ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ (БАКТЕРИО)ХЛОРОФИЛЛА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛАЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И РАССТРОЙСТВ Российский патент 2017 года по МПК A61K31/409 A61K31/555 A61K47/36 A61P27/02 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области офтальмологии и фотодинамической терапии (ФДТ) и касается фотодинамической терапии заболеваний, расстройств и состояний, связанных с аномалией роговицы или склеры, с применением фотосенсибилизаторов, водорастворимых соединений, в частности соединений хлорофилла и бактериохлорофилла.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ И АББРЕВИАТУРЫ

Bchl а: бактериохлорофилл а: пентациклический 7,8,17,18-тетрагидропорфирин, содержащий 5-е изоциклическое кольцо, центральный атом Mg, фитильную или геранилгеранильную группу в положении 17³, группу СООСН₃ в положении 13², атом И в положении 13², метальные группы в положениях 2, 7, 12, 18, ацетильную группу в положении 3 и этильную группу в положении 8, далее - соединение 1; Bphe: бактериофеофитин a (Bchl, в котором центральный Mg замещен на два атома Н); Bpheid: бактериофеофорбид а (свободная карбоновая кислота С-17, производная от Bphe без центрального атома металла); Chl: хлорофилл; Родобактериохлорин: тетрациклический 7,8,17,18-тетрагидропорфирин, содержащий группу -CH₂CH₂COOH в положении 17, -СООН в положении 13, метальные группы в положениях 2, 7, 12, 18, этильную группу в положении 8 и винил в положении 3; Pd-Bpheid: Pd-бактериофеофорбид a; WST11: дикалиевая соль палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-сульфоэтил)амида; РФК: реакционноспособные формы кислорода; БИК: ближняя инфракрасная область; РФ: рибофлавин.

На протяжении всего описания используется нумерация производных бактериохлорофилла в соответствии с IUPAC.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Лечение рибофлавином (РФ) с последующим облучением ультрафиолетом А (УФЛ, 370 им) приводит к повышению жесткости роговицы и склеры, предположительно из-за поперечного сшивания коллагена (ПСК). Такое лечение все чаще используется для остановки прогрессирования кератоконуса и эктазии роговицы после хирургической коррекции аномалий рефракции (Wollensak et al., 2003(а); Hafezi et al., 2007; Raiskup - Wolf et al., 2008). Однако недостатков: (1) длительное время лечения РФ (30 мин); (2) длительное воздействие на глаз УФА облучением (30 мин) и, наконец, (3) токсичность для кератоцитов (Wollensak et al., 2004(a): Wollensak et al., 2004(b); Wollensak, 2010(а)) и эпдотелиальных клеток роговицы (Wollensak et al., 2003(c); Spoeri et al. 2007), что делает проблематичным лечение роговицы толщиной менее 400 микрон (llafezi et al., 2009; Wollensak, 2010(b)). Следовательно, существует необходимость в более безопасном лечении, которое может повышать жесткость роговицы с меньшим риском для пациента (Avila and Navia, 2010; WO/2008/052081). Одна из возможностей заключается в использовании фотосенсибилизаторов, которые придают жесткость роговице при облучении в ближней инфракрасной области (БИК) с применением производных бактериохлорофилла в качестве фотосенсибилизаторов.

Миопия, также называемая близорукостью, является рефракционным дефектом глаз, при котором коллимированный свет обеспечивает фокусировку изображения перед сетчаткой, когда аккомодация ослаблена. Согласно оценкам. распространенность миопии во всем мире составляет от 800 миллионов до 2,3 миллиардов случаев. В некоторых странах, таких как Китай. Индия и Малайзия. до 41% взрослого населения страдают миопией до -1 диоптрии, и около 80% - до -0.5 диоптрий. Миопия связана с растяжением коллагеновой склеры. Удлинение глазного яблока происходит в заднем сегменте глазного яблока и затрагивает склеру. Такое удлинение глазного яблока вызывает прогрессирование миопии у предрасположенных к миопии детей и подростков. Оно, как правило, замедляется и останавливается в течение третьего десятилетия жизни, когда происходит созревание тканей организма с естественным повышением жесткости. Такое повышение жесткости связано с поперечным сшиванием, опосредованным гликированием.

В настоящее время не существует эффективного лечения, которое могло бы привести к остановке прогрессирования миопии и уменьшению потери зрения, вызванной дегенеративной миопией. Сообщалось о хирургических способах решения проблемы с целью прекращения прогрессирования миопии с применением армирующих лент вокруг глаза и подшиванием их к склере. Эти хирургические способы решения проблемы были спорными и технически сложными и не приобрели популярности. Критический возраст для вмешательства - период детства или ранней юности. Таким образом, необходимо применять более простой подход к повышению жесткости склеры.

Поскольку прогрессирование миопии связано с удлинением заднего сегмента глаза и последующим растяжением склеры и хориоретинальных тканей, повышение жесткости склеры посредством поперечного сшивания коллагена, как ожидается, замедлит/остановит прогрессирование заболевания и связанных с ним расстройств, таких как макулярное растяжение и атрофия или кровотечение и потеря зрения. Wollensak и Spoeri сообщили об использовании лечения РФ/УФА для достижения такого поперечного сшивания и повышения прочности склеры человека и свиньи in vitro. Повышение жесткости посредством поперечного сшивания было продемонстрировано на кроликах in vivo, и было показано, что такое повышение жесткости длится до нескольких месяцев. Такое лечение можно применять для прекращения прогрессирования миопии.

Однако такое лечение связано с рискам, обусловленными УФА, которые могут быть опасными. Кроме того, проникновение УФ излучения в ткани ограничено. Облучение склеры УФ требует наружного применения и неизбежно влечет хирургическое воздействие. Поэтому существует необходимость в альтернативных фотосенсибилизаторах, которые могут стимулировать поперечное сшивание коллагена с более безопасной и лучшей проникающей длиной волны в красной или ближней инфракрасной области (БИК).

Было продемонстрировано, что неопасное излучение с более глубоким проникновением в ткани, подобное БИК при ФДТ на основе бактериохлорофилла (BChl), обеспечивает эффективное и безопасное лечение рака в онкологии и при возрастной макулярной дегенерации глаз (ВМД) (патент США 7947672, международная публикация WO 2005/120573).

О применении новых водорастворимых производных хлорофилла (Chl) и бактериохлорофилла (BChl) в качестве сенсибилизаторов в ФДТ в последние годы сообщали авторы настоящего изобретения (патент США 7947672; международная публикация WO 2005/120573; Ashur et al. 2009; Mazor et al. 2005; Brandis et al., 2005) и другие (Moore et al., 2009; Bourges et al., 2006; Berdugo et al. 2008). После БИК облучения эти водорастворимые производные образуют радикалы и ⋅OH (Ashur et al. 2009; Mazor et al. 2005; Brandis et al., 2005; Vakrat-Haglili et al., 2005), и они до сих пор используются в направленной сосудистой фотодинамической терапии (НСФ) рака в доклинических (Mazor et al. 2005) и расширенных клинических исследованиях терапии рака предстательной железы (в настоящее время в Фазе III) (Trachtenberg J et al. 2007; Lepor H. 2008; Moore et al., 2009) после в.в. введения пациентам, получившим лечение. Эффективное образование кислородных радикалов в качестве предшественников поперечного сшивания белка (Liu et al., 2004), а также клинический опыт, полученный с помощью водорастворимых производных Bchl и Chl, делают эти сенсибилизаторы потенциальными кандидатами для применения в терапии, опосредованной поперечным сшиванием коллагена, в частности для повышения жесткости роговицы и склеры при БИК облучении после местного применения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящее время в соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что водорастворимые производные (бактерио)хлорофилла, описанные в патенте США 7947672 и международной публикации WO 2005/120573 при БИК облучении повышают жесткость роговицы и склеры глаза кролика после местного применения. Не ограничивающие иллюстрирующие результаты раскрыты в данном документе для ex vivo и in vivo обработки глаз кролика определенными водорастворимыми сульфированными производными бактериохлорофилла. Обработка роговицы и склеры глаз кролика такими фотосенсибилизаторами оказалась безопасной и значительно увеличила биомеханическую прочность роговицы и склеры.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к применению производных хлорофилла и бактериохлорофилла для минимально инвазивной фотодинамической терапии (ФДТ) заболеваний, расстройств и состояний, связанных с аномалией роговицы или склеры, в частности с истончением роговицы или растяжением склеры.

В главном аспекте в настоящем изобретении предложены офтальмологические композиции для применения в ФДТ глаза, содержащие производное (бактерио)хлорофилла формулы I, II или III, приведенные в настоящем описании, что значительно улучшает повышение жесткости роговицы и склеры после БИК облучения.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения глазных заболеваний, расстройств и состояний, в частности расстройств, связанных с истончением роговицы, таких как кератоконус, повышенное внутриглазное давление и эктазия роговицы, вызванная травмой, и расстройств, связанных с удлинением глазного яблока, таких как миопия и макулярное растяжение.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу предупреждения заболевания или ослабления роговицы и/или склеры до, во время или после инвазивных процедур.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг. 1 представлена фотография полоски роговицы, зажатой на расстоянии 6 мм между захватными устройствами управляемого микрокомпьютером испытательного прибора для биоматериала.

На Фиг. 2 представлена фотография центрального диска роговицы диаметром 8 мм, установленного на предметное стекло, которое было помещено под наклоном в кварцевую кювету для измерений способом флуоресцентной спектроскопии после обработки WST11/БИК и РФ/УФА.

На Фиг. 3 представлены оптические спектры поглощения (755 им) WST11. накопленного в деэпителизированных роговицах кролика, на которые воздействовали раствором WST11 в физиологическом растворе в течение 10, 20 и 30 минут.

На Фиг. 4А-4Н представлены изображения флуоресцентной микроскопии (Фиг. 4А, 4В, 4Е, 4F) и относящиеся к ним графики (Фиг. 4С, 4D, 4G, 4Н). демонстрирующие интенсивность флуоресценции в зависимости от глубины проникновения в деэпителизированные роговицы кролика, на которые ex-vivo воздействовали WST11 в физиологическом растворе в течение 10 минут (4А и 4С) и 30 минут (4В и 4D), и раствором WST11 и декстрана-500 в течение 10 минут (4Е и 4G) и 30 минут (4F и 4Н). Обнаруживали, флуоресценцию центральных сагиттальных срезов роговицы (12 мкм) при 760 нм после возбуждения при 740 нм.

На Фиг. 5 приведены оптические спектры поглощения WST11 из роговиц, обработанных ex-vivo раствором WST11 в течение 20 минут перед облучением при 755 им, 10 мВт/см² в течение заданного периода времени.

На Фиг. 6 показан спектр электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) α-(4-пиридил N-оксид)-N-трет-бутилнитрона (4-POBN, 65 мМ) в растворе, содержащем этиловый спирт (8%) и WST11 (черный) или РФ (светло-голубой) после БИК или УФА облучения, соответственно. Черные стрелки показывают квартет, образовавшийся при захвате синглетного кислорода 4-POBN, а звездочки показывают двойной триплет, образовавшийся при захвате гидроксильных и супероксидных радикалов.

На Фиг. 7 представлены ЭПР спектры 4-POBN, полученного из роговиц, обработанных ex-vivo WST11/БИК (черный) или РФ/УФА (светло-голубой), после погружения в раствор 4-POBN (65 мМ) в этиловом спирте (8%).

На Фиг. 8А-8В представлены графики, демонстрирующие значения ex vivo измерений деформации жесткости роговицы в единицах предела прочности (8А) и модуля упругости (модуль Юнга) (8В) роговиц после 30-мин инкубирования с WST11 с последующим 30-мин БИК облучением (т=10). или после инкубации с раствором РФ-D с последующим УФА облучением (РФ-О/УФА).

На Фиг. 9А-9В представлены графики, демонстрирующие значения in vivo измерений деформации жесткости роговицы в единицах предела прочности (9А) и модуля упругости (9В) через 1 месяц после обработки роговиц кролика WST11 (2,5 мг/мл) в течение 10, 20 или 30 минут с последующим 30-мин облучением БИК (755 нм, 10 мВт/см²) или после обработки РФ/УФА.

На Фиг. 10А-10В представлены графики, демонстрирующие значения in vivo измерений деформации жесткости роговицы в единицах предела прочности (10А) и модуля упругости (10В) через 1 месяц после обработки роговиц кролика или WST11 (2,5 мг/мл) в физиологическом растворе без декстрана (WST11), или WST11 с декстраном 500 (WST-D) в течение 20 минут, с последующим 30-мин БИК облучением (755 нм, 10 мВт/см²), или после обработки РФ с декстраном или без него, с последующим 30-мин УФА облучением. Контроль - необработанные глаза.

На Фиг. 11А-11С показаны гистологические срезы роговиц кролика, окрашенные гематоксилип-эозином через два дня (11А-11С) или через 1 неделю (11D) после in vivo обработки WST11/БИК облучением (увеличение ×20). 11А: контроль; 11В: роговица, обработанная WST11 в физиологическом растворе (WST11-S/БИК протокол); НС: роговица, обработанная WST11 и декстраном (WST11-D/БИК); 11D: через 1 неделю после обработки WST11-D/БИК.

На Фиг. 12А-12В показаны гистологические срезы роговиц кролика, окрашенные для выявления апоптоза, через 1 день после in vivo обработки WST11 в физиологическом растворе с последующим БИК облучением. 12А - Контроль - необработанные роговицы: 12В - роговица, обработанная WST11-S/БИК.

На Фиг. 13 приведены спектры флуоресценции роговиц кролика, обработанных WST11 и БИК облучением (WST11/БИК) или обработанных рибофлавином и УФА облучением (РФ/УФА).

На Фиг. 14 представлено изображение флуоресцентной микроскопии склеры кролика, демонстрирующее проникновение WST11.

На Фиг. 15А-15В представлены графики, демонстрирующие значения ех vivo измерений деформации жесткости верхнеэкваториальной области склеры в единицах предела прочности (15А) и модуля упругости (15В) роговиц после 30-мин инкубирования с WST11 с последующим 30-мин прямым БИК облучением (755 нм, 10 мВт/см²) задней обработанной области склеры. Контроль - необработанная нижнеэкваториальная область склеры.

На Фиг. 16А-16В представлены графики, демонстрирующие значения ех vivo измерений деформации жесткости верхнеэкваториальной области склеры в единицах предела прочности (15А) и модуля упругости (15В) роговиц после 20-мин инкубирования с WST11 с последующим 30-мин БИК облучением (755 нм, 10 мВт/см²) через переднюю область роговицы. Контроль - необработанная нижнеэкваториальная область склеры.

На Фиг. 17А-17В представлено схематическое изображение устройства, используемого для ex-vivo доставки лекарственного средства к склере и наружного или прямого облучения (17А) и облучения через переднюю область роговицы (17В).

На Фиг. 18А-18С представлены фотографии прибора трехзеркальной фундус-линзы, используемый для БИК облучения задней обработанной области склеры глаза кролика посредством облучения передней области роговицы.

СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что некоторые водорастворимые производные хлорофилла и бактериохлорофилла проникают в склеру и деэпителизированную роговицу довольно быстро и зависимым от времени образом, и после сенсибилизации посредством соответствующего облучения индуцируют стойкое и значительное повышение жесткости роговицы и склеры как ex vivo, так и in vivo. Подтверждением того факта, что эти фотосенсибилизаторы были фотохимически активны, было их непрерывное обесцвечивание и изменение спектров в их окисленной форме во время облучения.

Таким образом, основной задачей настоящего изобретения является обеспечение фармацевтических композиций, содержащих фотосенсибилизатор на основе хлорофилла или бактериохлорофилла для применения в минимально инвазивной фотодинамической терапии (ФДТ) заболеваний, расстройств и состояний, связанных с аномалией роговицы или склеры. В частности, предложенная в настоящем изобретении фармацевтическая композиция предназначена для лечения истончения роговицы и/или растяжения склеры.

В предпочтительных вариантах реализации фотосенсибилизатор, пригодный для целей настоящего изобретения, представляет собой водорастворимый (бактерио)хлорофилл формулы I, II или III:

,

где

М представляет собой 2Н или атом, выбранный из группы, состоящей из Mg, Pd, Pt, Zn, In, Gd и Yb;

X представляет собой О или N-R₇;

R₁, и R₆ каждый независимо представляет собой Y-R₈, или ;

Y представляет собой О или S;

R₂ представляет собой Н, ОН или COOR₉;

R₃ представляет собой Н, ОН, С₁-С₁₂ алкил или С₁-С₁₂ алкокси;

R₄ представляет собой , -CH=CR₉Hal, , , -CHO, -CH=NR₉, , -СН₂-OR₉, -CH₂-SR₉, -CH₂-Hal, -CH₂-R₉, , , -СН₂-CH₂R₉, -CH₂-CH₂Hal, -CH₂-CH₂OR₉, -CH₂-CH₂SR₉, , , -СОСН₃, , -С(СН₃)=CR₉Hal, -C(CH₃)-NR₉, , -СН(СН₃)-Hal, -СН(СН₃)-OR₉, -СН(СН₃)-SR₉, , или -C≡CR₉;

представляет собой метил или формил;

R₅ представляет собой О, S, N-R₉, , или CR₉-Hal;

R₇, R₈, R₉, и каждый независимо представляет собой:

(a) Н;

(b) C₁-С₂₅ гидрокарбил;

(c) C₁-C₂₅ гидрокарбил, замещенный одной или несколькими функциональными группами, выбранными из группы, состоящей из галогена, нитро, оксо, OR, SR, эпокси, эпитио, -CONRR', -COR, COOR'', -OSO₃R, -SO₃R'', -SO₂R, -NHSO₂R, -SO₂NRR', -NRR', =N-OR, =N-NRR', -C(=NR)-NRR', -NR-NRR', -(R)N-C(=NR)-NRR', O←NR-, >C=NR, -(CH₂)_n-NR-COR', -(CH₂)_n-CO-NRR', -O-(CH₂)_n-OR, -O-(CH₂)_n-O-(CH₂)_n-R, -PRR', -OPO₃RR', -PO₂HR и -PO₃R''R'', где n представляет собой целое число от 1 до 10, a R и R' каждый независимо представляет собой Н, гидрокарбил или гетероциклил, или R и R' вместе с атомом N, к которому они присоединены, образуют 3-7-членное насыщенное кольцо, которое необязательно содержит дополнительный гетероатом, выбранный из О, S и N, при этом дополнительный атом N может быть замещен, а R'' представляет собой II, катион, гидрокарбил или гетероциклил;

(d) C₁-C₂₅ гидрокарбил, замещенный одной или более функциональными группами, выбранными из группы, состоящей из положительно заряженных групп, отрицательно заряженных групп; основных групп, которые превращаются в положительно заряженные группы в физиологических условиях, и кислотных групп, которые превращаются в отрицательно заряженные группы в физиологических условиях;

(e) C₁-C₂₅ гидрокарбил, содержащий один или более гетероатомов и/или один или карбоциклических или гетероциклических функциональных групп:

(f) C₁-C₂₅ гидрокарбил, содержащий один или несколько гетероатомов и/или один или несколько карбоциклических или гетероциклических функциональных групп, и замещенный одной или несколькими функциональными группами, как определено в (с) и (d) выше;

(g) C₁-C₂₅ гидрокарбил, замещенный остатком аминокислоты, пептида, белка, моносахарида, олигосахарида или полисахарида; или

(h) остаток аминокислоты, пептида, белка, моносахарида, олигосахарида или полисахарида;

R₇ может дополнительно представлять собой -NRR', где R и R' каждый представляет собой Н или C₁-C₂₅ гидрокарбил, необязательно замещенный отрицательно заряженной группой, предпочтительно ;

R₈ может дополнительно представлять собой Н⁺ или катион , когда R₁, и R₆, каждый независимо представляет собой Y-R₈;

представляет собой катион металла, аммонийную группу или органический катион;

А представляет собой физиологически приемлемый анион;

m равен 0 или 1;

пунктирная линия в положениях 7-8 представляет собой необязательную двойную связь; и

его фармацевтически приемлемые соли и оптические изомеры.

В некоторых вариантах реализации пунктирная линия в положениях 7-8 представляет собой двойную связь, а фотосенсибилизатор представляет собой хлорофилл формулы I, II или III.

Пентациклическое соединение хлорофилла формулы I, где М представляет собой Mg, R₁ в положении 17³ представляет собой фитилокси, R₂ в положении 13² представляет собой СООСН₃, R₃ в положении 13² представляет собой атом Н, R₅ представляет собой О, R₄ в положении 3 представляет собой винил, пунктирная линия в положениях 7-8 представляет собой двойную связь, представляет собой метил или формил в положении 7, и R₄ представляет собой этил в положении 8, является хлорофиллом а и b, соответственно, и их производные будут содержать атом другого металла и/или другие заместители R₁, R₂, R₃, R₄, И/ИЛИ R₅.

Тетрациклическое соединение формулы II (три пиррола и один пирролин связаны посредством четырех метиновых связей), где М отсутствует, R₁ в положении 17³ представляет собой пропионовую кислоту, в положении 15 представляет собой -СН₂СООН, R₆, в положении 13² представляет собой -СООН, R₄ в положении 3 представляет собой винил, пунктирная линия в положениях 7-8 представляет собой двойную связь, представляет собой метил в положении 7, а R₄ представляет собой этил в положении 8, является хлорином, и его производные будут содержать атомы других металлов и/или другие заместители R₁, , R₄, И/ИЛИ R₆.

Пентациклическое соединение формулы III, где М отсутствует, Х представляет собой кислород, R₁ в положении 17³ представляет собой пропионовую кислоту, R₄ в положении 3 представляет собой винил, пунктирная линия в положениях 7-8 представляет двойную связь, представляет собой метил в положении 7, a R₄ представляет собой этил в положении 8, является пурпурином-18, и его производные будут содержать атомы других металлов и/или другие заместители R₁, R₄, , и/или X, отличные от кислорода.

В некоторых других вариантах реализации положения 7-8 гидрированы, и фотосенсибилизатор представляет собой бактериохлорофилл формулы I, II или III. Пентациклические соединения формулы I, где М представляет собой Mg, R₁ в положении 17³ представляет собой фитилокси или геранилгеранилокси, R₂ в положении 13 представляет собой СООСН₃, R₃ в положении 13² представляет собой атом Н, R₅ представляет собой О, R₄ в положении 3 представляет собой ацетил и в положении 8 представляет собой этил, а пунктирная линия в положениях 7-8 отсутствует, является бактериохлорофиллом a (Bchla), и его необязательные производные будут содержать атом другого металла и/или другие заместители R₁, R₂, R₃, R₄, и/или R₅.

Тетрациклические соединения (два пиррола и два пирролина связаны посредством четырех метиловых связей) формулы II, где М отсутствует, метальные группы в положениях 2, 7, 12, 18, R₁ в положении 17³ представляет собой пропионовую кислоту, в положении 13 представляет собой СООСН₃, R₄ в положении 3 представляет собой ацетил и в положении 8 представляет собой этил, а пунктирная линия в положениях 7-8 отсутствует, является бактериохлорином а. Когда виниловая группа присоединена в положения 3, соединение представляет собой родобактериохлорины ((3¹-винил)-бактериохлорин а). Производные бактериохлорина а и родобактериохлорина будут содержать атом другого металла и/или другие заместители R₁, , R₄ в положении 3 и/или R₆.

Пентациклическое соединение формулы III, где М отсутствует, Х представляет собой кислород, R₁ в положении 17³ представляет собой пропионовую кислоту, R₄ в положении 3 представляет собой ацетил и в положении 8 представляет собой этил, пунктирная линия в положениях 7-8 отсутствует, является бактериопурпурином-18, и его производные будут содержать атомы других металлов и/или другие заместители R₁, R₄, и/или X, отличные от кислорода.

Как используется в настоящем документе, термин «гидрокарбил» означает любые неразветвленные или разветвленные, насыщенные или ненасыщенные, ациклические или циклические, включая ароматические, гидрокарбильные радикалы, из 1-25 атомов углерода, предпочтительно от 1 до 20 или от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 6, наиболее предпочтительно 2-3 атомов углерода. Гидрокарбил может быть низшим алкильным радикалом, имеющим 1-6, предпочтительно 1-4 атомов углерода, например, метилом, этилом, пропилом, изопропилом, бутилом, изобутилом, трет-бутилом или алкенилом, алкинилом или циклоалкилом, или в положении 17 соединений формулы I, II или III гидрокарбил является радикалом, производным природных соединений Chl и Bchl, например, геранилгеранилом (2,6-диметил-2,6-октадиенилом) или фитилом (2,6,10,14-тетраметил-гексадец-14-ен-16-илом).

В одном варианте реализации алкильная группа содержит 10 атомов углерода или более, например, -С₁₀Н₂₁, -С₁₅Н₃₁, -С₁₆Н₃₃, -С₁₇Н₃₅, -С₁₈Н₃₇, -C₂₀H₄₁ и им подобные.

В другом варианте реализации С₁-С₂₅ гидрокарбил представляет собой неразветвленный или разветвленный С₂-С₂₅ алкенильный или алкинильный радикал, предпочтительно из 2-6 атомов углерода, например, винил, проп-2-ен-1-ил, бут-3-ен-1-ил, пент-4-ен-1-ил, гекс-5-ен-1-ил, этинил, пропаргил и им подобные.

В еще другом варианте реализации С₁-С₂₅ гидрокарбил представляет собой С₃-С₂₅ моноциклический или полициклический циклоалкил или частично ненасыщенный циклоалкил, предпочтительно С₃-С₁₄, более предпочтительно С₃-С₇ циклоалкил, такой как циклопронил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклогептил.

Гидрокарбил может дополнительно представлять собой арил или аралкил, при этом термин «арил», используемый в настоящем документе, относится к «С₆-C₁₄» ароматической карбоциклической группе, содержащей от 6 до 14 атомов углерода, предпочтительно от 6 до 10 атомов углерода, состоящей из одной, бициклической или трициклической кольцевой системы, такой как фенил, нафтил, карбазолил, антрил, фенантрил и т.п., а термин «аралкил» относится к радикалу, производному арилалкильного соединения, при этом арильный функциональная группа предпочтительно представляет собой С₆-С₁₄, более предпочтительно С₆-С₁₀ арил, такой как бензил, фенантрил и т.п.

Термин «гетероциклическое кольцо» или «гетероциклил» означает радикал, производный насыщенного, частично ненасыщенного, необязательно замещенного, моноциклического, бициклического или трициклического гетероцикла из 3-12, предпочтительно 5-10. более предпочтительно 5-6 членов в кольце, содержащем от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из О, S и/или N. Конкретными примерами являются дигидрофурил, тетрагидрофурил, пирролинил, пирролидинил, дигидротиенил, дигидропиридил, пиперидинил, хинолинил, пиперазинил, морфолино или 1,3-диоксанил.

Термины «гетероарил» или «гетероароматическая функциональная группа» относятся к моно- или полициклическому гетероароматическому кольцу, которое может содержать как карбоциклические, так и гетероциклические кольца, содержащие от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из О, S и/или N. и необязательно замещенные. Конкретные примеры включают, не ограничиваясь перечисленным, пирролил, фурил, тиенил, пиразолил, имидазолил, оксазолил, тиазолил, пиридил, хиполинил, изохиполинил, пиридазинил, пиримидипил, пиразинил, 1,3,4-триазинил, 1,2,3-триазинил, 1,3,5-триазинил, бензофурил, изобензофурил, индолил, имидазо[1,2-а]пиридил, бензимидазолил, бензтиазолил и бензоксазолил, бензодиазепинил и другие радикалы, производные дополнительных полициклических гетероароматических колец.

Любой «карбоциклил», «гетероциклил», «арил» или «гетероарил» может быть замещен одним или несколькими радикалами, такими как галоген, С₆-С₁₄ арил, С₁-С₂₅алкил, нитро, OR, SR, -COR, -COOR, COOR'', -SO₃R, -SO₃R'', -SO₂R, -NHSO₂R, -NRR', -(CH₂)_n-NR-COR' и -(CH₂)_n-CO-NRR', где n, R, R' и R'' являются такими, как определено выше. Следует понимать, что когда полициклическое гетероароматическое кольцо является замещенным, то замещения могут быть в любом карбоциклическом и/или гетероциклическом кольцах.

Термин «алкокси», используемый в настоящем документе, относится к группе (С₁-С₂₅)алкил-O-, где С₁-С₂₅алкил является таким, как определено выше. Примеры алкокси включают метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси, бутокси, изобутокси, трет-бутокси, пентокси, гексокси, -OC₁₂H₂₅, -ОС₁₅Н₃₁, -ОС₁₆Н₃₃, -OC₁₇H₃₅, -OC₁₈H₃₇ и им подобные. Термин «арилокси», как используемый в настоящем документе, относится к группе (С₆-С₁₈)арил-О-, где С₆-C₁₈ арил является таким, как определено выше, например фенокси и нафтокси.

Термин «галоген», используемый в настоящем документе, относится к фтору, хлору, брому или йоду.

Углеводородная цепь из R₇, R₈, R₉ и/или может необязательно содержать один или больше гетероатомов, таких как О, S и/или NH, и/или одну или несколько более карбоциклических колец или функциональных групп гетероциклического кольца, при этом «карбоциклический», как используется в настоящем документе, охватывает циклоалкил и арил, как определено в настоящем документе. В одном варианте реализации гидрокарбильная цепь содержит один или несколько атомов О и содержит ОН-концевую группу, как представленную остатком олигооксиэтиленгликоля из 4-10 атомов углерода, предпочтительно пептаоксиэтиленгликоля. В других вариантах реализации гидрокарбил содержит фенил или пиридил.

R₇, R₈, R₉, и/или могут также представлять собой гидрокарбил, замещенный одной или более функциональными группами, такими как галоген, например, Cl, Br, F или I, нитро, оксо, алкокси (OR), SR, эпокси, эпитио, -CONRR', -COR, COOR'', -COSR, -OSO₃R, -SO₃R'', -SO₂R, -NHSO₂R, -SO₂NRR', -NRR', =N-OR, =N-NRR', -C(=NR)-NRR', -NR-NRR', -(R)N-C(=NR)-NRR', O←NR-, >C=NR, -(CH₂)_n-NR-COR', -(CH₂)_n-CO-NRR', -O-(CH₂)_n-OR, -O-(CH₂)_n-O-(CH₂)_n-R, -PRR', -OPO₃RR', -PO₂HR и -PO₃R''R'', где n представляет собой целое число от 1 до 10, a R и R' каждый независимо представляет собой II, гидрокарбил или гетероциклил, или R и R' вместе с атомом N, к которому они присоединены, образуют 3-7-членное насыщенное кольцо, необязательно содержащее один или более гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из О, S или N, и необязательно дополнительно замещенное при дополнительном атоме N, а R'' представляет собой Н, катион, гидрокарбил или гетероциклил.

В некоторых вариантах реализации некоторые из вышеупомянутых функциональных групп представляют собой кислотные группы, которые при физиологическом pH могут превращаться в отрицательно заряженные группы, например, СООН, COSH, SO₃H, РО₃Н₂, или функциональные группы являются отрицательно заряженной группой, такой как COO^-, COS^-, , или . Отрицательно заряженная группа и кислотная группа может быть концевой группой или группой в гидрокарбильной цепи. В наиболее предпочтительных вариантах реализации гидрокарбил содержит 2 или 3 атома углерода, и концевая группа выбрана из СОО, или, наиболее предпочтительно, .

Как используется в настоящем документе, термин «физиологические условия» относится к условиям в различных тканях и клеточных компартментах организма.

В некоторых вариантах реализации R₇, R₈, R₉, и/или может быть замещен по меньшей мере одной положительно заряженной группой и/или по меньшей мере одной основной группой, которая превращается в положительно заряженную группу в физиологических условиях. В предпочтительном варианте реализации, по меньшей мере одна положительно заряженная группа может являться катионом, полученным из N-содержащей группы, такой как, но не ограничиваясь перечисленным, группа аммония -N⁺(RR'R''), гидразиния -(R)N-N⁺(R'R''), аммонийокси O←N⁺(RR')-, иминия >C=N⁺(RR'), амидиния -C(-RN)-N⁺R'R'' или гуанидиния -(R)N-C(=NR)-N⁺R'R'', где R, R' и R'' являются такими, как определено выше. Следует понимать, что положительно заряженная N-содержащая группа может являться концевой группой, группой в гидрокарбильной цепи или частью насыщенного кольца, в котором N является протонированным, как определено ниже. Кроме того, по меньшей мере одна положительно заряженная группа также может являться катионом, полученным из N-содержащего гетероароматического радикала, как определено ниже.

В одном предпочтительном варианте реализации гидрокарбильная цепь замещена аммониевой группой формулы -N⁺(RR'R''), где каждый из R, R' и R'' независимо представляет собой Н, гидрокарбил, предпочтительно С₁-С₂₅ алкил, более предпочтительно C₁-С₁₀ или C₁-С₆ алкил или гетероциклил. Когда один из R, R' или R'' является ОН, указанная группа представляет собой группу гидроксиламмония. Предпочтительно, аммониевая группа является группой четвертичного аммония, где R, R' и R'' каждый независимо представляет собой С₁-С₆ алкил, такой как метил, этил, пропил, бутил, пентил или гексил.

В некоторых вариантах реализации аммонийная группа формулы -N⁺(RR'R'') является циклической группой, где два из R, R' и R'' вместе с атомом N образуют 3-7-членное насыщенное кольцо, необязательно содержащее дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из атома О, S и N, и необязательно дополнительно замещенное при дополнительном атоме N, как определено ниже. Примеры таких циклических аммонийных групп включают азиридиний, пирролидиний, пиперидиний, пиперазиний. морфолиний, тиоморфолиний, азепиний и им подобные.

В некоторых вариантах реализации положительно заряженная группа является катионом, полученным из N-гетероароматического соединения, которое может представлять собой моно- или полициклическое соединение, которое может дополнительно содержать О, S или дополнительные атомы N. Кольцо, из которого получают указанный катион, должно содержать по меньшей мере один атом N и быть ароматическим, однако другое(-ие) кольцо(а), если они имеются, могут быть частично насыщенными. Примеры N-гетероароматических катионов включают пиразолий, имидазолий, оксазолий, тиазолий, ниридиний, пиримидиний, хинолиний, изохинолиний, 1,2,4-триазиний, 1,3,5-триазиний и пуриний.

Катион может также представлять собой ониевую группу, не содержащую N, такую как, но не ограничиваясь перечисленным, фосфониевая [-P⁺(RR'R'')], арсониевая [-As⁺(RR'R'')], оксониевая [-O⁺(RR')], сульфониевая [-S⁺(RR')], селенониевая [-Se⁺(RR')], теллурониевая [-Te⁺(RR')]. стибониевая [-Sb⁺(RR'R'')] или висмутониевая [-Bi⁺(RR'R'')] группа, где R, R' и R'' являются такими, как определено выше. В предпочтительных вариантах реализации R, R' и R'' представляют собой Н, С₁-С₆ алкил, такой как метил, этил, пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, пентил или гексил, арильную группу, предпочтительно фенил, или аралкильную группу, такую как бензил и фенетил.

В некоторых других вариантах реализации R₇, R₈, R₉ и/или замещены по меньшей мере одной основной группой, которая превращается в положительно заряженную группу в физиологических условиях. Как определено в настоящем документе, "основная группа, которая превращается в положительно заряженную группу в физиологических условиях" представляет собой, по меньшей мере теоретически, любую основную группу, которая в физиологических условиях будет образовывать положительно заряженную группу, как определено в настоящем документе, при этом физиологические условия, как используется в настоящем документе, не относятся исключительно к сыворотке крови, но относятся также к разным тканям и клеточным компартментам в организме.

В некоторых вариантах реализации основная группа является N-содержащей группой. Примеры таких N-содержащих основных групп включают, не ограничиваясь перечисленным, любую аминогруппу, которая будет образовывать аммонийную группу; любую иминовую группу, которая будет образовывать иминиевую группу; любую гидразиновую группу, которая будет образовывать гидразиниевую группу; любую аминооксигруппу. которая будет образовывать аммонийоксигрунпу; любую амидиновую группу, которая будет образовывать амидиниевую группу; любую гуанидиновую группу, которая будет образовывать гуанидиниевую группу; при этом все, как определены в настоящем документе. Другие примеры включают фосфино- и меркаптогруппы.

Таким образом, R₇, R₈, R₉, и/или могут быть замещены по меньшей мере одной основной группой, такой как -NRR', -C(=NR)-NR'R'', -NR-NR'R'', -(R)N-C(-NR)-NR'R'', O←NR- или >C=NR, где R, R' и R'' являются такими, как определено выше, но предпочтительно С₁-С₂₅ алкилом, более предпочтительно С₁-С₁₀ или C₁-С₆ алкилом, или гетероциклилом. В предпочтительных вариантах реализации основная группа представляет собой аминогруппу -NRR', концевую группу или группу в гидрокарбильной цепи, которая может представлять собой вторичный амино, где только один из R и R' является Н, или третичный амино, где ни один из R и R' не является Н, или она может представлять собой циклический амино, где R и R' вместе с атомом N образуют 3-7-членное насыщенное кольцо, необязательно содержащее дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из атома О, S и N и необязательно дополнительно замещенное при дополнительном атоме N.

C₁-C₂₅ гидрокарбил, определенный для R₇, R₈, R₉, и/или также может быть замещен остатком моно-, олиго- или полисахарида, такого как гликозил, или аминокислоты, нентида или белка. Кроме того, R₈, R₉, и каждый может независимо представлять собой фрагмент функциональной группы олигосахарида или полисахарида, предпочтительно моносахарида, такого как глтокозамии, и/или остаток аминокислоты, пептида или белка. В одном предпочтительном варианте реализации R₈, R₉, или в любом положении, но предпочтительно в положении 17³ представляет собой остаток аминокислоты, пептида или белка. Аминокислота, пептид или белок могут быть отрицательно заряженными, если они содержат свободную концевую карбоксильную группу и/или остаток аминокислоты, содержащий неконцевую свободную карбоксильную группу, например, аспарагиновую или глутаминовую кислоту.

В одном варианте реализации R₇, R₈, R₉, или представляет собой остаток аминокислоты, содержащей гидроксигруппу, такой как серии, треонин и тирозин или их производного, выбранного из сложных эфиров, таких как алкильных сложных эфиров, предпочтительно метальных, и N-защищенных производных, в которых N-защитная группа представляет собой, например, трет-бутилокси, карбобензокси или тритил, или пептидов (олигопептида или полипептида), содержащих такую аминокислоту и/или производные аминокислоты. Гидроксилированная аминокислота или пептид связан с группой СОО^-, предпочтительно в положении 17³, производного (бактерио)хлорофилла через свою гидроксигруппу. Примерами таких производных аминокислот являются сложный метиловый эфир серина, N-трет-бутилоксикарбонил-серин, сложный метиловый эфир N-тритил-серина, сложный метиловый эфир тирозина и сложный метиловый эфир N-трет-бутокси-тирозина, а примером нептида, который содержит производное указанной аминокислоты, является сложный метиловый эфир N-карбобензокси-серилсерина, все из которых получены в соответствии с описанием, приведенным в ЕР 0584552. включенным в настоящий документ посредством ссылки, как если бы оно было полностью раскрыто в данном документе.

В некоторых вариантах реализации R₇, R₈, R₉, или является остатком клеточноспецифического или тканеспецифического лиганда, выбранного из неитидов и белков, примерами которых являются, но не ограничиваются перечисленным, пептиды гормонов и антитела, например, иммуноглобулины. Пептид или белок может быть связан непосредственно с -СО группой через сложноэфирную, тиосложноэфирную или амидную связь, или он может быть связан через сложноэфирную или амидную связь с концевой функциональной группой радикала С₁-С₂₅ гидрокарбила. выбранной из ОН, СООН и NH₂.

В некоторых вариантах реализации производные (бактерио)хлорофилла, которые применяются в соответствии с настоящим изобретением, содержат группу СООН, COSH, COO^- и/или COS^-, полученную из R₁, и R₆, представляющих собой ОН или SH, или , соответственно, т.е., когда карбоксильная или тиокарбоксильная группа или карбоксилатный или тиокарбоксилатный анион присутствует в положении 13¹, 15¹ (m равен 0), 15² (m равен 1) и/или 17³.

В некоторых вариантах реализации R₁, и/или Re является основной группой или аммонийной группой , или R₅ представляет собой N-R₉, или .

В некоторых вариантах реализации R₁, и/или R₆ представляет собой Y-R₈, где Y является О, a R₈ представляет собой остаток аминокислоты или пептида (олиго- или полипептида), соединенный посредством амидной связи через свободную группу -NH₂.

Катион может представлять собой одновалентный или двухвалентный катион, полученный из щелочного или щелочноземельного металла, такой как К⁺, Na⁺, Li⁺, Ca⁺, более предпочтительно К⁺; или представляет собой органический катион, такой как определенный в настоящем документе для «катиона, полученного из N-содержащей группы». Предпочтительно, органический катион получают из амина, например, .

Как определено в настоящем документе, А представляет собой физиологически приемлемый анион, такой как хлорид, бромид, иодид, перхлорат, сульфат, фосфат или органический анион, такой как ацетат, бензоат, каприлат, цитрат, лактат, малонат, манделат, мезилат, оксалат, пропионат, сукцинат, тозилат и им подобные.

Как определено в настоящем документе, «3-7-членное насыщенное кольцо», образованное R и R' вместе с атомом N, к которому они присоединены, может представлять собой кольцо, включающее только N, такое как азиридин. пирролидин, пиперидин, пиперазин или азепин, или оно может содержать дополнительный гетероатом, выбранный из О и S, такое как морфолин или тиоморфолин. Дополнительный атом N в пиперазиновом кольце может быть необязательно замещен алкилом, например, C₁-С₆ алкилом, который может быть замещен галогеном, ОН или амино. Ониевые группы, производные от указанных насыщенных колец, включают азиридиний, пирролидиний, пиперидиний, пиперазиний, морфолиний, тиоморфолиний и азепиний.

В некоторых вариантах реализации производное (бактерио)хлорофилла, используемое в соответствии с настоящим изобретением, является неметаллированным, то есть М представляет собой 2Н. В предпочтительных вариантах реализации фотосенсибилизатор является металлированным, и М представляет собой Mg, Pd, Pt, Zn, In, Gd или Yb, более предпочтительно Pd.

В одном предпочтительном варианте реализации офтальмологическая композиция, предложенная в настоящем изобретении, для лечения глазных заболеваний и расстройств, связанных с истончением роговицы или растяжением склеры, содержит производное хлорофилла или бактериохлорофилла формулы I, где: М представляет собой двухвалентный Pd; R₁ представляет собой , или ; R₂ представляет собой метокси; R₃ представляет собой -С(=O)-СН₃; R₅ представляет собой О; представляет собой одновалентный катион, такой как К⁺, Na⁺, Li⁺ или ; и n представляет собой целое число от 1 до 10, предпочтительно 2 или 3. Предпочтительно, согласно настоящему варианту реализации, R₁ представляет собой .

В более предпочтительных вариантах реализации фотосенсибилизатор является бактериохлорофиллом формулы I, который содержит единственную отрицательно заряженную группу в положении 17, представленный соединением калиевой соли палладий бактериофеофорбид а 17³-(3-сульфопропил) амида.

В некоторых вариантах реализации офтальмологическая композиция для лечения истончения роговицы или растяжения склеры содержит производное хлорофилла или бактериохлорофилла формулы II, в котором R₆ или оба R₁ и R₆, являются . Предпочтительно, согласно этим вариантам реализации, R₉ представляет собой Н, и представляет собой C₁-С₁₀ алкил, замещенный по меньшей мере одной группой, выбранной из положительно заряженной группы, отрицательно заряженной группы, кислотной группы, которая превращается в отрицательно заряженную группу в физиологических условиях, или основной группы, которая превращается в положительно заряженную группу в физиологических условиях. В более конкретных вариантах реализации представляет собой C₁-C₆ алкил, замещенный кислотной группой SO₃H или ее щелочной солью, или основной группой -NRR' или -NH-(CH₂)_2-6-NRR', где каждый из R и R' независимо представляет собой Н, C₁-С₆ алкил, необязательно замещенный NH₂, или R и R' вместе с атомом N образуют 5-6-членное насыщенное кольцо, которое необязательно содержит атом О или N и необязательно дополнительно замещено при дополнительном атоме N группой -(CH₂)_2-6-NH₂.

В некоторых вариантах реализации офтальмологическая композиция по настоящему изобретению содержит производное бактериохлорофилла формулы II, в котором:

М представляет собой 2Н, Mg, Pd или Zn;

R₁ выбран из:

(i) ;

(ii) Y-R₈, где Y представляет собой О или S, a R₈ представляет собой остаток аминокислоты, пептида или белка;

(iii) -NH-CH₂-CH(OH)-CH₂OH;

(iv) -NH-(CH₂)_n-OH;

(v) -NH-СН(ОН)-СН₃;

(vi) -NH-(CH₂)_n-NR-(CH₂)_n-OH;

(vii) гликозиламино; или

(viii) , который является таким, как определено для R₆;

представляет собой С₁-С₆ алкокси, такой как метокси, этокси, пропокси или бутокси, более предпочтительно метокси;

R₄ представляет собой -С(=O)-СН₃, , , ; ; , ; или -C(CH₃)=NR₉, предпочтительно C(CH₃)=N-(CH₂)_n-NH₂ или ;

R₆ выбран из (i) , выбранного из:

(a) предпочтительно или ;

(b) ;

(c) ;

(d) -NH-(CH₂)_n-B:

(e)

;

(f)

, предпочтительно -NH-(СН₂)₂-1-морфолино или -NH-(СН₂)₃-пиперазино;

(g)

;

(h) -NH-(CH₂)_n-N(R'')-(CH₂)_n-NRR', предпочтительно -NH-(СН₂)₃-NH-(CH₂)₃-NH₂;

(j) -NH-(CH₂)_n-NRR', предпочтительно -NH-CH₂-CH₂-NRR';

представляет собой H⁺ или одновалентный катион, такой как К⁺, Na⁺, Li⁺ или , более предпочтительно K⁺;

Х представляет собой О, S или NH;

В представляет собой положительно заряженную группу, выбранную из аммония -N⁺R'R'', предпочтительно , гуанидиния, сульфония, фосфония, арсония; или В является основной группой, которая превращается в положительно заряженную группу в физиологических условиях, выбранной из амино -NRR', предпочтительно -NH₂, гуанидино, фосфино или арсино;

m равен 1, n представляет собой целое число от 1 до 10, предпочтительно 2 или 3; и

А представляет собой физиологически приемлемый анион;

где R, R' и R'' каждый независимо представляет собой И или C₁-С₆ алкил.

В предпочтительных вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит производное бактериохлорина или родобактериохлорина формулы II, где только R₆, или оба R₁ и R₆, выбраны из , , -NH-(CH₂)₃-NH-(CH₂)₃-NH₂, -NH-(СН₂)₂-1-морфолино или -NH-(СН₂)₃-пиперазино-(СН₂)₃-NH₂, а представляет собой одновалентный катион, такой как К⁺, Na⁺, Li⁺, , предпочтительно К⁺. В некоторых более предпочтительных вариантах реализации R₁ и R₆ оба представляют собой или .

В других предпочтительных вариантах реализации производные хлорина или (родо)бактериохлорина формулы II применяют в соответствии с настоящим изобретением, при этом они содержат по меньшей мере одну отрицательно заряженную группу, и М отсутствует или представляет собой двухвалентный ион Pd или Zn, предпочтительно Pd. В этих вариантах реализации R₁ выбран из , , или , или R₁ представляет собой Y-R₈, где Y представляет собой О, S, a R₈ является остатком аминокислоты, пептида или белка; представляет собой C₁-С₆ алкокси, такой как метокси, этокси, пропокси, бутокси, более предпочтительно метокси; R₄ выбран из -С(=O)-СН₃, , , или ; R₆ представляет собой ; или -; представляет собой одновалентный катион, такой как К⁺, Na⁺, Li⁺ или , более предпочтительно К⁺; m равен 1, и n представляет собой целое число от 1 до 10, предпочтительно 2 или 3.

В более предпочтительном варианте реализации отрицательно заряженный фотосенсибилизатор, который применяется в соответствии с настоящим изобретением, является производным бактериохлорина формулы II, где: М представляет собой Pd; R₁ представляет собой , или Y-R₈, где Y представляет собой О или S, a R₈ представляет собой остаток белка, предпочтительно иммуноглобулина; представляет собой C₁-С₆ алкокси, такой как метокси, этокси, пропокси, бутокси, более предпочтительно метокси; R₄ представляет собой -С(=O)-СН₃, или ; R₆ представляет собой , или ; представляет собой одновалентный катион, такой как К⁺, Na⁺, Li⁺ или , более предпочтительно К⁺; m равен 1, и n равен 2 или 3, более предпочтительно 2.

Примерами производных родобактериохлорина формулы II, которые содержат одну, две или три отрицательно заряженные группы в положениях 3, 13 и/или 17, являются:

дикалиевая соль палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-сульфоэтил)амида (здесь обозначен как WST11);

дикалиевая соль палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(-сульфопропил)амида (соединение 1);

дикалиевая соль палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди-(2-сульфоэтил)амида (соединение 2);

дикалиевая соль палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди-(3-сульфопропил)амида (соединение 3);

дикалиевая соль 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-сульфоэтил)амида (соединение 4);

дикалиевая соль 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(-сульфопропил)амида (соединение 5);

дикалиевая соль 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди-(2-сульфоэтил)амида (соединение 6);

дикалиевая соль 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди-(3-сульфопропил) амида (соединение 7);

дикалиевая соль цинк 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-сульфоэтил)амида;

калиевая соль палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-сульфоэтил)амида, 17³-(N-иммуноглобулин G) амида;

дикалиевая соль палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-карбоксиэтил)амида;

трикалиевая соль палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(3-фосфопропил)амида;

трикалиевая соль палладий 3¹-(3-сульфопропилимино)-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди(3-сульфопропил)амида;

трикалиевая соль палладий 3¹-(3-сульфопропиламино)-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди(3-сульфопропил)амида.

соль палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди(3-пропионил)амида;

дикалиевая соль палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди[2-(3-пропиониламино)-сульфоэтил]амида;

дикалиевая соль палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди[2-(3-пропиониламино)-фосфоэтил]амида;

дикалиевая соль палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди(3-тиопропионил)амида 3¹-гидрокси-3¹-дезоксо-бактериофеофорбида а;

3¹-(пиридин-4-илметокси)-3¹-дезоксо-бактериофеофорбид а;

сложный метиловый эфир бактериофеофорбид а 17³-[(2,6-дихлор-4-метоксифенил)(2,4-дихлорфенила)];

сложный метиловый эфир 3¹-гидрокси-3¹-дезоксо-бактериофеофорбид а 17³-[(2,6-дихлор-4-метокси-фенил)(2,4-дихлорофенила)];

сложный метиловый эфир 3¹-трифторацетокси-3¹-дезоксо-бактериофеофорбид а 17³-[(2,6-дихлор-4-метоксифенил)(2,4-дихлорфенила)];

3¹-бром-3¹-дезоксо-бактериофеофорбид а;

3-винил-3-деацетил-бактериофеофорбид;

3¹-(2-гидроксиэтокси)-3¹-дезоксо-бактериофеофорбид а;

3¹-(2,2,2-трифторэтокси)-3¹-дезоксо-бактериофеофорбид а;

3¹-(2-меркаптоэтилсульфанил)-3¹-дезоксо-бактериофеофорбид а;

3¹-(2-гидроксиэтиламино)-3¹-дезоксо-бактериофеофорбид а;

дикалиевая соль кобальт (III) 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-сульфоэтил)амида;

дикалиевая соль железо (III) 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-сульфоэтил)амида; и

никель(II) бактериофеофорбид а;

платина(II) бактериофеофорбид а.

В предпочтительном варианте реализации соединения, используемые в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой фармацевтически приемлемые соли производного бактериохлорина и таурина или гомотаурина с одновалентным или двухвалентным катионом щелочного или щелочноземельного металла или с , выбранного из:

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-сульфоэтил)амида;

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(-сульфопропил)амида;

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди-(2-сульфоэтил)амида;

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди-(3-сульфопропил)амида;

3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-сульфоэтил)амида;

3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(-сульфопропил)амида;

3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди-(2-сульфоэтил)амида; и

3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди-(3-сульфопропил)амида.

Наиболее предпочтительными соединениями являются WST11 и соединения 1-7.

Производные бактериохлорофилла, используемые в настоящем изобретении, могут быть получены с помощью способов, описанных в патенте США 7947672 или международной публикации WO 2005/120573. Для получения соединений, в которых R₈ представляет собой остаток аминокислоты, пептида или белка могут применяться способы, описанные в ЕР 0584552. Для получения отрицательно заряженных производных бактериохлорина, в которых R₈ представляет собой остаток аминокислоты, способ, описанный в ЕР 0584552, может быть скомбинирован со способом, описанным в Схеме 1 патента США 7947672.

Способы получения отрицательно заряженных соединений формулы II описаны в патенте США 7947672, упомянутом выше. Например, получение соединения бактериохлорина, в котором R₁ представляет собой ; представляет собой -ОСН₃; R₃ представляет собой ацетил; R₆ представляет собой группу , или ; является одновалентным катионом; m равен 1, и n равен от 1 до 10, включает: (i) взаимодействие соответствующего металлированного бактериофеофорбида (М-бактериофеофорбида) формулы I, приведенной в настоящем документе, где R₁ представляет собой ОН, с аминосульфоновой кислотой формулы H₂N-(СН₂)_n-SO₃H (например, таурин H₂N-(СН₂)₂-SO₃H или гомотаурин H₂N-(СН₂)₃-SO₃H), аминокарбоновой кислотой формулы H₂N-(CH₂)_n-СООН или аминофосфоновой кислотой формулы H₂N-(СН₂)_n-РО₃Н₂, соответственно, в -буфере; и (ii) выделение целевого соединения формулы II.

Бактериохлорины формулы II, которые имеют одинаковые отрицательно заряженные группы, упомянутые выше, в положениях 13 и 17, могут быть получены посредством взаимодействия соответствующего М-бактериофеофорбида с избытком реагента, такого как аминосульфоновая, аминокарбоновая или аминофосфоновая кислота, как описано выше, и выделения целевого 13,17-дизамещенного производного, или можно использовать другой способ, описанный в патенте США 7947672. Например, бактериохлорин формулы II, где каждый R₁ и R₆ представляет собой группу ; R₂ представляет собой -ОСН₃; R₃ представляет собой ацетил; представляет собой одновалентный катион; m равен 1, и n равен от 1 до 10, получают путем: (i) сочетания соответствующего М-бактериофеофорбида формулы I, где R₁ представляет собой ОН, с N-гидроксисульфосукцинимидом (сульфо NHS) в присутствии 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида (EDC); (ii) взаимодействие полученного сложного эфира М-бактериофеофорбид-17³-N-гидроксисульфосукцинимида с избытком аминосульфоновой кислоты формулы H₂N-(CH₂)_n-SO₃H в -буфере, с получением таким образом соединения формулы I, которое содержит единственную отрицательно заряженную группу в положении 17; (iii) взаимодействие этого продукта с избытком H₂N-(CH₂)_n-SO₃H в -буфере; и выделение целевого бактериохлорина формулы II. При замене аминосульфоновой кислоты на аминокарбоновую или аминофосфоновую кислоту получают соответствующие карбоксилатные и фосфонатные производные.

В других вариантах реализации фотосенсибилизатор, который применяют в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой производное пурпурина-18 или бактериопурпурина-18 формулы III, где Х представляет собой -NR₇, R₇ представляет собой -NRR', R представляет собой И, и R' представляет собой C₁-С₆ алкил, замещенный , или его щелочную соль, предпочтительно, фотосенсибилизатор является бактериопур пурином-18, где Х представляет собой -NR₇, a R₇ представляет собой , где представляет собой катион металла, аммонийную группу или органический катион, предпочтительно К⁺.

В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции, которые применяют в соответствии с настоящим изобретением, содержат производное хлорофилла или бактериохлорофилла формулы I, II или III, содержащее по меньшей мере одну положительно заряженную группу и/или по меньшей мере одну основную группу, которая превращается в положительно заряженную группу при физиологическом рН, при этом положительно заряженные группы и основная группа являются такими, как определено выше.

В некоторых вариантах реализации фотосенсибилизатор представляет собой производное хлорофилла или (родо)бактериохлорофилла формулы II, и R₆ представляет собой , R₉ представляет собой Н, и представляет собой НОСН₂-СН(ОН)-СН₂-.

В конкретных предпочтительных вариантах реализации фармацевтическая композиция, которую применяют в соответствии с настоящим изобретением, содержит производное бактериохлорина или родобактериохлорина формулы II, где R₁ выбран из ОН, или -NR₉-CH₂-CH(OH)-CH₂OH; и R₆ выбран из или -NR₉-CH₂-CH(OH)-CH₂OH, где R₉ представляет собой Н или С₁-С₆ алкил; а представляет собой C₁-C₂₅ гидрокарбил, замещенный по меньшей мере одной положительно заряженной группой и/или по меньшей мере одной основной группой, которая превращается в положительно заряженную группу в физиологических условиях. В предпочтительных вариантах реализации представляет собой C₁-C₂₅ алкил, предпочтительно C₁-С₁₀, более предпочтительно C₁-С₆ алкил, замещенный по меньшей мере одной положительно заряженной группой, более предпочтительно -N⁺RR'R'', или по меньшей мере одной основной группой, предпочтительно -NRR', и необязательно прерванный группой -N(R'')-, где R и R' каждый независимо представляет собой Н, C₁-С₆ алкил, необязательно замещенный NR''R'' или гетероциклил, такой как пиридил, или R и R' вместе с атомом N образуют 6-членное кольцо, дополнительно содержащее атом О, S или N, и R'' представляет собой Н или C₁-С₆ алкил.

Конкретные соединения, используемые в соответствии с этими предпочтительными вариантами реализации, являются положительно заряженными производными бактериохлорофилла, в которых М отсутствует или представляет собой Pd; представляет собой -OR₈, где R₈ представляет собой С₁-С₆ алкил; R₄ представляет собой -СОСН₃; и где:

(a) R₁ представляет собой ОН, и R₆, представляет собой ;

(b) R₁ и R₆ оба представляют собой одинаковую группу ;

(c) R₁ представляет собой -NH-СН₂-CH(OH)-СН₂ОН, и R₆ представляет собой группу ;

(d) R₁ представляет собой группу , и R₆ представляет собой -NH-СН₂-СН(ОН)-CH₂OH; и

(e) R₆ представляет собой -NH-CH₂-CH₂-NRR'; и R₁ выбран из группы, состоящей из

-NH-(CH₂)_n-OH;

-NH-CH(OH)-CH₃;

-NH-(CH₂)_n-NR-(CH₂)_n-OH; или

-гликозиламино.

Группа выбрана из:

(i) -NH-(CH₂)_n-NRR' или -NH-(CH₂)_n-N⁺RR'R'';

(ii) -NH-(CH₂)_n-N(R'')-(CH₂)_n-NRR';

(iii)

;

(iv)

; и

(v)

,

где

X представляет собой О, S или NR;

R, R' и R'' являются такими, как определено выше, но предпочтительно каждый независимо представляет собой Н или C₁-С₆ алкил, более предпочтительно метил или этил;

n представляет собой целое число от 1 до 10, предпочтительно от 2 до 6, более предпочтительно 2 или 3; и

m представляет собой целое число от 1 до 6, предпочтительно от 1 до 3.

Конкретными примерами таких положительно заряженных соединений или соединений, которые становятся положительно заряженными при физиологическом рН, являются соединения, включающие обозначенные в настоящем документе как соединения 4'-7', 8-12 и 24-75:

хлоридная соль палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2-N³-триметиламмонийэтил)амида (соединение 12);

ацетатная соль палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2-N³-(триметиламмонийэтил)амида (соединение 24);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2-N²-диметиламиноэтил)амид (соединение 25);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(3-N²-диметиламинопропил)амид (соединение 26);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2-[(2-аминоэтил)амино]этил)амид (соединение 27);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-([2-бис(2-аминоэтил)амино]этил)амид (соединение 28);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2-морфолино-N-этил)амид (соединение 29);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2-пиперазино-N-этил)амид (соединение 30);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2-[(2-N²-диэтиламиноэтил)амино]этил)амид (соединение 31);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(3-[(3-аминопропил)амино]пропил)амид (соединение 32);

3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹,17³-ди(2-аминоэтил)амид (соединение 4');

дицитратная соль 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹,17³-ди(2-N³-триметиламмонийэтил)амида (соединение 5');

3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹,17³-ди(3-аминопропил)амид (соединение 6');

дицитратная соль 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹,17³-ди(3-N³-триметиламмонийпропил)амида (соединение 7');

3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹,17³-ди(6-аминогексил)амид (соединение 8);

дицитратная соль 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹,17³-ди(6-N³-триметиламмонийгексил)амида (соединение 9);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди(2-аминоэтил)амид (соединение 10);

дифосфатная соль палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди(2-N³-триметиламмонийэтил)амида (соединение 11);

диацстатная соль палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹,17³-ди(2-N³-триметиламмонийэтил)амида (соединение 33);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹,17³-ди(3-аминопропил)амид (соединение 34);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹,17³-ди(4-аминобутил)амид (соединение 35);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹,17³-ди(2-N²-диметиламиноэтил)амид (соединение 36);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹,17³-ди(3-N²-диметиламинопропил)амид (соединение 37);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹,17³-ди-(2-[(2-аминоэтил)амино]этил)амид (соединение 38);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹,17³-ди-(2-[(2-N²-диэтиламиноэтил)амино]этил)амид (соединение 39);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹,17³-ди(2-морфолино-N-этил)амид (соединение 40);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹,17³-ди(2-пиперазино-N-этил)амид (соединение 41);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹,17³-ди-(3-[(3-аминопропил)амино]пропил)амид (соединение 42);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹,17³-ди([2-бис(2-аминоэтил)амино]этил)амид (соединение 43);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹,17³-ди(2-N-(2'-пиридил)аминоэтил)амид (соединение 44);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹,17³-ди(2-N²-диэтиламиноэтил)амид (соединение 45);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2-аминоэтил)амид-17³-(2,3-дигидроксипропил) амид (соединение 48);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2-N²-диметиламиноэтил)амид-17³-(2,3-дигидроксипропил)амид (соединение 50);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2-[(2-аминоэтил)амино]этил)амид-17³-(2,3-дигидроксипропил)амид (соединение 55);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2-N-(2'-пиридил)аминоэтил)амид-17³-(2,3-дигидроксипропил)амид (соединение 57);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-([2-бис(2-аминоэтил)амин]этил)амид-17³-(2,3-дигидроксипропил)амид (соединение 59);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(3-аминопропил)амид-17³-(2,3-дигидроксипропил)амид (соединение 60);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(4-аминобутил)амид-17³-(2,3-дигидроксипропил) амид (соединение 61);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2-N²-диэтиламиноэтил)амид-17³-(2,3-дигидроксипропил)амид (соединение 62);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2-N-этиламиноэтил)амид-17³-(2,3-дигидроксипропил)амид (соединение 63);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(3-N-метиламинопропил)амид-17³-(2,3-дигидроксипропил)амид (соединение 64);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(3-N-(2(-пиридил)аминопропил)амид-17³-(2,3-дигидроксипропил)амид (соединение 71);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(4-N-(2'-пиридил)аминобутил)амид-17³-(2,3-дигидроксипропил)амид (соединение 72);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2,3-дигидроксипропил)амид-17³-(2-триметиламмонийэтил)амид (соединение 46);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2,3-дигидроксипропил)амид-17³-(2-аминоэтил) амид (соединение 47);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2,3-дигидроксипропил)амид-17³-(2-N²-диметиламиноэтил)амид (соединение 49);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2,3-дигидроксипропил)амид-17³-(2-[(2-аминоэтил)амино]этил)амид (соединение 51);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2,3-дигидроксипропил)амид-17³-(2-[(2-N²-диэтиламиноэтил)амино]этил)амид (соединение 52);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2,3-дигидроксипропил)амид-17³-(2-морфолино-N-этил)амид (соединение 53);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2,3-дигидроксипропил)амид-17³-(2-пиперазино-N-этил)амид (соединение 54);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2,3-дигидроксипропил)амид-17³-(2-N-(2'-пиридил)аминоэтил)амид (соединение 56);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2,3-дигидроксипропил)амид-17³-([2-бис(2-аминоэтил)амино]этил)амид (соединение 58);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2,3-дигидроксипропил)амид-17³-(3-N-(2'-пиридил)аминопропил)амид (соединение 23);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2,3-дигидроксипропил)амид-17³-(4-N-(2(-пиридил)аминобутил)амид (соединение 24);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2-N²-диметиламиноэтил)амид-17³-(2-гидроксиэтил)амид (соединение 65);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2-N²-диметиламиноэтил)амид-17³-(3-гидроксипропил)амид (соединение 66);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2-N²-диметиламиноэтил)амид-17³-(2-гидроксипропил)амид (соединение 67);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2-N²-диметиламиноэтил)амид-17³-((R)-2-гидроксипропил)амид (соединение 68);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2-N²-диметиламиноэтил)амид-17³-((S)-2-гидроксипропил)амид (соединение 69);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-Родобактериохлорин-13¹-(2-N²-диметиламиноэтил)амид-17³-(2-(2-гидроксиэтиламино)этил)амид (соединение 20); и

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2-N²-диметиламиноэтил)амид-17³-(гликозил)амид (соединение 75).

Вышеперечисленные соединения могут быть получены, например, так, как детально описано в международной публикации WO 2005/120573, упомянутой выше.

Другие положительно заряженные производные бактериохлорина и основные производные бактериохлорина, которые становятся положительно заряженными при физиологическом рН, представляют собой соединения формулы II, где М представляет собой Pd, представляет собой -OR₈, где R₈ представляет собой C₁-С₆ алкил, предпочтительно метил, R₄ представляет собой -СОСН₃, a R₁ и/или R₆ представляют собой , где R₉ представляет собой Н, и представляет собой C₁-C₂₅ гидрокарбил, предпочтительно C₁-C₂₅ алкил, более предпочтительно C₁-С₁₀ алкил, замещенный: (i) группой гуанидино или гуанидиния; (ii) группой сульфония; (iii) группой фосфино или фосфония; (iv) группой арсино или арсония.

В более предпочтительном варианте реализации R₁ и R₆, оба являются одной и той же группой, выбранной из: (i) -NH-(CH₂)_n-C(=NH)-NH₂ или -NH-(CH₂)_n-С(=NH)-N⁺(R)₃А^-, более предпочтительно ; (ii) -NH-(CH₂)_n-S⁺(R)₂A^-, более предпочтительно ; (iii) -NH-(CH₂)_n-P(R)₂, более предпочтительно -NH-(СН₂)_n-Р(СН₃)₂ или NH-(CH₂)_n-P⁺(R)₃A^-, более предпочтительно -NH-(CH₂)_n-Р⁺(CH₃)₃А^-; или (iv) -NH-(CH₂)_n-As(R)₂, более предпочтительно -NH-(CH₂)_n-As(CH₃)₂ или NH-(CH₂)_n-As⁺(R)₃A^-, более предпочтительно -NH-(CH₂)_n-As⁺(CH₃)₃A^-, где n представляет собой целое число от 1 до 10, предпочтительно 2, 3 или 6.

Примерами таких соединений являются соединения, обозначенные в настоящем документе как соединения 14, 14а, 15-19;

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди(2-гуанидиноэтил)амид (соединение 14);

палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди(2-триметилгуанидинийэтил)амид (соединение 14а);

цитратная соль палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹-(2-S²-диметилсульфонийэтил)амида (соединение 15);

дицитратная соль 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹,17³-ди(2-P³-триметилфосфонийэтил)амида (соединение 17);

3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹,17³-ди(2-диметилфосфиноэтил)амид (соединение 18); и

дицитратная соль 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹,17³-ди(2-As³-триметиларсонийэтил)амида (соединение 19).

Указанные выше соединения могут быть получены, как описано в международной публикации WO 2005/120573.

В еще дополнительных предпочтительных вариантах реализации производное Bchl, которое применяют в соответствии с настоящим изобретением, является производным бактериохлорина формулы II, где М представляет собой 2Н или Pd, представляет собой -OR₈, где R₈ представляет собой C₁-С₆ алкил, предпочтительно метил, R₄ представляет собой -C(CH₃)=NR₉, a R₁ и/или R₆ представляют собой где представляет собой Н, a R₉ и представляют собой C₁-C₂₅ гидрокарбил, предпочтительно С₁-С₂₅ алкил, более предпочтительно C₁-С₁₀ алкил, замещенный по меньшей мере одной амино концевой группой или положительно заряженной группой, более предпочтительно аммониевой концевой группой формулы -N⁺(RR'R'')A^-, где R, R' и R'' представляют собой предпочтительно одинаковый C₁-С₆ алкил, предпочтительно метил, а А^- представляет собой анион. В более предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения, R₄ представляет собой группу формулы -C(CH₃)=N-(CH₂)_n-NH₂ или , наиболее предпочтительно , a R₁ и R₆ представляют собой группу формулы -NH-(CH₂)_n-NH₂ или , более предпочтительно , где n представляет собой целое число от 1 до 10, но предпочтительно 2, 3 или 6. Примерами таких соединений являются соединения, обозначенные в настоящем документе как соединения 20-23:

3¹-(аминоэтилимино)-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин-13¹,17³-ди(2-аминоэтил)амид (соединение 20);

палладий 3¹-(аминоэтилимино)-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди(2-аминоэтил)амид (соединение 21):

3¹-(триметиламмонийэтилимино)-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди(2-триметиламмонийэтил)амид (соединение 22); и

палладий 3¹-(триметиламмонийэтилимино)-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди(2-триметиламмонийэтил)амид (соединение 23).

Указанные выше соединения могут быть получены, как описано в международной публикации WO 2005/120573.

В некоторых вариантах реализации положительно заряженный фотосенсибилизатор, который применяют в соответствии с настоящим изобретением, является производным Bchl формулы I, где М представляет собой Pd, R₂ представляет собой -СООСН₃, R₃ представляет собой Н, R₄ представляет собой -СОСН₃, R₅ представляет собой =O, a R₁ представляет собой -OR₈, где R₈ представляет собой остаток аминокислоты, содержащей гидроксигруппу, предпочтительно серина, или ее производного, предпочтительно алкил, более предпочтительно метил, сложный эфир, или пептида, содержащего указанную аминокислоту или ее производное, в которых свободная аминогруппа остатка аминокислоты может быть кватернизована как группа триметиламмония. Пример такого производного формулы I представляет собой обозначенное в настоящем документе соединение 13: йодидная соль сложного метилового эфира О-[Pd-Bpheid]-[N³-триметиламмоний-2-метил]-серина.

В соответствии с настоящим изобретением фармацевтически приемлемые соли соединений (бактерио)хлорофилла формулы I-III применяются для ФДТ лечения глаз, как соли, образованные любыми карбоксильными группами, присутствующими в молекуле, так и основно-, а также кислотно-аддитивные соли.

Фармацевтически приемлемые соли образуются с катионами металлов или аминов, таких как катионы щелочных и щелочноземельных металлов или органических аминов. Примерами металлов, используемых в качестве катионов, являются натрий, калий, магний, кальций и тому подобные. Примерами подходящих аминов являются N,N'-дибензилэтилендиамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, N-метилглюкамин и прокаин (см., например, Berge S.M., et al., "Pharmaceutical Salts," (1977) J. of Pharmaceutical Science, 66:1-19).

Кислотно-аддитивные соли основных фотосенсибилизаторов включают соли, полученные из неорганических кислот, таких как соляная, азотная, фосфорная, серная, бромистоводородная, йодистоводородная, фосфористая и им подобных, а также соли, полученные из органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, алкановые дикарбоновые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и т.д. Таким образом, такие соли включают сульфат, пиросульфат, бисульфат, сульфит, бисульфит, нитрат, фосфат, моногидрофосфат, дигидрофосфат, метафосфат, пирофосфат, хлорид, бромид, йодид, ацетат, пропионат, каприлат, изобутират, оксалат, малонат, сукцинат, суберат, себацинат, фумарат, малеат, манделат, бензоат, хлорбензоат, метилбензоат, динитробензоат, фталат, бензолсульфонат, толуолсульфонат, фенилацетат, цитрат, лактат, малеат, тартрат, метансульфонат и т.п. Также предусматриваются соли аминокислот, такие как аргинат и подобные и глюконат или галактуронат (см., например, Berge S.M., et al., "Pharmaceutical Salts," (1977) J. of Pharmaceutical Science, 66:1-19).

Кислотно-аддитивные соли указанных основных соединений получают путем приведения формы свободного основания в контакт с достаточным количеством заданной кислоты для получения соли традиционным способом. Форма свободного основания может быть регенирирована путем приведения солевой формы в контакт с основанием и выделения свободного основания традиционным способом. Формы свободного основания отличаются от их соответствующих солевых форм отчасти определенными физическими свойствами, такими как растворимость в полярных растворителях, но в ином отношении, для целей настоящего изобретения указанные соли являются эквивалентными их соответствующим свободным основаниям.

Основно-аддитивные соли кислых фотосенсибилизаторов, применяемых в соответствии с настоящим изобретением, получают путем приведения формы свободной кислоты в контакт с достаточным количеством заданного основания для получения соли традиционным способом. Форма свободной кислоты может быть регенирирована путем приведения солевой формы в контакт с кислотой и выделения свободной кислоты традиционным способом. Формы свободной кислоты отличаются от их соответствующих солевых форм отчасти определенными физическими свойствами, такими как растворимость в полярных растворителях, но в ином отношении, для целей настоящего изобретения указанные соли являются эквивалентными их соответствующим свободным кислотам.

Отрицательно заряженные и положительно заряженные соединения хлорофилла и бактериохлорофилла и их фармацевтически приемлемые соли, которые применяются в соответствии с настоящим изобретением, являются высоко растворимыми в воде и обеспечивают приготовление водного состава без добавления поверхностно-активных веществ.

Фармацевтическая композиция, которая применяется в соответствии с настоящим изобретением, является офтальмологической композицией, предпочтительно жидкой, например, раствором, суспензией и эмульсией или гелем, который наносят местно на глаз пациента и оставляют для проникновения в роговицу или склеру перед применением ФДТ. Офтальмологическая композиция обычно содержит инертные фармацевтически приемлемые носители и наполнители, хорошо известные в данной области техники. Фармацевтическая композиция может дополнительно включать один или более функциональных наполнителей, например, с целью опосредования глубины проникновения активного агента. Ограничение глубины проникновения фотосенсибилизатора может быть выгодным, поскольку это ограничивает лечение областью, которая представляет интерес, тем самым минимизируя неблагоприятные воздействия на прилегающие ткани, вызванные реакционноспособными формами кислорода (РФК), образующимися при облучении фотосенсибилизатора.

Для получения фармацевтических композиций, фотосенсибилизаторы могут быть лиофилизированы, например, с маннитом, и сухой порошок непосредственно растворяют в физиологическом растворе или любом другом фармацевтически приемлемом водном растворе для местного нанесения пациенту или для применения на целевом образце in vitro. Получение композиций осуществляют при помощи хорошо известных в данной области техники способов, например, таких, которые кратко изложены в работе Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., Easton, Pa, 1990.

Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что проникновение некоторых производных бактериохлорофилла в роговицу и склеру кролика, которые подвергались действию фотосенсибилизатора в течение 10 или 30 минут, было значительно более глубоким, когда фотосенсибилизатор применяли без декстрана-500, чем при применении с указанным наполнителем. Показатели роговицы кроликов, полученные посредством флуоресцентной микроскопии и представленные на Фиг. 4А-4Н, показывают, что отрицательно заряженное производное бактериохлорина WST11 пересекает половину стромы роговицы через 10 минут инкубирования и всю глубину стромы через 30 мин инкубирования при отсутствии декстрана. В противоположность этому, применение WST11 с декстраном-500 ограничивает глубину проникновения до наружной 1/3 части стромы роговицы после 10 минут и до ~50% после 30 минут инкубирования. Аналогичные результаты были получены при измерении глубины проникновения другого сульфированного производного Bchls, то есть соединений 1-7, в присутствии декстрана в составе.

Обработка WST11 (или соединениями 1-7), смешанным с декстраном-500, не изменила эффект повышения жесткости по сравнению с WST11 без декстрана. Тем не менее, такая обработка значительно снижает неблагоприятные воздействия обработки. В клиническом аспекте, продолжительность и степень отека роговицы и заживления эпителия роговицы были значительно сокращены. Кроме того, эпителиальная пелена, которая образуется в некоторых обработанных роговицах, появлялась только при отсутствии декстрана. Тем не менее, самым важным эффектом, по-видимому, является защита эндотелиального слоя и снижение повреждения кератоцитов в обработанных роговицах. Это ясно продемонстрировано на гистологических срезах глаз кролика, представленных на Фиг. 11А-11С в настоящем документе. Гистологические исследования после обработки WST11 (или соединениями 1-7) в смеси с декстраном 500 с последующим БИК облучением продемонстрировали снижение популяции кератоцитов в передней области роговицы без повреждения эндотелия.

Эта защита, а также ослабление отека и сокращение времени заживления, вероятно, связаны с уменьшением глубины проникновения WST11 и, следовательно, ограничения в пространстве действия фотогенерированных радикалов. Удивительно, но тогда как WST11 в физиологическом растворе проникал на глубину половины стромы роговицы после 10 минут инкубирования, обеспечивал придание жесткости в меньшей степени, чем после проникновения на аналогичную глубину в роговице при применении WST11 с декстраном. Это наблюдение может в качественном отношении коррелировать с накоплением WST11 в центральном слое роговицы и возможностью генерировать более высокую концентрацию РФК в этой области по сравнению с более диффузным распределением WST11 при отсутствии декстрана.

Защитная роль декстрана, вероятно, сохраняется при лечении рибофлавином (РФ)/УФА, известным в данной области техники благодаря приданию жесткости роговице. Хотя было заявлено, что состав РФ с декстраном-500 помогает поддерживать изоосмолярность раствора (Letko et al., 2011), недавно сообщалось, что проникновение раствора РФ-декстрана (РФ-D) в строму ограничено первыми 200 мкм, даже при длительном времени воздействия (Søndergaard et al., 2010). Это открытие подтверждается данными, полученными авторами настоящего изобретения, и обосновывает тот вывод, что декстран ограничивает проникновение фотосенсибилизатора в передней области роговицы, и тем самым защищает эндотелий от фототоксичного действия. Молекулярная природа этого эффекта до сих пор не определена, но выясняется, что полисахарид образует вместе с природным коллагеном матрицу, которая действует как барьер, предотвращающий миграцию фотосенсибилизатора в более глубокие слои.

Декстран является высокомолекулярным полимером глюкозы, легко усваиваемым и разлагаемым, что объясняет его широкое применение в качестве наполнителя для офтальмологических композиций, например, искусственных слез и глазных капель. Фракции декстрана получают посредством частичного кислотного гидролиза нативного декстрана, при этом они имеют различные свойства и применения и поставляются в диапазоне молекулярных масс от 1000 до 2 миллионов. Молекулярная масса фракции в большинстве случаев является ключевым свойством. Обозначение декстран 5, декстран 10 и т.п. характеризует среднюю молекулярную массу, деленную на 1000. Таким образом, декстран 10 соответствует средней молекулярной массе 10000. В некоторых вариантах реализации фракции декстрана выбирают из декстрана 50, декстрана 70, декстрана 100, декстрана 200, декстрана 500, декстрана 1000 и декстрана 2000. Наиболее предпочтительной фракцией декстрана, которая используется для приготовления офтальмологической композиции по настоящему изобретению, является декстран 500.

При добавлении к составу 20% декстрана 500, вязкость состава увеличивается приблизительно до 179 сП. Альтернативным подходом к объяснению снижения глубины проникновения фотосенсибилизатора при совместном введении с декстраном является увеличение вязкости состава. Авторы настоящего изобретения исследовали эффект совместного введения фотосенсибилизатора с 65% раствором глюкозы или 92% раствором глицерина, обладающими вязкостью 200 сП, сопоставимой с вязкостью 20%-ного раствора декстрана. Оказалось, что 65% раствор глюкозы или 92% раствор глицерина ограничивал глубину проникновения фотосенсибилизатора в той же степени, что и декстран.

Таким образом, в более предпочтительных вариантах реализации настоящее изобретение обеспечивает вязкую офтальмологическую композицию для лечения истончения роговицы. Согласно этим вариантам реализации офтальмологическая композиция содержит вязкий агент, такой как наполнитель, который увеличивает вязкость состава и тем самым ограничивает или задерживает проникновение активного агента в роговицу. Любой вязкий агент, используемый в офтальмологических составах, подходит для целей настоящего изобретения. Предпочтительными функциональными наполнителями, которые функционируют как вязкие вещества, являются биополимеры, предпочтительно полисахариды, более предпочтительно природные полисахариды, которые являются легко биоразлагаемыми в организме в результате естественных биологических процессов. Природные полисахариды являются предпочтительными также благодаря своим уникальным физико-химическим свойствам, относительно низкой стоимости, и поскольку их можно химически модифицировать для того, чтобы удовлетворить конкретные потребности. Неограничивающие примеры полимерных вязких агентов включают декстран, склероглюкан и его производные, геллановую камедь, гуаровую камедь, метилцеллюлозу (МЦ), поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, желатин, карбомеры и т.п. Предпочтительными вязкими агентами являются декстран и экзополисахаридные гидрогели склероглюкана, особенно его карбоксилированные производные, геллановая камедь и гуаровая камедь.

Неполимерные вязкие агенты, которые могут быть использованы в офтальмологическом составе по настоящему изобретению, включают глюкозу и глицерин.

Альтернативно, композиция может быть введена совместно с вязким, инертным раствором, таким как, но, не ограничиваясь перечисленным, 20% раствор декстрана или 65% раствор глюкозы или 92% глицерина.

Офтальмологическое применение производных бактериохлорофилла в роговице и склере кролика с последующим облучением при 600-900 нм и захват фотогенерированных радикалов кислорода в роговице и склере индуцировало фотохимические реакции, возможно, реакции полимеризации, которые приводят к стойкому повышению жесткости роговицы и склеры ex vivo и in vivo. Фотохимические реакции производных бактериохлорофилла, нанесенных на глаза кроликов, можно наблюдать по непрерывное обесцвечивание и изменения спектров во время облучения (обесцвечивание показано в настоящем документе на Фиг. 5).

Инкубирование ех vivo роговицы кроликов с WST11 в течение 30 минут перед облучением приводила к увеличению модуля упругости и предела прочности на 369% и 267%, соответственно. Обработка с теми же параметрами, выполненная in vivo, приводила к увеличению модуля упругости и предела прочности на 174% и 111%, соответственно. Для роговицы, обработанной in vivo, модуль упругости увеличивался со временем инкубирования.

Инкубирование ex vivo склеры кроликов с WST11 в течение 30 минут перед облучением приводила к увеличению модуля упругости и предела прочности на 300% и 274%, соответственно.

Таким образом, ФДТ роговицы и склеры, предварительно обработанных водорастворимым производным (бактерио)хлорофилла, повысила предел прочности и модуль упругости по меньшей мере в 2 раза без повреждения эндотелиальных клеток. Это лечение оказалось безопасным в моделях животных, и поэтому может быть рассмотрено для клинических исследований в отношении кератоконуса и эктазии роговицы после рефрактивной хирургии.

Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ фотодинамической терапии глазных заболеваний, расстройств и состояний, связанных с истончением роговицы или растяжением склеры, включающий следующие стадии: (а) введение индивидууму, страдающему истончением роговицы или растяжением склеры, фотосенсибилизатора, который является (бактерио)хлорофиллом формулы I, II или III, как определено выше, или содержащей его фармацевтической композиции; и (b) облучение глаза светом с длиной волны в красной или ближней инфракрасной области (БИК) спектра.

Способ, предложенный в настоящем изобретении, является предпочтительным для лечения РФ/УФА. В ряде сообщений было показано, что УФА облучение является токсичным для эндотелиальных клеток роговицы (Wollensak et al., 2004(а); Wollensak et al., 2004(b); Wollensak 2010(a)) и приводит к полной гибели кератоцитов (Spoeri et al, 2007; Hafezi et al., 2009; Wollensak et al., 2010(b)) даже при ограничении глубины проникновения применяемого РФ.

Механизм, вовлеченный в повышение жесткости роговицы при лечении бактериохлорофиллом/БИК, может отличаться от механизма, имеющего место при РФ/УФА. Возбужденные фотонами водорастворимые производные бактериохлорофилла, такие как WST11, генерируют супероксидные и гидроксильные радикалы с минимальными следами синглетного кислорода, который является основным РФК продуктом лечения РФ/УФА (см. Фиг. 6).

В одном варианте реализации способ по настоящему изобретению применяется для лечения заболеваний, расстройств и состояний, связанных с истончением роговицы, выбранных из кератоконуса, эктазии роговицы, вызванной травмой, например, эктазии после проведения лазерного кератомилеза (LASIK, laser-assisted in situ keratomileusis), эктазии после проведения фоторефрактивной кератэктомии (ФРК), постинфекционной эктазии, периферической эктазии или ревматоидного состояния роговицы.

Другие неограничивающие заболевания и состояния, связанные с потерей зрения в результате аномалий склеры, которые можно лечить с помощью способов по настоящему изобретению, включают дегенеративную миопию, обычную миопию, стафилому склеры, макулярную деформацию, макулярную атрофию, глаукому с глазной гипертензией, глаукому низкого давления, и их комбинации.

Комбинированное лечение фотосенсибилизатором на основе (бактерио)хлорофилла и облучением глаза светом или в красной или БИК области спектра может быть использовано для предотвращения ожидаемого ослабления склеры или истончения роговицы у пациентов, у которых предполагается проведение или которые уже подверглись инвазивным процедурам.

Таким образом, в дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ предотвращения заболевания роговицы и/или склеры или их ослабления до, во время или после инвазивных процедур, включающий следующие стадии: (а) введение индивидууму, у которого предполагается наличие заболевания или ослабления роговицы и/или склеры, соединения хлорофилла или бактериохлорофилла, как определено выше, или содержащей такое соединение фармацевтической композиции; и (b) облучение глаза светом с длиной волны в красной или ближней инфракрасной области (БИК) спектра.

Количество производного (бактерио)хлорофилла для введения с целью ФДТ будет установлено лечащим врачом в соответствии с опытом, накопленным при использовании других производных Bchl, используемых при ФДТ, и будет изменяться в зависимости от выбора производного, используемого в качестве активного ингредиента, состояния, подлежащего лечению, способа введения, возраста и состояния пациента и мнения врача.

ПРИМЕРЫ

Материалы и способы

(i) Соединения. Одновалентная соль палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-сульфоэтил)амида (например, дикалиевая соль, WST11) была предоставлена компанией STEBA Laboratories, Израиль. Двухвалентная соль палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(-сульфопропил)амида (например, дикалиевая соль, соединение 1); двухвалентная соль палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди-(2-сульфоэтил)амида (например, дикалиевая соль, соединение 2); соль палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди-(3-сульфопропил)амида (например, дикалиевая соль, соединение 3); соль 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-сульфоэтил)амида (например, дикалиевая соль, соединение 4); соль 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(-сульфопропил)амида (например, дикалиевая соль, соединение 5); двухвалентная соль 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди-(2-сульфоэтил)амида (например, дикалиевая соль, соединение 6) и двухвалентная соль 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди-(3-сульфопропил)амида (например, дикалиевая соль, соединение 7) были получены так, как описано в патенте США 7947672. Другие производные бактериохлорофилла, например, производные, содержащие отрицательно заряженные группы или положительно заряженные группы, получали, как описано в патенте США 7947672 и международной публикации WO 2005/120573. Растворы производных бактериохлорофилла получали в двух формах: (а) только в физиологическом растворе в концентрации 2,5 мг/мл и рН доводили до 7,3 (далее по тексту -«Bchl-S раствор» или «Bchl-S»); (b) 2,5 мг/мл производного бактериохлорофилла в физиологическом растворе с 20% декстрана 500 (31392 Fluka, Швейцария) и рН доводили до 7,3 (далее по тексту - «Bchl-D раствор» или «Bchl-D»).

Использовали две формы раствора рибофлавина (РФ): (а) 0,1% раствор рибофлавин-5'-фосфата в физиологическом растворе, рН доведен до 7,3 (далее по тексту - «раствор РФ»); (b) коммерчески доступный (Medio Cross, Германия) 0,1% раствор рибофлавин-5'-фосфата в 20% декстране Т-500, измеренный рН 6,8 (далее по тексту - «раствор РФ-D» или «РФ-D»).

(ii) Источники излучения, (а) Диодный лазер с настраиваемой мощностью до 1 Вт при длине волны 755 нм (CeramOptec, Германия); (b) светодиодная система с длиной волны 760 нм 2х18 мВт (Roithner Lasertechnik, Австрия); и (с) светодиодная система с длиной волны 370 нм 2×3 мВт (Roithner Lasertechnik, Австрия).

(iii) Животное. Новозеландских белых кроликов (NZW) размещали и содержали со свободным доступом к пище и воде в центре для разведения и содержания животных научно-исследовательского института Weizmann (Rehovot, Израиль). Все экспериментальные процедуры были одобрены институциональным комитетом по содержанию и использованию животных. Все эксперименты были проведены с соблюдением положения ARVO (Ассоциации офтальмологии и исследования зрения) по использованию животных в исследованиях глаз и зрения.

Способы

(а) Исследования роговицы

Биомеханическое тестирование жесткости роговицы

(i) Подготовка образцов для ex vivo биомеханического исследования повышения жесткости роговицы. Глаза кроликов (в возрасте 15-16 недель, с массой 3-4 кг) посмертно энуклеировали. Перед энуклеацией на склере были отмечены положения на 12 и 6 ч для сохранения последующего относительного положения разреза. Роговицы деэпителизировали механически при помощи PKR скребка (Becton Dickenson, США). Как правило, около 10 кроликам была назначена обработка бактериохлорофиллом/БИК, далее по тексту-«исследуемая группа» (например, WST11/БИК), а 2-х кроликов для сравнения обрабатывали с помощью РФ/УФА (далее - «РФ/УФА группа»). В исследуемой группе 10 глаз 10 кроликов погружали верхней стороной вниз на 30 минут в исследуемое соединение в физиологическом растворе (Bchl-S) с последующим БИК облучением (600-900 нм) диодным лазером при 10 мВт/см² в течение 30 минут. Необработанные контралатеральные глаза служили в качестве контроля. В группе РФ/УФА местно наносили раствор РФ-D на 2 глаза 2 кроликов каждые 10 минут в течение 30 минут с последующим УФА облучением при 370 нм двойным диодом при 3 мВт/см² в течение 30 минут. После обработки роговично-склеральные кольца извлекали и помещали на парафиновые полусферические прокладки соответствующей формы, чтобы обеспечить изготовление точных срезов без растяжения ткани. Полоски роговицы шириной 4±0,2 мм вырезали со стороны эпителия в ориентации сверху вниз с помощью самосконструированного резчика с двойным лезвием. Полоски включали 2 мм склеры на обоих концах. Толщину центральной роговицы измеряли способом ультразвуковой пахиметрии (ультразвуковой пахометр Humphrey, США). Затем полоски роговицы переносили в биомеханический испытательный прибор.

(ii) Подготовка образцов для исследования in vivo

Использовали кроликов в возрасте от двенадцати до двадцати пяти недель (масса тела 2,5-3 кг). Им проводили анестезию путем внутримышечной (в.м.) инъекции кетамина в дозе 35 мг/кг (Rhone Merieux, Лион, Франция) и ксилазина в дозе 5 мг/кг (Vitamed, Беньямина, Израиль). Как правило, 16 кроликам назначали обработку бактериохлорофиллом. После деэпителизации один глаз каждого кролика обрабатывали местно тестируемым соединением в физиологическом растворе в течение 10, 20 и 30 минут, используя колпачок для глаз (диаметром 12 мм), с последующим БИК облучением в течение 10, 20 или 30 минут (755 нм, 10 мВт/см²). Другой глаз служил в качестве необработанного контроля. Для предотвращения воздействия на лимбальные стволовые клетки, облучаемая область была ограничена маской из алюминиевой фольги с центральным отверстием диаметром 8 мм. Для определения роли декстрана 12 кроликов разделили на 4 группы обработки по 3 кролика в каждой: группу 1, Bchl-S группу, обрабатывали производным бактериохлорофилла в физиологическом растворе; группу 2, Bchl-D группу, обрабатывали раствором бактериохлорофилл-декстран. Обе группы инкубировали с тестируемым соединением в течение 20 мин с последующим БИК облучением (755 нм, 10 мВт/см²) в течение 30 минут. Группу 3, РФ группу, обрабатывали рибофлавином без декстрана, и группу 4, РФ-D группу, обрабатывали раствором РФ-декстран (РФ-D). Обе группы инкубировали с растворами РФ или РФ-D в течение 30 минут с последующим УФА облучением (370 нм, 3 мВт/см²) в течение 30 минут. Глазную мазь, содержащую 0,1% дексаметазона, неомицин и полимиксин В (Maxitrol®, Alcon, Бельгия) наносили на обработанные глаза один раз в день в течение двух недель. Через четыре недели после обработки кроликов умерщвляли, а роговично-склеральные кольца извлекали и помещали на парафиновые полусферические прокладки соответствующей формы, чтобы обеспечить изготовление точных срезов без растяжения ткани. Полоски роговицы шириной 4±0,2 мм вырезали со стороны эпителия, как описано выше в разделе ex-vivo. Полоски роговицы сразу же переносили в биомеханический испытательный прибор.

Накопление, проникновение и фотообесцвечивание лекарственных средств

(i) Общее накопление фотосенсибилизатора

Глаза кроликов сразу после смерти деэпителизировали механически. Для большинства исследований использовали 6 кроликов, при этом 6 глаз 6 кроликов подвергали действию тестируемого соединения бактериохлорофилла в течение 10, 20 и 30 минут (2 глаза на каждое исследование), используя колпачок для глаз, тогда как контралатеральные глаза оставались необработанными и служили в качестве контроля. Роговицы извлекали и с помощью круглого трепана вырезали центральные участки круглой формы диаметром 8 мм и помещали на внешнюю сторону полиметилметакрилатной кюветы в области прохождения луча света. Регистрировали спектры поглощения и измеряли оптическую плотность (ОП) при 600-900 нм (в большинстве случаев при 755 нм) с помощью спектрофотометра V-570 (Jasco, Япония).

(ii) Исследования глубины проникновения

Глаза кроликов посмертно энуклеировали и деэпителизировали механически. Глаза подвергали действию раствора Bchl-S, используя колпачок для глаз, в течение 5, 10 и 30 минут и действию раствора Bchl-D в течение 10 и 30 мин в темноте. Контроли: необработанные глаза и один глаз, обработанный только декстраном-500 в течение 30 мин в темноте. После такой предварительной обработки роговицы быстро промывали физиологическим раствором и с помощью трепана вырезали центральные участки круглой формы диаметром 8 мм, извлекали, заворачивали в алюминиевую фольгу и замораживали на сухом льду до дальнейшего использования. Центральные серийные сагиттальные срезы роговицы (12 мкм) нарезали с помощью криомикротома, устанавливали на предметное стекло и хранили замороженными при температуре -70°С до использования. Для измерения флуоресценции отдельные срезы помещали на основание микроскопа и немедленно регистрировали полученные фотографии. Регистрировали интенсивность флуоресценции роговиц, обработанных Bchl-S или Bchl-D, из 3 серийных криосрезов при 760 нм, при возбуждении при 740 нм, используя флуоресцентный микроскоп (ВХ61, Olympus, Япония), оснащенный ПЗС-камерой (Cascade 512B, Roper Sci., США) и фильтром, пропускающим длинноволновую часть спектра выше 760 нм. Цифровые данные анализировали, используя программное обеспечение ImageJ (NIH, США).

(iii) Фотообесцвечивание фотосенсибилизатора

Роговицы глаз умерщвленных кроликов были деэпителизированы. Как правило, исследованию подвергали 5 кроликов, и 8 из 10 глаз предварительно обрабатывали в течение 20 минут производным бактериохлорофилла в физиологическом растворе (Bchl-S), с использованием колпачка для глаз. Избыток раствора тщательно убирали фильтровальной бумагой. Глаза облучали в течение заданного периода времени: 0, 10, 30 и 60 минут (две роговицы на период времени). Дополнительные два глаза использовали в качестве контроля. Роговицы извлекали, и с помощью круглого трефина вырезали центральные участки круглой формы диаметром 8 мм. Спектры поглощения регистрировали с использованием спектрофотометра V-570 (Jasco, Япония).

Флуоресцентная спектроскопия после обработки BChl/БИК и РФ/УФА

Глаза кроликов энуклеировали посмертно. Эпителий роговицы деэпителизировали с помощью скребка. Как правило, два глаза двух кроликов погружали в растворы Bchl-S или Bchl-D на период 30 мин, с последующим БИК облучением (30 мин). Раствор РФ-D наносили на два глаза на 30 мин, с последующим УФА облучением (30 мин). Два глаза служили в качестве контроля. Роговицы извлекали, и с помощью круглого трефипана вырезали центральные участки круглой формы диаметром 8 мм. Участки круглой формы устанавливали на предметное стекло, которое помещали наклонно под углом 45° (Фиг. 2) в спектрофлуориметр (Varian-Cary Eclipse, США). Возбуждающий луч устанавливали на уровне 295, 315, 320, 328, 335 нм, и считывали соответствующие спектры эмиссии при 360-480 нм. Другие показания снимали при возбуждении при 350 нм и эмиссии при 380-480 нм, и при возбуждении при 370 нм и эмиссии при 400-700 нм. Ширина щели возбуждения составляла 10 нм, щели эмиссии ~10 нм.

Гистология

Спустя сорок восемь часов или 1 неделю после обработки Bchl-S, Bchl-D, РФ или РФ-D кроликов умерщвляли, а глаза немедленно энуклеировали и фиксировали в фиксаторе Дэвидсона (спустя 48 час после обработки) или в 4% формальдегиде (спустя 1 неделю после обработки). Готовили срезы толщиной шесть мкм или из целого глаза, или из роговицы и окрашивали гематоксилином-эозином (Н&Е). Исследовали патологию срезов роговицы и сетчатки. Срезы фотографировали цифровой видеокамерой (Nikon DS-Ril, Япония), установленной на световом микроскопе (Е-800 Leica, Германия). Плотность кератоцитов и эндотелиальных клеток подсчитывали в 2 областях 2 центральных гистологических срезов и проводили вычисления, используя программное обеспечение Image-Pro (MediaCybernetics, MD, США).

Окрашивание для выявления апоптоза. Для выявления апоптоза, кроликов умерщвляли спустя один день после обработки Bchl-S или Bchl-D. Их роговицы извлекали, фиксировали в 4% формальдегиде и помещали в парафин. Готовили центральные срезы из роговицы толщиной шесть мкм, помещали на предметные стекла и депарафинизировали. Анализ терминального ник-мечения dUTP-дигоксигенином, опосредованного концевой дезоксирибонуклеотидил-трансферазой на основе пероксидазы (TUNEL), проводили в соответствии с инструкциями изготовителя (Apop-Tag assay, Chemicon, Merck Millipore, Дармштадт, Германия).

Окрашивание эндотелия. Кролики прошли анализ повреждения эндотелия роговицы спустя 1 день после обработки, с использованием окрашивания ализарином красным S и трипановым синим, как описано в работе Spence and Peyman, 1976. Обработка включала или предварительную обработку в течение 20 минут растворами Bchl-S или Bchl-D с последующим 30-минутным облучением при 755 нм (2 кролика), или только 30-минутное облучение при 760 нм (2 кролика). Контралатеральные необработанные глаза служили в качестве контроля.

(b) Исследования склеры

Подготовка образцов для ex vivo биомеханических исследований повышения жесткости склеры

Глаза кроликов энуклеировали сразу же после смерти и обрабатывали снаружи путем применения колпачка для глаз с 2,5 мг/мл тестируемого соединения в физиологическом растворе (Bchl-S) в течение 30 минут на верхнюю или нижнюю области склеры, с последующим облучением БИК при 10 мВт/см2 в течение 30 минут. Противоположная сторона склеры служила в качестве контроля. Полосы склеры шириной 4 мм вырезали на экваториальной обработанной области и противолежащей склере и проводили измерения деформации с использованием испытательного прибора для биоматериала.

Измерения импрегнирования

Ex-vivo импрегнирование:

Глаза умерщвленных кроликов энуклеировали и верхнюю экваториальную область склеры (или нижнюю экваториальную) подвергали воздействию раствора тестируемого соединения (Bchl-S) (2,5 мг/мл) в течение 10 минут и 30 минут, используя колпачок для глаз диаметром 10 мм, наполненную тестируемым соединением. Нижняя экваториальная область склеры (или верхняя экваториальная область склеры, если проводили импрегнирование на нижний экватор) служила в качестве контроля.

In situ импрегнирование:

Раствор тестируемого соединения наносили в верхне-височный или нижненазальный (попеременно) квадрант кролика при помощи изогнутого пластикового или металлического глайда с прикрепленным тампоном Merocel®, присоединенного с помощью трубки, которая проходит снаружи вдоль глайда. Глайд вводят сквозь отверстия конъюнктивы у лимба (см. Фиг. 17А-17В). После размещения глайда, прикрепленного к склере, трубку соединяли со шприцем или насосом и вводили путем инъекции резервуар с тестируемым соединением для импрегнации склеры. Нанесение фотосенсибилизатора продолжали в течение 10 или 30 минут.После этого глайд с Merocel® извлекали.

Следующий способ был выполнен после ex-vivo или in-situ импрегнирования фотосенсибилизатора.

Обработанную область склеры и противолежащую контрольную склеру вырезали с помощью круглого трефина для кожи диаметром 8 мм и ножниц и немедленно замораживали. Сагиттальные срезы толщиной 20 микрон рассекали криомикротомом в центральной части участка круглой формы склеры. Регистрировали интенсивность флуоресценции при 755 нм при возбуждении при 740 нм с использованием флуоресцентного микроскопа (Olympus, Япония).

Облучение in vivo через передний сегмент.

БИК облучение проводили через роговицу и хрусталик с помощью диодного лазера с контактной фундус-линзой (Volk pan-fundoscopic) или путем установки оптического волокна на непрямой офтальмоскоп, и с помощью линзы +20 диоптрий, подающей свет на склеру через сетчатку и пигментный эпителий. Интенсивность облучения корректировали соответствующим образом за счет ослабления излучения.

После облучения кроликов умерщвляли, их глаза энуклеировали и обработанную область склеры и противолежащую контрольную склеру вырезали с помощью круглого трефина для кожи диаметром 8 мм и ножниц. Участки склеры круглой формы немедленно замораживали. Сагиттальные срезы толщиной 50 микрон выполняли криомикротомом в центральной части участка склеры круглой формы. Флуоресцентную спектроскопию проводили с использованием флуоресцентного микроскопа (Olympus, Япония), и регистрировали интенсивность флуоресценции при 755 нм при возбуждении при 740 нм.

(с) Биомеханическое тестирование

Полоски роговицы и склеры были зажаты горизонтально на расстоянии 6 мм между захватными устройствами управляемого микрокомпьютером испытательного прибора для биоматериала (Minimal, Germany) с датчиком усилия 200 Ньютон (Фиг. 1). Контролируемое затягивание винтов проводили с помощью калиброванной отвертки с заданным крутящим моментом 9 кН.м (Torqueleader, Англия). Напряжение увеличивали линейно со скоростью 1,0 мм/мин и измеряли вплоть до разрыва ткани. Модуль упругости рассчитывали при помощи испытательной машины. Предел прочности и модуль упругости были выражены в единицах мегапаскаль (МПа).

(d) Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса (ЭПР)

Все измерения ЭПР выполняли с использованием спектрометра Magnettech ESR Miniscope MS 100 Spectrometer (Германия) с микроволновым мостом X-band. Спектрометр ЭПР работает в диапазоне 9,3-9,55 ГТц, при микроволновой мощности 20 мВт. Измерения ЭПР проводили при комнатной температуре в стеклянных капиллярах или плоских кюветах.

Образцы водных растворов производных бактериохлорофилла без декстрана или с ним (Bchl-S и Bchl-D, соответственно) и рибофлавина без декстрана или с ним (РФ и РФ-D, соответственно) облучали при 755 нм, как описано в работе Ashur et al, 2009. В каждый раствор добавляли спин-ловушку α-(4-пиридил N-оксид)-N-трет-бутилнитрон (4-POBN, 65 мМ) и этиловый спирт (8%). Контроли содержали облученный 4-POBN в физиологическом растворе с/без декстрана и необлученные растворы BChl-S, BChl-D, РФ и РФ-D с/без 4-POBN.

Измерения ЭПР роговиц кролика ex-vivo. Глаза кроликов посмертно энуклеировали. Роговицы деэпителизировали механически, и полоски роговицы шириной 5 мм вырезали с помощью самосконструированного резчика с двойным лезвием. Полоски немедленно погружали на 30 мин в растворы, содержащие 4-POBN (65 мМ) и этиловый спирт (8%), и либо Bchl-S либо РФ-D. Затем полоски промывали физиологическим раствором и помещали в плоские кюветы (0,5×5 мм³) для БИК/УФА облучения с последующими измерениями ЭПР с помощью вышеупомянутого спектрометра Miniscope.

Пример 1. Поглощение WST11 тканью роговицы кролика

(i) Общее накопление WST11 роговицей кролика

Шесть глаз 3-х умерщвленных кроликов деэпителизировали механически сразу же после смерти. Пять из этих глаз подвергали действию WST11 в физиологическом растворе (раствор WST11-S) в течение 10, 20 и 30 мин, используя колпачок для глаз, и определяли оптическое поглощение промытых роговиц при 755 нм, как описано в разделе «Материалы и способы». Один глаз служил в качестве необработанного контроля.

Как продемонстрированно на Фиг. 3, оптическая плотность импрегнированных роговиц увеличивалась со временем до значения 1,71 единиц ОП без интерференции с собственным спектром WST11.

(ii) Глубина проникновения WST11 в роговицу кролика

При местном применении проникновение и глубина фотохимического воздействия на ткани роговицы была определена для нескольких производных бактериохлорофилла. Результаты представлены в настоящем документе для измерений с WST11.

Глубина проникновения фотосенсибилизатора определяет степень воздействия фотодинамического эффекта на ткани роговицы. В частности, чем глубже проникновение, тем выше вероятность повреждения эндотелия. Для корректировки глубины проникновения тестируемых соединений после разного времени инкубирования, оцифрованную флуоресценцию препарированных дисков роговицы контролировали с помощью флуоресцентной микроскопии, как описано в разделе «Материалы и способы».

Исследование глубины проникновения WST11 в деэпителизированную роговицу после различных периодов инкубирования проводили в темноте в отсутствие или в присутствии декстрана, с применением растворов WST11 в физиологическом растворе или декстране (растворы WST11-S или WST11-D, соответственно) на 20 глазах умерщвленных кроликов. Сагиттальные замороженные срезы, установленные на предметные стекла, подвергали флуоресцентной микроскопии. Распределение WST11 по роговице регистрировали фотографически с помощью флуоресцентной микроскопии (возбуждение/эмиссия 740/760 нм). Контролями служили 4 необработанных глаза и 1 глаз, обработанный в течение 30 минут только декстраном-Т 500.

Спустя 10 минут воздействия (на 2 глаза) раствором WST11-S, WST11 явно присутствовал во всей внешней половине стромы (Фиг. 4А, 4С). Дальнейшее воздействие (30 минут; 5 глаз) привело в результате к диффузии флуоресценции полностью до десцеметовой мембраны (Фиг. 4В, 4D). Такая обработка увеличила толщину стромы от 360-380 мкм до 600-730 мкм. В противоположность этому, применение раствора WST11-D ограничило глубину проникновения до наружной 1/3 (200 из 520 мкм) стромы роговицы, при этом в обоих вариантах время воздействия составило 10 и 30 минут (исследовали 3 глаза и 5 глаз, соответственно), как показано на Фиг. 4Е, 4G и Фиг. 4F, 4Н, соответственно. Важно отметить, что флуоресценция WST11-D в роговице показала сравнительно резкий фронт миграции лекарственного средства, не выходя за пределы центра стромы. Тем не менее, на глубине 200 мкм после 30 минут воздействия WST11-D уровень флуоресценции был для роговицы все еще выше, что предполагает более высокий уровень накопления.

Сопоставимые результаты для импрегнирования и глубины проникновения роговицы были получены с растворами соединения 1-7 в физиологическом растворе и декстране (данные не показаны).

Пример 2. Фотохимия WST11 в роговице

(i) Фотообесцвечивание в роговицах, обработанных WST11 ex-vivo

Ранее авторами настоящего изобретения было описано, что образование кислородных радикалов при облучении определенных производных бактериохлорофилла, таких как WST11 при отсутствии сывороточного альбумина, сопровождается обесцвечиванием БИК перехода и увеличением поглощения при ~645 нм из-за фотохимического образования молекул, подобных хлорофиллу (Ashur et al. 2009). Поэтому такие изменения являются важными маркерами фотохимической активности таких производных бактериохлорофилла in situ. Таким образом, в деэпителизированных роговицах кроликов наблюдали изменения оптического поглощения нескольких сульфированных производных бактериохлорофилла во время облучения роговицы. Результаты, полученные для 10 роговиц от 5 умерщвленных кроликов, получавших WST11 в физиологическом растворе, представлены в настоящем документе.

Восемь деэпителизированных глаз обрабатывали WST11-S в течение 20 мин, используя колпачок для глаз, а оставшиеся 2 глаза служили в качестве контроля. Как показано на Фиг. 5, поглощение при 755 нм WST11 в роговице уменьшилось на 30, 50 и 75% после БИК облучения в течение 10, 30 и 60 мин, соответственно (обращенная вниз стрелка). Параллельно, увеличивалось поглощение при 645 нм (обращенная вверх стрелка), что характерно для образования соответствующего производного хлорина посредством фотохимического взаимодействия WST11 с молекулярным кислородом (Ashur et al., 2009).

(ii) Образование кислородных радикалов посредством фотовозбуждения WST11 в роговице, установленное из спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (ЭПР)

Сравнение ЭПР спектров α-(4-пиридил N-оксид)-N-трет-бутилнитрона (4-POBN) в водном растворе после фотообразования реакционноспособных форм кислорода (РФК) за счет WST11/БИК (черный) и РФ/УФА (светло-голубой) и спин-ловушки 4-POBN представлены на Фиг. 6. Наблюдаемый квартет обусловлен захватом синглетного кислорода и присутствует только в спектрах РФ/УФА, в то время как секстет характеризует образование супероксидных и гидроксильных радикалов (звездочки) как при WST11/БИК, так и РФ/УФА.

ЭПР измерения для РФК, захваченных в роговице кролика, обработанной WST11/БИК, показаны на Фиг. 7. Сигналы аналогичны тем, которые наблюдаются в водных растворах без следов синглетного кислорода. Сигналы, генерируемые РФ/УФА, находились на уровне шумов.

Пример 3. Повышение жесткости роговицы в ответ на обработку WST11-S/БИК

Измерения деформации обработанных ex-vivo глаз

Измерения деформации проводили у 12 кроликов, как описано в разделе «Материалы и способы». Коротко, 10 глаз 10 кроликов обрабатывали WST11/БИК, а 2 глаза 2 кроликов обрабатывали РФ-D/УФА. Контралатеральные глаза служили в качестве контроля.

Измерения деформации после предварительного инкубирования в течение 30 мин с WST11-S с последующим БИК облучением, продемонстрировали приблизительно 3-кратное увеличение жесткости роговицы (для всех 10 глаз) по сравнению с необработанными глазами в качестве контроля (Фиг. 8А-8В). Наблюдалось максимальное увеличение на 267% предела прочности (Р<0,0001) от среднего значения 1,63 мегапаскаль (МПа) без обработки до 5,98 МПа после обработки и увеличение на 369% модуля упругости (Р<0,0001) от среднего значения 3,76 МПа без обработки до 17,65 МПа после обработки. Результаты приведены в таблице 1.

Средний предел прочности в двух роговицах, обработанных РФ-D/УФА, увеличился с 1,44 МПа без обработки до 6,46 МПА после обработки, а средний модуль упругости - с 3,28 МПа без обработки до 20,72 МПа после обработки.

Таким образом, повышение жесткости в результате обработки WST11/БИК оказалось близким к повышению жесткости, которое наблюдалось в двух роговицах, обработанных РФ-D/УФА.

Измерения деформации обработанных in-vivo глаз

Роговицы 16 живых кроликов предварительно обработали в течение 10 (n=4), 20 (n=6) и 30 (n=6) минут WST11-S (2,5 мг/мл). Затем проводили БИК облучение (755 нм, 10 мВт/см²) в течение 30 минут. Глазам предоставляли возможность заживления, и через один месяц измеряли предел прочности обработанных роговиц (как описано в разделе «Материалы и способы») и обнаружили увеличение на 45, 113 и 126%, соответственно, по сравнению с необработанными глазами. Средний модуль упругости в обработанных WST11-S/БИК роговицах продемонстрировал увеличение на 10, 79 и 173% для такого же времени лечения. Результаты показаны на Фиг. 9А-9В и в таблицах 1 и 2.

В роговицах, обработанных WST11-S/БИК, в течение одной недели после обработки развился отек. Эпителиальный дефект роговицы через 10-14 дней постепенно зажил. После заживления эпителия, роговицы восстановили прозрачность, при этом для некоторых роговиц наблюдалась эпителиальная пелена.

Следует отметить, что кролики в исследовании in vivo во время обработки были в возрасте 12 недель, а во время умерщвления - в возрасте 16 недель, тогда как группу кроликов ex-vivo умерщвляли в возрасте 12 недель. Взросление привело в результате к более высоким исходным значениям модуля упругости и предела прочности контрольных глаз (Таблица 1), что, вероятно, объясняет разницу между параметрами, достигнутыми при двух условиях исследования (Knox et al., 2010; Elsheikh et al., 2007).

Измерения деформации роговицы кролика проводили как ех vivo, так и in vivo, как описано выше, но подвергая глаза воздействию растворов соединений 1-3 в физиологическом растворе в течение указанных периодов времени с последующим БИК облучением. Значения предела прочности и модуля упругости, полученные для этих соединений, были сходными с результатами, полученными для WST11-S (данные не показаны).

Пример 4. Обработка роговицы WST11-D/БИК in vivo

Для определения роли декстрана исследовали фотохимическую обработку составом WST11 2,5 мг/мл, содержащим 20% декстрана Т-500 (WST11-D). Были исследованы шесть кроликов: 3 кролика были подвергнуты предварительной обработке в течение 20 мин раствором WST11-S, а 3 - раствором WST11-D с последующим БИК облучением в течение 30 минут. Дополнительных 4-х кроликов обрабатывали РФ (n=2) или РФ-D (n=2) в течение 30 минут с последующим 30-мин УФА облучением (370 нм, 3 мВт/см²).

Как продемонстрировано на Фиг. 10А-10В, применение WST11-S или WST11-D не оказало влияния на приблизительно двукратное увеличение как среднего предела прочности, так и модуля упругости по сравнению с необработанными роговицами вторых глаз.

Тем не менее, важное открытие заключается в том, что обработка WST11 значительно уменьшала масштаб и продолжительность отека и эпителиального дефекта по сравнению с обработкой РФ-D/УФА. Отек роговицы прошел через 5 дней, а эпителий зажил в течение 7-9 дней без развития пленки. В роговицах, обработанных РФ и РФ-D, эпителиальный дефект зажил через 4 дня. В группе РФ-D отек прошел через 4 дня с восстановлением прозрачности, тогда как в группе РФ отек сохранялся в течение 6 дней, при этом в следующие 2 дня наличия наблюдалась пелена центрального эпителия.

Пример 5. Реакция эндотелия и кератоцитов на обработку WST11-S/БИК или WST11-D/БИК

Изучали реакцию эндотелия и кератоцитов глаз кроликов на инкубирование с растворами WST11 и соединений 1-7 в физиологическом растворе или декстране с последующим БИК облучением. Влияние этих различных растворов бактериохлорофилла было практически одинаковым. Подробные результаты представлены в настоящем документе для измерений для WST11.

Один кролик был подвергнут обработке WST11 в физиологическом растворе (WST11-S; 20-минутное инкубирование, 30-минутное облучение при 755 нм). Шесть кроликов были подвергнуты обработке WST11-D (n=4, 20-минутное инкубирование, 30-минутное облучение при 755 нм) или РФ-D (n=2, 30-минутное инкубирование, 30-минутное облучение при 370 нм), как описано выше (в разделе «Исследования in-vivo»}. Контралатеральные глаза были использованы в качестве контроля.

Гистологическое исследование роговиц через два дня после обработки WST11-S/БИК продемонстрировало выраженный отек (роговица отекала до 890 мкм) и уменьшенное количество кератоцитов по всей строме, более выраженное в передней половине (см. Фиг. 1В). Наблюдалась структура сотовидной лакунарной гидратации, содержащая кератоциты или обломки кератоцитов. Тем не менее, слой эндотелиальных клеток оказался интактным и не отличался от контроля (Фиг. 11А). Статистической разницы количества эндотелиальных клеток между обработкой и контролем не было (Р=0,47). В противоположность этому, роговицы, обработанные WST11-D показали минимальный отек роговицы, отсутствие эпителия в центральной части и статистически значимое снижение количества кератоцитов (481±121 клеток/мм² в обработанных роговицах по сравнению с 1060±210 клеток/мм² в контрольных, Р<0,0001), ограниченное наружной половиной стромы (Фиг. 11С). Не было никаких доказательств повреждения эндотелия по сравнению с контролем, как после прижизненного (данные не представлены), так и после Н&Е окрашивания (Фиг. 11А). Спустя одну неделю после обработки гистологические срезы продемонстрировали сокращение передней стромы до 250 мкм (в дополнение к уплотнению стромы до 340 мкм, которое произошло после фиксации контрольных образцов в формальдегиде), потерю кератоцитов в передней 1/3 стромы (80 мкм) с эпителиальным заживлением, но без повреждения эндотелия (Фиг. 11D). Окрашивание сетчатки Н&Е через два дня после обработки WST11-D/БИК не показало каких-либо морфологических изменений по сравнению с контролем (данные не показаны).

Исследование апоптоза проводили с помощью анализа терминального ник-мечения dUTP-дигоксигенином, опосредованного концевой дезоксирибонуклеотидил-трансферазой на основе пероксидазы (TUNEL). Спустя один день после операции, TUNEL-положительные кератоциты были обнаружены в наружной ½ передней стромы обработанных роговиц, как показано на Фиг. 12В. Окрашивание TUNEL в задней строме не наблюдалось, эндотелий отсутствовал и имелся отек центральной стромы, как в контрольных роговицах (Фиг. 12А).

Пример 6. Флуоресцентная спектроскопия роговиц кролика

Восемь глаз кроликов энуклеировали посмертно и деэпителизировали эндотелий роговицы. Три глаза погружали в раствор WST11-S, а 3 глаза - в раствор SWT11-D на период времени 30 минут с последующим БИК облучением. Два глаза обрабатывали раствором РФ-D в течение 30 минут с последующим УФА облучением. Контралатеральные глаза служили в качестве контроля. Флуоресценцию сегментов роговицы измеряли так, как описано в разделе «Материалы и способы».

Возбуждение роговиц, обработанных РФ-D/УФА, при 320 нм генерирует четкий сигнал эмиссии при 405 нм, что, вероятно, соответствует флуоресценции дитирозина, представляющей собой известный отличительный признак поперечного сшивания (Kato et al., 1994). Такая эмиссия отсутствовала в роговицах, обработанных WST11-S/БИК и WST11-D/БИК, и в контролях, как показано на Фиг. 13. Возбуждение при любой другой длине волны не изменяет существенным образом профиль эмиссии роговицы.

Пример 7. Измерение на основе палладия системной абсорбции применяемого местно WST11-D

Шести кроликам проводили анестезию, как описано в разделе «Материалы и способы». После деэпителизации одну роговицу каждого кролика обрабатывали WST11-D 2,5 мг/мл (n=3) и 10 мг/мл (n= 3) в течение 20 минут, используя колпачок для глаз. Образцы крови (~0,5 мл) отбирали из ушной вены перед (время 0) и через 10, 20, 40 и 60 минут после начала применения, помещали в предварительно взвешенные полиэтиленовые пробирки объемом 1,5 мл, взвешивали и лиофилизировали. Сухие образцы разлагали азотной кислотой, и определяли концентрации Pd при помощи масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС), используя набор Pd стандартов (High-purity Standards, США), как описано ранее (Mazor et al, 2005).

Исследования ИСП-МС образцов крови, отобранных у кроликов во время и после местного нанесения WST11-D, не смогли обнаружить каких-либо значительных уровней Pd⁺², в качестве доказательства отсутствия проникновения лекарственного средства в кровеносную систему обработанных животных во всех измеренных точках времени.

Пример 8. Термографический анализ поверхности роговицы

Трех кроликов обрабатывали WST11-D в течение 20 минут с последующим БИК облучением (755 нм, 10 мВт/см²) в течение 30 минут. Проводились измерения температуры на поверхности роговицы во время обработки WST11-D/БИК с использованием ИК-термокамеры (Тепловизор InfRec R300, NEC Avio Infrared Technologies Co., Ltd., Токио, Япония) с температурной разрешающей способностью 0,05°С, точностью температуры ±1°С и пространственным разрешением 120 мкм. Изображения регистрировали перед облучением, каждые 7 минут во время облучения и в конце (последние секунды) облучения. Избранные термографические изображения были обработаны с помощью анализатора InfReC Analyzer NS9500 Lite (NEC Avio Infrared Technologies Co., Ltd., Токио, Япония).

Постоянный градиент температуры от Т=32°С в центре роговицы до Т=37,5°С на периферии лимба измеряли до, во время и после обработки. Отклонения менее 1°С наблюдались на протяжении всей процедуры (данные не показаны).

Пример 9. Трансэпителиальная доставка WST11 в роговицу кроликов.

Проницаемость роговицы для лекарственных средств является клинически важной, поскольку она является основным фактором, определяющим эффективность местного применения офтальмологических композиций. Для изучения трансэпителиального проникновения офтальмологических композиций по настоящему изобретению, доставку SWT11 оценивали в присутствии известного наполнителя, усиливающего трансэпителиальную проницаемость, содержащего раствор хлорида бензалкония, содержащий NaCl.

Двум кроликам проводили анестезию и обрабатывали следующим образом:

В одном глазу каждого кролика удаляли эпителий и инкубировали центральную область роговицы с раствором 2,5 мг/мл WST11 в 0,9% хлориде натрия, рН 7,3, используя колпачок для глаз в течение 20 минут. В контралатеральном глазу эпителий не затрагивали и центральную область роговицы инкубировали с раствором 2,5 мг/мл WST11 в 0,44% хлориде натрия, содержащем 0,02% бензалкония хлорида, рН 7,3, используя колпачок для глаз в течение 20 минут, а затем эпителий удаляли.

После инкубации с фотосенсибилизатором животных умерщвляли, центральные диски роговицы диаметром 8 мм извлекали и оценивали общее накопление фотосенсибилизатора путем регистрации спектров поглощения и измерения ОП при 755 нм, как описано в разделе «Материалы и способы».

Накопление WST11 в деэпителизированных роговицах приводило в результате к оптической плотности (ОП) приблизительно 0,86 у одного кролика и 0,75 у второго кролика, при этом трансэпителиальное накопление в роговице приводило в результате к ОП приблизительно 0,12 у первого кролика, что составляет приблизительно 14% накопленного в деэпителизированной роговице WST11 и приблизительно 0,16 у второго кролика, что составляет приблизительно 21% фотосенсибилизатора, накопленного в деэпителизированной роговице.

Таким образом, при вышеуказанном условии нанесения, количество фотосенсибилизатора, доставленного посредством трансэпителиального инкубирования роговицы, может составить ~1/6 от количества, накопленного в деэпителизированной роговице.

Пример 10. Глубина проникновения в роговицу WST11 в водном 65% растворе сахарозы

Водный 65% раствор сахарозы имеет вязкость, аналогичную 20% декстрану Т-500 (~175 сП). Глубина проникновения применяемого местно фотосенсибилизатора в составе, содержащем 65% сахарозы, исследовали в роговицах кроликов. Результаты, описанные в настоящем документе, были получены для WST11 в 65% растворе сахарозы.

Двум кроликам проводили анестезию, их роговицы деэпителизировали и один глаз каждого кролика обрабатывали раствором WST11 2,5 мг/мл в водном 65% растворе сахарозы, рН 7,3, используя колпачок для глаз, в течение 10 минут и таким же образом обрабатывали контралатеральный глаз, но в течение 30 минут. Затем животных умерщвляли, извлекали центральные диски роговицы диаметром 8 мм, подвергали глубокой заморозке и нарезали сагиттальные срезы, как описано в разделе «Материалы и способы».

После 10-минутного инкубирования фотосенсибилизатор проникал до ~1/3 наружной стромы, а после 30-мин инкубации - до ~1/2 наружной стромы, у обоих животных (данные не показаны). Таким образом, 65%-ный раствор сахарозы может быть применен так же эффективно, как декстран для ограничения проникновения фотосенсибилизатора в роговицу.

Пример 11. Глубина проникновения WST11 в склеру кролика

Глубину проникновения WST11 в склеру кролика оценивали посредством флуоресцентной микроскопии, как описано в разделе «Материалы и способы». Результаты, продемонстрированные на Фиг.14, показывают, что WST11, который применяли ex vivo, используя колпачок для глаз, и in-situ, используя тампон Merocel®, проникал в ткань склеры.

Пример 12. Биомеханическое тестирование склеры кролика, обработанной ex vivo WST11-S и наружным БИК облучением

Исследование деформации склеры энуклеированных глаз кроликов выполняли после обработки WST11 (2,5 мг/мл), как описано в разделе «Материалы и способы». После импрегнирования фотосенсибилизатора, склеру облучали посредством применения лазерного луча непосредственно к обработанной области (внешнее облучение), с помощью плоского оптического волокна, проходящего вдоль изогнутого пластикового или металлического глайда, как показано на фиг 17А. Полоски склеры вырезали и тестировали.

Измеренные значения продемонстрировали значительное увеличение жесткости обработанной склеры. Среднее максимальное напряжение в контрольной склере составило 2,77±0,99 МПа. Среднее максимальное напряжение в склере, обработанной WST11/БИК, составило 7,6±0,99 МПа (увеличение 174%). Средний модуль упругости в контрольной склере составил 15,2±7,5 МПа. Средний модуль упругости в склере, обработанной WST11/БИК, составил 45,6±3,9 МПа (увеличение 200%). Результаты показаны на Фиг. 15А-15В.

Пример 13. Биомеханическое тестирование склеры кролика, обработанной ex vivo WST11-S и БИК облучением через передний сегмент глаза.

Авторы настоящего изобретения предположили, что поскольку ткани являются достаточно прозрачными для облучения при 755-820 нм, то должна существовать возможность доставить достаточное излучение к задней области склеры посредством БИК облучения через роговицу и передний сегмент глаза с помощью либо прибора трехзеркальной фундус-линзы, показанной на Фиг. 18А-18С, либо посредством облучения роговицы при помощи непрямого офтальмоскопа с использованием устройства, описанного на Фиг. 17В.

Шесть глаз трех кроликов энуклеировали. Заднюю область глаза вплоть до экваториальной линии инкубировали, используя колпачок для глаз, с 2,5 мг/мл раствора WST11 в физиологическом растворе с рН 7,3 в течение 20 минут, а затем облучали посредством БИК облучения через переднюю область роговицы с помощью диодного лазера (755 нм, 0,5 Вт) и трехзеркальной фундус-линзы (Фиг. 18А-18С) в течение 30 минут. Полоски склеры вырезали и исследовали, как описано в разделе «Материалы и способы».

Измеренные значения продемонстрировали значительное увеличение жесткости обработанной склеры. Среднее максимальное напряжение в контрольной склере составило 4,65±1,15 МПа. Среднее максимальное напряжение в склере, обработанной WST11/БИК, составило 6,59±1,32 МПа (увеличение 42%). Средний модуль упругости в контрольной склере составил 25,25±5,30 МПа. Средний модуль упругости в склере, обработанной WST11/БИК, составил 38,83±6,89 МПа (увеличение 54%). Результаты показаны на Фиг. 16А-16В.

Пример 14. Повышение жесткости склеры in vivo посредством облучения через передний сегмент

Повышение жесткости склеры in vivo, избегая при этом токсичности для сетчатки глаза и глазницы, достигается следующим образом:

Импрегнирование фотосенсибилизатора (производное Bchl) в склеру выполняют путем введения в субтеноново пространство глайда сквозь отверстия в конъюнктиву лимба в 4 квадрантах. Внутренние дистальные 10 мм глайда являются пористыми и содержат резервуар с тестируемым соединением. Этот резервуар соединен посредством трубки, которая проходит вдоль глайда снаружи. После размещения глайда, прикрепленного к склере, трубку соединяют с шприцем или насосом, и резервуар с тестируемым соединением вводят для импрегнирования склеры. Концентрация сенсибилизатора и время воздействия а priori оптимизированы с помощью ex-vivo измерений энуклеированных глаз кроликов посредством флуоресцентной спектроскопии замороженных гистологических срезов склеры, как описано в Примере 11 выше. При необходимости, растворы декстрана или сахарозы используются для оптимизации глубины проникновения.

Сохранность сетчатки зависит от энергии падающего перпендикулярно света. В доклинических и клинических исследованиях Фазы II направленной сосудистой ФДТ с WST11, авторами изобретения было показано, что облучение сетчатки при 50-70 Дж (82-120 с при 600 мВт/см²) является безопасным. Следовательно, энергию света при лечении устанавливают в диапазоне 5-12 Дж (10-20 мВт/см² в течение 20-10 мин), для которого ожидается минимальная заболеваемость сетчатки.

Используя оптимизированные параметры применяют Bchl-S или Bchl-D так, как описано выше, с последующим фронтальным облучением при 755 нм при оптимизированной лазерной выходной мощности в диапазоне 20-250 мВт, чтобы доставить a priori оптимизированную интенсивность излучения к заднему сегменту глаза. Облучение проводят с использованием БИК лазера с He-Ne направленным лучом через 3-зеркальную фундус-линзу Гольдмана или БИК лазера, прикрепленного к непрямому офтальмоскопу с He-Ne направленным лучом. Спустя месяц после обработки кроликов умерщвляли, а глаза энуклеировали. Успешность лечения оценивали посредством измерения деформации полос склеры, вырезанных из верхней и нижней областей склеры обработанных глаз, по сравнению с соответствующими участками склеры необработанных вторых глаз.

Пример 15. Повышение жесткости склеры in vivo посредством облучения через передний сегмент

Повышение жесткости склеры in vivo, избегая при этом токсичности для сетчатки глаза и глазницы, достигается, как описано в Примере 14, но фотосенсибилизатор доставляли к склере при помощи тампона Merocel®, присоединенного к глайду, вставленному сквозь отверстия в конъюнктиве, вместо использования пористого глайда для доставки фотосенсибилизатора.

Пример 16. Повышение жесткости склеры in vivo посредством облучения через передний сегмент

Повышения жесткости склеры in vivo достигают так, как описано в Примере 14, но облучение применяют наружно путем введения глайда, соединенного с оптическим волокном сквозь отверстия лимба конъюнктивы, как показано на (Фиг. 17В). Это глайд предназначен для распространения рассеянного света, направленного к склере, при этом она является непрозрачной со стороны глазницы. Глайд для облучения соединен с лазером БИК или светодиодным источником, чтобы доставить БИК свет. Как глайды для импрегнирования, так и глайды для облучения размечены миллиметровой линейкой для подтверждения глубины введения. Положение глайда для облучения можно контролировать во время доставки излучения при помощи фундоскопии или визуализации глазного дна.

Альтернативный глайд, используемый для повышения жесткости склеры in vivo, представляет собой глайд, выполненный в виде объединенного блока для доставки как лекарственного средства, так и облучения.

СПИСОК УПОМИНАЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1) Ashur I, et al. 2009, "Photocatalytic generation of oxygen radicals by the water-soluble bacteriochlorophyll derivative WST11, noncovalently bound to serum albumin", J Phys Chem., 113:8027-37.

2) Avila MY, Navia JL, 2010, "Effect of genipin collagen crosslinking on porcine corneas", J Cataract Refract Surg., 36:659-664.

3) Berdugo M et al. 2008, "Evaluation of the new photosensitizer stakel (WST-11) for photodynamic choroidal vessel occlusion in rabbit and rat eyes", Inv Ophthalmol Vis Sci. 49:1633-1644.

4) Bourges JL et al., 2006, "PDT of corneal neovessels using a new hydrosoluble photosensitizer (WST11)", Acta Ophthalmol Scand., 84(S 239:41): 352.

5) Brandis A, Mazor O, Neumark E, Rosenbach-Belkin V, Salomon Y, Scherz A. 2005, "Novel water-soluble bacteriochlorophyll derivatives for vascular-targeted photodynamic therapy: synthesis, solubility, phototoxicity, and the effect of serum proteins", Photochem Photobiol., 81:983-993.

6) Elsheikh A, Wang D, Brown M, Rama P, Campanelli M, Pye D, 2007, "Assessment of comeal biomechanical properties and their variation with age", CurrEye Res., 32:11-19.

7) Hafezi F, Kanellopoulos J, Wiltfang R, Seiler T. 2007, "Comeal collagen crosslinking with riboflavin and ultraviolet A to treat induced keratoectasia after laser in situ keratomileusis" J Cataract Refract Surg., 33:2035-2040.

8) Hafezi F, Mrochen M, Iseli HP, Seller T. 2009, "Collagen crosslinking with ultraviolet-A and hypoosmolar riboflavin solution in thin corneas", J Cataract Refract Surg., 35:621-624.

9) Kato Y, Uchida K, Kawakishi S. Aggregation of collagen exposed to UVA in the presence of riboflavin: a plausible role of tyrosine modification. Photochem Photobiol. 1994;59:343-349.

10) Knox Cartwright NE, Tyrer JR, Marshall J, 2010, "Age-related differences in the elasticity of the human cornea". Invest Ophthalmol Vis Sci., 52:4324-4329.

11) Lepor H. 2008, "Vascular targeted photodynamic therapy for localized prostate cancer", Rev Urol., 10:254-261.

12) Letko E, Majmudar PA, Forstot SL, Epstein RJ, Rubinfeld RS, 2011, "UVA-light and riboflavin-mediated comeal collagen cross-linking", Int ophthalmol din., 51:63-76.

13) Liu К et al. 2004, "Superoxide, hydrogen peroxide and hydroxyl radical in Dl/D2/cytochrome b-559 Photosystem II reaction center complex", Photosynthesis Research., 81:41-47.

14) Mazor O. et al. 2005, "WST11, A novel water-soluble bacteriochlorophyll derivative; cellular uptake, pharmacokinetics, biodistribution, and vascular targeted photodynamic activity against melanoma tumors", Photochem Photobiol., 81:342-345.

15) Moore CM, Pendse D, Emberton M. 2009, "Photodynamic therapy for prostate cancer-a review of current status and future promise", Nat din Pract Urol., 6:18-30.

16) Raiskup-Wolf F, Hoyer A, Spoeri E, Pillunat LE. 2008, "Collagen cross-linking with riboflavin and ultraviolet-A light in keratoconus: long-term results", J Cataract Refract Surg. 34:796-801.

17) Sondergaard AP, Hjortdal J, Breitenbach T, Ivarsen A, 2010, "Comeal distribution of riboflavin prior to collagen cross-linking", Curr Eye Res., 116:121-135.

18) Spence DJ, Peyman GA. 1976, "A new technique for the vital staining of the comeal endothelium", Inv Ophthalmol Vis Sci., 15: 1000-1002.

19) Spoeri E, Mrochen M, Sliney D, Trokel S, Seiler T. 2007, "Safety of UVA-riboflavin cross-linking of the cornea", Cornea, 26:385-389.

20) Trachtenberg J et al. 2007, "Vascular targeted photodynamic therapy with palladium-bacteriopheophorbide photosensitizer for recurrent prostate cancer following definitive radiation therapy: assessment of safety and treatment response", J Urol., 178:1974-1979.

21) Vakrat-Haglili Y et al., 2005, "The microenvironment effect on the generation of reactive oxygen species by Pd-Bacteriopheophorbide", J Am Chem Soc., 127:6487-6497.

22) Wollensak G, 2010(a) "Histological changes in human cornea after cross-linking with riboflavin and ultraviolet A", Letter to the editor. Acta Ophthalmol. 88: e17-18.

23) Wollensak G, Aurich H, Wirbelauer C, Saadettin S. 2010(b), "Significance of the riboflavin film in corneal collagen crosslinking", J Cataract Refract Surg., 36:114-120.

24) Wollensak G, Spoeri E, Reber F, Pillunat L, Funk R. 2003(c), "Comeal endothelial cytoxicity of riboflavin/UVA treatment in vitro", Ophthalmic Res., 35:324-328.

25) Wollensak G, Spoeri E, Reber F, Seller T. 2004(a) "Keratocyte cytotoxicity of riboflavin/UVA-treatment in vitro". Eye, 18:718-722.

26) Wollensak G, Spoeri E, Seller T. 2003 (a) "Riboflavin/ultraviolet-A-induced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus", Am J Ophthalmol, 135:620-627.

27) Wollensak G, Spoeri E, Wilsch M, Seller T. 2003(b) "Endothelial cell damage after riboflavin-ultraviolet-A treatment in the rabbit", J Cataract Refract Surg. 29:1786-1790.

28) Wollensak G, Spoeri E, Wilsch M, Seller T. 2004(b) "Keratocyte apoptosis after comeal collagen cross-linking using riboflavin/UVA treatment", Cornea. 23:43-49.

Изобретение относится к химико-фармацевтической композиции и представляет собой применение соединений бактериохлорофилла для получения фармацевтической композиции для фотодинамической терапии заболеваний, расстройств и состояний, связанных с аномалией роговицы и склеры, выбранных из истончения роговицы и ослабления склеры. Также изобретение включает в себя способы фотодинамической терапии истончения роговицы или растяжения склеры, включающие стадии введения индивидууму, страдающему истончением роговицы или растяжением склеры, фармацевтической композиции, содержащей соединение бактериохлорофилла; и облучения глаза светом с длиной волны в красной или ближней инфракрасной области спектра. Изобретение позволяет получать альтернативные фотосенсибилизаторы, которые могут обеспечить сшивку коллагена в обширных задних областях склеры с максимальной безопасностью в отношении сетчатки и орбитальных тканей. 3 н. и 13 з.п. ф-лы, 18 ил., 2 табл., 16 пр.

1. Применение соединения бактериохлорофилла для получения фармацевтической композиции для фотодинамической терапии (ФДТ) заболеваний, расстройств и состояний, связанных с аномалией роговицы или склеры, выбранных из истончения роговицы и ослабления склеры, где соединение бактериохлорофилла представляет собой производное, имеющее формулу II:

где

М представляет собой 2Н, Mg, Pd или Zn;

R₁ выбран из -O^-R₁₀⁺ или -NH-(CH₂)_n-SO₃^-R₁₀⁺;

R'₂ представляет собой метокси;

R₄ в положении 3 представляет собой -С(=O)-СН₃ и в положении 8 представляет собой -СН₂-СН₃;

R'₄ представляет собой -СН₃;

R₆ представляет собой -NH-(CH₂)_n-SO₃^-R₁₀⁺;

R₁₀⁺ представляет собой Н⁺, NH₄⁺ или одновалентный катион, выбранный из K⁺, Na⁺, Li⁺;

m равен 1, n представляет собой целое число от 1 до 10;

пунктирная линия в положениях 7-8 отсутствует,

а также его фармацевтически приемлемые соли и оптические изомеры.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанный бактериохлорофилл формулы II выбран из фармацевтически приемлемых K⁺, Na⁺, Li⁺ или NH₄⁺ солей следующих соединений:

Палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-сульфоэтил) амид;

Палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(-сульфопропил) амид;

Палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди-(2-сульфоэтил) амид;

Палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди-(3-сульфопропил) амид;

3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-сульфоэтил) амид;

3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(-сульфопропил) амид;

3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди-(2-сульфоэтил) амид; и

3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди-(3-сульфопропил) амид.

3. Применение по п. 2, где указанное соединение бактериохлорофилла выбрано из:

дикалиевой соли палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-сульфоэтил) амида;

дикалиевой соли палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(-сульфопропил) амида;

дикалиевой соли палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди-(2-сульфоэтил) амида;

дикалиевой соли палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди-(3-сульфопропил) амида;

дикалиевой соли 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-сульфоэтил) амида;

дикалиевой соли 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(-сульфопропил) амида;

дикалиевой соли 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди-(2-сульфоэтил) амида; и

дикалиевой соли 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹,17³-ди-(3-сульфопропил) амида.

4. Применение по п. 1, где указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит вязкий агент.

5. Применение по п. 4, отличающееся тем, что указанный вязкий агент представляет собой биополимер.

6. Применение по п. 5, отличающееся тем, что указанный биополимер представляет собой полисахарид, выбранным из декстрана, склероглюкана и их производных, геллановой камеди, гуаровой камеди или метилцеллюлозы.

7. Применение по п. 1, где указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит усилитель трансэпителиальной проницаемости.

8. Применение по п. 1, где указанная фармацевтическая композиция предназначена для местного применения.

9. Применение по п. 1, где указанная фармацевтическая композиция пригодна для фотодинамической терапии перед проведением местного облучения глаза светом с длиной волны в красной или ближней инфракрасной области (БИК) спектра.

10. Применение по п. 1 для ФДТ кератоконуса.

11. Применение по п. 10, где соединение бактериохлорофилла формулы II представляет собой дикалиевую соль палладий 3¹-оксо-15-метоксикарбонилметил-родобактериохлорин 13¹-(2-сульфоэтил) амида (WST11).

12. Применение по п. 1, где соединение бактериохлорофилла формулы II содержится в фармацевтической композиции, содержащей декстран.

13. Применение по п. 1, где указанное истончение роговицы или ослабление склеры связано с заболеванием, расстройством или состоянием, выбранным из кератоконуса, эктазии после проведения лазерного кератомилеза (LASIK), эктазии после проведения фоторефрактивной кератэктомии (ФРК), постинфекционной эктазии, периферической эктазии, ревматоидного состояния роговицы, дегенеративной миопии, обычной миопии, стафиломы склеры, глаукомы с глазной гипертензией, глаукомы низкого давления и их комбинации.

14. Способ фотодинамической терапии истончения роговицы, включающий стадии:

(а) введения индивидууму, страдающему истончением роговицы, фармацевтической композиции, содержащей соединение бактериохлорофилла, имеющее формулу II:

где

М представляет собой 2Н, Mg, Pd или Zn;

R₁ выбран из -O^-R₁₀⁺ или -NH-(CH₂)_n-SO₃^-R₁₀⁺;

R'₂ представляет собой метокси;

R₄ в положении 3 представляет собой -С(=O)-СН₃ и в положении 8 представляет собой -СН₂-СН₃;

R'₄ представляет собой -СН₃;

R₆ представляет собой -NH-(CH₂)_n-SO₃^-R₁₀⁺;

R₁₀⁺ представляет собой Н⁺, NH₄⁺ или одновалентный катион, выбранный из K⁺, Na⁺, Li⁺;

m равен 1, n представляет собой целое число от 1 до 10;

пунктирная линия в положениях 7-8 отсутствует,

а также его фармацевтически приемлемые соли и оптические изомеры;

(b) облучения глаза светом с длиной волны в красной или ближней инфракрасной области (БИК) спектра.

15. Способ фотодинамической терапии растяжения склеры, включающий стадии: (а) введения индивидууму, страдающему растяжением склеры, фармацевтической композиции, содержащей соединение бактериохлорофилла, имеющее формулу II:

,

где

М представляет собой 2Н, Mg, Pd или Zn;

R₁ выбран из -O^-R₁₀⁺ или -NH-(CH₂)_n-SO₃^-R₁₀⁺;

R'₂ представляет собой метокси;

R₄ в положении 3 представляет собой -С(=O)-СН₃ и в положении 8 представляет собой -СН₂-СН₃;

R'₄ представляет собой -СН₃;

R₆ представляет собой -NH-(CH₂)_n-SO₃^-R₁₀⁺;

R₁₀⁺ представляет собой Н⁺, NH₄⁺ или одновалентный катион, выбранный из K⁺, Na⁺, Li⁺;

m равен 1, n представляет собой целое число от 1 до 10;

пунктирная линия в положениях 7-8 отсутствует,

а также его фармацевтически приемлемые соли и оптические изомеры; и

(b) облучения глаза светом с длиной волны в красной или ближней инфракрасной области (БИК) спектра.

16. Способ по п. 14 или 15, где указанное истончение роговицы или растяжение склеры связано с заболеванием, расстройством или состоянием, выбранным из кератоконуса, эктазии после проведения лазерного кератомилеза (LASIK), эктазии после проведения фоторефрактивной кератэктомии (ФРК), постинфекционной эктазии, периферической эктазии, ревматоидного состояния роговицы, дегенеративной миопии, обычной миопии, стафиломы склеры, глаукомы с глазной гипертензией, глаукомы низкого давления и их комбинации.