью анализа, например, иммунологического анализа, проводимого CAPRIN-1 с использованием анти-CAPRIN-1 антитела. Большинство таких методов известны специалистам, и могут быть применены любые методы иммунологического анализа, проводимые с использованием антитела, такие как иммуногистохимический анализ, вестерн-блот-анализ, иммунопреципитация, анализ на молекулярное связывание, ELISA и биохимический анализ на ферментативную активность. В этом контексте, используемый здесь термин «уровень экспрессии» включает уровень внутриклеточной аккумуляции и избыточный уровень белка.
Уровни экспрессии CAPRIN-1 в образце могут быть классифицированы по баллам, как описано в примерах. Чем выше балл, тем выше количество CAPRIN-1 в раковой ткани или в сыворотке пациента, страдающего раком. В настоящем изобретении, термин «измерение» или «анализ» охватывает детектирование и методы качественной, количественной и полуколичественной оценки.
Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 или 14, представляет собой аминокислотную последовательность CAPRIN-1 собаки. CAPRIN-1 собаки, имеющий такую аминокислотную последовательность, был обнаружен методом SEREX с использованием библиотеки кДНК яичек собак и сыворотки, взятой у собак с раковой опухолью, и идентифицирован из библиотеки кДНК как полипептид, связывающийся со специфическим антителом, присутствующим в сыворотке собак с раковой опухолью (см. пример 1). Сам белок CAPRIN-1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 или 14, может быть также проанализирован как антиген в тканях собак вышеупомянутым методом в целях выявления наличия или отсутствия чувствительности к лекарственному средству, нацеленному на CAPRIN-1 (см. Примеры). В этом контексте, словосочетание «имеющий аминокислотную последовательность» означает, что аминокислотные остатки, в соответствии с имеющейся информацией о предварительно определенной аминокислотной последовательности, расположены в этой последовательности в определенном порядке. Так, например, словосочетание «полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2», означает полипептид длиной в 70 9 аминокислотных остатков, где аминокислотные остатки присоединены друг к другу в следующей последовательности аминокислот: Met Pro Ser Ala … (и так далее) … Gln Gln Val Asn, как показано в SEQ ID NO: 2. В настоящем описании, словосочетание «полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2» сокращенно обозначается «полипептид SEQ ID NO: 2». Это также касается и словосочетания «имеющий нуклеотидную последовательность». В данном случае, слово «имеющий» в словосочетании «имеющий аминокислотную последовательность» и «имеющий нуклеотидную последовательность» может быть заменено словами «состоящий из».
Используемый здесь термин «полипептид» означает молекулу, которая образуется посредством пептидных связей из множества аминокислот и включает не только полипептидную молекулу, состоящую из большого числа аминокислот, но также и низкомолекулярное соединение, имеющее небольшое число аминокислот (олигопептид), и полноразмерный белок. Полипептид согласно изобретению также включает полноразмерные белки CAPRIN-1, имеющие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: с четными номерами от SEQ ID NO: 2 до 30.
В способе согласно изобретению дополнительный другой CAPRIN-1 млекопитающих, отличающийся от собачьего CAPRIN-1, представленного в SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 или 14, может быть также использован в качестве аналита. В настоящем описании, такой CAPRIN-1 млекопитающих, но не собачий CAPRIN-1, также называется «гомологом» собачьего CAPRIN-1. Термин «CAPRIN-1» охватывает CAPRIN-1, происходящий не только от собак, но также и от других млекопитающих. Примерами дополнительных белков CAPRIN-1 млекопитающих, которые могут быть определены в способе согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, человеческий CAPRIN-1 и кошачий CAPRIN-1. Как конкретно описано ниже в примерах, мРНК, кодирующая человеческий CAPRIN-1, также как и мРНК, кодирующая собачий CAPRIN-1 представлена в SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 или 14, экспрессируется на достаточно высоких уровнях в человеческих клетках яичек и в раковых клетках. Однако, антитело против человеческого CAPRIN-1 не детектируется в организме здорового человека. Антитело против кошачьего CAPRIN-1 не детектируется в организме здоровых кошек, а детектируется только у кошек с раковой опухолью. Таким образом, возможность введения лекарственного средства, нацеленного на CAPRIN-1, млекопитающему, не являющемуся собакой, может быть также определена путем измерения уровня экспрессии CAPRIN-1, происходящего от млекопитающего, не являющегося собакой.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий CAPRIN-1, и его аминокислотная последовательность представлены в SEQ ID NO: 1 или 3, и в SEQ ID NO: 2 или 4, соответственно, в списке последовательностей. Нуклеотидные последовательности человеческого CAPRIN-1 и собачьего CAPRIN-1 идентичны на 94%, а их аминокислотные последовательности идентичны на 98%. Поскольку аминокислотные последовательности CAPRIN-1 даже у собак и человека, которые имеют очень отдаленное родство, являются в высокой степени, то есть, на 98%, идентичными, то вероятно, что многие не-человеческие и не-собачьи белки последовательности белка CAPRIN-1 имеют высокую степень идентичности (приблизительно на 85% или более) последовательностям человеческого или собачьего CAPRIN-1. Белками CAPRIN-1, уровень экспрессии которых определяют в способе согласно изобретению, могут быть, но не ограничиваются им, белок, имеющий последовательность, которая, предпочтительно, на 85% или более, более предпочтительно, на 95% или более идентична аминокислотной последовательности собачьего CAPRIN-1, представленного в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 или 14.
Антигенная молекула, такая как белок, который имеет сложную структуру с высокой молекулярной массой, обычно содержит множество эпитопов, отличающихся друг от друга по своей структуре. Таким образом, антитела многих типов, которые, соответственно, распознают множество эпитопов и связываются с множеством эпитопов на такой антигенной молекуле, продуцируются in vivo. Другими словами, такими продуцируемыми in vivo антителами против антигенной молекулы (например, белка) являются поликлональные антитела, которые представляют собой смеси антител многих типов. Поликлональными антителами также являются антитела, которые, как было обнаружено авторами настоящего изобретения, присутствуют в сыворотке индивидуума, страдающего раком, и специфически связываются с рекомбинантным CAPRIN-1 посредством реакции «антиген-антитело». Термин «поликлональное антитело», используемый в настоящем изобретении, означает антитело, которое присутствует в сыворотке организма индивидуума, содержащего антигенную молекулу, и представляет собой антитело против антигенной молекулы, вырабатываемое данным организмом.
Конкретными примерами предпочтительных полипептидов, используемых в качестве антигена, являются полипептиды, представленные в любой последовательности SEQ ID NO: с четными номерами от SEQ ID NO: 2 до 30, и их фрагменты.
Нуклеотидные последовательности полинуклеотидов, кодирующие полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, представленных в любой из последовательностей SEQ ID NO: с четными номерами от SEQ ID NO: 2 до 30 (то есть, SEQ ID NO: 2, 4, 6…28 и 30), представлены в любой последовательности SEQ ID NO: с нечетными номерами от SEQ ID NO: 1 до 2 9 (то есть SEQ ID NO: 1, 3, 5…27 и 29), соответственно.
Специалистам хорошо известно, что даже белок, полученный из антигенного белка путем замены, делеции, добавления или инсерции небольшого числа аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности данного белка, может, по существу, обладать такой же антигенностью, как и исходный белок. Таким образом, полипептид, имеющий последовательность, полученную из аминокислотной последовательности CAPRIN-1 путем замены, делеции, добавления и/или инсерции небольшого числа (предпочтительно, 1 или нескольких) аминокислотных остатков, может быть использован для детекции рака также как и полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, представленных в любой последовательности SEQ ID NO: с четными номерами от SEQ ID NO: 2 до 30, при условии, что этот полипептид имеет последовательность, которая на 80% или более, на 85% или более, предпочтительно, на 90% или более, более предпочтительно, на 95% или более, а еще более предпочтительно, на 98% или более идентична исходной последовательности и специфически связывается с поликлональным антителом против CAPRIN-1 посредством реакции «антиген-антитело» (далее, для удобства, этот полипептид будет также называться «модифицированным полипептидом со специфической реактивностью»). При этом, предпочтительно, чтобы модифицированный полипептид со специфической реактивностью имел аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности CAPRIN-1 путем замены, делеции, добавления и/или инсерции 1 или нескольких аминокислотных остатков. Используемый здесь термин «несколько» означает целое число от 2 до 10, предпочтительно, целое число от 2 до 6, а более предпочтительно, целое число от 2 до 4.
Термин «идентичность последовательностей», используемый здесь по отношению к аминокислотной последовательности, означает процентную величину, полученную путем деления числа соответствующих аминокислотных остатков на общее число аминокислотных остатков с наилучшим соответствием, выявленным путем выравнивания аминокислотных остатков двух сравниваемых аминокислотных последовательностей. Для выравнивания, если это необходимо, в одну или в обе эти сравниваемые последовательности могут быть внесены пробелы. Такое выравнивание последовательностей может быть осуществлено с использованием хорошо известной программы, например, BLAST, FASTA, of CLUSTAL W (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:2264-2268, 1993; и Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997).
Двадцать аминокислот, составляющих природный белок, могут быть классифицированы по аналогичным свойствам на следующие группы: нейтральные аминокислоты, имеющие небольшую полярную боковую цепь (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met и Pro); нейтральные аминокислоты, имеющие гидрофильную боковую цепь (Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr и Cys); кислотные аминокислоты (Asp и Glu); основные аминокислоты (Arg, Lys и His) и ароматические аминокислоты (Phe, Tyr, Trp и His). Известно, что замена аминокислоты каждой другой аминокислотой, входящей в одну и ту же группу, то есть, консервативная замена, в большинстве случаев, не влияет на свойства полипептида. Таким образом, в случае замены аминокислотных остатков CAPRIN-1, член каждой из этих групп может быть заменен другим членом той же самой группы так, чтобы сохранялась активность связывания этого белка с соответствующим антителом. Однако, в настоящем изобретении, модифицированная форма может иметь неконсервативную замену, при условии, что такая модифицированная форма будет обладать иммунитет-индуцирующей активностью, эквивалентной или, по существу, эквивалентной активности немодифицированной формы.
Полипептид, используемый в настоящем изобретении, может быть синтезирован методами химического синтеза, например, методами синтеза с использованием Fmoc (флуоренилметилоксикарбонила) и tBoc (трет-бутилоксикарбонила) (Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimentation Course in English) 1, the Japanese Biochemical Society ed., Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd. (Japan), 1981). Кроме того, этот полипептид может быть синтезирован рутинными методами на различных коммерчески доступных пептидных синтезаторах. Альтернативно, полипептид может быть легко получен методами генной инженерии, известными специалистам (Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons и т.п.). Так, например, РНК экстрагируют из ткани, экспрессирующей ген, кодирующий человеческий CAPRIN-1 SEQ ID NO: 2 или его гомолог. Из этой РНК получают кДНК гена с помощью ОТ-ПЦР. Полноразмерную кДНК или ее нужный неполный фрагмент вводят в экспрессионные векторы, которые затем переносят в клетки-хозяева с получением представляющего интерес полипептида. Нуклеотидные последовательности кДНК, кодирующие собачьи белки CAPRIN-1 SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 и 14, представлены в SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11 и 13, соответственно. Нуклеотидные последовательности кДНК, кодирующие человеческие белки CAPRIN-1 SEQ ID NO: 2 и 4 в виде человеческих гомологов этого белка, представлены в SEQ ID NO: 1 и 3, соответственно. Поэтому, праймеры, используемые в ОТ-ПЦР, могут быть легко сконструированы исходя из информации об этих нуклеотидных последовательностях. Как упоминается ниже, ген, кодирующий CAPRIN-1 млекопитающего, не являющегося человеком, может быть амплифицирован с использованием праймеров, сконструированных исходя из информации о нуклеотидной последовательности, представленной последовательностями SEQ ID NO: с нечетными номерами от SEQ ID NO: 5 до SEQ ID NO: 29. Таким образом, кДНК, кодирующая, например, кошачий CAPRIN-1, может быть также легко получена методом, аналогичным методу, описанному выше. Экстракция РНК, ОТ-ПЦР, включение кДНК в векторы и перенос этих векторов в клетки-хозяева могут быть осуществлены, например, хорошо известными методами, описанными ниже. Кроме того, используемые векторы или клетки-хозяева являются хорошо известными, а их различные продукты являются коммерчески доступными.
Клетками-хозяевами могут быть любые клетки, способные экспрессировать вышеописанный полипептид. Примерами прокариотических клеток являются Е. coli. Примерами эукариотических клеток являются культивированные клетки млекопитающих, такие как клетки почек обезьян COS1; клетки яичника китайского хомячка СНО; клеточная линия почек человеческого эмбриона HEK293; клеточная линия кожи мышиного эмбриона NIH3T3; клетки дрожжей, размножающихся почкованием; клетки дрожжей, размножающихся делением; клетки шелкопряда и клетки яиц Xenopus.
В случае, когда клетками-хозяевами являются прокариотические клетки, то используемые экспрессионные векторы должны содержать ориджин репликации прокариотических клеток, промотор, сайт связывания с рибосомой, сайт множественного клонирования, терминатор, ген резистентности к лекарственному средству, ауксотрофный комплементарный ген и т.п. Примерами экспрессионных векторов для Е. coli могут быть векторы серии pUC, pBluescriptII, экспрессионные системы рЕТ и экспрессионные системы pGEX. ДНК, кодирующая вышеописанный полипептид, может быть встроена в такие экспрессионные векторы, которые затем переносят в прокариотические клетки-хозяева, и полученные трансформанты культивируют так, чтобы полипептид, кодируемый такой ДНК, экспрессировался в прокариотических клетках-хозяевах. В соответствии с этим, указанный полипептид может экспрессироваться в виде гибридного белка вместе с дополнительным белком. В этом контексте, ДНК, кодирующая вышеописанный полипептид, может быть получена, например, путем конструирования кДНК с помощью ОТ-ПЦР, как указывалось выше. Альтернативно, ДНК может быть синтезирована рутинными методами на коммерчески доступных синтезаторах нуклеиновых кислот, как указывается ниже. Нуклеотидные последовательности кДНК генов, кодирующих белки CAPRIN-1 SEQ ID NO: 2 и 4, представлены в SEQ ID NO: 1 и 3, соответственно, в списке последовательностей.
В случае, когда клетками-хозяевами являются эукариотические клетки, то используемые экспрессионные векторы для этих клеток имеют промотор, область сплайсинга, сайт полиаденилирования и т.п. Примерами таких экспрессионных векторов могут быть pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, вектор на основе EBV, pRS, pcDNA3 и pYES2. Как описано выше, ДНК, кодирующая полипептид, используемый в настоящем изобретении, может быть встроена в указанные экспрессионные векторы, которые затем переносят в эукариотические клетки-хозяева, и полученные трансформанты культивируют так, чтобы полипептид, кодируемый такой ДНК, экспрессировался в эукариотических клетках-хозяевах. В случае использования экспрессионных векторов, таких как pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1 или pEGFP-C1, полипептид может экспрессироваться в виде различных гибридных белков, меченных His-меткой (например, (His)6-(His)10), меткой FLAG, меткой myc, НА-меткой, GFP или т.п.
Экспрессионные векторы могут быть перенесены в клетки-хозяева хорошо известными методами, такими как электропорация, метод с использованием фосфата кальция, липосомный метод, метод с использованием DEAE-декстрана, микроинжекция, вирусная инфекция, липофекция и связывание с пептидами, проникающими в клетки.
Представляющий интерес полипептид может быть выделен и очищен из клеток-хозяев путем проведения комбинированных методов разделения, известных специалистам. Примерами таких методов являются обработка денатурирующим агентом (например, мочевиной) или поверхностно-активным веществом, обработка ультразвуком, ферментативное расщепление, высаливание, фракционирование и осаждение растворителем, диализ, центрифугирование, ультрафильтрация, гель-фильтрация, электрофорез в ДСН-ПААГ, изоэлектрическое фокусирование, ионообменная хроматография, гидрофобная хроматография, аффинная хроматография и обращенно-фазовая хроматография.
Полипептидами, полученными этими методами, также являются формы гибридных белков с другими произвольно выбранными белками. Примерами могут быть гибридные белки с глутатион-S-трансферазой (GST) или His-меткой. Полипептиды, экспрессируемые в трансформированных клетках, могут подвергаться различным внутриклеточным модификациям после трансляции. Могут быть также использованы и посттрансляционно модифицированные полипептиды, при условии, что такие полипептиды обладают способностью связываться с поликлональным антителом против CAPRIN-1. Примерами таких посттрансляционных модификаций могут быть элиминация N-концевого метионина; N-концевое ацетилирование, гликозилирование; ограниченная деградация, опосредуемая внутриклеточной протеазой; миристоилирование; изопренилирование и фосфорилирование.
В способе согласно изобретению, CAPRIN-1, который может содержаться в биологическом образце, подвергают анализу. Как упоминалось выше, было обнаружено, что раковые клетки экспрессируют CAPRIN-1 в качестве антигена на достаточно высоком уровне. Как конкретно описано ниже в примерах, сам белок CAPRIN-1 может быть проанализирован в раковых клетках или в раковых тканях для того, чтобы определить, может ли лекарственное средство, нацеленное на CAPRIN-1, быть введено пациенту с высоким уровнем экспрессии CAPRIN-1.
Полипептид в образце может быть легко проанализирован с применением хорошо известного метода иммунологического анализа. В частности, CAPRIN-1, который может присутствовать в образце, может быть проанализирован с помощью иммуноанализа, проводимого с использованием, например, полученного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, способного вступать в реакцию антиген-антитело, например, с CAPRIN-1. Не только собачий CAPRIN-1 SEQ ID NO: 6, но также и его гомологи, происходящие от других млекопитающих, например человеческий CAPRIN-1, представленный в CAPRIN-1 SEQ ID NO: 2 или 4 или кошачий CAPRIN-1, могут быть проанализированы с использованием антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, способного вступать в реакцию антиген-антитело, например, с собачьим CAPRIN-1, представленным в SEQ ID NO: 6, что обусловлено способностью этих антител к перекрестной реакции.
Сам метод иммуноанализа является хорошо известным рутинным методом, упомянутым выше. Антитело, которое распознает CAPRIN-1, может быть подвергнуто иммуногистохимическому анализу на его реактивность с CAPRIN-1 в образце ткани известным методом с использованием замороженных срезов, фиксированных параформальдегидом или ацетоном, или срезов ткани, залитых в парафин и фиксированных параформальдегидом, где указанная ткань представляет собой ткань, взятую у пациента во время хирургической операции или у животного, имеющего ксенотрансплантат ткани, инокулированный клеточной линией, экспрессирующей CAPRIN-1 либо спонтанно, либо после трансфекции.
Таким образом, уровень экспрессии CAPRIN-1 в иммуногистохимически окрашенном образце может быть количественно определен путем присвоения численной оценки исходя из паттернов окрашивания. Предпочтительными являются оценка 2 или выше. В наиболее предпочтительном аспекте изобретения, паттерны окрашивания классифицируют по 4-балльной шкале оценок. Так, например, CAPRIN-1, экспрессируемый на поверхности раковых клеток в образце ткани, окрашивают с применением обычного метода иммуногистохимического окрашивания, и количество такого белка оценивают по 4-балльной шкале исходя из паттернов окрашивания. В данном случае, каждая из указанных оценок определена ниже.
Балл 0 (без сверхэкспрессии CAPRIN-1): Позитивного окрашивания клеточной мембраны не наблюдается, либо такое окрашивание наблюдается для менее, чем 10% раковых клеток.
Балл 1 (без сверхэкспрессии CAPRIN-1): Слабое, почти незаметное окрашивание клеточной мембраны наблюдается для 10% или более раковых клеток, и эти раковые клетки частично окрашены только в их клеточных мембранах.
Балл 2 (со сверхэкспрессией CAPRIN-1): Слабое или умеренное полное позитивное окрашивание клеточной мембраны наблюдается для 10% или более раковых клеток, либо сильное полное позитивное окрашивание клеточной мембраны наблюдается для 10% или более и 30% или менее раковых клеток.
Балл 3 (со сверхэкспрессией CAPRIN-1): Сильное полное позитивное окрашивание клеточной мембраны наблюдается для 30% или более раковых клеток.
Такая система оценок разработана Американским онкологическим обществом (США) и одобрена Японским обществом по изучению заболеваний (Япония). Аналогичная система оценок также применяется в «HercepTest» для количественного определения избытка ракового антигена Her2 в образцах, взятых у пациентов. Количественное измерение Her2 проводят в соответствии с рекомендациями по проведению тестов на Her2 ASCO/CAP. В Японии, руководство по проведению теста на Her2, включающего эту систему оценок для трастузумаба, было также утверждено Японским комитетом по заболеваниям.
Отношение окрашенных раковых клеток после их иммуногистохимического окрашивания, определенного для каждой оценки, может быть вычислено путем подсчета по меньшей мере 500 клеток в поле зрения под оптическим микроскопом с 4-кратным, 10-кратным или 20-кратным увеличением; измерения клеток, клеточные мембраны которых окрашены как описано в каждой оценке; и проведения вычислений в независимых испытаниях по следующей формуле:
Число позитивных клеток / общее число клеток (приблизительно 500 клеток) × 100
В методе иммуногистохимического окрашивания антитело, реагирующее с CAPRIN-1, может быть окрашено различными методами. Так, например, указанное антитело может быть визуализировано посредством реакции с козьим антимышиным антителом или с козьим антикуриным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные вступать в реакцию «антиген-антитело» с CAPRIN-1 и используемые в иммуноанализе самого CAPRIN-1, могут быть также использованы в качестве лекарственного средства или включены в набор для диагностики рака. В этом случае лекарственное средство или набор для диагностики рака могут также состоять из антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, либо они могут также включать, например, различные добавки, используемые для стабилизации или т.п.антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть конъюгированы с металлом, таким как марганец или железо. Такое конъюгированное с металлом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, при их введении в организм, аккумулируются на участке, содержащем большее количество антигенного белка. В соответствии с этим, присутствие раковых клеток, продуцирующих антигенный белок, может быть детектировано путем измерения уровня металла с помощью МРТ или т.п.
Было обнаружено, что CAPRIN-1 представляет собой плазматический мембранный белок, который экспрессируется на поверхности раковых клеток. Поскольку в организме пациентов, страдающих раком, содержится множество протеолитических ферментов, то внеклеточную область в последовательности CAPRIN-1, экспрессируемого на раковых клетках, отделяют от раковых клеток после разложения. Поэтому, отделенная таким образом внеклеточная область CAPRIN-1 присутствует в большем количестве в крови по сравнению с внутриклеточной областью CAPRIN-1, имеющихся на раковых клетках. В соответствии с этим, CAPRIN-1 присутствует не только в раковых тканях, фиксированных на предметном стекле, но и в сыворотке пациентов, страдающих раком, и может быть обнаружен путем детектирования CAPRIN-1 с помощью анализа согласно изобретению, проводимого с использованием анти-CAPRIN- 1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, способного к более сильному связыванию с внеклеточной областью CAPRIN-1. Кроме того, такой метод детектирования, который проводят с использованием антитела, связывающегося с внеклеточной областью CAPRIN-1, дает возможность точно идентифицировать пациента, страдающего раком, у которого, как предполагается, могут наблюдаться терапевтические эффекты от введения терапевтического лекарственного средства, нацеленного на CAPRIN-1, в частности, терапевтического анти-CAPRIN-1 антитела, и позволяет осуществлять более эффективное лечение рака. Таким образом, в настоящем изобретении, предпочтительно, используется антитело, связывающееся с внеклеточной областью CAPRIN-1 на раковых клетках. Примерами неполных пептидов белка CAPRIN-1, содержащих эпитоп, распознаваемый таким антителом, являются пептиды, соответствующие внеклеточным областям в аминокислотных последовательностях, представленных в последовательностях SEQ ID NO: с четными номерами от SEQ ID NO: 2 до SEQ ID NO: 30 в списке последовательностей, за исключением SEQ ID NO: 6 и 18. Конкретными примерами являются пептиды, содержащие последовательность из 7 или более смежных аминокислот в области аминокислотных остатков 50-98 или аминокислотных остатков 233-34 4 в SEQ ID NO: 2, и пептиды, содержащие последовательность из 7 или более смежных аминокислот в области, гомологичной этим аминокислотным остаткам в аминокислотных последовательностях, представленных SEQ ID NO: с четными номерами от SEQ ID NO: 2 до SEQ ID NO: 30, за исключением SEQ ID NO: 6 и 18. Более конкретными примерами являются аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 43 или 61, предпочтительно, аминокислотная последовательность представленная в SEQ ID NO: 62, содержащейся в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 61, и аминокислотные последовательности, которые на 80% или более, предпочтительно, на 85% или более, более предпочтительно, на 90% или более, а еще более предпочтительно, на 95% или более идентичны указанной аминокислотной последовательности. Антитело, используемое в настоящем изобретении, охватывает все антитела, связывающиеся с любыми из этих пептидов. Конкретными примерами являются антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, связывающиеся с аминокислотной последовательностью, представленную в SEQ ID NO: 63, и моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, имеющие аминокислотную последовательность моноклонального антитела, содержащего аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 70 и 71.
Термин «антигенсвязывающий фрагмент антитела» означает любой фрагмент антитела, обладающий способностью связываться с антигеном, такой как Fab- или F(ab)2-фрагмент, содержащийся в молекуле антитела. Антителом может быть поликлональное антитело или моноклональное антитело. В высокой степени репродуцируемое моноклональное антитело является предпочтительным для иммуноанализа или т.п. Эти поликлональные и моноклональные антитела могут быть получены хорошо известным методом с использованием пептида в качестве иммуногена, и могут быть легко продуцированы рутинными методами. Метод иммунизации включает иммунизацию животного, например, белком CAPRIN-1, конъюгированным с белком-носителем, таким как гемоцианин лимфы улитки (KLH), казеин или сывороточный альбумин, используемые в качестве иммуногена вместе с адъювантом для индуцирования вырабатывания антитела против CAPRIN-1. Антитело-продуцирующие клетки (например, клетки селезенки или лимфоциты), взятые у иммунизированного животного, подвергают слиянию с миеломными клетками с получением гибридом. Затем отбирают гибридомы, продуцирующие антитела, связывающиеся с CAPRIN-1, и эти гибридомы подвергают пролиферации. Моноклональные антитела, для которых CAPRIN-1 является антигеном, могут быть получены из супернатанта культуры. Этот метод представляет собой хорошо известный рутинный метод.
Раком, детектируемым способом согласно изобретению, является рак, сверхэкспрессирующий CAPRIN-1. Примеры таких раковых заболеваний представляют собой рак молочной железы, опухоль головного мозга, рак пищевода, рак желудка, рак легкого, рак печени, рак почки, рак щитовидной железы, рак селезенки, рак поджелудочной железы, рак толстой кишки, рак кожи, рак яичника, рак матки (рак шейки матки и рак тела матки), рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак яичка и остеосаркома. Другими примерами раковых заболеваний могут быть, но не ограничиваются ими, плоскоклеточный рак головы и шеи, меланома, аденокарциномы различных типов, гепатоцеллюлярный рак, базальноклеточный рак, опухоль десны типа акантомы, опухоль ротовой полости, рак перианальных желез, опухоль анальной пазухи, аденокарцинома апокринных желез анальной пазухи, карцинома клеток Сертоли, рак преддверья влагалища, рак сальных желез, эпителиома сальных желез, аденома сальных желез, рак потовых желез, аденокарцинома носовой полости, аденокарцинома носа, аденокарцинома бронхов, рак протоков, рак молочной железы, комбинированная карцинома молочной железы, смешанная злокачественная опухоль молочной железы, аденокарцинома внутрипротоковых сосочков, фибросаркома, гемангиоперицитома, хондросаркома, саркома мягких тканей, гистиоцитосаркома, миксосаркома, недифференцированная саркома, мастоцитома, лейомиома кожи, внутрибрюшинная лейомиома, лейомиома, лимфома, хронический лимфоцитарный лейкоз, лимфома желудочно-кишечного тракта, лимфома пищеварительных органов, мелкоклеточная/среднеклеточная лимфома, опухоль коры надпочечника, опухоль гранулезных клеток и феохромоцитома.
Биологический образец, применяемый в способе согласно изобретению, представляет собой биологический образец, взятый у млекопитающего, предпочтительно, у человека, собаки или кошки.
Примеры биологических образцов, используемых в способе согласно изобретению, представляют собой физиологические жидкости, ткани и клетки. Используемый здесь термин «физиологическая жидкость» означает биологический образец в жидком состоянии. Примерами являются кровь (включая сыворотку, плазму и интерстициальную жидкость), лимфа, асциты, плевральные выпоты, цереброспинальная жидкость, мокрота, слезная жидкость, выделения из носа, слюна, моча, вагинальная жидкость и сперма. Физиологическая жидкость может включать, например, перитониальные промывки физиологическим раствором. При этом, предпочтительными являются сыворотка, плазма, асциты или плевральные выпоты.
В способе настоящего изобретения, если измеренный уровень экспрессии CAPRIN-1 в биологическом образце превышает
(предпочтительно, чтобы такое превышение было статистически значимым) уровень экспрессии CAPRIN-1 у здорового индивидуума, то это указывает на наличие рака, которое может быть установлено по специфическому связыванию с анти-CAPRIN-1 антителом, используемым в анализе (то есть, рака, против которого может быть направлено антитело, используемое в качестве противоракового терапевтического лекарственного средства) биологического образца, взятого из организма (индивидуума). Исходя из этого, уровень экспрессии CAPRIN-1 в биологическом образце, взятом у пациента с раком, может быть определен методом согласно изобретению, а затем этот уровень сравнивают с уровнем экспрессии CAPRIN-1 у здорового индивидуума для того, чтобы определить, может ли лекарственное средство, нацеленное на CAPRIN-1, использоваться для лечения рака у данного пациента (например, может ли данное антитело использоваться в качестве терапевтического лекарственного средства для лечения рака у данного пациента).
Таким образом, способ согласно изобретению позволяет идентифицировать ракового пациента, у которого могут наблюдаться терапевтические эффекты после введения терапевтического лекарственного средства, нацеленного на CAPRIN-1, включая антитело против CAPRIN-1, и тем самым проводить более эффективное лечение рака.
В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения, настоящее изобретение относится к способу отбора терапевтического противоракового лекарственного средства, специфичного для данного индивидуума, где указанный способ включает: измерение уровня экспрессии CAPRIN-1 в биологическом образце с использованием антитела, обладающего иммунологической реактивностью с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63, и, если такой уровень экспрессии CAPRIN-1 превышает (предпочтительно, чтобы такое превышение было статистически значимым) уровень экспрессии CAPRIN-1 у здорового индивидуума, то этот способ также включает отбор лекарственного средства, нацеленного на CAPRIN-1, предпочтительно, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, обладающего иммунологической реактивностью с CAPRIN-1, где указанное антитело представляет собой противораковое терапевтическое лекарственное средство, нацеленное на CAPRIN-1 и подходящее для введения индивидууму, у которого был взят биологический образец. Такой отбор терапевтического лекарственного средства для индивидуального лечения рака у пациента позволяет реализовать так называемую специально разработанную противораковую терапию, оптимизированную для конкретного пациента.
Используемый здесь термин «статистически значимый» означает, что при статистической обработке двух количественных величин было обнаружено их значимое различие. В частности, примером может быть случай, когда уровень значимости составляет менее, чем 5%, 1% или 0,1%. Метод статистической проверки не имеет конкретных ограничений, при условии, что этот метод известен специалистам и позволяет определять наличие или отсутствие значимости. Так, например, может быть применен метод, в котором используется критерий Стьюдента или критерий множественного сравнения.
Примеры
Настоящее изобретение будет более подробно описано в примерах, приведенных ниже. Однако, эти примеры не ограничивают объема настоящего изобретения.
Пример 1: Анализ на экспрессию CAPRIN-1 в каждой ткани
Экспрессию гена CAPRIN-1 в нормальных тканях и в различных раковых тканях и раковых клеточных линиях собаки и человека измеряли с помощью ОТ-ПЦР как описано в примере 1(4) в WO 2010/016526. Результат представлен на фигуре 1. В результате было обнаружено, что из всех нормальных тканей здоровых собак, самый высокий уровень экспрессии наблюдался в яичках. Кроме того, экспрессия наблюдалась в раковой опухоли молочной железы собак. Экспрессия гена была также подтверждена в человеческих тканях. В результате анализа всех нормальных тканей экспрессия гена собачьего CAPRIN-1 была подтверждена только в яичках, и такая экспрессия детектировалась в раковых клеточных линиях многих типов, включая 8 раковых клеточных линий молочной железы человека (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, ВТ-20, MDA-MB-231V и MRK-nu-1), а также в 4 клеточных линиях опухоли головного мозга, в 3 клеточных линиях лейкоза, в 1 клеточной линии рака легких и в 2 клеточных линиях рака пищевода. Эти результаты продемонстрировали, что CAPRIN-1 не экспрессируется в нормальных тканях, за исключением яичек, но экспрессируется во многих раковых клетках, включая раковые клетки молочной железы.
Пример 2: Получение анти-CAPRIN-1 антитела
(1) Получение мышиного моноклонального антитела против человеческого CAPRIN-1
100 мкг человеческого CAPRIN-1, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 и полученного как описано в примере 3 заявки WO 2010/016526, смешивали с равным количеством адъюванта MPL + TDM (Sigma-Aldrich Corp.). Эту смесь использовали в виде раствора антигена для введения мышам. Этот раствор антигена внутрибрюшинно вводили каждой 6-недельной мыши Balb/c (Japan SLC, Inc.). Затем, через 1 неделю вводили 3 бустер-дозы. Через три дня после последней иммунизации, у мышей вырезали селезенку и помещали между двумя стерилизованными предметными стеклами. Процедуры промывки буфером PBS(-) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) и удаления супернатанта путем центрифугирования при 1500 об/мин повторяли три раза в течение 10 минут и получали клетки селезенки. Полученные клетки селезенки смешивали с мышиными миеломными клетками SP2/0 (закупленными у АТСС) в отношении 10:1. 200 мкл среды RPMI164 0, содержащей 10% FBS, нагревали до 37°С и смешивали с 800 мкл ПЭГ1500 (Boehringer Ingelheim GmbH), и полученный таким образом раствор ПЭГ добавляли к клеточной смеси, а затем оставляли на 5 минут для слияния клеток. После удаления супернатанта путем центрифугирования при 1700 об/мин в течение 5 минут, клетки суспендировали в 150 мл среды RPMI1640, содержащей 15% FBS, в которую был добавлен 2%-ный эквивалент раствора HAT (Gibco) (селективная среда HAT). Эту суспензию добавляли в пятнадцать 96-луночных планшетов (Nunc) в концентрации 100 мкл/лунку. Клетки селезенки и миеломные клетки подвергали слиянию путем культивирования при 37°С в течение 7 дней в 5% CO2 с получением гибридом.
Полученные гибридомы скринировали на аффинность связывания антител против CAPRIN-1, продуцируемых гибридомами и используемых в качестве индикатора. 1 мкг/мл раствора белка CAPRIN-1 добавляли в 96-луночный планшет в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли на 18 часов при 4°С. Каждую лунку три раза промывали PBS-T. Затем добавляли 0,5%-ный раствор альбумина бычьей сыворотки (BSA) (Sigma-Aldrich Corp.) в концентрации 400 мкл/лунку и оставляли на 3 часа при комнатной температуре. После этого, раствор удаляли из каждой лунки, и каждую лунку три раза промывали 400 мкл PBS-T. Затем добавляли супернатант каждой гибридомной культуры, полученный как описано выше, в концентрации 100 мкл/лунку, и оставляли на 2 часа при комнатной температуре. Каждую лунку три раза промывали PBS-T. Затем добавляли ПХ-меченные антитела против мышиных IgG (H+L) (Life Technologies Inc.), 5000-кратно разведенные PBS, в концентрации 100 мкл/лунку, и оставляли на 1 час при комнатной температуре. Каждую лунку три раза промывали PBS-T. После этого добавляли раствор субстрата ТМВ (Thermo Fisher Scientific Inc.) в концентрации 100 мкл/лунку, и оставляли на 15-30 минут для инициации цветной реакции. После проявления окраски, реакцию прекращали добавлением 1 н серной кислоты в концентрации 100 мкл/лунку. Оптическую плотность измеряли на абсорбционном спектрометре на длине волны 450 нм и 595 нм. В результате, несколько гибридом, продуцирующих антитела с высокой оптической плотностью, отбирали в качестве кандидатов на представляющие интерес гибридомные линии.
Отобранные гибридомы добавляли в 96-луночный планшет при плотности 0,5 клеток/лунку и культивировали в этом планшете. Через неделю в лунках наблюдалось образование моноколоний этими гибридомами. Затем клетки в этих лунках продолжали культивировать, и клонированные гибридомы скринировали на аффинность связывания антител, продуцированных этими гибридомами, с CAPRIN-1, где такая аффинность связывания служила индикатором для отбора. Было получено множество гибридомных линий, продуцирующих моноклональные антитела, реагирующие с белком CAPRIN-1. Супернатанты культуры этих гибридом очищали с использованием G-белка в качестве носителя, и получали 150 типов моноклональных антител, связывающихся с CAPRIN-1.
Затем, эти моноклональные антитела скринировали на способность реагировать с поверхностью раковых клеток молочной железы, экспрессирующих CAPRIN-1. В частности, 106 клеток человеческой клеточной линии рака молочной железы MDA-MB-231V центрифугировали в 1,5-миллилитровой микроцентрифужной пробирке. Затем добавляли 100 мкл супернатанта каждой гибридомы, полученной как описано выше, и оставляли на 1 час на льду. После промывки буфером PBS добавляли ФИТЦ-меченные козьи антитела против мышиных IgG (Invitrogen), 500-кратно разведенные в PBS, содержащем 0,1%-ную фетальную бычью сыворотку, и эту смесь оставляли на 1 час на льду. После промывки буфером PBS измеряли интенсивность флуоресценции на FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). С другой стороны, осуществляли вышеописанную процедуру, где вместо антител добавляли среду в качестве контроля. В результате было отобрано 10 моноклональных антител (#1-#10), обладающих более высокой интенсивностью флуоресценции, чем контроль, то есть, способных реагировать с поверхностью клеток рака молочной железы. Соответствующие последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи этих моноклональных антител представлены в SEQ ID NO: 44-60. Моноклональное антитело #1 содержит вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 44 и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 45; моноклональное антитело #2 содержит вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 44 и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 46; моноклональное антитело #3 содержит вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 44 и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 47; моноклональное антитело #4 содержит вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 44 и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 48; моноклональное антитело #5 содержит вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 49 и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 50; моноклональное антитело #6 содержит вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 51 и вариабельную область легкой цепи, представленную SEQ ID NO: 52; моноклональное антитело #7 содержит вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 53 и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 54; моноклональное антитело #8 содержит вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 55 и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 56, моноклональное антитело #9 содержит вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 57 и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 58; а моноклональное антитело #10 содержит вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 59 и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 60.
(2) Идентификация пептида в CAPRIN-1, связанном с мышиным антителом против человеческого CAPRIN-1, реагирующим с поверхностью раковых клеток
Мышиные моноклональные антитела против человеческого CAPRIN-1 #1-#10, реагирующие с поверхностью раковых клеток и полученные как описано выше, использовали для идентификации неполных последовательностей в белке CAPRIN-1, распознаваемом этими антителами.
Сначала, DTT (Fluka) добавляли в конечной концентрации 10 мМ к 100 мкл 1 мкг/мкл раствора рекомбинантного белка CAPRIN-1, растворенного в PBS, и оставляли на 5 минут при 95°С для реакции восстановления дисульфидных связей в CAPRIN-1. Затем добавляли 20 мМ (конечная концентрация) иодацетамида (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и проводили реакцию алкилирования тиоловых групп при 37°С в течение 30 минут в защищенных от света условиях. К 40 мкг полученных восстановленных и алкилированных белков CAPRIN-1 добавляли 50 мкг каждого из мышиных моноклональных антител против человеческого CAPRIN-1 #1-#10. Общее количество каждой смеси доводили до 1 мл добавлением 20 мМ фосфатно-буферного раствора (рН 7,0). Полученную смесь оставляли для реакции на ночь при 4°С с перемешиванием.
Затем, к каждой реакционной смеси добавляли трипсин (Promega K.K.) в конечной концентрации 0,2 мкг, и оставляли для реакции на 1 час, 2 часа, 4 часа и 12 часов при 37°С. Реакционную смесь смешивали со стеклянными сферами, покрытыми белком A (GE Healthcare Bio-Science Ltd.), блокировали буфером PBS, содержащим 1% BSA (Sigma-Aldrich Corp.), промывали PBS, а затем 1 мМ карбоната кальция и буфером NP-40 (20 мМ фосфатно-буферного раствора (рН 7,4), 5 мМ EDTA, 150 мМ NaCl, 1% NP-40) и оставляли на 30 минут для реакции.
Каждый реакционный раствор промывали 25 мМ раствора аммонийкарбонатного буфера (рН 8,0), а затем комплексы антиген-антитело элюировали 100 мкл 0,1%-ной муравьиной кислоты. Элюат анализировали с помощью ЖХ-МС на устройстве Q-TOF Premier (Waters-MicroMass). Этот анализ проводили в соответствии с протоколом, прилагаемым к данному устройству.
В результате, полипептид, представленный SEQ ID NO: 61, был идентифицирован как неполная последовательность CAPRIN-1, распознаваемая всеми мышиными моноклональными антителами против человеческого CAPRIN-1, #1-#10. В полипептиде, представленном в SEQ ID NO: 61, пептид, представленный SEQ ID NO: 62, был также идентифицирован как неполная последовательность, распознаваемая всеми моноклональными антителами #1-#4, #5-#7 и #9. Было также обнаружено, что пептид, представленный SEQ ID NO: 63, распознается моноклональным антителом #10.
(3) Получение куриного моноклонального антитела против человеческого CAPRIN-1
300 мкг человеческого CAPRIN-1, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 и полученного как описано в примере 3 заявки WO 2010/016526, смешивали с равным количеством полного адъюванта Фрейнда. Эту смесь использовали в виде раствора антигена для введения курам. Этот раствор антигена внутрибрюшинно вводили 7-недельным курам. Затем через каждые 4 недели вводили 7 бустер-доз и иммунизацию завершали. Через четыре дня после введения последней дозы, у каждой курицы вырезали селезенку и помещали между двумя стерилизованными предметными стеклами. Процедуры промывки буфером PBS(-) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) и удаления супернатанта путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 минут повторяли три раза и получали клетки селезенки. Полученные клетки селезенки смешивали с куриными миеломными клетками, дефицитными по легким цепям и взятыми у кур путем трансформации с использованием вируса птичьего ретикулоэндотелиоза в отношении 5:1. 200 мкл среды IMDM, содержащей 10% FBS, нагревали до 37°С и смешивали с 8 00 мкл ПЭГ1500 (Boehringer Ingelheim GmbH), и полученный таким образом раствор ПЭГ добавляли к клеточной смеси, а затем оставляли на 5 минут для слияния клеток. После удаления супернатанта путем центрифугирования при 1700 об/мин в течение 5 минут, клетки суспендировали в 300 мл среды IMDM, содержащей 10% FBS, в которую был добавлен 2%-ный эквивалент раствора HAT (Gibco) (селективная среда HAT). Эту суспензию добавляли в тридцать 96-луночных планшетов (Nunc) в концентрации 100 мкл/лунку. Клетки селезенки и куриные миеломные клетки подвергали слиянию путем культивирования при 37°С в течение 7 дней в 5% СО2 с получением гибридом.
Полученные гибридомы скринировали на аффинность связывания антител против CAPRIN-1, продуцируемых этими гибридомами и используемых в качестве индикатора. 1 мкг/мл раствора CAPRIN-1 добавляли в 96-луночный планшет в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли на 18 часов при 4°С. Каждую лунку три раза промывали PBS-T. Затем добавляли 0,5%-ный раствор альбумина бычьей сыворотки (BSA) (Sigma-Aldrich Corp.) в концентрации 400 мкл/лунку и оставляли на 3 часа при комнатной температуре. После этого, раствор удаляли из каждой лунки, и каждую лунку три раза промывали 400 мкл PBS-T. Затем добавляли супернатант каждой гибридомной культуры, полученный как описано выше, в концентрации 100 мкл/лунку, и оставляли на 2 часа при комнатной температуре. Каждую лунку три раза промывали PBS-T. Затем добавляли ПХ-меченные антитела против куриных IgY (Sigma-Aldrich Corp.), 5000-кратно разведенные PBS, в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли на 1 час при комнатной температуре. Каждую лунку три раза промывали PBS-T. После этого добавляли раствор субстрата ТМВ (Thermo Fisher Scientific Inc.) в концентрации 100 мкл/лунку, и оставляли на 15-30 минут для инициации цветной реакции. После проявления окраски, реакцию прекращали добавлением 1 н серной кислоты в концентрации 100 мкл/лунку. Оптическую плотность измеряли на абсорбционном спектрометре на длине волны 450 нм и 595 нм. В результате, несколько гибридом, продуцирующих антитела с высокой оптической плотностью, отбирали в качестве кандидатов на представляющие интерес гибридомные линии.
Отобранные гибридомы добавляли в 96-луночный планшет при плотности 0,5 клеток/лунку и культивировали в этом планшете. Через неделю в лунках наблюдалось образование моноколоний этими гибридомами. Затем клетки в этих лунках продолжали культивировать, и клонированные гибридомы скринировали на аффинность связывания антител, продуцированных этими гибридомами, с белками CAPRIN-1, где такая аффинность связывания служила индикатором для отбора. В результате было получено множество гибридомных линий, продуцирующих моноклональные антитела, реагирующие с белками CAPRIN-1.
Затем, эти моноклональные антитела скринировали на способность реагировать с поверхностью раковых клеток молочной железы, экспрессирующих CAPRIN-1. В частности, 5×105 клеток человеческой клеточной линии рака молочной железы MDA-MB-231V центрифугировали в 1,5-миллилитровой микроцентрифужной пробирке. Затем добавляли 100 мкл супернатанта культуры каждой гибридомы, полученной как описано выше, и оставляли на 1 час на льду. После промывки буфером PBS добавляли ФИТЦ-меченные козьи антитела против куриных IgG (H + L) (SouthernBiotech), 30-кратно разведенные буфером PBS, содержащим 0,1%-ную FBS, и эту смесь оставляли на 1 час на льду. После промывки буфером PBS измеряли интенсивность флуоресценции на FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). С другой стороны, также осуществляли вышеописанную процедуру, где для получения контрольного образца использовали среду для гибридомной культуры. В результате было отобрано 1 моноклональное антитело (куриное моноклональное антитело против человеческого CAPRIN-1 #11), обладающее более высокой интенсивностью флуоресценции, чем контроль, то есть, способное реагировать с поверхностью клеток рака молочной железы, экспрессирующих CAPRIN-1.
(4) Получение химерного рекомбинантного антитела «мышь-курица»
Амплифицированный генный фрагмент вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 64) куриного моноклонального антитела против человеческого CAPRIN-1 #11, полученного как описано в предыдущем параграфе (3), обрабатывали с обоих концов рестриктирующими ферментами, а затем очищали и встраивали рутинным методом в вектор pcDNA4/myc-His (Life Technologies Inc.), в который уже были встроены генные вставки лидерной последовательности, происходящей от куриного антитела, и константной области Н-цепи мышиного IgG1. Кроме того, амплифицированный генный фрагмент вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 65) куриного моноклонального антитела против человеческого CAPRIN-1 #11 обрабатывали с обоих концов рестриктирующими ферментами, а затем очищали и встраивали рутинным методом в вектор pcDNA3.1/myc-His (Life Technologies Inc.), в который уже были встроены генные вставки лидерной последовательности, происходящей от куриного антитела, и константной области L-цепи мышиного IgG1.
Затем, рекомбинантный вектор, имеющий генную вставку вариабельной области тяжелой цепи куриного моноклонального антитела против человеческого CAPRIN-1 #11, и рекомбинантный вектор, имеющий генную вставку вариабельной области легкой цепи куриного моноклонального антитела против человеческого CAPRIN-1 #11, встраивали в клетки CHO-K1 (полученные из банка клеток RIKEN). В частности, 2×105 клеток СНО-K1 культивировали в 1 мл среды Хэмса F12 (Life Technologies Inc.), содержащей 10% FBS на лунку 12-луночного планшета для культивирования, и промывали PBS(-). После этого добавляли 1 мл свежей среды Хэмса F12, содержащей 10% FBS на лунку. 250 нг каждого вектора, растворенного в 30 мкл OptiMEM (Life Technologies Inc.), смешивали с 30 мкл реагента для трансфекции Polyfect (QIAGEN N.V.), и эту смесь добавляли в каждую лунку. Клетки СНО-K1, котрансфицированные рекомбинантными векторами, культивировали в среде Хэмса F12, содержащей 10% FBS, в которую было добавлено 200 мкг/мл зеоцина (Life Technologies Inc.) и 200 мкг/мл генетицина (Roche Diagnostics K.K.), а затем эти клетки помещали в 96-луночный планшет при плотности 0,5 клеток/лунку, в результате чего получали клеточную линию, стабильно продуцирующую химерное моноклональное антитело «мышь-курица» против человеческого CAPRIN-1 #12, имеющее вариабельные области куриного моноклонального антитела против человеческого CAPRIN-1 #11 и константные области мышиного IgG1. Полученную клеточную линию культивировали в течение 5 дней в 150 см2 - колбе при плотности 5×105 клеток/мл с использованием 30 мл бессывороточной среды OptiCHO (Life Technologies Inc.), в результате чего получали супернатант культуры, содержащий антитело #12.
(5) Идентификация эпитопа CAPRIN-1, распознаваемого химерным моноклональным антителом «мышь-курица» против человеческого CAPRIN-1 #12
Химерное моноклональное антитело «мышь-курица» против человеческого CAPRIN-1 #12, реагирующее с поверхностью раковых клеток и полученное как описано в параграфе (4), использовали для идентификации области эпитопа CAPRIN-1, распознаваемого этим антителом. 100 мкг рекомбинантных белков CAPRIN-1 растворяли в буфере для растворения, не содержащем ингибитора белка, а затем подвергали реакции с моноклональным антителом #12. К этому раствору добавляли пищеварительный фермент трипсин или химотрипсин, а затем проводили реакцию гидролиза при подходящей температуре. После реакции добавляли носитель с G-белком-сефарозой, а затем эту смесь снова подвергали реакции и осаждали центрифугированием. После удаления супернатанта, носитель промывали буфером для растворения и PBS, после чего растворяли в 0,1%-ной муравьиной кислоте, и выделяли супернатант. Выделенный образец супернатанта наносили не обращенно-фазовую колонку с патроном для экстракции HLB (HLB Extraction Cartridge (Water-OASIS)), и получали раствор образца, не содержащего антитела. Полученный образец подвергали обращенно-фазовой жидкостной хроматографии (Chromatography Nanosysterns (KYA Technologies Corp.)) и получали раствор, содержащий только пептиды. Этот раствор вводили в квадрупольный масс-спектрометр тандемного типа TOF (Waters-MicroMass) и анализировали с помощью МС/МС для детектирования пептидов, содержащихся в образце. В результате, пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 66, был идентифицирован как неполная последовательность CAPRIN-1, распознаваемая химерным моноклональным антителом «мышь-курица» против человеческого CAPRIN-1 #12. Этот пептид также называется неполной последовательностью CAPRIN-1, распознаваемой куриным моноклональным антителом против человеческого CAPRIN-1 #11, содержащим вариабельные области антитела #12.
(6) Получение химерного антитела «человек-курица» против человеческого CAPRIN-1
Амплифицированный генный фрагмент вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 64) куриного моноклонального антитела против человеческого CAPRIN-1 #11, полученного как описано в предыдущем параграфе (3), обрабатывали с обоих концов рестриктирующими ферментами, а затем очищали и встраивали рутинным методом в вектор pcDNA4/myc-His (Life Technologies Inc.), в который уже были встроены генные вставки лидерной последовательности, происходящей от куриного антитела и содержащей SEQ ID NO: 67, и константной области Н-цепи человеческого IgG1, содержащая SEQ ID NO: 68. Кроме того, амплифицированный генный фрагмент вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 65) куриного моноклонального антитела против человеческого CAPRIN-1 #11 обрабатывали с обоих концов рестриктирующими ферментами, а затем очищали и встраивали рутинным методом в вектор pcDNA3.1/myc-His (Life Technologies Inc.), в который уже были встроены генные вставки лидерной последовательности, происходящей от куриного антитела и содержащей SEQ ID NO: 68, и константной области L-цепи человеческого IgG1, содержащей SEQ ID NO: 69.
Затем, рекомбинантный вектор, имеющий генную вставку вариабельной области тяжелой цепи антитела #11, и рекомбинантный вектор, имеющий генную вставку вариабельной области легкой цепи антитела #11, встраивали в клетки CHO-K1 (полученные из банка клеток RIKEN). В частности, 2×105 клеток CHO-K1 культивировали в 1 мл среды Хэмса F12 (Life Technologies Inc.), содержащей 10% FBS на лунку 12-луночного планшета для культивирования, и промывали PBS(-). После этого добавляли 1 мл свежей среды Хэмса F12, содержащей 10% FBS на лунку. 250 нг каждого вектора, растворенного в 30 мкл OptiMEM (Life Technologies Inc.), смешивали с 30 мкл реагента для трансфекции Polyfect (QIAGEN N.V.), и эту смесь добавляли в каждую лунку. Клетки СНО-К1, котрансфицированные рекомбинантными векторами, культивировали в среде Хэмса F12, содержащей 10% FBS, в которую было добавлено 200 мкг/мл зеоцина (Life Technologies Inc.) и 200 мкг/мл генетицина (Roche Diagnostics K.K.), а затем эти клетки помещали в 96-луночный планшет при плотности 0,5 клеток/лунку, в результате чего получали клеточную линию, стабильно продуцирующую химерное антитело «человек-курица» против человеческого CAPRIN-1 #13, имеющее вариабельные области куриного моноклонального антитела против человеческого CAPRIN-1 #11 и константные области человеческого IgG1. Полученную клеточную линию культивировали в течение 5 дней в 150 см2-колбе при плотности 5×105 клеток/мл с использованием 30 мл бессывороточной среды OptiCHO (Life Technologies Inc.), в результате чего получали супернатант культуры, содержащий антитело #13.
(7) Получение мышиного моноклонального антитела против человеческого CAPRIN-1 #14
Как описано в параграфе (1), гибридный белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63 и идентифицированную в параграфе (2), и белок-носитель KLH (гемоцианин лимфы улитки), служащий в качестве иммуногена, смешивали с равным количеством адъюванта TiterMax Gold(R) (CytRx Corp.), и эту смесь подкожно вводили каждой мыши в количестве 20 мкг/дозу с интервалами в 7 дней. После введения всего 4 доз, через 3 дня после последней дозы иммунизации, от каждой мыши брали клетки селезенки, и эти клетки подвергали слиянию с мышиными миеломными клетками, как описано в параграфе (1), в результате чего получали гибридомы. Затем антитела скринировали с использованием в качестве индикатора способности каждого антитела, содержащегося в супернатантах культуры полученных гибридом, реагировать с 1 мкг/мл растворов белка CAPRIN-1, полученных как описано в примере 3 заявки WO 2010/016526, или с гибридным белком, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63, и используемым в качестве иммуногена, и с белком-носителем KLH. 1 мкг/мл раствора белка CAPRIN-1, полученного как описано в примере 3 заявки WO 2010/016526, гибридный белок (30 мкг/мл) с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 63, и белок-носитель BSA отдельно добавляли в концентрации 100 мкл/лунку в 96-луночные планшеты, и эти планшеты оставляли на 18 часов при 4°С. Каждую лунку промывали PBS-T. Затем добавляли раствор Block Асе (DS Pharma Biomedical Co. Ltd.) в концентрации 400 мкл/лунку и оставляли на 3 часа при комнатной температуре. Раствор удаляли из каждой лунки, и каждую лунку промывали PBS-T. Затем добавляли супернатант каждой гибридомной культуры, полученный как описано выше, в концентрации 100 мкл/лунку, и оставляли на 2 часа при комнатной температуре. Каждую лунку промывали PBS-T. Затем добавляли ПХ-меченные антитела против мышиных IgG (H+L) (Life Technologies Inc.), 5000-кратно разведенные PBS, в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли на 1 час при комнатной температуре. Каждую лунку промывали PBS-T. После этого добавляли раствор субстрата ТМВ (Thermo Fisher Scientific Inc.) в концентрации 100 мкл/лунку и оставляли на 5-30 минут для инициации цветной реакции. После проявления окраски, реакцию прекращали добавлением 1 н серной кислоты в концентрации 100 мкл/лунку. Оптическую плотность измеряли на абсорбционном спектрометре на длине волны 450 нм и 595 нм. В результате были отобраны гибридомы, продуцирующие антитела с высокой оптической плотностью.
Отобранные гибридомы добавляли в 96-луночный планшет при плотности 0,3 клеток/лунку и культивировали в этом планшете. Через одну неделю в лунках наблюдалось образование моноколоний этими гибридомами. Клетки в этих лунках продолжали культивировать, и клонированные гибридомы скринировали вышеописанным методом на аффинность связывания антител, продуцированных этими гибридомами, с аминокислотной
последовательностью CAPRIN-1, которая представляла собой неполную последовательность SEQ ID NO: 63 и служила в качестве индикатора для получения гибридом, продуцирующих антитела против CAPRIN-1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 63.
Моноклональные антитела, продуцируемые полученными гибридомами, скринировали на их способность реагировать с поверхностью раковых клеток молочной железы, экспрессирующих CAPRIN-1. В частности, 106 клеток человеческой клеточной линии рака молочной железы MDA-MB-231 центрифугировали в 1,5-миллилитровой микроцентрифужной пробирке. Затем добавляли 100 мкл супернатанта культуры каждой гибридомы, полученной как описано выше, и оставляли на 1 час на льду. После промывки буфером PBS добавляли ФИТЦ-меченные козьи антитела против мышиных IgG (Life Technologies Inc.), 500-кратно разведенные в PBS, содержащем 0,1%-ную FBS, и эту смесь оставляли на 1 час на льду. После промывки буфером PBS измеряли интенсивность флуоресценции на FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). С другой стороны, осуществляли ту же самую процедуру, где вместо антител использовали пробу сыворотки каждой необработанной 6-недельной мыши Balb/c, 500-кратно разведенную средой для гибридомной культуры, и образец, используемый в качестве негативного контроля и состоящий из клеток, реагирующих только со «вторыми» антителами. В результате было получено мышиное моноклональное антитело против человеческого CAPRIN-1 #14, обладающее более высокой интенсивностью флуоресценции, чем негативный контроль, то есть способное реагировать с поверхностью клеток рака молочной железы. Антитело #14 состоит из вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 70, и вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 71.
Полученное мышиное моноклональное антитело против человеческого CAPRIN-1 #14 оценивали на его способность специфически реагировать с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 63, которая представляет собой неполную последовательность CAPRIN-1, используемую в качестве иммуногена. 30 мкг/мл раствора, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 63, в 0,1 М водном растворе карбоната натрия, и 30 мкг/мл раствора, состоящего из неполной последовательности CAPRIN-1, не содержащей аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 63, отдельно добавляли в 96-луночные планшеты Immobilizer Amino для ELISA (Nunc) в концентрации 100 мкг/мл, и оставляли для реакции на всю ночь и на весь день при 4°С для связывания пептидов с лунками. В каждую лунку, связанную с пептидом, добавляли 0,1 М водный раствор карбоната натрия, содержащий 10 мМ этаноламина, а затем эти планшеты оставляли на 1 час при комнатной температуре. Из каждой лунки удаляли раствор, а затем каждую лунку промывали PBS-T. После этого добавляли раствор Block Асе в концентрации 400 мкл/лунку и оставляли на 3 часа при комнатной температуре. Из каждой лунки удаляли раствор, и каждую лунку промывали PBS-T. После этого добавляли супернатант культуры, содержащий мышиное моноклональное антитело #14 в концентрации 50 мкл/лунку и оставляли на 1 час при комнатной температуре для прохождения реакции. Затем, каждую лунку промывали PBS-T и добавляли ПХ-меченные антитела против мышиных IgG (H+L) (Life Technologies Inc.), 5000-кратно разведенные раствором Block Асе в концентрации 50 мкл/лунку, и оставляли на 1 час при комнатной температуре. Каждую лунку тщательно промывали PBS-T. После этого добавляли раствор субстрата ТМВ (Thermo Fisher Scientific Inc.) в концентрации 100 мкл/лунку, и оставляли на 5-30 минут для инициации цветной реакции. После проявления окраски, реакцию прекращали добавлением 1 н серной кислоты в концентрации 100 мкл/лунку. Оптическую плотность измеряли на абсорбционном спектрометре на длине волны 450 нм и 595 нм. В результате было обнаружено, что мышиное моноклональное антитело #14 не реагировало с неполной последовательностью CAPRIN-1, не содержащей аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 63, но, при этом, специфически реагировало только с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 63. Таким образом, было подтверждено, что полипептид, представленный в SEQ ID NO: 63, содержит область эпитопа, распознаваемую анти-CAPRIN-1 антителом #14.
Пример 3. Отбор оптимального антитела для детектирования CAPRIN-1
(1) Отбор антитела с использованием ткани рака молочной железы человека
31 образец ткани рака молочной железы из массива залитых в парафин тканей рака молочной железы человека (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd.) использовали для иммуногистохимического окрашивания. Массив тканей рака молочной железы человека обрабатывали при 60°С в течение 3 часов, а затем помещали в бутыль для окрашивания, заполненную ксилолом, и процедуры замены ксилола свежим ксилолом проводили три раза через каждые 5 минут. Затем проводили ту же самую процедуру, но с использованием этанола и PBS-T. Массив тканей рака молочной железы человека помещали в бутыль для окрашивания, заполненную 10 мМ раствора цитратного буфера (рН 6,0), содержащего 0,05% твина 20, после чего обрабатывали при 125°С в течение 5 минут и оставляли на 40 минут или более при комнатной температуре. Избыток воды вокруг этих срезов вытирали полотенцем Kimwipe.
Срез на предметном стекле очерчивали кружочком маркером Dako (Dako, an Agilent Technologies Company) и по каплям добавляли соответствующее количество пероксидазных ферментов (Dako, an Agilent Technologies Company). Предметное стекло оставляли на 5 минут при комнатной температуре, а затем помещали в бутыль для окрашивания, заполненную PBS-T, и процедуры замены PBS-T свежим PBS-T проводили три раза через каждые 5 минут. После этого добавляли раствор PBS-T, содержащий 10% FBS и используемый в качестве блокирующего раствора, и предметное стекло оставляли на 1 час при комнатной температуре во влажной камере. Затем добавляли 10 мкг/мл мышиного моноклонального антитела против человеческого CAPRIN-1 #8 или #14, полученного как описано в примере 2, в растворе PBS-T, содержащем 5% FBS. Предметное стекло оставляли на ночь при 4°С во влажной камере. После 3-кратной промывки PBS-T в течение 10 минут по каплям добавляли соответствующее количество конъюгированного полимера, меченного пероксидазой (Dako, an Agilent Technologies Company), и предметное стекло оставляли на 30 минут при комнатной температуре во влажной камере. После 3-кратной промывки PBS-T в течение 10 минут добавляли окрашивающий раствор DAB (Dako, an Agilent Technologies Company), и предметное стекло оставляли приблизительно на 10 минут при комнатной температуре. После этого окрашивающий раствор отбрасывали, и предметное стекло три раза промывали PBS-T в течение 10 минут. После промывки дистиллированной водой, предметное стекло помещали на 1 минуту в 70%, 80%, 90%, 95% и 100% растворы этанола в указанном порядке, и предметное стекло оставляли на ночь в ксилоле. Затем предметное стекло вынимали, и срез помещали в заливочную среду Glycergel (Dako, an Agilent Technologies Company), после чего проводили наблюдение. Уровень экспрессии CAPRIN-1 в тканях оценивали в соответствии с критериями, представленными ниже. Затем отбирали предметное стекло, для которого были получены положительные результаты, и наблюдали картину окрашивания для CAPRIN-1. Сначала проводили наблюдение картины окрашивания раковых клеток в тканях на CAPRIN-1; а затем определяли интенсивность позитивного окрашивания и отношение позитивных клеток, и все эти процедуры проводили на оптическом микроскопе с объективом 4×. Затем этот объектив заменяли объективом 10× или 20×, и проводили анализ для того, чтобы определить, дают ли клеточные мембраны или цитоплазма положительные результаты на локализацию CAPRIN-1. Результаты детектирования оценивали и классифицировали по баллам от 0 до 3. Подробное описание баллов приводится ниже.
Балл 0 (без сверхэкспрессии CAPRIN-1): Позитивного окрашивания клеточной мембраны не наблюдается, либо такое окрашивание наблюдается для менее, чем 10% раковых клеток.
Балл 1 (без сверхэкспрессии CAPRIN-1): Слабое, почти незаметное окрашивание клеточной мембраны наблюдается для 10% или более раковых клеток, и эти раковые клетки частично окрашены только в их клеточных мембранах.
Балл 2 (со сверхэкспрессией CAPRIN-1): Слабое или умеренное полное позитивное окрашивание клеточной мембраны наблюдается для 10% или более раковых клеток, либо сильное полное позитивное окрашивание клеточной мембраны наблюдается для 10% или более и 30% или менее раковых клеток.
Балл 3 (со сверхэкспрессией CAPRIN-1): Сильное полное позитивное окрашивание клеточной мембраны наблюдается для 30% или более раковых клеток.
Ткань была определена как раковая ткань CAPRIN-1-позитивная, если результаты анализа были оценены баллами 2 и 3.
В результате, экспрессия CAPRIN-1 в тканях рака молочной железы была успешно подтверждена с использованием обоих антител. Результаты иммуногистохимического окрашивания с использованием антитела #8 были оценены баллом 2 для 14 образцов и баллом 3 для 1 образца, а поэтому, число CAPRIN-1-позитивных образцов было равно 15. В противоположность этому, результаты иммуногистохимического окрашивания с использованием антитела #14 были оценены баллом 2 для 12 образцов и баллом 3 для 8 образцов, а поэтому, число CAPRIN-1-позитивных образцов было равно 20. Таким образом, антитело #14 с более высокой чувствительностью было отобрано для детектирования CAPRIN-1 с использованием тканей рака человека.
(2) Детектирование CAPRIN-1 на различных нормальных тканях человека методом иммуногистохимического окрашивания с использованием антитела #14
Массив нормальных тканей человека (US Biomax, Inc.)(включая ткани головного мозга, щитовидной железы, легких, селезенки, почек, пищевода, желудка, толстой кишки, поджелудочной железы, мышцы, кожи, слюнных желез, яичника, матки, молочной железы, плаценты, костного мозга, яичек и предстательной железы) использовали в методе иммуногистохимического окрашивания. Избыток воды вокруг этих срезов вытирали полотенцем Kimwipe. Срез на предметном стекле очерчивали кружочком маркером Dako (Dako, an Agilent Technologies Company), и по каплям добавляли соответствующее количество пероксидазных ферментов (Dako, an Agilent Technologies Company). Предметное стекло оставляли на 5 минут при комнатной температуре, а затем помещали в бутыль для окрашивания, заполненную PBS-T, и процедуры замены PBS-T свежим PBS-T проводили три раза через каждые 5 минут. После этого добавляли раствор PBS-T, содержащий 10% FBS и используемый в качестве блокирующего раствора, и предметное стекло оставляли на 1 час при комнатной температуре во влажной камере. Затем добавляли 10 мкг/мл мышиного моноклонального антитела против человеческого CAPRIN-1 #14, полученного как описано в примере 2, в растворе PBS-T, содержащем 5% FBS. Предметное стекло оставляли на ночь при 4°С во влажной камере. После 3-кратной промывки PBS-T в течение 10 минут по каплям добавляли соответствующее количество конъюгированного полимера, меченного пероксидазой (Dako, an Agilent Technologies Company), и предметное стекло оставляли на 30 минут при комнатной температуре во влажной камере. После 3-кратной промывки PBS-T в течение 10 минут добавляли окрашивающий раствор DAB (Dako, an Agilent Technologies Company), и предметное стекло оставляли приблизительно на 10 минут при комнатной температуре. После этого окрашивающий раствор отбрасывали, и предметное стекло три раза промывали PBS-T в течение 10 минут. После промывки дистиллированной водой, предметное стекло помещали на 1 минуту в 70%, 80%, 90%, 95% и 100% растворы этанола в указанном порядке, и предметное стекло оставляли на ночь в ксилоле. Затем предметное стекло вынимали, и срез помещали в заливочную среду Glycergel (Dako, an Agilent Technologies Company), после чего проводили наблюдение.
Уровень экспрессии CAPRIN-1 в тканях оценивали в соответствии с критериями, представленными ниже. Затем отбирали предметное стекло, для которого были получены положительные результаты, и наблюдали картину окрашивания для CAPRIN-1. Сначала проводили наблюдение картины окрашивания раковых клеток в тканях на CAPRIN-1, а затем определяли интенсивность позитивного окрашивания и отношение позитивных клеток, и все эти процедуры проводили на оптическом микроскопе с объективом 4×. Затем этот объектив заменяли объективом 10× или 20×, и проводили анализ для того, чтобы определить, дают ли клеточные мембраны или цитоплазма положительные результаты на локализацию CAPRIN-1. Результаты детектирования оценивали и классифицировали по баллам от 0 до 3. Подробное описание баллов приводится ниже.
Балл 0 (без сверхэкспрессии CAPRIN-1): Позитивного окрашивания клеточной мембраны не наблюдается, либо такое окрашивание наблюдается для менее, чем 10% раковых клеток.
Балл 1 (без сверхэкспрессии CAPRIN-1): Слабое, почти незаметное окрашивание клеточной мембраны наблюдается для 10% или более раковых клеток, и эти раковые клетки частично окрашены только в их клеточных мембранах.
Балл 2 (со сверхэкспрессией CAPRIN-1): Слабое или умеренное полное позитивное окрашивание клеточной мембраны наблюдается для 10% или более раковых клеток, либо сильное полное позитивное окрашивание клеточной мембраны наблюдается для 10% или более и 30% или менее раковых клеток.
Балл 3 (со сверхэкспрессией CAPRIN-1): Сильное полное позитивное окрашивание клеточной мембраны наблюдается для 30% или более раковых клеток.
Ткань была определена как раковая ткань CAPRIN-1-позитивная, если результаты анализа были оценены баллами 2 или 3.
Ткани матки и предстательной железы давали балл 1, а все остальные ткани давали балл 0. Таким образом, в нормальных человеческих тканях экспрессия CAPRIN-1 не наблюдалась.
(3) Детектирование белка CAPRIN-1 на различных раковых тканях человека методом иммуногистохимического окрашивания с использованием мышиного антитела против человеческого CAPRIN-1, #14
Различные раковые ткани из массива залитых в парафин тканей рака человека (US Biomax, Inc.) использовали для иммуногистохимического окрашивания. Массив тканей рака человека обрабатывали при 60°С в течение 3 часов, а затем помещали в бутыль для окрашивания, заполненную ксилолом, и процедуры замены ксилола свежим ксилолом проводили три раза через каждые 5 минут. Затем проводили ту же самую процедуру, но с использованием этанола и PBS-T. Массив тканей рака человека помещали в бутыль для окрашивания, заполненную 10 мМ раствора цитратного буфера (рН 6,0), содержащего 0,05% твина 20, после чего обрабатывали при 125°С в течение 5 минут и оставляли на 4 0 минут или более при комнатной температуре. Избыток воды вокруг этих срезов вытирали полотенцем Kimwipe. Срез на предметном стекле очерчивали кружочком маркером Dako (Dako, an Agilent Technologies Company) и по каплям добавляли соответствующее количество пероксидазных ферментов (Dako, an Agilent Technologies Company). Предметное стекло оставляли на 5 минут при комнатной температуре, а затем помещали в бутыль для окрашивания, заполненную PBS-T, и процедуры замены PBS-T свежим PBS-T проводили три раза через каждые 5 минут. После этого добавляли раствор PBS-T, содержащий 10% FBS и используемый в качестве блокирующего раствора, и предметное стекло оставляли на 1 час при комнатной температуре во влажной камере. Затем добавляли 10 мкг/мл мышиного моноклонального антитела #14, полученного как описано в примере 2, в растворе PBS-T, содержащем 5% FBS. Предметное стекло оставляли на ночь при 4°С во влажной камере. После 3-кратной промывки PBS-T в течение 10 минут по каплям добавляли соответствующее количество конъюгированного полимера, меченного пероксидазой (Dako, an Agilent Technologies Company), и предметное стекло оставляли на 30 минут при комнатной температуре во влажной камере. После 3-кратной промывки PBS-T в течение 10 минут добавляли окрашивающий раствор DAB (Dako, an Agilent Technologies Company), и предметное стекло оставляли приблизительно на 10 минут при комнатной температуре. После этого, окрашивающий раствор отбрасывали, и предметное стекло три раза промывали PBS-T в течение 10 минут. Предметное стекло промывали дистиллированной водой, помещали на 1 минуту в 70%, 80%, 90%, 95% и 100% растворы этанола в указанном порядке, и оставляли на ночь в ксилоле. Затем предметное стекло вынимали, и срез помещали в заливочную среду Glycergel (Dako, an Agilent Technologies Company), после чего проводили наблюдение.
Уровень экспрессии CAPRIN-1 в тканях оценивали в соответствии с критериями, представленными ниже. Затем отбирали предметное стекло, для которого были получены положительные результаты, и наблюдали картину окрашивания для CAPRIN-1. Сначала проводили наблюдение картины окрашивания раковых клеток в тканях на CAPRIN-1, а затем определяли интенсивность позитивного окрашивания и отношение позитивных клеток, и все эти процедуры проводили на оптическом микроскопе с объективом 4×. Затем этот объектив заменяли объективом 10× или 20×, и проводили анализ для того, чтобы определить, дают ли клеточные мембраны или цитоплазма положительные результаты на локализацию CAPRIN-1. Результаты детектирования оценивали и классифицировали по баллам от 0 до 3. Подробное описание баллов приводится ниже.
Балл 0 (без сверхэкспрессии CAPRIN-1): Позитивного окрашивания клеточной мембраны не наблюдается, либо такое окрашивание наблюдается для менее, чем 10% раковых клеток.
Балл 1 (без сверхэкспрессии CAPRIN-1): Слабое, почти незаметное окрашивание клеточной мембраны наблюдается для 10% или более раковых клеток, и эти раковые клетки частично окрашены только в их клеточных мембранах.
Балл 2 (со сверхэкспрессией CAPRIN-1): Слабое или умеренное полное позитивное окрашивание клеточной мембраны наблюдается для 10% или более раковых клеток, либо сильное полное позитивное окрашивание клеточной мембраны наблюдается для для 10% или более и 30% или менее раковых клеток.
Балл 3 (со сверхэкспрессией CAPRIN-1): Сильное полное позитивное окрашивание клеточной мембраны наблюдается для 30% или более раковых клеток.
Ткань была определена как раковая ткань CAPRIN-1-позитивная, если результаты анализа были оценены баллами 2 или 3.
В результате было обнаружено, что позитивными на CAPRIN-1 были 16 из 22 образцов ткани опухоли головного мозга (64%), 19 из 32 образцов ткани рака легких (59%), 18 из 21 образца ткани рака матки (86%), 10 из 16 образцов ткани рака пищевода (63%), 27 из 30 образцов ткани рака почек (90%), 14 из 17 образцов ткани рака печени (82%), 11 из 15 образцов ткани рака щитовидной железы (73%), 10 из 14 образцов ткани рака желудка (71%), 17 из 19 образцов ткани рака поджелудочной железы (89%), 13 из 13 образцов ткани рака предстательной железы (100%), 12 из 14 образцов ткани рака мочевого пузыря (86%), 11 из 14 образцов ткани рака толстой кишки (79%), 24 из 30 образцов ткани рака кожи (80%) и 16 из 21 образцов ткани рака молочной железы (76%).
(4) Детектирование белка CAPRIN-1 на ткани рака молочной железы собак методом иммуногистохимического окрашивания с использованием мышиного антитела против человеческого CAPRIN-1, #14
100 замороженных образцов ткани рака молочной железы собак, у которых была диагностирована злокачественная опухоль рака молочной железы, использовали для иммуногистохимического окрашивания. Каждую замороженную ткань рака молочной железы собак разрезали с получением 10-20 мкм-срезов с использованием Cryostat (Leica Biosystems), а затем помещали на предметное стекло и вместе с предметным стеклом сушили феном в течение 30 минут, в результате чего было приготовлено предметное стекло с находящимся на нем срезом ткани. Затем предметное стекло помещали в бутыль для окрашивания, заполненную PBS-T (физиологическим раствором, содержащим 0,05% твина 20), и через каждые 5 минут PBS-T три раза заменяли свежим PBS-T. Избыток воды вокруг этих срезов вытирали полотенцем Kirawipe. Срез на предметном стекле очерчивали кружочком маркером Dako (Dako, an Agilent Technologies Company). Затем добавляли раствор PBS-T, содержащий 10%-ную фетальную бычью сыворотку и используемый в качестве блокирующего раствора, и предметное стекло оставляли на 1 час при комнатной температуре во влажной камере. Затем добавляли 10 мкг/мл мышиного моноклонального антитела против человеческого CAPRIN-1 #8 или #14, полученного как описано в примере 2, в блокирующем растворе. Предметное стекло оставляли на ночь при 4°С во влажной камере. После 3-кратной промывки PBS-T в течение 10 минут добавляли анти-IgG антитела, меченные биотином MOM (Vectastain) и 250-кратно разведенные блокирующим раствором, и предметное стекло оставляли на 1 час при комнатной температуре во влажной камере. После 3-кратной промывки PBS-T в течение 10 минут добавляли реагент авидин-биотин ABC (Vectastain), и предметное стекло оставляли приблизительно на 5 минут при комнатной температуре во влажной камере. После 3-кратной промывки PBS-T в течение 10 минут добавляли окрашивающий раствор DAB (10 мг DAB + 10 мкл 30% Н2О2/50 мл 0,05 М трис-HCl (рН 7,6)), и предметное стекло оставляли приблизительно на 30 минут при комнатной температуре во влажной камере. Предметное стекло промывали дистиллированной водой. После этого добавляли гематоксилиновый реагент (Dako, an Agilent Technologies Company), и предметное стекло оставляли на 1 минуту при комнатной температуре, а затем промывали дистиллированной водой. Предметное стекло помещали на 1 минуту в 70%, 80%, 90%, 95% и 100% растворы этанола в указанном порядке, а затем оставляли на ночь в ксилоле. Затем предметное стекло вынимали, и срез помещали в заливочную среду Glycergel (Dako, an Agilent Technologies Company), после чего проводили наблюдение.
Уровень экспрессии CAPRIN-1 в тканях оценивали в соответствии с критериями, представленными ниже. Затем отбирали предметное стекло, для которого были получены положительные результаты, и наблюдали картину окрашивания для CAPRIN-1. Сначала проводили наблюдение картины окрашивания раковых клеток в тканях на CAPRIN-1, а затем определяли интенсивность позитивного окрашивания и отношение позитивных клеток, и все эти процедуры проводили на оптическом микроскопе с объективом 4×. Затем этот объектив заменяли объективом 10× или 20×, и проводили анализ для того, чтобы определить, дают ли клеточные мембраны или цитоплазма положительные результаты на локализацию CAPRIN-1. Результаты детектирования оценивали и классифицировали по баллам от 0 до 3. Подробное описание баллов приводится ниже.
Балл 0 (без сверхэкспрессии CAPRIN-1): Позитивного окрашивания клеточной мембраны не наблюдается, либо такое окрашивание наблюдается для менее, чем 10% раковых клеток.
Балл 1 (без сверхэкспрессии CAPRIN-1): Слабое, почти незаметное окрашивание клеточной мембраны наблюдается для 10% или более раковых клеток, и эти раковые клетки частично окрашены только в их клеточных мембранах.
Балл 2 (со сверхэкспрессией CAPRIN-1): Слабое или умеренное полное позитивное окрашивание клеточной мембраны наблюдается для 10% или более раковых клеток, либо сильное полное позитивное окрашивание клеточной мембраны наблюдается для 10% или более и 30% или менее раковых клеток.
Балл 3 (со сверхэкспрессией CAPRIN-1): Сильное полное позитивное окрашивание клеточной мембраны наблюдается для 30% или более раковых клеток.
Раковая ткань собак была определена как CAPRIN-1-позитивная и давала нужный терапевтический эффект после введения терапевтического лекарственного средства, нацеленного на CAPRIN-1, если результаты анализа были оценены баллами 2 или 3.
В результате, экспрессия CAPRIN-1 в тканях рака молочной железы собак была успешно подтверждена с использованием обоих антител. В частности, результаты иммуногистохимического окрашивания с использованием антитела #8 были оценены баллом 2 для 69 образцов и баллом 3 для 11 образцов, и таким образом, число CAPRIN-1-позитивных образцов было равно 80 (80%). В противоположность этому, результаты иммуногистохимического окрашивания с использованием антитела #14 были оценены баллом 2 для 50 образцов и баллом 3 для 32 образцов, и таким образом, число CAPRIN-1-позитивных образцов было равно 82 (82%).
(5) Детектирование CAPRIN-1 на тканях рака молочной железы кошек методом иммуногистохимического окрашивания с использованием мышиного моноклонального антитела против человеческого CAPRIN-1, #14
30 замороженных образцов ткани рака молочной железы кошек, у которых была диагностирована злокачественная опухоль рака молочной железы, использовали для иммуногистохимического окрашивания. Каждую замороженную ткань рака кошек разрезали с получением 10-20 мкм-срезов с использованием Cryostat (Leica Biosystems), а затем помещали на предметное стекло и вместе с предметным стеклом сушили феном в течение 30 минут, в результате чего было приготовлено предметное стекло с находящимся на нем срезом ткани. Затем предметное стекло помещали в бутыль для окрашивания, заполненную PBS-T (физиологическим раствором, содержащим 0,05% твина 20), и через каждые 5 минут PBS-T три раза заменяли свежим PBS-T. Избыток воды вокруг этих срезов вытирали полотенцем Kimwipe. Срез на предметном стекле очерчивали кружочком маркером Dako (Dako, an Agilent Technologies Company). Затем добавляли раствор PBS-T, содержащий 10% фетальную бычью сыворотку и используемый в качестве блокирующего раствора, и предметное стекло оставляли на 1 час при комнатной температуре во влажной камере. Затем добавляли 10 мкг/мл мышиного моноклонального антитела против человеческого CAPRIN-1 #8 или #14, полученного как описано в примере 2, в блокирующем растворе. Предметное стекло оставляли на ночь при 4°С во влажной камере. После 3-кратной промывки PBS-T в течение 10 минут добавляли анти-IgG антитела, меченные биотином MOM (Vectastain) и 250-кратно разведенные блокирующим раствором, и предметное стекло оставляли на 1 час при комнатной температуре во влажной камере. После 3-кратной промывки PBS-T в течение 10 минут добавляли реагент авидин-биотин ABC (Vectastain), и предметное стекло оставляли приблизительно на 5 минут при комнатной температуре во влажной камере. После 3-кратной промывки PBS-T в течение 10 минут добавляли окрашивающий раствор DAB (10 мг DAB + 10 мкл 30% Н2О2/50 мл 0,05 М трис-HCl (рН 7,6)), и предметное стекло оставляли приблизительно на 30 минут при комнатной температуре во влажной камере. Предметное стекло промывали дистиллированной водой. После этого добавляли гематоксилиновый реагент (Dako, an Agilent Technologies Company), и предметное стекло оставляли на 1 минуту при комнатной температуре, а затем промывали дистиллированной водой. Предметное стекло помещали на 1 минуту в 70%, 80%, 90%, 95% и 100% растворы этанола в указанном порядке, а затем оставляли на ночь в ксилоле. Затем предметное стекло вынимали, и срез помещали в заливочную среду Glycergel (Dako, an Agilent Technologies Company), после чего проводили наблюдение. Уровень экспрессии CAPRIN-1 в тканях оценивали в соответствии с критериями, представленными ниже. Затем отбирали предметное стекло, для которого были получены положительные результаты, и наблюдали картину окрашивания для CAPRIN-1. Сначала проводили наблюдение картины окрашивания раковых клеток в тканях на CAPRIN-1, а затем определяли интенсивность позитивного окрашивания и отношение позитивных клеток, и все эти процедуры проводили на оптическом микроскопе с объективом 4×. Затем этот объектив заменяли объективом 10× или 20×, и проводили анализ для того, чтобы определить, дают ли клеточные мембраны или цитоплазма положительные результаты на локализацию CAPRIN-1. Результаты детектирования оценивали и классифицировали по баллам от 0 до 3. Подробное описание баллов приводится ниже.
Балл 0 (без сверхэкспрессии CAPRIN-1): Позитивного окрашивания клеточной мембраны не наблюдается, либо такое окрашивание наблюдается для менее, чем 10% раковых клеток.
Балл 1 (без сверхэкспрессии CAPRIN-1): Слабое, почти незаметное окрашивание клеточной мембраны наблюдается для 10% или более раковых клеток, и эти раковые клетки частично окрашены только в их клеточных мембранах.
Балл 2 (со сверхэкспрессией CAPRIN-1): Слабое или умеренное полное позитивное окрашивание клеточной мембраны наблюдается для 10% или более раковых клеток, либо сильное полное позитивное окрашивание клеточной мембраны наблюдается для 10% или более и 30% или менее раковых клеток.
Балл 3 (со сверхэкспрессией CAPRIN-1): Сильное полное позитивное окрашивание клеточной мембраны наблюдается для 30% или более раковых клеток.
Раковая ткань кошек была определена как CAPRIN-1-позитивная и давала ожидаемый терапевтический эффект после введения терапевтического лекарственного средства, нацеленного на CAPRIN-1, если результаты анализа были оценены баллами 2 или 3.
В результате, экспрессия CAPRIN-1 в тканях рака молочной железы кошек была успешно подтверждена с использованием обоих антител. В частности, результаты иммуногистохимического окрашивания с использованием антитела #8 были оценены баллом 2 для 2 0 образцов и баллом 3 для 4 образцов, и таким образом, число CAPRIN-1-позитивных образцов было равно 24 (80%). В противоположность этому, результаты иммуногистохимического окрашивания с использованием антитела #14 были оценены баллом 2 для 18 образцов и баллом 3 для 6 образцов, и таким образом, число CAPRIN-1-позитивных образцов было равно 27 (90%).
Пример 4. Корреляция экспрессии CAPRIN-1, измеряемая с использованием образца рака на противоопухолевый эффект антитела против CAPRIN-1
(1) Детектирование CAPRIN-1 методом иммуногистохимического окрашивания с использованием раковой ткани, взятой у мышей с раковой опухолью, которым были трансплантированы мышиные раковые клетки.
Две мышиных раковых клеточных линии (B16F10 и ЕМТ-6) подкожно трансплантировали (каждой из 5 мышей) в дорсальную область 26 мышей Balb/c (Japan SLC, Inc.), и культивировали до тех пор, пока размер опухоли не достигал диаметра приблизительно 7 мм. Из каждой из этих двух групп мышей отбирали три мыши, имеющие, соответственно, трансплантированные раковые клетки 2 типов. У каждой мыши вырезали опухолевую массу, а затем эту опухолевую массу разрезали в PBS и фиксировали путем перфузии в течение ночи в 0,1М фосфатно-буферном растворе (рН 7,4), содержащем 4% параформальдегид (PFA). Перфузат отбрасывали и поверхность ткани каждого органа промывали PBS. Раствор PBS, содержащий 10% сахарозу, добавляли в 50-миллилитровую центрифужную пробирку, после чего, в нее помещали каждую раковую ткань и встряхивали при 4°С в течение 2 часов с помощью роторной мешалки. Этот раствор заменяли раствором PBS, содержащим 20% сахарозу, и образец оставляли при 4°С до осаждения раковой ткани. Затем этот раствор заменяли раствором PBS, содержащим 30% сахарозу, и образец оставляли при 4°С до осаждения раковой ткани. Затем раковую ткань вынимали, и нужные части отрезали хирургическим скальпелем. После этого, на поверхность ткани выливали соединение OCT (Tissue Tek) так, чтобы оно распределялось по поверхности. Затем ткань помещали на устройство Cryomold. Устройство Cryomold помещали на сухой лед для быстрого замораживания ткани, а затем ткань разрезали с получением 10-20 мкм-срезов с использованием Cryostat (Leica Biosystems), помещали на предметное стекло и вместе с предметным стеклом сушили феном в течение 30 минут, в результате чего было приготовлено предметное стекло с находящимся на нем срезом ткани. На следующий день, предметное стекло три раза промывали PBS(-). Затем добавляли PBS(-), содержащий 5% козью сыворотку и используемый в качестве блокирующего раствора, после чего предметное стекло оставляли на 1 час при комнатной температуре во влажной камере. Затем добавляли 10 мкг/мл мышиного моноклонального антитела против человеческого CAPRIN-1 #8 или #14, полученного как описано в примере 2, в растворе PBS(-). Предметное стекло оставляли на ночь при 4°С во влажной камере. После 5-кратной промывки PBS(-) в течение 5 минут по каплям добавляли соответствующее количество конъюгированного полимера, меченного пероксидазой (Dako, an Agilent Technologies Company), и предметное стекло оставляли на 30 минут при комнатной температуре во влажной камере. После 6-кратной промывки PBS-T в течение 5 минут добавляли окрашивающий раствор DAB (Dako, an Agilent Technologies Company), и предметное стекло оставляли приблизительно на 10 минут при комнатной температуре. После этого, окрашивающий раствор отбрасывали, и предметное стекло три раза промывали PBS(-) в течение 5 минут. Затем предметное стекло помещали в заливочную среду Glycergel (Dako, an Agilent Technologies Company), после чего проводили наблюдение. В методе оценки, осуществляемом как описано в примере 3, результаты иммуногистохимического окрашивания, проводимого с использованием антитела #8, были представлены баллом 1 для клеток меланомы B16F10 и клеток рака молочной железы ЕМТ-6. Таким образом, экспрессия CAPRIN-1 не детектировалась. С другой стороны, результаты иммуногистохимического окрашивания, проводимого с использованием антитела #14, были представлены баллом 1 для раковых клеток B16F10, а с использованием антитела #8 баллом 3 для раковых клеток ЕМТ-6.
(2) Противоопухолевый эффект антитела против CAPRIN-1 Химерное моноклональное антитело «человек-курица» против человеческого CAPRIN-1 #13 исследовали на его противоопухолевый эффект на мышах с раковой опухолью, полученных как описано в предыдущем параграфе (1). Из всех 10 мышей, которым трансплантировали каждую раковую клеточную линию (B16F10 и ЕМТ-6), 5 мышам с раковой опухолью каждой группы внутрибрюшинно вводили антитело #13 в дозе 200 мкг (200 мкл) на мышь. Затем каждой мыши с раковой опухолью в экспериментальной группе в течение 2 дней 3 раза внутрибрюшинно вводили антитело в той же самой дозе. После этого каждый день измеряли размер опухоли и оценивали противоопухолевый эффект антитела #13. С другой стороны, остальным 5 мышам с раковой опухолью вместо антитела вводили PBS(-), и эти мыши, в свою очередь, были включены в контрольную группу.
В результате наблюдения противоопухолевого эффекта было обнаружено, что объемы опухоли у мышей экспериментальной группы, которым были трансплантированы раковые клетки B16F10, и которым было введено антитело #13, увеличивались приблизительно на 150%, 200%, 370% и 630% на дни 4, 6, 8 и 11, соответственно, причем, объем опухоли на момент введения антитела был принят за 100%. С другой стороны, объемы опухоли у мышей экспериментальной группы, которым были трансплантированы раковые клетки ЕМТ-6 и которым было введено антитело #13, снижались на 51% на день 4, приблизительно на 31% на день 6 и на 9% на день 8, причем объем опухоли на момент введения антитела был принят за 100%, и опухоли у этих мышей почти полностью исчезали на дни 10-14. Объемы опухоли у мышей контрольной группы, которым были трансплантированы раковые клетки B16F10 и ЕМТ-6, и которым вводили PBS (-), увеличивались приблизительно на 230%, 290%, 470% и 800% на дни 4, 6, 8 и 11, соответственно.
Исходя из вышеуказанных результатов, было обнаружено, что результаты детекции CAPRIN-1, измеренные с использованием антитела #8, не коррелировали с противораковым терапевтическим эффектом, определенным по противоопухолевой активности антитела, тогда как результаты детекции CAPRIN-1, измеренные с использованием антитела #14, коррелировала с противораковым терапевтическим эффектом, определенным по противоопухолевой активности антитела. В частности, результаты детекции CAPRIN-1 с использованием антитела #14 давали балл 3 для раковых тканей, происходящих от трансплантата ЕМТ-6, что указывало на сверхэкспрессию CAPRIN-1, и исходя из противоопухолевой активности введенного антитела были оценены фармакологические эффекты.
С другой стороны, результаты измерения уровня экспрессии CAPRIN-1 с использованием антитела #14 давали балл 1 для раковых тканей, происходящих от трансплантата B16F10. Таким образом, экспрессия CAPRIN-1 не детектировалась. Кроме того, антитело #13, обладающее противоопухолевой активностью, не давало фармакологических эффектов при его введении мышам с раковой опухолью, которым были трансплантированы раковые клетки B16F10.
Эти результаты показали, что у индивидуума с раковой опухолью, у которого наблюдается высокий уровень экспрессии CAPRIN-1 в раковой ткани, как было определено путем детектирования CAPRIN-1 в раковой ткани с использованием антитела #14 согласно изобретению, специфически связывающегося с CAPRIN-1, могут наблюдаться очень хорошие терапевтические эффекты после введения анти-CAPRIN-1 антитела, обладающего противоопухолевой активностью.
Промышленное применение
Настоящее изобретение может быть применено в целях промышленного приготовления препаратов для диагностики рака.
Все цитируемые здесь публикации, патенты и патентные заявки во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Текст Списка последовательностей в свободном формате
Праймеры: SEQ ID NO: 31-36 и 38-42
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| МЕТОД ДЕТЕКЦИИ РАКА | 2013 |
|
RU2646464C2 |
| ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И/ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ РАКА | 2011 |
|
RU2598258C2 |
| ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И/ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ РАКА | 2011 |
|
RU2607366C2 |
| ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И/ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ РАКА | 2011 |
|
RU2597971C2 |
| ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И/ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ РАКА | 2011 |
|
RU2567657C2 |
| ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И/ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ РАКА | 2011 |
|
RU2603742C2 |
| ИНДУЦИРУЮЩИЙ ИММУНИТЕТ АГЕНТ | 2013 |
|
RU2639518C2 |
| ИНДУЦИРУЮЩИЙ ИММУНИТЕТ АГЕНТ | 2009 |
|
RU2511039C2 |
| ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ РАКА | 2013 |
|
RU2631804C2 |
| ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ | 2009 |
|
RU2498819C2 |
Группа изобретений относится к медицине и касается способа детектирования рака, включающего измерение уровня экспрессии CAPRIN-1, экспрессированного на клеточной поверхности, в биологическом образце посредством реакции «антиген-антитело» с использованием антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, обладающего иммунологической реактивностью с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63. Группа изобретений также касается лекарственного средства для диагностики рака, содержащего антитело, обладающее иммунологической реактивностью с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63, или антигенсвязывающий фрагмент этого антитела; набора для диагностики рака, содержащего указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент этого антитела. Группа изобретений обеспечивает детектирование рака. 4 н. и 13 з.п. ф-лы, 4 пр., 1 ил.
1. Способ детектирования рака, включающий измерение уровня экспрессии CAPRIN-1, экспрессированного на клеточной поверхности, в биологическом образце посредством реакции «антиген-антитело» с использованием антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, обладающего иммунологической реактивностью с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63.
2. Способ детектирования рака по п. 1, где измеряемый CAPRIN-1 представляет собой
(a) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в любой последовательности с четными номерами от SEQ ID NO: 2 до 30 в списке последовательностей, или
(b) полипептид, имеющий последовательность, которая на 85% или более идентична последовательности указанного полипептида.
3. Способ детектирования рака по п. 1 или 2, где указанный биологический образец представляет собой образец, взятый у человека, собаки или кошки.
4. Способ детектирования рака по п. 1, где указанный биологический образец представляет собой образец, взятый у собаки, и где измеряемый CAPRIN-1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 или 14.
5. Способ детектирования рака по п. 1, где указанный биологический образец представляет собой образец, взятый у человека, и где измеряемый CAPRIN-1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 или 4.
6. Способ детектирования рака по п. 1, где уровень экспрессии измеряемого CAPRIN-1, значительно превышающий уровень экспрессии CAPRIN-1 у здорового индивидуума, указывает на наличие рака, являющегося мишенью для антитела, используемого в качестве терапевтического лекарственного средства для лечения рака.
7. Способ детектирования рака по п. 1, где измерение уровня экспрессии CAPRIN-1 осуществляют методом иммунологического анализа.
8. Способ детектирования рака по п. 7, где метод иммунологического анализа представляет собой ELISA и/или метод иммуногистохимического окрашивания.
9. Способ детектирования рака по п. 1, где указанный образец представляет собой физиологическую жидкость, ткань или клетку.
10. Способ детектирования рака по п. 1, где указанный рак представляет собой по меньшей мере одно раковое заболевание, выбранное из группы, состоящей из рака молочной железы, опухоли головного мозга, рака пищевода, рака желудка, рака легкого, рака печени, рака почки, рака щитовидной железы, рака селезенки, рака поджелудочной железы, рака толстой кишки, рака кожи, рака яичника, рака матки, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря, рака яичка, остеосаркомы и фибросаркомы.
11. Способ детектирования рака по п. 1, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой моноклональное антитело, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 70, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или антигенсвязывающий фрагмент этого антитела.
12. Лекарственное средство для диагностики рака, содержащее антитело, обладающее иммунологической реактивностью с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63, или антигенсвязывающий фрагмент этого антитела.
13. Лекарственное средство по п. 12, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой моноклональное антитело, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 70, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или антигенсвязывающий фрагмент этого антитела.
14. Набор для диагностики рака, содержащий
антитело, обладающее иммунологической реактивностью с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63, или антигенсвязывающий фрагмент этого антитела и
добавки, используемые для стабилизации антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
15. Набор по п. 14, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой моноклональное антитело, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 70, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или антигенсвязывающий фрагмент этого антитела.
16. Способ отбора терапевтического лекарственного средства, специфичного для индивидуума, для лечения рака, где указанный способ включает измерение уровня экспрессии CAPRIN-1 в биологическом образце с использованием антитела, обладающего иммунологической реактивностью с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63, или антигенсвязывающего фрагмента этого антитела и, если уровень экспрессии статистически значимо превышает уровень экспрессии у здорового индивидуума, отбор лекарственного средства, нацеленного на CAPRIN-1, в качестве терапевтического лекарственного средства для лечения рака, которое является подходящим для его введения индивидууму, у которого был взят биологический образец.
17. Способ отбора терапевтического лекарственного средства, специфичного для индивидуума, для лечения рака по п. 16, где указанное лекарственное средство, нацеленное на CAPRIN-1, представляет собой антитело, обладающее иммунологической реактивностью с CAPRIN-1, или его антигенсвязывающий фрагмент.
| Способ приготовления лака | 1924 |
|
SU2011A1 |
| Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов | 1917 |
|
SU2A1 |
| KADDAR T., et al., Two new miR-16 targets: caprin-1 and HMGA1, proteins implicated in cell proliferation.Biol Cell | |||
| Колосоуборка | 1923 |
|
SU2009A1 |
| Печь-кухня, могущая работать, как самостоятельно, так и в комбинации с разного рода нагревательными приборами | 1921 |
|
SU10A1 |
| SAFFARI M., et al., Identification of novel p53 target genes by cDNA AFLP in glioblastoma cells.Cancer Lett | |||
| Колосоуборка | 1923 |
|
SU2009A1 |
| Печь-кухня, могущая работать, как самостоятельно, так и в комбинации с разного рода нагревательными приборами | 1921 |
|
SU10A1 |
| Станок для изготовления деревянных ниточных катушек из цилиндрических, снабженных осевым отверстием, заготовок | 1923 |
|
SU2008A1 |
