Способ определения кофеина в биологическом материале Российский патент 2017 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к биологии, токсикологической и аналитической химии, а именно к способам определения кофеина в биологическом материале, и может быть использовано в практике химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и клинических лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения кофеина в биологической жидкости (растворе альбумина), состоящий в том, что анализируемую пробу обрабатывают раствором пепсина в растворе хлороводородной кислоты, доводят реакцию среды полученной смеси до pH 4, инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа, экстрагируют трижды хлороформом при соотношении объемов водной и органической фаз 1:1, экстракты объединяют, остаток растворяют в фосфатном буфере с pH 7,4, полученный раствор фильтруют и определяют количество извлеченного производного пурина спектрофотометрическим методом по величине оптической плотности фильтрата, измеренной при длине волны 273 нм (Стрелова О.Ю., Чувина Н.А. Изолирование кофеина из крови с применением ферментативного гидролиза на примере модельного вещества // Судебно-медицинская экспертиза. - 2008. - Т. 51, №4. - С. 28-31).

Способ отличается недостаточно высокими чувствительностью и селективностью определения.

Известен способ определения кофеина в биологической жидкости (крови), заключающийся в том, что анализируемую пробу обрабатывают сульфатом аммония, выдерживают в течение 30 минут при перемешивании, раствор центрифугируют при 3000 оборотах в минуту, центрифугат отделяют, доводят его реакцию до pH 4,0-5,0, экстрагируют трижды хлороформом при соотношении водной и органической фаз на каждой стадии экстракции 1:1, экстракты объединяют, экстрагент испаряют, остаток растворяют в фосфатном буфере с pH 7,4, полученный раствор фильтруют и определяют количество извлеченного вещества по величине оптической плотности, измеренной при длине волны 273 нм (Стрелова О.Ю., Чувина Н.А. Оценка эффективности методов изолирования токсических веществ из крови // Судебно-медицинская экспертиза. - 2008. - Т. 51, №3. - С. 22-24).

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью.

Наиболее близким является способ определения кофеина в биологическом материале (плазме крови), заключающийся в том, что биологический материал однократно обрабатывают ацетоном, жидкое извлечение отделяют фильтрованием, упаривают в токе воздуха при комнатной температуре, водный остаток разбавляют водой, насыщают сульфатом аммония, доводят pH среды до 4,2-4,5, однократно экстрагируют смесью органических растворителей этилацетата и хлороформа, взятых в объемном отношении 2:8, в условиях, когда объем водной фазы в 5 раз превышает объем смеси органических растворителей, органический экстракт отделяют, хроматографируют в тонком слое гидроксилированного сорбента СТХ-1 на пластинах «Сорбфил», применяя подвижную фазу гексан - ацетон - 25%-ный раствор аммиака в соотношениях 30:30:1 по объему, хроматограмму проявляют в УФ-свете, анализируемое вещество элюируют из сорбента хлороформом и проводят определение физико-химическим методом, которым является спектрофотометрия, вычисляя количественное содержание кофеина по величине оптической плотности хлороформного элюата, измеряемой при длине волны 276 нм (Коренман Я.И., Шорманов В.К., Мокшина Н.Я., Кривошеева О.А., Голубицкий Г.Б. Выделение, экстракционное концентрирование и определение кофеина при исследовании плазмы крови // Судебно-медицинская экспертиза. - 2012. -Т. 55, №2. - С. 32-35).

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью определения.

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение чувствительности определения.

Технический результат достигается тем, что биологический материал неоднократно дважды по 30 минут обрабатывают ацетоном, каждое жидкое извлечение отделяют фильтрованием, отдельные извлечения объединяют, упаривают в токе воздуха при комнатной температуре, водный остаток разбавляют водой, насыщают сульфатом аммония, доводят pH среды до 4,2-4,5, однократно экстрагируют смесью органических растворителей этилацетата и хлороформа, взятых в объемном отношении 2:8, в условиях, когда объем водной фазы равен объему смеси органических растворителей, органический экстракт отделяют, растворители испаряют из экстракта до получения сухого остатка, остаток растворяют в смеси растворителей пропанол-2 - хлороформ, взятых в соотношении 5:5 по объему, хроматографируют в макроколонке силикагеля L 40/100 мкм с использованием подвижной фазы пропанол-2 - хлороформ в соотношении 5:5 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С, затем в токе азота до полного удаления растворителей, остаток растворяют в дихлорметане и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия, с применением капиллярной колонки длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой 5% фенил - метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 0,7 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 80°С, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура программируется вначале от 80°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, затем от 200°С до 300°С со скоростью 12,5°С в минуту, температура инжектора составляет 200°С, температура интерфейса детектора - 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току, по результатам измерений на хромато-масс-спектрометре строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества, методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид: S=5238700⋅С+43091, где S - площадь хроматографического пика, а С - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, мкг, и вычисляют количество кофеина по площади хроматографического пика.

Способ осуществляется следующим образом: биологический материал, содержащий кофеин, неоднократно дважды по 30 минут обрабатывают ацетоном, каждое жидкое извлечение отделяют фильтрованием, отдельные извлечения объединяют, упаривают в токе воздуха при комнатной температуре, водный остаток разбавляют водой, насыщают сульфатом аммония, доводят pH среды до 4,2-4,5, однократно экстрагируют смесью органических растворителей этилацетата и хлороформа, взятых в объемном отношении 2:8, в условиях, когда объем водной фазы равен объему смеси органических растворителей, органический экстракт отделяют, растворители испаряют из экстракта до получения сухого остатка, остаток растворяют в смеси растворителей пропанол-2 - хлороформ, взятых в соотношении 5:5 по объему, хроматографируют в макроколонке силикагеля L 40/100 мкм с использованием подвижной фазы пропанол-2 - хлороформ в соотношении 5:5 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С, затем в токе азота до полного удаления растворителей, остаток растворяют в дихлорметане и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия, с применением капиллярной колонки длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой 5% фенил - метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 0,7 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 80°С, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура программируется вначале от 80°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, затем от 200°С до 300°С со скоростью 12,5°С в минуту, температура инжектора составляет 200°С, температура интерфейса детектора - 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току, по результатам измерений на хромато-масс-спектрометре строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества, методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид: S=5238700⋅С+43091, где S - площадь хроматографического пика, а С - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, мкг, и вычисляют количество кофеина по площади хроматографического пика.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Определение кофеина в плазме крови

К 10 г плазмы крови человека прибавляют 1,00 мг кофеина, тщательно перемешивают биологический материал с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°С. По истечении указанного времени биологический материал дважды по 30 минут обрабатывают при перемешивании порциями ацетона по 20 г каждая. Каждое жидкое извлечение отделяют от твердых частиц биологического материала фильтрованием через бумажный фильтр, который затем дополнительно промывают 10 г ацетона. Обе порции фильтрата и промывную жидкость объединяют и упаривают в токе воздуха при комнатной (18-22°С) температуре, удаляя ацетон и часть воды, до объема 2-3 мл. Водный остаток разбавляют водой до 5 мл, прибавляют 4 мл буферного раствора с pH 4,5, насыщают полученный раствор сульфатам аммония, доводят pH среды раствора универсальным буфером до 4,2-4,5, однократно экстрагируют в течение 10 минут смесью органических растворителей этилацетата и хлороформа, взятых в объемном отношении 2:8, в условиях, когда объем водной фазы равен объему смеси органических растворителей. Органический экстракт отделяют, растворители испаряют из экстракта в токе воздуха при комнатной (18-22°С) температуре до получения сухого остатка, остаток растворяют в 2-3 мл смеси растворителей пропанол-2 - хлороформ, взятых в соотношении 5:5 по объему, полученный раствор вносят в хроматографическую макроколонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 мкм. Хроматографируют, используя подвижную фазу пропанол-2 - хлороформ в соотношении 5:5 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции элюата, с 8 по 10 включительно, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С, затем в токе азота до полного удаления растворителей, остаток растворяют в 5 мл дихлорметана и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия.

В процессе определения 4 мкл дихлорметанового раствора вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют с применением капиллярной колонки длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой 5% фенил - метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 0,7 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 80°С, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура программируется вначале от 80°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, затем от 200°С до 300°С со скоростью 12,5°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 10 минут, температура инжектора составляет 200°С, температура интерфейса детектора - 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току с задержкой 2,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 7,88 мин соответствует кофеину. В масс-спектре данного соединения, снятом по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 42, 55, 67, 82, 94, 109, 136, 149, 165, 194. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 194, интенсивность которой принимается за 100%.

Кофеин идентифицируют по сочетанию времени удерживания в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание кофеина, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Построение градуировочного графика

В ряд мерных колб вместимостью 25 мл вносят 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,25, 2,5 и 5,0 мл 1,25% раствора кофеина в дихлорметане и доводят объем содержимого каждой колбы до метки дихлорметаном.

4 мкл каждого из полученных растворов вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют с применением капиллярной колонки длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой 5% фенил - метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 0,7 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 80°С, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура программируется вначале от 80°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, затем от 200°С до 300°С со скоростью 12,5°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 10 минут, температура инжектора составляет 200°С, температура интерфейса детектора - 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току с задержкой 2,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

Исходя из площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, вычисляют количество кофеина.

По результатам измерений на хромато-масс-спектрометре строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 5,0⋅10^-8-1,0⋅10^-5 г.

Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид:

S=5238700⋅C+43091,

где S - площадь хроматографического пика; С - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, мкг.

Результаты количественного определения кофеина в плазме крови представлены в таблице 1.

Пример 2

Определение кофеина в крови

К 10 г крови человека прибавляют 1,00 мг кофеина, тщательно перемешивают биологический материал с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°С. По истечении указанного времени биологический материал дважды по 30 минут обрабатывают при перемешивании порциями ацетона по 20 г каждая. Каждое жидкое извлечение отделяют от твердых частиц биологического материала фильтрованием через бумажный фильтр, который затем дополнительно промывают 10 г ацетона. Обе порции фильтрата и промывную жидкость объединяют и упаривают в токе воздуха при комнатной (18-22°С) температуре, удаляя ацетон и часть воды, до объема 2-3 мл. Водный остаток разбавляют водой до 5 мл, прибавляют 4 мл буферного раствора с pH 4,5, насыщают полученный раствор сульфатам аммония, доводят pH среды раствора универсальным буфером до 4,2-4,5, однократно экстрагируют в течение 10 минут смесью органических растворителей этилацетата и хлороформа, взятых в объемном отношении 2:8, в условиях, когда объем водной фазы равен объему смеси органических растворителей. Органический экстракт отделяют, растворители испаряют из экстракта в токе воздуха при комнатной (18-22°С) температуре до получения сухого остатка, остаток растворяют в 2-3 мл смеси растворителей пропанол-2 - хлороформ, взятых в соотношении 5:5 по объему, полученный раствор вносят в хроматографическую макроколонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 мкм. Хроматографируют, используя подвижную фазу пропанол-2 - хлороформ в соотношении 5:5 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции элюата, с 8 по 10 включительно, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С, затем в токе азота до полного удаления растворителей, остаток растворяют в 5 мл дихлорметана и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия.

В процессе определения 4 мкл дихлорметанового раствора вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют с применением капиллярной колонки длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой 5% фенил - метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 0,7 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 80°С, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура программируется вначале от 80°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, затем от 200°С до 300°С со скоростью 12,5°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 10 минут, температура инжектора составляет 200°С, температура интерфейса детектора - 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току с задержкой 2,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 7,88 мин соответствует кофеину. В масс-спектре данного соединения, снятом по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 42, 55, 67, 82, 94, 109, 136, 149, 165, 194. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 194, интенсивность которой принимается за 100%.

Кофеин идентифицируют по сочетанию времени удерживания в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание кофеина, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Построение градуировочного графика

Построение градуировочного графика и его уравнение приводятся в примере 1.

Результаты количественного определения кофеина в крови представлены в таблице 2.

Пример 3

Определение кофеина в ткани печени

К 10 г измельченной (до размеров частиц 0,2-0,5 мм) ткани печени прибавляют 1,00 мг кофеина, тщательно перемешивают биологический материал с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°С. По истечении указанного времени биологический материал дважды по 30 минут обрабатывают при перемешивании порциями ацетона по 20 г каждая. Каждое жидкое извлечение отделяют от твердых частиц биологического материала фильтрованием через бумажный фильтр, который затем дополнительно промывают 10 г ацетона. Обе порции фильтрата и промывную жидкость объединяют и упаривают в токе воздуха при комнатной (18-22°С) температуре, удаляя ацетон и часть воды, до объема 2-3 мл. Водный остаток разбавляют водой до 5 мл, прибавляют 4 мл буферного раствора с pH 4,5, насыщают полученный раствор сульфатам аммония, доводят pH среды раствора универсальным буфером до 4,2-4,5, однократно экстрагируют в течение 10 минут смесью органических растворителей этилацетата и хлороформа, взятых в объемном отношении 2:8, в условиях, когда объем водной фазы равен объему смеси органических растворителей. Органический экстракт отделяют, растворители испаряют из экстракта в токе воздуха при комнатной (18-22°С) температуре до получения сухого остатка, остаток растворяют в 2-3 мл смеси растворителей пропанол-2 - хлороформ, взятых в соотношении 5:5 по объему, полученный раствор вносят в хроматографическую макроколонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 мкм. Хроматографируют, используя подвижную фазу пропанол-2 - хлороформ в соотношении 5:5 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции элюата, с 8 по 10 включительно, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С, затем в токе азота до полного удаления растворителей, остаток растворяют в 5 мл дихлорметана и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия.

В процессе определения 4 мкл дихлорметанового раствора вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют с применением капиллярной колонки длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой 5% фенил - метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 0,7 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 80°С, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура программируется вначале от 80°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, затем от 200°С до 300°С со скоростью 12,5°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 10 минут, температура инжектора составляет 200°С, температура интерфейса детектора - 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току с задержкой 2,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 7,88 мин соответствует кофеину. В масс-спектре данного соединения, снятом по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 42, 55, 67, 82, 94, 109, 136, 149, 165, 194. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 194, интенсивность которой принимается за 100%.

Кофеин идентифицируют по сочетанию времени удерживания в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание кофеина, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Построение градуировочного графика

Построение градуировочного графика и его уравнение приводятся в примере 1.

Результаты количественного определения кофеина в ткани печени представлены в таблице 3.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 200 раз повышает чувствительность определения в детектируемой пробе и в 2 раза - в биологическом материале.

Сравнительные характеристики предлагаемого и известного способов представлены в таблице 4.

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии и касается способа определения кофеина в биологическом материале. Способ заключается в том, что биологический материал обрабатывают ацетоном, жидкое извлечение отделяют фильтрованием, упаривают в токе воздуха при комнатной температуре, водный остаток разбавляют водой, насыщают сульфатом аммония, доводят pH среды до 4,2-4,5, однократно экстрагируют смесью органических растворителей этилацетата и хлороформа, взятых в объемном отношении 2:8, органический экстракт отделяют, хроматографируют и проводят определение физико-химическим методом, вычисляя количественное содержание анализируемого вещества, и отличается тем, что обработку биологического объекта ацетоном осуществляют неоднократно дважды по 30 минут, экстрагируют в условиях, когда объем водной фазы равен объему смеси органических растворителей, перед хроматографированием растворители испаряют из экстракта до получения сухого остатка, остаток растворяют в смеси растворителей пропанол-2 - хлороформ, взятых в соотношении 5:5 по объему, хроматографируют в макроколонке силикагеля L 40/100 мкм с использованием подвижной фазы пропанол-2 - хлороформ в соотношении 5:5 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С, затем в токе азота до полного удаления растворителей, остаток растворяют в дихлорметане, в качестве физико-химического метода используют хромато-масс-спектрометрию, определение проводят в капиллярной колонке длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой 5% фенил - метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 0,7 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 80°С, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура программируется вначале от 80°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, затем от 200°С до 300°С со скоростью 12,5°С в минуту, температура инжектора составляет 200°С, температура интерфейса детектора - 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току, по результатам измерений на хромато-масс-спектрометре строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества, методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид: S=5238700⋅С+43091, где S - площадь хроматографического пика, а С - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, мкг, и вычисляют количество кофеина по площади хроматографического пика. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности определения кофеина в биологическом материале. 4 табл., 3 пр.

Способ определения кофеина в биологическом материале, заключающийся в том, что биологический материал обрабатывают ацетоном, жидкое извлечение отделяют фильтрованием, упаривают в токе воздуха при комнатной температуре, водный остаток разбавляют водой, насыщают сульфатом аммония, доводят pH среды до 4,2-4,5, однократно экстрагируют смесью органических растворителей этилацетата и хлороформа, взятых в объемном отношении 2:8, органический экстракт отделяют, хроматографируют и проводят определение физико-химическим методом, вычисляя количественное содержание анализируемого вещества, отличающийся тем, что обработку биологического объекта ацетоном осуществляют неоднократно дважды по 30 минут, экстрагируют в условиях, когда объем водной фазы равен объему смеси органических растворителей, перед хроматографированием растворители испаряют из экстракта до получения сухого остатка, остаток растворяют в смеси растворителей пропанол-2 - хлороформ, взятых в соотношении 5:5 по объему, хроматографируют в макроколонке силикагеля L 40/100 мкм с использованием подвижной фазы пропанол-2 - хлороформ в соотношении 5:5 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С, затем в токе азота до полного удаления растворителей, остаток растворяют в дихлорметане, в качестве физико-химического метода используют хромато-масс-спектрометрию, определение проводят в капиллярной колонке длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой 5% фенил - метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 0,7 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 80°С, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура программируется вначале от 80°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, затем от 200°С до 300°С со скоростью 12,5°С в минуту, температура инжектора составляет 200°С, температура интерфейса детектора - 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току, по результатам измерений на хромато-масс-спектрометре строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества, методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид: S=5238700⋅С+43091, где S - площадь хроматографического пика, а С - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, мкг, и вычисляют количество кофеина по площади хроматографического пика.