Каллусный штамм культивируемых клеток растения живучка туркестанская Ajuga turkestanica (Regel) Briq. в условиях in vitro - продуцент туркестерона Российский патент 2017 года по МПК C12N5/04 A61K36/18 

Область применения

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, культивированию клеток растения живучки туркестанской, и может быть использовано для получения ценного биологически активного соединения - туркестерона, которое широко применяется в спортивной медицине и косметологии.

Уровень техники

Живучка туркестанская Ajuga turkestanica (Rgl.) Briq. многолетнее травянистое растение, относится к семейству Lamiaceae - эндемик Западного Тянь-Шаня и Гиссаро-Алая, произрастает на территории Узбекистана и Таджикистана, полукустарник семейства Яснотковые. Побеги живучки туркестанской применяются в спортивной медицине и косметологии, благодаря наличию в них специфического фитоэкдистероида - туркестерона, который по анаболическому эффекту не уступает синтетическим препаратам, не являясь при этом допингом. Туркестерон не токсичен, проявляет тонизирующее действие, стимулирует работоспособность, предохраняет от негативного воздействия различных стрессорных факторов. Живучка туркестанская является источником фитоэкдистероидов. Вид продуцирует экдистерон, аюгалактон, аюгастерон, циастерон, 22-ацетилциастерон, туркестерон [Б.З. Усманов, М.Б. Горовиц, Н.К. Абубакиров. Фитоэкдизоны Ajuga turkestanica V. // Химия природных соединений. - 1977. - №5. - Р. 710-714].

Для соединений установлен широкий спектр биологической активности при различных экспериментальных патологических состояниях [З. Саатов, В.Н. Сыров, А.У. Маматханов, Н.К. Абубакиров. Фитоэкдистероиды растений рода Ajuga и их биологическая активность. 1. Распространение и химические структуры выделенных соединений // Химия природных соединений. - 1994. - №2. - С. 152]. Сумма экдистероидов растения обладает гипогликемической активностью [Т.А. Кутепова, В.Н. Сыров, З.А. Хушбактова, З. Саатов. Кутепова Т.А. Гипогликемическая активностьсуммы экдистероидов из Ajuga turkestanica. // Химико фармацевтический журнал, - Т. 35 - №11 - С. 24-25].

Экдистерон и туркестерон оказывают благотворное действие на энергетические реакции организма [Ташмухамедова М.А., К.Г. Алматов, З.А. Хушбактова, В.Н. Сыров, А.А. Абидов. Функционирование митохондрий печени крыс при введении им фитоэкдистероидов и неробола. // Узбекский биологический журнал, - 1987 - т. 3 - с. 3].

Также эти соединения обладают способностью блокировать процессы свободнорадикального окисления. Растение является среднеазиатским эндемиком с узким ареалом распространения. В связи с этим большой интерес представляет разработка биотехнологического способа получения экдистероидов с использованием культур клеток Ajuga turkestanica.

Ранее было установлено, что полученная культура тканей и клеток Ajuga turkestanica сохраняет биосинтез доминирующих в растении экдистероидов: экдистерона (20Е) и туркестерона [С.В. Лев, Р.П. Закирова, З. Саатов, М.Б. Горовиц, Н.К. Абубакиров. Экдистероиды культуры тканей и клеток Ajuga turkestanica. II Химия природных соединений-1990. - №1. - С. 51-52].

Содержание веществ в первые циклы выращивания составляло соответственно 0,12% и 0,032% на сухой вес. В процессе длительного культивирования биосинтетическая активность каллусной культуры существенно снижалась [Р.П. Закирова М.Р. Якубова. Продуктивность каллусной ткани Ajuga turkestanica при многолетнем культивировании. // Химия природных соединений. - 2002. - №4. - С. 298]. Как правило, содержание вторичных соединений в условиях in vitro на порядок ниже и беднее по составу, чем в интактном растении и часто снижается при культивировании в течение нескольких лет. Была показана возможность повышения синтеза туркестерона путем индукции морфогенеза, но повышенный синтез не был стабилен и сохранялся на срок до 11-12 циклов субкулитивирования [Р.П. Закирова, И.Т. Абдукадыров, М.Р. Якубова Возможность повышения содержания экдистероидов в каллусных и суспензионных культурах клеток Ajuga turkestanica за счет использования индуцированного морфогенеза. // Биотехнология. 2012. №3. С. 44-47]. Также для повышения синтеза туркестерона добавляли элиситоры, либо проводили трансформацию с помощью агробактерий [Cheng, D. M., Yousef, G. G., Grace, M., Rogers, R. В., & Lila, M. A. (2007). In vitro production of phytoecdysteroids from Ajuga turkestanica II The FASEB Journal - V. 21(6) - A1079].

Таким образом, в литературе не было найдено работ по получению культуры клеток живучки туркестанской, обладающей стабильным и относительно высоким синтезом туркестерон в клетках самого штамма, а также высокими ростовыми характеристиками.

Задача изобретения

Задача изобретения - создание нового каллусного штамма живучки туркестанской (Ajuga turkestanica (Regel) Briq.), который является продуцентом туркестерона, со стабильными ростовыми параметрами, высокой жизнеспособностью, устойчивым синтезом туркестерона в процессе культивирования и отсутствием сезонной зависимости его получения.

Решение задачи

Эта задача была решена созданием нового каллусного штамма живучки туркестанской в условиях in vitro, депонированного в Российскую Коллекцию Культивируемых Клеток Высших Растений при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук под обозначением At21 №88, который является продуцентом туркестерона.

Новизна изобретения

Новизной настоящего изобретения является то, что впервые был получен штамм растения живучка туркестанская - продуцент туркестерона с высокими ростовыми характеристиками и стабильным относительно высоким синтезом туркестерона, по сравнению с описанными в литературе аналогами, сохраняющимся без дополнительных методов индукции синтеза.

Сущность изобретения

По мнению авторов, предлагаемое изобретение состоит в том, что за основу взяты листья, черешки и завязи растений живучки туркестанской, привезенных из горных районов Узбекистана, которые стерилизуют и помещают в жидкую питательную среду в качестве эксплантов. В результате был создан новый каллусный штамм - продуцент туркестерона.

Перечень иллюстративных материалов

Фигура 1. Ростовые характеристики культуры клеток живучки туркестанской Ajuga turkestanica.

Фигура 2. ВЭЖХ-хроматограмма анализа содержания туркестерона в биомассе культуры клеток живучки туркестанской Ajuga turkestanica.

Таблица 1. Состав сред для инициации каллусообразования и последующего выращивания каллусов живучки туркестанской Ajuga turkestanica.

Таблица 2. Ростовые параметры культуры клеток живучки туркестанской Ajuga turkestanica.

Реализация изобретения

Культуру клеток живучки туркестанской получают из интактных растений, используя в качестве эксплантов листья, стебли и завязи. Образцы растений для получения были привезены из горных районов Узбекистана. Растительные образцы промывают проточной водой, после чего выдерживают 20 сек. в 96% этаноле. Потом промывают стерильной дистиллированной водой. Затем растительные образцы помещают в раствор диацида на 4 мин., промывают стерильной дистиллированной водой, снова помещают в раствор диацида на 4 мин, после чего 3-кратно промывают в дистиллированной стерильной воде. Завязи, листовые пластинки и стебли подсекают скальпелем, предварительно разрезав на сегменты длиной 5 мм, и используют в качестве эксплантов, которые помещают на агаризованную питательную среду. Для инициации каллусообразования живучки туркестанской используют агаризованную среду Гамборга без гормонов (табл.1, среда 1), через неделю помещают на среду Гамборга с добавлением 4 мг/л 2,4-дихлорфеноскиуксусной кислоты (2,4-Д) и 0,1 мг/л кинетина (табл.1, среда 2), на которой культуры выращивают в течение 1 недели. Затем полученные каллусные культуры переводят на среду с 2 мг/л 2,4-Д и 0,1 мг/л кинетина (табл.1, среда 3), на которой проводят 2 цикла субкультивирования по 2 недели. Для последующего выращивания используют среду с 1 мг/л а-нафтилуксусной кислоты (НУК) и 0,05 мг/л бензиламинопурина (БАП) (табл. 1, среда 4).

Культивирование проводят в темноте, при 26±1°C, влажности помещения 70±5%, в чашках Петри диаметром 60 мм (10 среды в чашке). Цикл субкультивирования составляет 4 недели. При пересеве каллус делят на 3-5 частей, в зависимости от ростовых параметров культуры на данный момент.

Полученные каллусные культуры клеток выращивают в течение более 20 циклов. В процессе культивирования определяют ростовые и биосинтетические характеристики.

Штамм Ajuga turkestanica (Regel) Briq. под обозначением At21 №88 обладает следующими признаками.

Культуральные признаки: биомасса клеток гомогенная, светло-кремовой окраски.

Индекс роста (кратность прироста биомассы за одно субкультивирование) определяют по числу клеток, по сырому и сухому весу биомассы. Для определения веса сырой биомассы клетки отделяют от среды культивирования, промывают водой на бумажных фильтрах на вакуумном насосе и взвешивают. Сухую биомассу клеток получают после высушивания образцов при 25°±1С в потоке теплого воздуха. Жизнеспособность оценивают по проценту неокрашенных клеток в 0,1% растворе феносафранина.

В результате постоянного мониторинга состояния культур установлено, что жизнеспособность суспензионных культур стабильно держится на 90-97%. Ростовые характеристики культуры клеток живучки туркестанской представлены на фиг.1.

При анализе представленных кривых роста следует отметить отсутствие лаг-фазы. Начало экспоненциальной фазы роста отмечено на 14 сутки субкультивирвания. Замедление роста на 29 сутки культивирования позволяет использовать 4-недельный цикл выращивания. Ростовые параметры рассчитывали по сухому весу биомассы. Результаты представлены в табл.2.

Для определения содержания туркестерона навеску лиофилизированной биомассы культуры клеток подвергают кислотному гидролизу в 1.0 н. растворе соляной кислоты. Реакцию проводят в течение 14 часов при температуре 85оС.После гидролиза содержимое колбы переносят в делительную воронку, разбавляют водой и нейтрализуют 1.0 н. NH₄OH. Экдистероиды исчерпывающе экстрагируют этилацетатом, растворитель отгоняют на роторном испарителе. Сухой остаток растворяют в 1 мл смеси ацетонитрил-вода (27:73, по объему). Полученный раствор фильтруют через нейлоновый фильтр с порами 0,2 мкм (Acrodisc, США) и используют для ВЭЖХ анализа.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводят на приборе Agilent 1200 (Agilent Technologies, США). Пробу объемом 20 мкл наносят на колонку Zorbax С18 (250×4,6 мм, 5 мкм). Скорость подвижной фазы 0,5 мл/мин. В качестве компонентов подвижной фазы используют ацетонитрил и воду. Элюирование осуществляют в изократическом режиме при соотношении ацетонитрил:вода 27:73, по объему. Детектирование осуществляют по поглощению при 247 нм. Количественное содержание туркестерона определяют методом внешней калибровки по стандарту туркестерона.

Результаты изобретения

Как видно из таблицы 2, штамм обладает высокой жизнеспособностью - около 95% при стабильных ростовых характеристиках. В штамме At21 №88 культуры клеток живучки туркестанской был обнаружен туркестерон, содержание которого в сухой биомассе достигало 0,05%.

В результате изобретения был показан способ получения каллусной культуры клеток живучки туркестанской, обладающей высокими ростовыми и относительно высоким устойчивым синтезом туркестерона в процессе культивирования, превышающими таковые у мировых аналогов. Удобство такого способа получения туркестерона состоит в отсутствии сезонной зависимости их производства.

Изобретение относится к биотехнологии. Каллусный штамм живучки туркестанской Ajuga turkestanica (Regel) Briq. At21, обладающий способностью продуцировать в условиях in vitro туркестерон, депонирован во Всероссийской Коллекции культивируемых клеток высших растений под регистрационным номером 88. Штамм может быть использован для получения туркестерона. Изобретение обеспечивает высокий выход туркестерона. 2 ил.,2 табл.

Каллусный штамм культивируемых клеток растения живучка туркестанская Ajuga turkestanica (Regel) Briq., депонированный во Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших растений под регистрационным номером 88, в условиях in vitro - продуцент туркестерона.