Изобретение относится к биологии и токсикологической химии, а именно к способам определения нифедипина в биологическом материале, и может быть использована в практике химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и клинических лабораторий. Способ относится к числу массовых.
Известен способ определения нифедипина биологическом материале (крови), который заключается в том что биологический объект обрабатывают при перемешивании дважды по 30 минут порциями хлороформа. объём каждой из которых в два раза превышает объем биологического объекта, полученные хлороформные излечение объединяют, в 4-5 раз упаривают при комнатной температуре в токе воздуха, доводят до определённого объёма хлороформом, часть хлороформного раствора хроматографируют в тонком слое на пластине «Сорбфил» UV-254 с обращенной фазой, применяя элюент ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объёму, в присутствии вещества-свидетеля, анализируемое вещество элюируют из сорбента хлороформом, оптическую плотность хлороформного элюата измеряют при длине волны 243 нм, а содержание нифедипина рассчитывают по величине оптической плотности (Квачахия Л.Л., Шорманов В.К. Идентификация нифедипина в биологических жидкостях // Фармация. - 2013. - № 8. - С. 16-19.
Способ характеризуется недостаточно высокими чувствительностью и селективностью.
Известен способ определения нифедипина биологическом материале, заключающиеся в том, что биологический объект измельчают, двукратно по 30 минут обрабатывает порциями органического изолирующего агента, которым является этилацетат, при условии, что масса каждой порции изолирующего агента в два раза превышает массу биологического объекта, полученные органические излечение объединяют, растворитель из объединённого излечения испаряют в токе воздуха, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-буферный раствор с рН 3 в отношении 6:4 по объёму, хроматографируют в макроколонке с сорбентом «Силасорб С-18» 30 μ, элюируя смесью растворителей вцетонитрил-буферный раствор с рН 3 в отношении 6:4 по объёму, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 в отношении 15:5:1 по объему и проводят определение методом ВЭЖХ в аналитической колонке размерами 64×2 мм, заполненной сорбентом «Силасорб 600», с применением подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 в отношении 15:5:1 по объему, подаваемой со скоростью 100 мкл/мин, и УФ-детектора, регистрирующего оптическую плотность при 280 нм (Шорманов В.К., Квачахия Л.Л., Маркелов М.Ю., Конарева Е.Г. Определение нифедипина в биологическом материале // Судебно-медицинская экспертиза. - 2011. - Т. 54, № 4. - С. 31-34).
Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью определения.
Наиболее близким является способ определения нифедипина в биологическом материале, заключающийся в том, что биологический объект измельчают, двукратно по 30 минут обрабатывают порциями органического изолирующего агента, которым является ацетон, полученные органические извлечения объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей ацетон-вода в отношении 7:3 по объему, хроматографируют в макроколонке с сорбентом «Силасорб С-18» 30 μ, используя двухкомпонентную подвижную фазу ацетон-вода в отношении 7:3 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил- фосфатный буферный раствор с рН 9 в отношении 5:5 по объему и проводят определение физико-химическим методом, в качестве которого используется ВЭЖХ, хроматографируя в аналитической колонке Hibar размерами 150×4,6 мм, содержащей неподвижную фазу Purospher STAR RP-18 endcapped, с применением жидкой подвижной фазы ацетонитрил-фосфатный буферный раствор с рН 9 в отношении 5:5 по объему, подаваемой со скоростью 1000 мкл/мин, и детектора, которым является УФ-спектрофотометр, регистрирующего оптическую плотность при 250 нм. (Пат. 2686741RU. G01N33/00 (2019.02); G01N33/48 (2019.02). Способ определения нифедипина в биологическом материале / Шорманов В.К., Квачахия Л.Л.; заявитель и патентообладатель: федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU). - № 2018120858; заявл. 05.06.2018; опубл. 30.04.2019, Бюл. № 13. - 11 с.).
Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью определения.
Техническим результатом настоящего изобретения является повышение чувствительности определения.
Технический результат достигается тем, что биологический объект измельчают, двукратно по 30 минут обрабатывают порциями органического изолирующего агента, которым является смесь ацетон-ацетонитрил в отношении 7,5:2,5 по объему, полученные органические извлечения объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объему, хроматографируют в макроколонке с сорбентом «Силасорб С-18» 30 μ, используя двухкомпонентную подвижную фазу ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в метаноле и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия, в капиллярной колонке НР-5 ms Ultra inert длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой, представляющей собой (5%-фенил)диметилполисилоксан при толщине плёнки неподвижной фазы 0,25 мкм, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1,0 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, затем с 200°С до 290°С со скоростью 12,5°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 290°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество нифедипина по площади хроматографического пика.
Способ осуществляется следующим образом: биологический объект, содержащий нифедипин, измельчают, двукратно по 30 минут обрабатывают порциями органического изолирующего агента, которым является смесь ацетон-ацетонитрил в отношении 7,5:2,5 по объему, полученные органические извлечения объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объему, хроматографируют в макроколонке с сорбентом «Силасорб С-18» 30 μ, используя двухкомпонентную подвижную фазу ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в метаноле и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия, в капиллярной колонке НР-5 ms Ultra inert длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой, представляющей собой (5%-фенил)диметилполисилоксан при толщине плёнки неподвижной фазы 0,25 мкм, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1,0 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, затем с 200°С до 290°С со скоростью 12,5°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 290°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество нифедипина по площади хроматографического пика.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
Определение нифедипина (1,4-дигидро-2,6-диме-тил-4-(2-нитрофенил)-3,5-пиридинди карбоновой кислоты диметилового эфира) в ткани печени
К 10 г измельчённой до размеров частиц 0,2-0,5 мм ткани печени прибавляют 10 мг нифедипина, тщательно перемешивают биологический объект с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°С. По истечении указанного времени биологический объект двукратно по 30 минут обрабатывают порциями органического изолирующего агента, которым является смесь ацетон-ацетонитрил в отношении 7,5:2,5 по объему, при условии, что масса каждой порции изолирующего агента в 2 раза превышает массу биологического объекта. При этом биологический объект заливают 20 г смеси ацетон-ацетонитрил в отношении 7,5:2,5 по объему и выдерживают 30 минут при периодическом перемешивании. Извлечение отделяют от твёрдых частиц биоматериала, операцию настаивания повторяют в указанных условиях.
Полученные органические извлечения объединяют, растворитель из объединённого извлечения испаряют в токе воздуха, остаток неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают порциями ацетона по 15 мл каждая при энергичном перемешивании, извлечения отделяют, объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объёму путём обработки остатка 2,4 мл ацетонитрила и последующего прибавления к ацетонитрильному раствору 1,6 мл воды. Полученный раствор вносят в хроматографическую макроколонку размерами 490×11 мм, заполненную 7,5 г сорбента «Силасорб С-18» 30 μ и предварительно промытую смесью растворителей ацетонитрил-вода в соотношении 6:4 по объёму. Хроматографируют, элюируя даухкомпонентной подвижной фазой ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объёму. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая.
Фракции элюата с 6 по 8 включительно, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С. Остаток растворяют в 10 мл метанола (раствор А). 0,5 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят метанолом до метки (раствор Б) и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия.
В процессе определения 4 мкл раствора Б вводят в хромато-масс-спектрометр.
Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы «Agilent Technologies» (США) модели 7890В GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5977А этой же фирмы.
Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке НР-5 ms Ultra Inert длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой, представляющей собой (5%-фенил)метилполисилоксан, при толщине плёнки неподвижной фазы 0,25 мкм.
Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, затем с 200°С до 290°С со скоростью 12,5°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 290°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество нифедипина по площади хроматографического пика.
В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1 мл/мин. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,9 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-400 m/z.
Пик на хроматограмме с временем удерживания 12,55 мин соответствует нифедипину. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 42, 77, 127, 168, 224, 254, 284, 329, 355. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 284, интенсивность которой принимается за 100 %.
Нифедипин идентифицируют по сочетанию времени удерживания в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.
По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание нифедипина, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесённую в биологический материал.
Построение градуировочного графика
В ряд мерных колб вместимостью 25 мл вносят 0,02, 0,04, 0,06, 0,2, 0,8 мл 0,00125% раствора и 0,2, 0,6. 1.0, 1,6, 2,0 и 2,5 мл 0,025% раствора нифедипина в метаноле и доводят объём содержимого каждой колбы до метки метанолом.
4 мкл каждого из полученных растворов вводят в хромато-масс-спектрометр.
Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы «Agilent Technologies» (США) модели 7890В GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5977А этой же фирмы.
Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке НР-5 ms Ultra Inert длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой, представляющей собой (5%-фенил)метилполисилоксан, при толщине плёнки неподвижной фазы 0,25 мкм.
Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, затем с 200°С до 290°С со скоростью 12,5°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 290°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество нифедипина по площади хроматографического пика.
В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1 мл/мин. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,9 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-400 m/z.
По результатам измерений на хромато-масс-спектрометре строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 4⋅10-11 - 1,0⋅10-7 г.
Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид:
S=18252936⋅C +29749,
где S - площадь хроматографического пика; C- концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, нг.
Результаты количественного определения нифедипина в ткани печени представлены в таблице 1.
Результаты определения нифедипина в ткани печени (n=5; p=0,95)
в 10 г
ткани печени
характеристики,
%
пика на хроматограмме,
усл. ед.
в хроматографируемой пробе
в пересчёте
на навеску, внесённую
в биомате
риал
от внесён
ной в биоматериал
навески
= 87,42 = 1,35 = 3,76
= 4,30
Пример 2
Определение нифедипина (1,4-дигидро-2,6-диме-тил-4-(2-нитрофенил)-3,5-пиридиндикарбоновой кислоты диметилового эфира) в ткани желудка
К 10 г измельчённой до размеров частиц 0,2-0,5 мм ткани желудка прибавляют 10 мг нифедипина, тщательно перемешивают биологический объект с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°С. По истечении указанного времени биологический объект двукратно по 30 минут обрабатывают порциями органического изолирующего агента, которым является смесь ацетон-ацетонитрил в отношении 7,5:2,5 по объему, при условии, что масса каждой порции изолирующего агента в 2 раза превышает массу биологического объекта. При этом биологический объект заливают 20 г смеси ацетон-ацетонитрил в отношении 7,5:2,5 по объему и выдерживают 30 минут при периодическом перемешивании. Извлечение отделяют от твёрдых частиц биоматериала, операцию настаивания повторяют в указанных условиях.
Полученные органические извлечения объединяют, растворитель из объединённого извлечения испаряют в токе воздуха, остаток неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают порциями ацетона по 15 мл каждая при энергичном перемешивании, извлечения отделяют, объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объёму путём обработки остатка 2,4 мл ацетонитрила и последующего прибавления к ацетонитрильному раствору 1,6 мл воды. Полученный раствор вносят в хроматографическую макроколонку размерами 490×11 мм, заполненную 7,5 г сорбента «Силасорб С-18» 30 μ и предварительно промытую смесью растворителей ацетонитрил-вода в соотношении 6:4 по объёму. Хроматографируют, элюируя даухкомпонентной подвижной фазой ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объёму. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая.
Фракции элюата с 6 по 8 включительно, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С. Остаток растворяют в 10 мл метанола (раствор А). 0,5 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят метанолом до метки (раствор Б) и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия.
В процессе определения 4 мкл раствора Б вводят в хромато-масс-спектрометр.
Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы «Agilent Technologies» (США) модели 7890В GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5977А этой же фирмы.
Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке НР-5 ms Ultra Inert длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой, представляющей собой (5%-фенил)метилполисилоксан, при толщине плёнки неподвижной фазы 0,25 мкм.
Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, затем с 200°С до 290°С со скоростью 12,5°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 290°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество нифедипина по площади хроматографического пика.
В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1 мл/мин. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,9 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-400 m/z.
Пик на хроматограмме с временем удерживания 12,55 мин соответствует нифедипину. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 42, 77, 127, 168, 224, 254, 284, 329, 355. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 284, интенсивность которой принимается за 100 %.
Нифедипин идентифицируют по сочетанию времени удерживания в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.
По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание нифедипина, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесённую в биологический материал.
Построение градуировочного графика и его уравнение приводятся выше в примере 1.
Результаты количественного определения нифедипина в ткани желудка представлены в таблице 2.
Результаты определения нифедипина в ткани желудка (n=5; p=0,95)
в 10 г ткани желудка
характеристики,
%
пика на хроматограмме,
усл. ед.
в хроматографируемой пробе
в пересчёте
на навеску, внесённую
в биомате
риал
от внесён
ной в биоматериал
навески = 88,86 = 1,25 = 3,47= 3,91
Пример 3
Определение нифедипина (1,4-дигидро-2,6-диме-тил-4-(2-нитрофенил)-3,5-пиридиндикарбоновой кислоты диметилового эфира) в ткани селезёнки
К 10 г измельчённой до размеров частиц 0,2-0,5 мм ткани селезёнки прибавляют 10 мг нифедипина, тщательно перемешивают биологический объект с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°С. По истечении указанного времени биологический объект двукратно по 30 минут обрабатывают порциями органического изолирующего агента, которым является смесь ацетон-ацетонитрил в отношении 7,5:2,5 по объему, при условии, что масса каждой порции изолирующего агента в 2 раза превышает массу биологического объекта. При этом биологический объект заливают 20 г смеси ацетон-ацетонитрил в отношении 7,5:2,5 по объему и выдерживают 30 минут при периодическом перемешивании. Извлечение отделяют от твёрдых частиц биоматериала, операцию настаивания повторяют в указанных условиях.
Полученные органические извлечения объединяют, растворитель из объединённого извлечения испаряют в токе воздуха, остаток неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают порциями ацетона по 15 мл каждая при энергичном перемешивании, извлечения отделяют, объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объёму путём обработки остатка 2,4 мл ацетонитрила и последующего прибавления к ацетонитрильному раствору 1,6 мл воды. Полученный раствор вносят в хроматографическую макроколонку размерами 490×11 мм, заполненную 7,5 г сорбента «Силасорб С-18» 30 μ и предварительно промытую смесью растворителей ацетонитрил-вода в соотношении 6:4 по объёму. Хроматографируют, элюируя даухкомпонентной подвижной фазой ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объёму. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая.
Фракции элюата с 6 по 8 включительно, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С. Остаток растворяют в 10 мл метанола (раствор А). 0,5 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят метанолом до метки (раствор Б) и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия.
В процессе определения 4 мкл раствора Б вводят в хромато-масс-спектрометр.
Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы «Agilent Technologies» (США) модели 7890В GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5977А этой же фирмы.
Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке НР-5 ms Ultra Inert длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой, представляющей собой (5%-фенил)метилполисилоксан, при толщине плёнки неподвижной фазы 0,25 мкм.
Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, затем с 200°С до 290°С со скоростью 12,5°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 290°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество нифедипина по площади хроматографического пика.
В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1 мл/мин. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,9 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-400 m/z.
Пик на хроматограмме с временем удерживания 12,55 мин соответствует нифедипину. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 42, 77, 127, 168, 224, 254, 284, 329, 355. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 284, интенсивность которой принимается за 100 %.
Нифедипин идентифицируют по сочетанию времени удерживания в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.
По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание нифедипина, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесённую в биологический материал.
Построение градуировочного графика и его уравнение приводятся выше в примере 1.
Результаты количественного определения нифедипина в ткани селезёнки представлены в таблице 3.
Результаты определения нифедипина в ткани селезёнки (n=5; p=0,95)
в 10 г ткани селезёнки
характеристики,
%
пика на хроматограмме,
усл. ед.
в хроматографируемой пробе
в пересчёте
на навеску, внесённую
в биомате
риал
от внесён
ной в биоматериал
навески = 84,72 = 1,37 = 3,82= 4,51
Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов (на примере исследования ткани печени)
а) в 100 г биоматериала
б) в детектируемой пробе
2,5⋅10-11 г
5,0⋅10-10 г
Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 12 раз повышает чувствительность определения в биологическом материале и в 20 раз в хроматографируемой пробе. Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в таблице 4.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Способ определения нифедипина в биологическом материале | 2018 |
|
RU2686741C1 |
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ О-(2,3-ДИГИДРО-2,2-ДИМЕТИЛ-7-БЕНЗОФУРАНИЛ)-N-МЕТИЛКАРБАМАТА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ | 2014 |
|
RU2548742C1 |
| Способ определения О-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата и О-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамата в биологическом материале | 2016 |
|
RU2623070C1 |
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 2-МЕТОКСИ-4-АЛЛИЛГИДРОКСИБЕНЗОЛА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ | 2011 |
|
RU2456597C1 |
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗАМЕЩЕННЫХ 2-МЕТОКСИГИДРОКСИБЕНЗОЛА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ | 2013 |
|
RU2537125C1 |
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 2-МЕТОКСИ-4-АЛЛИЛГИДРОКСИБЕНЗОЛА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ | 2008 |
|
RU2395081C2 |
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ N-(4-НИТРО-2-ФЕНОКСИФЕНИЛ)-МЕТАНСУЛЬФОНАМИДА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ | 2013 |
|
RU2537121C1 |
| Способ определения 2,6-бис-[бис-(бета-оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидина в биологическом материале | 2016 |
|
RU2617176C1 |
| Способ определения N-(бензимидазолил-2)-О-метилкарбамата в биологическом материале | 2018 |
|
RU2692127C1 |
| Способ определения 3-метоксигидроксибензола в биологическом материале | 2016 |
|
RU2613310C1 |
Изобретение относится к биологии и токсикологической химии. Раскрыт способ определения нифедипина в биологическом материале, в котором в качестве органического изолирующего агента используется смесь ацетон-ацетонитрил в соотношении 7,5:2,5 по объёму, перед хроматографированием в макроколонке сорбентом «Силасорб С-18» 30 μ остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-вода в соотношении 6:4 по объёму, при хроматографировании в макроколонке сорбентом «Силасорб С-18» 30 μ используют двухкомпонентную подвижную фазу ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объёму, перед определением физико-химическим методом остаток растворяют в метаноле, в качестве физико-химического метода применяют метод хромато-масс-спектрометрии, при его применении хроматографируют в колонке НР-5 ms Ultra Inert длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, содержащей неподвижную фазу, представляющую собой (5%-фенил)метилполисилоксан в виде плёнки толщиной 0,25 мкм, в качестве подвижной фазы используют гелий, подаваемый со скоростью 1 мл/мин, детектором является масс-спектрометр, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70 °С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70 до 200 °С со скоростью 40 °С в минуту, затем с 200 до 290 °С со скоростью 12,5 °С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 мин, температура инжектора составляет 250 °С, температура квадруполя 150 °С, температура интерфейса детектора 290 °С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество нифедипина по площади хроматографического пика. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности анализа. 4 табл., 3 пр.
Способ определения нифедипина в биологическом материале, заключающийся в том, что биологический объект измельчают, двукратно по 30 мин обрабатывают порциями органического изолирующего агента, полученные органические извлечения объединяют, растворитель из объединённого излечения испаряют в токе воздуха, остаток неоднократно обрабатывает ацетоном, ацетоновое извлечение отделяют, объединяют, упаривают в токе воздуха при 18-22 °С до полного удаления растворителя, остаток растворяют, хроматографируют в макроколонке сорбентом «Силасорб С-18» 30 μ, используя двухкомпонентную подвижную фазу, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют и приводят определение физико-химическим методом, хроматографируя в колонке, содержащей неподвижную фазу, с применением подвижной фазы и детектора, отличающийся тем, что в качестве органического изолирующего агента используется смесь ацетон-ацетонитрил в соотношении 7,5:2,5 по объёму, перед хроматографированием в макроколонке сорбентом «Силасорб С-18» 30 μ, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-вода в соотношении 6:4 по объёму, при хроматографировании в макроколонке сорбентом «Силасорб С-18» 30 μ используют двухкомпонентную подвижную фазу ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объёму, перед определением физико-химическим методом остаток растворяют в метаноле, в качестве физико-химического метода применяют метод хромато-масс-спектрометрии, при его применении хроматографируют в колонке НР-5 ms Ultra Inert длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, содержащей неподвижную фазу, представляющую собой (5%-фенил)метилполисилоксан в виде плёнки толщиной 0,25 мкм, в качестве подвижной фазы используют гелий, подаваемый со скоростью 1 мл/мин, детектором является масс-спектрометр, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70 °С, данная температура выдерживается в течение 2 мин, в дальнейшем температура повышается от 70 до 200 °С со скоростью 40 °С в минуту, затем с 200 до 290 °С со скоростью 12,5 °С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 мин, температура инжектора составляет 250 °С, температура квадруполя 150 °С, температура интерфейса детектора 290 °С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество нифедипина по площади хроматографического пика.
| Способ определения нифедипина в биологическом материале | 2018 |
|
RU2686741C1 |
| CN 108593828 A, 28.09.2018 | |||
| КВАЧАХИЯ Л.Л | |||
| и др | |||
| Особенности изолирования нифедипина из биологического материала // ВЕСТНИК ВОРОНЕЖСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА | |||
| СЕРИЯ: ХИМИЯ | |||
| БИОЛОГИЯ | |||
| ФАРМАЦИЯ, 2019, N.1, стр.159-165 | |||
| WANG D | |||
| et al | |||
| Determination of nifedipine in human plasma by ultra performance liquid | |||
