Фторхинолоны на основе 4-дезоксипиридоксина Российский патент 2017 года по МПК C07D401/14 C07D471/04 A61K31/437 A61K31/4427 A61K31/4709 A61K31/496 A61P31/04 

Изобретение относится к химии органических гетероциклических соединений, а именно - к новым соединениям фторхинолонового ряда общей формулы (I), содержащих фрагмент 4-дезоксипиридоксина, проявляющих антибактериальные свойства. Соединения могут найти применение в медицине и ветеринарии.

,

где ; R₂=H; ,

R₁=C₂H₅; R₂=H; ,

R₁=С₂Н₅; R₂=F; ,

; R₂=OCH₃; .

Заболевания, вызываемые болезнетворными бактериями, являются одной из важнейших проблем современности. В последние годы в России и в мире растет число инфекций, вызываемых не чувствительными к антибиотикам штаммами бактерий. Подобный рост наблюдается как для внутрибольничных инфекций (ВБИ), возникающих в лечебно-профилактических учреждениях вследствие непосредственного распространения бактерий от пациента к пациенту, так и для внебольничных случаев заражения.

По данным официальной статистики ежегодно в России регистрируется от 50 до 60 тыс. случаев ВБИ, однако, по расчетным данным, эта цифра в 40-50 раз выше. При этом только в 2015 году от бактериальных инфекций в России умерло около 2500 человек [Федеральная служба государственной статистики. www.gks.ru/free_doc/2015/demo/t3_3.xls]. В Европейском союзе резистентные инфекции также приводят к значительному увеличению нагрузки на экономику и здравоохранение: число пациентов, погибших в результате резистентных бактериальных внутрибольничных инфекций, ежегодно составляет там свыше 25 тыс. человек [Возрастающая угроза развития антимикробной резистентности Возможные меры. Доклад ВОЗ: www.who.int/iris/bitstream/10665/44812/16/9789244503188_rus.pdf].

Одним из наиболее эффективных классов антибактериальных препаратов, использующихся в современной практике, являются фторхинолоны. Фторхинолоны отличаются широким спектром антимикробного действия, включая стафилококки, высокой бактерицидной активностью и хорошей фармакокинетикой, что позволяет применять их для лечения инфекций различной локализации. Наличие у ряда препаратов лекарственных форм для внутривенного введения и приема внутрь в сочетании с высокой биодоступностью позволяет проводить ступенчатую терапию, которая при сопоставимой клинической эффективности существенно дешевле парентеральной.

Из препаратов группы фторхинолонов следует выделить: ципрофлоксацин, ломефлоксацин, моксифлоксацин, входящие в Перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов РФ [Распоряжение правительства РФ №2724-р от 26.12.2015, с 56], а также норфлоксацин.

Ципрофлоксацин - антибактериальное средство группы фторхинолонов II поколения. Механизм его действия заключается в подавлении бактериальной ДНК-гиразы (топоизомеразы II и IV, ответственные за процесс суперспирализации хромосомной ДНК вокруг ядерной РНК, что необходимо для считывания генетической информации), нарушении синтеза ДНК, роста и деления бактерий, что вызывает выраженные морфологические изменения (в том числе клеточной стенки и мембран) и быструю гибель бактериальной клетки.

Ципрофлоксацин оказывает антибактериальное действие с наибольшей активностью в отношении ряда аэробных грамотрицательных и грамположительных бактерий, а именно: Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Shigella spp., Salmonella spp., Neisseria meningitidis, N. Gonorrhoeae, Staphylococcus spp. (продуцирующих и не продуцирующих пенициллиназу), некоторых штаммов Enterococcus spp., а также Campylobacter spp., Legionella spp., Mycoplasma spp., Chlamidia spp., Mycobacterium spp [Яковлев В.П. Антибактериальные препараты группы фторхинолонов // Рус. мед. журн. - 1997, Вып. 5 - С. 1405-1413].

Ципрофлоксацин применяют при инфекционно-воспалительных заболеваниях, вызванных чувствительными к ципрофлоксацину микроорганизмами, в т.ч. при заболеваниях дыхательных путей, брюшной полости и органов малого таза, костей, суставов, кожи, септицемии, тяжелых инфекциях ЛОР-органов и др. [ G. Quinolones: a class of antimicrobial agents // Vet. Med. - 2001 - V. 46 - P. 257-274].

Существенным недостатком ципрофлоксацина является ограничение приема по возрасту - противопоказано назначение этого препарата детям и подросткам, так как он вызывает нарушение роста [Белобородова Н.В., Падейская Е.Н., Бирюков А.В. Фторхинолоны в педиатрии - за и против // Педиатрия - 1996. Вып. 2. - С. 76-84].

Также к недостаткам ципрофлоксацина относят и довольно часто встречающиеся побочные проявления действия препарата - боль в животе, тошнота, дисбактериоз, бессонница, головокружение, проявление аллергических реакций (отек Квинке, крапивница, зуд). В последние годы отмечается значительный рост резистентности микроорганизмов ко всему классу фторхинолонов [Norrby S.R. Side-effects of quinolones: comparisons between quinolones and other antibiotics // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 1991 - V. 10 - P. 378-383].

Ломефлоксацин - антибактериальное средство группы фторхинолонов II поколения. Воздействует на бактериальный фермент ДНК-гиразу, обеспечивающую сверхспирализацию, образует комплекс с ее тетрамером (субъединицы гиразы А2В2) и нарушает транскрипцию и репликацию ДНК, приводит к гибели микробной клетки. Активен в отношении широкого ряда грамотрицательных аэробных микроорганизмов: Citrobacter diversus, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa (только для инфекций мочевыводящих путей) и др.; грамположительных аэробных микроорганизмов: Staphylococcus aureus (включая метициллин-устойчивые штаммы), Staphylococcus epidermidis (включая метициллин-устойчивые штаммы). Также ломефлоксацин активен в отношении бактерий, которые продуцируют бета-лактамазы [Яковлев В.П. Антибактериальные препараты группы фторхинолонов // Рус. мед. журн. - 1997, Вып. 5 - С. 1405-1413].

Ломефлоксацин применяют при инфекциях мочевыводящих путей, желудочно-кишечного тракта (далее - ЖКТ) (дизентерия, брюшной тиф, сальмонеллез, холера) и желчевыводящих путей, инфекциях органов дыхания, гнойных инфекциях кожи и мягких тканей, инфицированных ранах, ожогах, гонорее, хламидиозе, простатите, остеомиелите, бактериальных инфекциях переднего отдела глаза: конъюнктивите, блефарите, блефароконъюнктивите, в т.ч. хламидийной этиологии [ G. Quinolones: a class of antimicrobial agents // Vet. Med - 2001 - V. 46 - P. 257-274].

К недостатком ломефлоксацина относится ограничение его приема по возрасту - противопоказано назначение этого препарата детям и подросткам, так как он вызывает нарушение роста [Белобородова Н.В., Падейская Е.Н., Бирюков А.В. Фторхинолоны в педиатрии - за и против // Педиатрия - 1996. Вып. 2. - С. 76-84].

Помимо этого, к недостаткам ломефлоксацина относят возникающие аллергические реакции (отек Квинке, крапивница, зуд), фототоксичность, а также запрет на его употребление в период беременности и лактации [Norrby S.R. Side-effects of quinolones: comparisons between quinolones and other antibiotics // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 1991 - V. 10 - P. 378-383].

Норфлоксацин - антибактериальное средство группы фторхинолонов II поколения. Ингибирует бактериальную ДНК-гиразу, нарушает синтез ДНК белков, что приводит к гибели бактерий. Норфлоксацин активен в отношении большинства штаммов аэробных грамположительных бактерий - Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus agalactiae, аэробные грамотрицательных бактерий - Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens [Яковлев В.П. Антибактериальные препараты группы фторхинолонов // Рус. мед. журн. - 1997, Вып. 5 - С. 1405-1413].

Применяется норфлоксацин при острых и хронических инфекциях мочевыводящих путей (неосложненных и осложненных), вызванных чувствительными к препарату возбудителями.

К недостатком норфлоксацина можно отнести побочные действия препарата - тошноту, понос, головную боль, чувство усталости, сонливость [Rubinstein Е. History of Quinolones and Their Side Effects // Chemotherapy - 2001 - V. 47 - P. 3-8].

Моксифлоксацин - антибактериальное средство группы фторхинолонов IV поколения. Ингибирует топоизомеразу II (ДНК-гираза) и топоизомеразу IV - ферменты, необходимые для репликации, транскрипции, репарации и рекомбинации бактериальной ДНК. Нарушает синтез ДНК микробной клетки, оказывает бактерицидное действие. Проявляет активность в отношении широкого спектра грамположительных (Staphylococcus aureus (включая штаммы, нечувствительные к метициллину), Streptococcus pneumoniae) и грамотрицательных (Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Klebsiella pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Escherichia coli, Enterobacter cloacae) микроорганизмов, анаэробных, кислотоустойчивых и атипичных бактерий: Mycoplasma spp., Chlamydia spp., Legionella spp. Эффективен в отношении бактериальных штаммов, резистентных к бета-лактамным антибиотикам и макролидам [Keating G.M., Scott L.J. Moxifloxacin A Review of its Use in the Management of Bacterial Infections // Drugs - 2004 - V. 64. - P. 2347-2377].

Применяется моксифлоксацин при инфекциях верхних и нижних дыхательных путей: остром синусите, обострениях хронического бронхита, внебольничной пневмонии; инфекциях кожи и мягких тканей.

Побочные эффекты у моксифлоксацина выражены редко, тем не менее иногда наблюдаются случаи тошноты, диареи и головокружения. Также необходимо отметить высокую (на порядок) стоимость моксифлоксацина в сравнении с фторхинолонами II поколения [Ball P., Stahlmann R., Kubin R., Choudhri S., Owens R. Safety profile of oral and intravenous moxifloxacin: Cumulative data from clinical trials and postmarketing studies // Clinical Therapeutics - 2004. - V. 26 - P. 940-950].

Исследование взаимоотношений структура-биологическая активность в ряду производных фторхинолонов выявило, что наибольшее влияние на их биологическое действие оказывает природа заместителя при атоме С-7. Наиболее часто в качестве таких заместителей оказываются пяти- и шестичленные азотсодержащие гетероциклы, такие как пиперазин, пиримидин, 1,2,3-триазол, пирролидин и их замещенные производные [Emamia S., Shafiee A., Foroumadi A. Quinolones: Recent Structural and Clinical Developments // Iran. J. Pharm. Res. - 2005. - V. - P. 123-136].

В статье [Gamal El-Din А.А. Abuo-Rahma, Н.А. Sarhan, Gamal F.M. Gad. Design, synthesis, antibacterial activity and physicochemical parameters of novel N-4-piperazinyl derivatives of norfloxacin // Bioorg. Med. Chem. - 2009. - V. 17 - P. 3879-3886] описаны производные норфлоксацина, модифицированные по атому азота пиперазинового кольца в реакции Манниха. Данные производные обладали существенно большей антибактериальной активностью по отношению к штаммам P. aeruginosa, Е. coli, K. pneumonia и S. aureus чем норфлоксацин.

В статье [J.С. McPherson III, R. Runner, Т.В. Buxton, J.F. Hartmann, D. Farcasiu, I. Bereczki, E. Roth, S. Tollas, E. , F. Rozgonyi, P. Herczegh. Synthesis of osteotropic hydroxybisphosphonate derivatives of fluoroquinolone antibacterials // Eur. J. Med. Chem. - 2012. - V. 47. - P. 615-618] предложено эффективное использование бисфонатов фторхинолонов, полученных модификацией пиперазинового атома азота, показывающее возможность направленной доставки антимикробных агентов для лечения инфекций костной ткани.

В патенте [US 2012322766. Use of oxazolidinone-quinoline hybrid antibiotics for the treatment of anthrax and other infections / Morphochem ag komb chemie - Опубл. - 20.12.2012] описаны «гибридные» фторхинолоны, модифицированные по атому С-7 хинолонового кольца фрагментами оксазалидинонов, эффективные в лечении сибирской язвы и других инфекционных заболеваний.

Следует обратить внимание на то, что существенным недостатком всех приведенных выше соединений является их высокая токсичность, которая не позволяет рассматривать их в качестве кандидатов в антибактериальные лекарственные средства.

Задачей заявленного технического решения является создание новых нетоксичных (безопасных) антибактериальных препаратов фторхинолонового ряда, обладающих высокой антибактериальной активностью, с целью расширения арсенала известных средств указанного назначения.

Техническим результатом заявленного технического решения является получение новых соединений общей формулы (I), содержащих в своем составе как фрагмент 4-дезоксипиридоксина, так и фрагмент антибактериального препарата фторхинолонового ряда.

Задача решается и указанный технический результат достигается получением заявленных новых соединений фторхинолонового ряда общей формулы (I):

согласно нижеприведенной схеме 1, где заявленные соединения обозначены номерами I-1 - I-4.

(a) N,N-Диметилформамид (далее - ДМФА), Ципрофлоксацин, KI, NaHCO₃, 60°С, 48 ч;

(b) ДМФА, H₂O, норфлоксацин гидрохлорид, KI, NaHCO₃, 70°С, 72 ч;

(c) ДМФА, H₂O, ломефлоксацин гидрохлорид, KI, NaHCO₃, 60°С, 72 ч;

(d) ДМФА, H₂O, моксифлоксацин гидрохлорид, KI, NaHCO₃, 80°С, 4 ч;

(e) Н₂О, HCl, 20°С.

Характеристики новых соединений, полученных в соответствии со схемой 1, приведены далее в примерах конкретного выполнения.

Структуры полученных соединений подтверждены методами масс-спектрометрии, ¹Н и ¹³С ЯМР-спектроскопии.

Спектры ЯМР регистрируют на приборе Bruker AVANCE-400. Химический сдвиг определяют относительно сигналов остаточных протонов дейтерированных растворителей (¹Н и ¹³С).

Температуры плавления определяют с помощью прибора Stanford Research Systems МРА-100 OptiMelt. Контроль за ходом реакций и чистотой соединений проводят методом ТСХ на пластинах Sorbfil Plates.

HRMS-эксперимент проводят с использованием масс-спектрометра TripleTOF 5600, АВ Sciex (Германия) из раствора в метаноле методом ионизации - турбоионный спрей (TIS) - при энергии столкновения с молекулами азота 10 еВ.

Примеры конкретного выполнения заявленного технического решения

Пример 1. Получение гидрохлорида 1-циклопропил-6-фтор-7-(4-((5-гидрокси-4,6-диметилпиридин-3-ил)метил)пиперазинил)-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты (I-1)

К раствору 8.12 г (39.0 ммоль) 3-гидрокси-5-хлорометил-2,4-диметилпиридиний хлорида 1 [Штырлин Н.В. Синтез и биологическая активность четвертичных фосфониевых солей на основе 3-гидроксипиридина и 4-дезоксипиридоксина [Текст] / Н.В. Штырлин, P.M. Вафина, М.В. Пугачев, P.M. Хазиев, Е.В. Никитина, М.И. Зелди, А.Г. Иксанова, Ю.Г. Штырлин // Известия Академии наук. Серия химическая - 2016. - N. 2. - С. 537-545] в 200 мл смеси вода-ДМФА 1:1 добавляют 12.49 г (33.9 ммоль) ципрофлоксацина гидрохлорида и 8.98 г (106.9 ммоль) гидрокарбоната натрия. По окончанию активного выделения газа (~2 минуты) добавляют 1.40 г (8.4 ммоль) йодистого калия. Полученный раствор перемешивают в течение 48 ч при плюс 60°С. По окончании перемешивания растворитель удаляют в вакууме. К сухому остатку добавляют 150 мл дистиллированной воды и кипятят 30 минут. Нерастворившийся осадок отфильтровывают и кипятят в 100 мл ацетона 30 минут. Раствор охлаждают до 30°С и отфильтровывают нерастворившийся осадок в вакууме.

Осадок переносят в круглодонную колбу на 100 мл, добавляют 50 мл дистиллированной воды и подкисляют концентрированной соляной кислотой до pH=2.56. Растворитель удаляют в вакууме. К сухому остатку добавляют 50 мл диметилформамида и перемешивают при 80°С на масляной бане 30 минут, после чего охлаждают до комнатной температуры. Нерастворившийся осадок отфильтровывают и высушивают в вакууме.

Сухой остаток переносят в круглодонную колбу на 100 мл, заливают 60 мл воды и при перемешивании нейтрализуют добавлением NaHCO₃ до pH=6.00. Выпавший осадок отфильтровывают, переносят в круглодонную колбу на 100 мл, добавляют 100 мл дистиллированной воды и подкисляют 4 мл концентрированной соляной кислоты. Выпавший осадок отфильтровывают, переносят в круглодонную колбу на 100 мл, заливают 60 мл воды и при перемешивании нейтрализуют добавлением NaHCO₃ до pH=6.00.

Выпавший осадок отфильтровывают, переносят в круглодонную колбу на 100 мл, добавляют 50 мл дистиллированной воды и подкисляют концентрированной соляной кислотой до pH=2.56. Раствор высушивают в вакууме. Далее кипятят в этаноле (на 1 г вещества берется 10 мл этанола) и порционно добавляют воду до полного растворения содержимого колбы. Выпавший осадок отфильтровывают, высушивают досуха. Выход соединения I-1 - 9.00 г (46%). Т.пл не ниже 190°С (разл.).

Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, ДМСО-d₆) δ, м.д.: 1.18-1.20 м (2Н, СН_{2циклопропил}), 1.30-1.31 м (2Н, СН_{2циклопропил}), 2.56 с (3Н, СН₃), 2.64 с (3Н, СН₃), 3.56 уш.с (4Н, 2СН_{2пиперазин}), 3.49-3.56 уш.с (4Н, 2СН_{2пиперазино} + СН_{циклопропил}), 4.63 с (2Н, CH₂N), 7.60 д (1Н, ⁴J_H-F=7.3 Гц, СН_ар), 7.97 д (1H, ³J_H-F=13.0 Гц, СН_ар), 8.68 с (1Н, СН_ар), 8.72 с (1H, СН_пир), 15.06 с (1Н, С(О)ОН).

Спектр ЯМР ¹³С (100 МГц, ДМСО-d₆) δ, м.д.: 7.62 с (2СН_{2циклопропил}), 14.24 с (СН₃), 15.29 c (СН₃), 35.97 c (СН_{циклопропил}), 46.12 c (2СН_{2пиперазино}), 50.57 с (2СН_{2пиперазино}), 52.78 с (СН₂), 106.85 с (С_ар), 106.87 с (С_ар), 111.21 д (²J_C-F=22.7 Гц, C_ap), 119.32 д (³J_C-F=7.6 Гц, С_ар), 126.24 с (С_ар), 135.06 с (C_ap), 139.08 с (С_ар), 144.55 с (C_ap), 143.66 д (²J_C-F=10.3 Гц, C_ap-N), 145.35 с (С_ар), 148.26 с (С_ар), 152.45 с (С_ар), 152.83 д (¹J_C-F=250.0 Гц, C_ap-F), 165.83 с (С(О)ОН), 176.38 с (C=O).

Масс-спектр (HRMS-ESI): Найдено [М-Cl]⁺ 467.2089, C₂₅H₂₈FN₄O₅. Вычислено [М-Cl]⁺ 467.2089.

Пример 2. Получение гидрохлорида 1-этил-6-фтор-7-(4-((5-гидлрокси-4,6-диметилпиридин-3-ил)метил)пиперазин-1-ил)-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты (I-2)

2.00 г (9.6 ммоль) соединения 1, 2.97 г (8.4 ммоль) норфлоксацина гидрохлорида, 2.21 г (26.3 ммоль) бикарбоната натрия и 0.35 г (2.1 ммоль) йодида калия растворяют в 100 мл смеси ДМФА-вода (9:1). Реакционную смесь перемешивают 72 часа при 70°С. Растворитель удаляют в вакууме, сухой остаток суспензируют в воде и кипятят. Нерастворимую часть отфильтровывают, суспензируют в ацетоне и кипятят. Остаток заливают водой и добавляют концентрированную соляную кислоту до гомогенизации раствора. Полученный раствор высушивают досуха и заливают ДМФА. Нерастворившуюся часть отделяют, растворяют в воде и добавляют эквимольное количество бикарбоната натрия. Выпавший осадок отфильтровывают, суспензируют в воде и добавляют, концентрированную соляную кислоту до гомогенизации раствора. Полученный раствор высушивают досуха. Выход соединения - I-2 1.80 г (47%), т.пл. 295-300°С (разл.).

Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, ДМСО-d₆) δ, м.д.: 1.41 т (3Н, ³J_H-H=6.9 Гц, СН₂СН3), 2.56 с (3Н, СН₃), 2.64 с (3Н, СН₃), 3.32-3.62 м (8Н, 4СН_{2пиперазин}), 4.61 с (2Н, CH₂N), 4.62 кв (2Н, ⁴J_H-F=6.9 Гц, СН2СН₃), 7.26 д (1Н, ⁴J_H-F=7.3 Гц, СН_ар), 7.97 д (1Н, ³J_H-F=12.2 Гц, CH_ap), 8.69 с (1H, CH_ap), 8.97 с (1Н, СН_пир).

Спектр ЯМР ¹³С (100 МГц, ДМСО-d₆) δ, м.д.: 14.28 с (СН₂СН3), 14.51 с (СН₃), 15.33 с (СН₃), 46.43 с (2СН_{2пиперазино}), 49.22 с (CH2CH₃), 50.52 с (2СН_{2пиперазино}), 52.89 с (CH₂N), 106.53 д (³J_C-F=2.1 Гц, С_ар), 107.22 с (C_ap), 111.53 д (²J_C-F=22.8 Гц, С_ар), 120.04 д (⁴J_C-F=7 Гц, С_ар), 137.20 с (С_ар), 141.49 с (С_ар), 144.00 уш.с (C_ap), 145.51 уш.с (С_ар), 148.84 с (С_ар), 152.73 с (С_ар), 153.38 д (⁴J_C-F=250.0 Гц, С_ар), 166.11 с (С(О)ОН), 176.27 с (C=O).

Масс-спектр (HRMS-ESI): Найдено [M-Cl]⁺ 455.2089, C₂₄H₂₈FN₄O₅. Вычислено [M-Cl]⁺ 455.2089.

Пример 3. Получение гидрохлорида 1-этил-6,8-дифтор-7-(4-((5-гидрокси-4,6-диметилпиридин-3-ил)метил)-3-метилпиперазин-1-ил)-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты (I-3)

0.50 г (2.4 ммоль) соединения 1, 0.81 г (2.1 ммоль) ломефлоксацина гидрохлорида, 0.55 г (6.6 ммоль) бикарбоната натрия и 0.07 г (0.4 ммоль) йодида калия растворяют в 60 мл смеси ДМФА-вода (9:1). Реакционную смесь перемешивают, например, 72 часа при 60°С. Растворитель удаляют в вакууме, сухой остаток суспензируют в воде и кипятят. Нерастворимую часть отфильтровывают, суспензируют в ацетоне и кипятят. Остаток заливают 5 мл воды, добавляют 2 мл концентрированной соляной кислоты, до выпадения осадка. Реакционную смесь упаривают досуха. Остаток перекристаллизовывают из смеси метанол-вода (10:1). Выпавший осадок отделяют, растворяют в воде и добавляют эквимольное количество бикарбоната натрия. Выпавший осадок отфильтровывают, суспензируют в воде и добавляют концентрированную соляную кислоту до гомогенизации раствора. Содержимое колбы высушивают досуха. Выход соединения I-3 - 0.15 г (14%), бежевое кристаллическое вещество, т.пл. 230-250°С (разл.).

Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, ДМСО-d₆) δ, м.д.: 1.45 т (3Н, ³J_H-H=6.9 Гц, СН₂СН3), 1.57 уш.с (3Н, СН_{3пиперазин}), 2.56 с (3Н, СН₃), 2.63 с (3Н, СН₃), 3.23-3.71 м (9Н, СН_{пиперазин} + 3СН_{2пиперазин} + CH₂N), 4.60 уш.с (2Н, CH2CH₃), 7.91 д (1Н, ³J_H-F=11.6 Гц, CH_ap), 8.71 уш.с (1Н, СН_ар), 8.95 с (1Н, СН_пир), 10.90 уш.с (1H, ОН).

Спектр ЯМР ¹³С (100 МГц, ДМСО-d₆), δ, м.д.: 14.18 с (СН₂СН3), 15.36 с (СН₃), 15.98 с (СН₃), 16.03 с (СН₃), 47.15 уш.с (СН_{2пиперазино}), 50.03 уш.с (СН_{2пиперазино}), 50.22 уш.с (СН_{пиперазино}), 53.72 с (СН₂), 53.87 с (СН₂), 107.02 с (C_ap), 107.18 с (С_ар), 107.23 д (⁴J_C-F=1.7 Гц, С_ар), 121.48 уш.с (С), 127.18 д (J_C-F=7 Гц, С_ар), 141.56 с (С_ар), 145.41 с (С_ар), 151.44 с (С_ар), 152.47 с (C_ap), 154.12 дд (¹J_C-F=253.03 Гц, ³J_C-F=3.8 Гц, С_ар), 165.51 с (С(О)ОН), 175.57 с (С=O).

Масс-спектр (HRMS-ESI): Найдено [M-Cl]⁺ 487.2151, C₂₅H₂₉F₂N₄O₄. Вычислено [М-Cl]⁺ 487.2151.

Пример 4. Получение гидрохлорида 1-циклопропил-6-фтор-7-((4aS,7aS)-1-((5-гидрокси-4,6-диметилпиридин-3-ил)метил)октагидро-6Н-пиррол[3,4-b]пиридин-6-ил)-8-метокси-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты (I-4)

16.30 г (78.3 ммоль) соединения 1, 29.7 г (68.1 ммоль) моксифлоксацина гидрохлорида, 18.00 г (214.6 ммоль) гидрокарбоната натрия и 2.26 г (13.6 ммоль) йодида калия растворяют в 500 мл смеси ДМФА-вода (9:1). Реакционную смесь перемешивают, например, 4 часа при 80°С. Растворитель удаляют в вакууме, сухой остаток суспензируют в воде и кипятят. Нерастворимую часть отфильтровывают, заливают водой и растворяют добавлением концентрированной соляной кислоты до гомогенизации раствора. Растворитель высушивают в вакууме. Сухой остаток промывают этанолом. Нерастворимую часть отделяют и высушивают досуха. Выход соединения I-4 - 19.50 г (50%), желтое кристаллическое вещество, т.пл. 230-250°С (разл.).

Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, ДМСО-d₆) δ, м.д.: 0.92-1.14 уш.м (4Н, 2СН_{2циклопропил}), 1.52 уш.с (1H, СН), 1.82 уш.с (3Н, СН₃), 2.50 с (3Н, СН₃), 2.60 с (3Н, СН₃), 3.16 уш.с (1H, СН_{циклопропил}), 3.30-3.58 уш.м (11Н, 2СН_{2пирролидин} + 2СН + 3СН_{2пиперазин}), 3.63 с (3Н, ОСН₃), 4.15 с (2Н, CH₂N), 4.51 уш.с (1H, ОН), 7.69 д (³J_C-F=13.8 Гц, СН_ар), 8.61 уш.с (1H, СН_ар), 8.67 с (1H, СН_ар).

Спектр ЯМР ¹³С (100 МГц, ДМСО-d₆), δ, м.д.: 7.61 с (СН₂), 13.15 с (СН₃), 14.96 с (СН₃), 14.33 с (СН₂), 19.48 с (СН₂), 19.98 с (СН₂), 20.03 с (СН₂), 21.61 с (СН), 34.23 с (СН), 39.74 с (ОСН₃), 51.57 с (СН₂), 60.91 уш.с (СН₂), 105.45 с (С_ар), 107.5 с (С_ар), 133.49 с (С_ар), 135.48 д (C_ap, ²J_C-F=10.58 Гц, C_ap-N), 140.42 с (С_ар), 149.48 с (С_ар), 151.43 с (С_ар), 164.89 с (С(О)ОН), 175.08 д (⁴J_C-F=2.3 Гц, С=O).

Масс-спектр (HRMS-ESI): Найдено [М-Cl]⁺ 537.2508, C₂₉H₃₄FN₄O₅. Вычислено [М-Cl]⁺ 537.2508.

Пример 5. Исследование антибактериальной активности заявленных соединений фторхинолонового ряда

Измерение антибактериальной активности заявленных соединений проводилось на штаммах Staphylococcus aureus АТСС 29213 (музейный штамм), Staphylococcus epidermidis (клинический изолят), Micrococcus luteus (клинический изолят), Bacillus subtilis 168 (музейный штамм), Escherichia coli АТСС 25922 (музейный штамм), Salmonella typhimurium ТА100 (музейный штамм). Сравнительная оценка спектра антибактериального действия на эталонных штаммах и клинических изолятах грамположительных микроорганизмов проводилась с использованием микрометода определения минимальной подавляющей концентрации (далее - МПК) методом серийных разведений в бульоне Мюллера-Хинтон с использованием 96-луночных стерильных планшетов.

Минимальной подавляющей концентрацией (МПК) принято считать первую наименьшую концентрацию антибиотика (из серии последовательных разведений), где визуально не определяется бактериальный рост [Methods for the determination of susceptibility of bacteria to antimicrobial agents. Terminology. EUCAST Definitive Document. January 1998 // Clin. Microb. Infect. 1998. - V. 4. - №5. - P. 291-296].

Для приготовления инокулюма (инфекционного материала, используемого для искусственного заражения), предназначенного для исследования антибактериальной активности, используют чистую, суточную культуру бактерий, выросших на плотной питательной среде (агаризованная среда LB). В стерильном изотоническом растворе хлорида натрия готовят взвесь микроорганизмов, доводя плотность инокулюма до 0.5 по стандарту МакФарланда (1.5⋅10⁸ КОЕ/мл). Затем полученный инокулят разводят до концентрации 10⁷ КОЕ/мл LB-бульоном. Инокулюм используют в течение 15 минут после приготовления; чистоту бактериальных штаммов контролируют перед каждым экспериментом.

В лунки каждого планшета вносят по 100 мкл бульона Мюллера-Хинтон; в первую лунку вносят испытуемое соединение в концентрации 128 мкг/мл в объеме 100 мкл и последовательным двукратным разведением доводят его концентрацию до 0.25 мкг/мл. Затем в каждую лунку вносят приготовленный инокулюм, разводя тем самым вдвое концентрацию изучаемых соединений (до 64.0 мкг/мл). Каждый препарат в эксперименте титруют трижды. В качестве контроля включают лунки, не содержащие тестируемых препаратов (контроль роста культуры). Кроме того, ставят контроль чистоты питательных сред и растворителей. Планшеты инкубируют в термостате при 36°С в течение, например, 24 часов.

Оценку роста культур проводят визуально, сравнивая рост микроорганизмов в присутствии изучаемых тестируемых соединений и рост культуры без тестируемых соединений.

В качестве препаратов сравнения используют широко применяемые известные антибактериальные средства фторхинолонового ряда - ципрофлоксацин, норфлоксацин, ломефлоксацин и моксифлоксацин. Также в качестве препарата сравнения заявителем использован так называемый «антибиотик последней надежды» ванкомицин.

Как видно из представленных в таблице 1 данных, все заявленные соединения обладают выраженной антибактериальной активностью по отношению ко всем исследуемым штаммам микроорганизмов. При этом в отношении грамположительных бактерий соединения I-1 - I-4 оказались, в зависимости от штамма, сопоставимы или в 2-16 раз более активны, чем препараты сравнения. В отношении грамотрицательных бактерий соединения I-1 - I-4 существенно более активны, чем ломефлоксацин и ванкомицин, и сопоставимы по активности с моксифлоксацином, ципрофлоксацином и норфлоксацином.

Пример 6. Исследование общей острой токсичности соединения I-4 на крысах при внутрижелудочном введении

Острую токсичность соединения I-4 исследовали по методу фиксированной дозы на крысах линии Wistar (ООО «Питомник РАМНТ») обоего пола, по 6 голов в группе самок и группе самцов. Начальная доза для исследования соединения I-4 - 2000 мг/кг. Использовали внутрижелудочное (пероральное) введение соединения I-4 животным (<2.5 мл/100 г) с применением желудочного зонда.

При введении дозы 2000 мг/кг соединения I-4 крысам обоего пола наблюдалось небольшое угнетение активности, вызванное механическим воздействием на животных. Через 20-30 минут поведение животных нормализовалось. Через 1.5-2,0 часа животные начинали принимать корм и воду. На 2 и 3 сутки наблюдения был зафиксирован падеж среди самок - одна самка пала на вторые, а другая - на третьи сутки (Таблица 2).

На протяжении всего эксперимента все основные показатели жизнедеятельности у подопытных животных соответствовали норме и не отличались от нормы. У крыс отмечался хороший аппетит, блестящая шерсть, видимые слизистые оболочки были бледно-розового цвета, поведение соответствовало данному виду животного, никаких отклонений при наблюдении выявлено не было.

В конце эксперимента проводили эвтаназию и патоморфологическое вскрытие контрольных и подопытных животных. При вскрытии крыс никаких патологий не наблюдалось. Трупы животных правильного телосложения, средней упитанности. Естественные отверстия: рот - закрыт, язык находится в ротовой полости, слизистая оболочка губ, десен бледно-розовые гладкие, блестящие. Носовые отверстия - слизистая бледно-розовая, сухая, истечений нет, проходимость хорошая. Ушные раковины без изменений, наружный слуховой проход чистый. Анус - закрыт, слизистая оболочка бледно-розовая. Шерсть удерживается хорошо, шерстный покров блестящий. Кожа эластичная, подкожная клетчатка хорошо выражена, желтоватого цвета, эластичная. Мышцы красноватого цвета, хорошо развиты, сухожилия и связки белого цвета, эластичные, прочные. Конфигурация костей и суставов не нарушена. Положение органов грудной и брюшной полостей: анатомически правильное. Жидкости в грудной и брюшной полостях нет. Проходимость глотки и пищевода не нарушена. Сердце в объеме не изменено. В полостях сердца содержится незначительное количество несвернувшейся крови, эндокард гладкий, блестящий. Легкие от бледно-розового до красного цвета, неравномерно окрашенные, дольчатость выражена хорошо. Селезенка не увеличена в объеме, края острые, продолговатой формы, упругой консистенции, красно-коричневого цвета. Печень не увеличена в размере, края острые, форма не изменена, консистенция плотная, цвет вишневый. Желудок заполнен кормовыми массами. Слизистая оболочка желудка не гиперемирована, без кровоизлияний. Слизистая оболочка тонкого и толстого отделов кишечника без изменений. Почки бобовидной формы, темно-коричневого цвета, в околопочечной клетчатке содержится умеренное количество жира, капсула отделяется легко, граница между корковой и мозговой зонами выражена. Мочевой пузырь пустой или переполнен мочой светло-желтого цвета, слизистая оболочка бледно-розового цвета. Половые органы без отклонений. У самцов семенники упругой консистенции, находятся в полости мошонки, имеют эллиптическую форму. У самок яичники и матка в норме. Головной мозг не отечен, мозговое вещество упругой консистенции, без кровоизлияний.

Среднесмертельная доза (ЛД₅₀) для соединения I-4 на крысах выявлена не была, поскольку при введении соединения I-4 в дозе 2000 мг/кг не наблюдалось 50% гибели животных. Таким образом, проведенные исследования показали, что соединение I-4 при внутрижелудочном введении в дозе 2000 мг/кг не вызывает никаких отклонений в основных показателях жизнедеятельности крыс и существенно менее токсично (минимум в 1.5 раза), чем моксифлоксацин, для которого величина ЛД₅₀ на крысах при внутрижелудочном введении составляет 1320 мг/кг, причем для моксифлоксацина наблюдались ряд побочных эффектов, таких как, нарушение двигательных функций, одышка, понос [Е. von Keutz, G. . Preclinical safety evaluation of moxifloxacin, a novel fluoroquinolone // J. Antimicrob. Chemother. - 1999 - V. 43 - P. 91-100].

Таким образом, из описанных выше примеров конкретного осуществления заявленного технического решения можно сделать вывод, что заявителем получены новые фторхинолоны на основе 4-дезоксипиридоксина, обладающие высокой антибактериальной активностью и низкой токсичностью.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из исследованного уровня техники не выявлены технические решения, обладающие заявленной совокупностью отличительных признаков, обеспечивающих достижение заявленных технических результатов.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, так как не является очевидным для специалиста в данной области науки и техники.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», т.к. может быть реализовано на любом специализированном предприятии с использованием стандартного оборудования, известных отечественных материалов и технологий.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к новым производным фторхинолона общей формулы (I), где R₁ = ; R₂ = H; R₃ = ; или R₁ = C₂H₅; R₂ = H; R₃ = ; или R₁ = C₂H₅; R₂ = F; R₃ = ; или R₁ = ; R₂ = OCH₃; R₃ = . Технический результат: получены новые производные фторхинолона, обладающие антибактериальной активностью. 2 табл., 6 пр.

Соединения фторхинолонового ряда общей формулы (I), обладающие антибактериальной активностью,

,

где R₁ = ; R₂ = H; R₃ = ,

R₁ = C₂H₅; R₂ = H; R₃ = ,

R₁ = C₂H₅; R₂ = F; R₃ = ,

R₁ = ; R₂ = OCH₃; R₃ = .