ЖИДКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛИТЕЛЬНО ДЕЙСТВУЮЩИХ ИНСУЛИНА И ИНСУЛИНОТРОПНОГО ПЕПТИДА Российский патент 2018 года по МПК A61K38/28 A61K47/00 A61P3/10 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к жидкой композиции комбинации длительно действующих инсулина и инсулинотропного пептида, содержащей инсулин и инсулинотропный пептид, являющиеся физиологически активными пептидами, и не содержащий альбумина стабилизатор, который содержит буфер, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и изотонический агент; и к способу получения жидкой композиции.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Инсулин представляет собой пептид, секретируемый бета-клетками поджелудочной железы, и в организме он играет центральную роль в контроле уровней глюкозы в крови. Если количество секретируемого инсулина в организме недостаточно или если секретируемый инсулин функционирует неправильно, уровень глюкозы в крови будет повышен, приводя к метаболическому заболеванию, называемому диабетом. При неправильной секреции инсулина или его неправильном функционировании в организме уровень глюкозы в крови нерегулируемо повышается, и этот тип диабета называют диабетом II типа. Диабет I типа развивается, когда поджелудочная железа не вырабатывает достаточно инсулина для регуляции повышения уровня глюкозы в крови. Диабет II типа обычно лечат посредством введения пероральных гипогликемических агентов, состоящих, главным образом, из химических соединений, и иногда некоторым пациентам можно вводить инсулин. С другой стороны, для лечения диабета I типа введение инсулина необходимо.

Широко применяемое лечение инсулином представляет собой инъекции инсулина до и после приема пищи. В настоящее время инсулин доступен в композиции для парентеральных инъекций, его вводят главным образом подкожно, и, в зависимости от продолжительности лечения, способ введения может быть другим. Введение инсулина посредством инъекции более эффективно снижает уровень глюкозы в крови по сравнению с пероральным лекарственным средством, и его можно безопасно применять в обстоятельствах, при которых пероральное лекарственное средство не может быть использовано. Кроме того, парентеральные инъекции инсулина не имеют ограничений по дозе, тем не менее, поскольку их необходимо проводить регулярно три раза в сутки, они обладают такими недостатками, как вызывание отвращения к иглам, сложный способ введения, симптомы гипогликемии и увеличение массы тела из-за длительного введения инсулина. В частности, увеличение массы тела повышает риск развития сердечнососудистых заболеваний и может нарушать регуляторную функцию организма относительно уровня глюкозы в крови. В то же время было предпринято множество попыток максимизировать терапевтический эффект инсулинового пептидного лекарственного средства посредством поддержания высокого уровня лекарственного средства в крови на протяжении длительного периода времени после введения лекарственного средства в организм. В результате был разработан, произведен и выведен на рынок длительно действующий инсулин. Примеры такого длительно действующего лекарственного средства включают лантус (инсулин гларгин; Sanofi Aventis) и левемир (инсулин детемир; Novo Nordisk). В отличие от инсулина «нейтральный протамин Хагедорна» (NPH) длительно действующие лекарственные средства имеют меньший риск гипогликемии в состоянии сонливости. В частности, левемир уменьшает степень увеличения массы тела. Тем не менее способ введения, включающий одну или две инъекции в сутки, все еще имеет недостатки.

В то же время, глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1), являющийся разновидностью инсулинотропного пептида, представляет собой инкретиновый гормон, секретируемый L-клетками подвздошной и толстой кишки. Основной функцией GLP-1 является повышение секреции инсулина для развития глюкозозависимой секреции инсулина в организме, предотвращая таким образом гипогликемию. Благодаря этому эффекту, GLP-1 можно использовать для лечения диабета 2 типа. Тем не менее, поскольку период полувыведения GLP-1 из сыворотки составляет всего 2 минуты, возможности разработки лекарственного средства на его основе ограничены. Поэтому был разработан и произведен новый агонист GLP-1, называемый эксендином-4. Эксендин-4 представляет собой агонист GLP-1, образующийся в слюнной железе ящерицы-ядозуба. Кроме того, эксендин-4 устойчив к дипептидилпептидазе-4 (DPP-IV) и обладает более высокой физиологической активностью, чем GLP-1. Таким образом, период полувыведения эксендина-4 из организма составляет от 2 до 4 часов, что намного больше, чем у GLP-1 (патент США, регистрационный № US 5424286). Тем не менее достаточной продолжительности физиологической активности лекарственного средства нельзя добиться только повышением устойчивости к DPPIV. Например, доступный в настоящее время эксендин-4 (эксенатид) необходимо вводить пациенту два раза в сутки инъекцией, и он все еще имеет недостатки, вызывая тошноту и рвоту.

Поэтому в качестве способа одновременного поддержания активности белкового лекарственного средства и улучшения его стабильности в организме для решения описанных выше проблем авторы настоящего изобретения ранее предложили разработку длительно действующего белкового конъюгата посредством связывания известного физиологически активного полипептида и Fc-области иммуноглобулина ковалентной связью с использованием непептидильного полимера в качестве линкера (корейский патент, регистрационный №10-0725315). В частности, ранее было подтверждено, что как длительно действующий конъюгат инсулина, так и длительно действующий конъюгат эксендина-4 имеют существенно увеличенную продолжительность сохранения in vivo (корейский патент, регистрационный №10-1058290 и публикация №10-2011-0134210). Тем не менее введение терапевтически эффективного количества инсулина или эксендина-4 для поддержания стабильного уровня глюкозы в крови может приводить к увеличению массы тела или симптомам тошноты и рвоты. Поэтому существует выраженная потребность в разработке терапевтического способа, позволяющего снизить дозу лекарственного средства и частоту введения, обеспечивая в то же время превосходный терапевтический эффект в отношении диабета.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая проблема

С учетом данного предшествующего уровня техники при попытке обеспечить стабильную жидкую композицию комбинации длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида, которая позволяла бы хранить комбинацию двух конъюгатов на протяжении длительного периода времени без риска заражения вирусами, авторы настоящего изобретения повысили стабильность комбинации двух конъюгатов с использованием стабилизатора, содержащего буфер, сахарный спирт, хлорид натрия в качестве изотонического агента и неионное поверхностно-активное вещество, и разработали экономически выгодную и стабильную жидкую композицию, в чем и заключается настоящее изобретение.

Техническое решение

Одной задачей настоящего изобретения является обеспечение жидкой композиции комбинации длительно действующих инсулина и инсулинотропного пептида, содержащей инсулин и инсулинотропный пептид, являющиеся физиологически активными пептидами, и не содержащий альбумина стабилизатор, который содержит буфер, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и изотонический агент.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение способа получения жидкой композиции.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции для предотвращения или лечения диабета, содержащей инсулин и инсулинотропный пептид.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение способа лечения диабета, включающего введение композиции субъекту с диабетом.

Полезные эффекты

Комбинация длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида демонстрирует отличный терапевтический эффект для лечения диабета. Кроме того, жидкая композиция комбинации длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида по настоящему изобретению содержит стабилизатор, содержащий буфер, сахарный спирт, изотонический агент и неионное поверхностно-активное вещество, но не содержит человеческого сывороточного альбумина и других потенциально токсичных для организма факторов, и, таким образом, риск инфицирования вирусами отсутствует. Кроме того, жидкая композиция обеспечивает превосходную стабильность при хранении для длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида, имеющих увеличенную молекулярную массу и увеличенную продолжительность сохранения in vivo по сравнению с нативной формой, поскольку они состоят из инсулина или инсулинотропного пептида и Fc-области иммуноглобулина. В частности, согласно настоящему изобретению предложена стабильная жидкая композиция комбинации длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида. Такая жидкая композиция по настоящему изобретению представляет собой простую композицию, обеспечивающую превосходную стабильность при хранении и, таким образом, более выгодную с экономической точки зрения по сравнению с композициями, полученными с использованием других стабилизаторов и лиофильной сушки. Кроме того, настоящая жидкая композиция позволяет сохранять активность белка в организме на протяжении более длительного периода по сравнению с другими обычными композициями инсулина и инсулинотропного пептида, и, таким образом, она может быть использована как эффективная композиция лекарственного средства.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 показаны результаты мониторинга преципитации для композиций длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида, полученного в композициях по Таблице 3, при 40°C в течение 1 недели.

На Фиг. 2 показаны результаты IE-HPLC (ионообменная высокоэффективная жидкостная хроматография) - анализа длительно действующих конъюгата инсулина и конъюгата инсулинотропного пептида, которые получали в композициях по Таблице 4 и хранили при 40°C в течение 4 недель.

На Фиг. 3 показаны результаты PH-HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой) - анализа длительно действующих конъюгата инсулина и конъюгата инсулинотропного пептида, которые получали в композициях по Таблице 4 и хранили при 40°C в течение 4 недель.

На Фиг. 4 показаны результаты мониторинга преципитации белка в каждой из комбинированных композиций, имеющих разный состав, по сравнению с раздельной композицией.

НАИЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В качестве одного аспекта настоящего изобретения предложена жидкая композиция длительно действующих инсулина и инсулинотропного пептида, содержащая инсулин и инсулинотропный пептид, являющиеся физиологически активными пептидами, и не содержащий альбумина стабилизатор, который содержит буфер, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и изотонический агент. Жидкая композиция по настоящему изобретению характеризуется тем, что инсулин и инсулинотропный пептид вводят совместно.

Инсулин может быть представлен в жидкой композиции в форме фармацевтически эффективного количества длительно действующего конъюгата инсулина, где инсулин связан с Fc-областью иммуноглобулина. Инсулинотропный пептид может быть представлен в жидкой композиции в форме фармацевтически эффективного количества длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида, где инсулинотропный пептид связан с Fc-областью иммуноглобулина.

При использовании здесь «длительно действующий конъюгат инсулина» относится к конъюгату, где физиологически активный инсулин, включая производное, вариант, предшественник и фрагмент, связан с Fc-областью иммуноглобулина, и он может относиться к конъюгату с увеличенной продолжительностью сохранения физиологической активности in vivo по сравнению с нативным инсулином. При использовании здесь длительно действующий конъюгат инсулина относится к инсулину, связанному с Fc-областью иммуноглобулина через непептидильный линкер или пептидильный линкер. При использовании здесь «длительно действующий конъюгат инсулинотропного пептида» относится к конъюгату, где физиологически активный инсулинотропный пептид, включая производное, вариант, предшественник и фрагмент, связан с Fc-областью иммуноглобулина, и он может относиться к конъюгату с увеличенной продолжительностью сохранения физиологической активности in vivo по сравнению с нативным инсулинотропным пептидом.

При использовании здесь длительно действующий конъюгат инсулинотропного пептида относится к инсулинотропному пептиду, связанному с Fc-областью иммуноглобулина через непептидильный линкер или пептидный линкер.

При использовании здесь термин «длительно действующий» относится к увеличению продолжительности сохранения физиологической активности по сравнению с нативным пептидом. Термин «конъюгат» относится к форме пептида, где инсулин или инсулинотропный пептид связан с Fc-областью иммуноглобулина.

Длительно действующий конъюгат инсулина или конъюгат инсулинотропного пептида по настоящему изобретению имеет увеличенную продолжительность сохранения эффекта по сравнению с нативным инсулином или инсулинотропным пептидом. Тип длительно действующего конъюгата инсулина или конъюгата инсулинотропного пептида включает, без ограничения, форму инсулина или инсулинотропного пептида, полученную посредством модификации, замены, добавления или делеции аминокислот нативного инсулина или инсулинотропного пептида, конъюгат, где инсулин или инсулинотропный пептид связан с биоразлагаемым полимером, таким как ПЭГ (полиэтиленгликоль), конъюгат, где инсулин или инсулинотропный пептид связан с белком с большой продолжительностью сохранения, таким как альбумин или иммуноглобулин, конъюгат, где инсулин или инсулинотропный пептид связан с жирной кислотой, обладающей аффинностью связывания с альбумином в организме, или форму инсулина или инсулинотропного пептида, помещенную в биоразлагаемую наночастицу.

Длительно действующий конъюгат инсулина или инсулинотропного пептида, используемый в настоящем изобретении, получают посредством соединения синтезированного инсулина или инсулинотропного пептида с Fc-областью иммуноглобулина. Способ соединения этих двух компонентов может представлять собой поперечное связывание инсулина или инсулинотропного пептида и Fc-области иммуноглобулина через непептидильный полимер или получение слитого белка, в котором инсулин или инсулинотропный пептид и Fc-область иммуноглобулина соединены посредством генетической рекомбинации.

При использовании здесь «инсулин» относится к пептиду, секретируемому поджелудочной железой в ответ на повышенные уровни глюкозы в крови в организме для поглощения глюкозы в печени, мышцах или жировой ткани и ее превращения в гликоген и для прекращения использования жира в качестве источника энергии и, таким образом, функционирующему, контролируя уровень глюкозы в крови. Этот пептид включает нативный инсулин, базальный инсулин и их агонисты, предшественники, производные, фрагменты и варианты.

При использовании здесь «нативный инсулин» представляет собой гормон, секретируемый поджелудочной железой для стимуляции поглощения глюкозы и ингибирования распада жира в клетках и, таким образом, функционирующему, контролируя уровень глюкозы в крови. Инсулин образуется при процессинге его предшественника, проинсулина, не обладающего функцией регуляции уровня глюкозы в крови. Аминокислотные последовательности инсулина представляют собой следующее.

Альфа-цепь:

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO: 1).

Бета-цепь:

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (SEQ ID NO: 2).

При использовании здесь «базальный инсулин» относится к пептиду, регулирующему нормальные изменения уровня глюкозы в крови в течение каждого дня, и примеры такого пептида включают левемир, лантус и деглюдек. При использовании здесь «агонист инсулина» относится к соединению, связывающему собственный рецептор инсулина, демонстрируя такую же биологическую активность, как инсулин, независимо от структурного отличия от инсулина. При использовании здесь «вариант инсулина» относится к пептиду, имеющему одно или более чем одно отличие аминокислотной последовательности от нативного инсулина, обладающему функцией регуляции уровня глюкозы в крови в организме. Производное инсулина может быть получено посредством одного из замены, добавления, делеции и модификации некоторых аминокислот нативного инсулина или их комбинации. При использовании здесь «производное инсулина» относится к пептиду с по меньшей мере 80%-й гомологией аминокислотной последовательности нативному инсулину, где некоторые группы аминокислотных остатков могут быть химически замещены (например, альфа-метилирование, альфа-гидроксилирование), удалены (например, дезаминирование) или модифицированы (например, N-метилирование), обладающему функцией регуляции уровня глюкозы в крови в организме. При использовании здесь «фрагмент инсулина» относится к фрагменту, где одна или более чем одна аминокислота добавлена или удалена на N-конце или С-конце нативного инсулина, где могут быть добавлены аминокислоты, не встречающиеся в природе (например, аминокислота D-типа). Фрагмент инсулина обладает функцией регуляции уровня глюкозы в крови в организме.

Каждый из способов получения агонистов, производных, фрагментов и вариантов инсулина можно применять по отдельности или в комбинации. Например, объем настоящего изобретения включает пептид, где одна или более аминокислотных последовательностей отличаются от соответствующих последовательностей нативного пептида и N-концевой аминокислотный остаток дезаминирован, обладающий, в то же время, функцией регуляции уровня глюкозы в крови в организме.

Инсулин, используемый в настоящем изобретении, может быть получен посредством рекомбинантной технологии или синтезирован посредством твердофазного синтеза. Кроме того, инсулин, используемый в настоящем изобретении, может быть связан с непептидильным полимером. Такой непептидильный полимер может быть использован в настоящем изобретении в качестве линкера. Соединение инсулина с непептидильным полимером в качестве линкера позволяет улучшить стабильность инсулина, сохраняя в то же время его активность. Применение методики генетической рекомбинации позволяет использовать в качестве линкера пептид.

При использовании здесь «непептидильный полимер» относится к биологически совместимому полимеру, состоящему из одной или более повторяющихся единиц, связанных друг с другом ковалентной связью любого типа, но не пептидной связью. В настоящем изобретении «непептидильный полимер» может быть использован взаимозаменяемо с «непептидильным линкером».

Непептидный полимер, который может быть использован в настоящем изобретении, может быть выбран из группы, состоящей из биоразлагаемых полимеров, таких как полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированные полиолы, поливиниловый спирт, полисахариды, декстран, поливинилэтиловый эфир, полимолочная кислота (PLA) и сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA); липидных полимеров; хитинов; гиалуроновой кислоты; и их комбинации. Предпочтительно в качестве непептидильного полимера используют полиэтиленгликоль. Объем настоящего изобретения также включает их производные, хорошо известные в данной области, и производные, которые могут быть легко получены с применением методик, доступных в данной области техники.

Пептидильный линкер, используемый в слитом белке, полученном обычной методикой внутрирамочного слияния, имеет ограничение, состоящее в том, что в организме он может легко расщепляться протеазой, и, таким образом, он не может в достаточной степени увеличить период полувыведения активного лекарственного средства из сыворотки, так, как при использовании носителя. Тем не менее в настоящем изобретении при использовании полимера, устойчивого к протеазе, можно поддерживать период полувыведения пептида из сыворотки, сходный с периодом полувыведения при использовании носителя. Поэтому непептидильный полимер, который можно использовать в настоящем изобретении, включает непептидильные полимеры любого типа, при условии, что они обладают указанной выше функцией, то есть устойчивы к протеазе. Молекулярная масса непептидильного полимера составляет от 1 до 100 кДа и предпочтительно от 1 до 20 кДа. Кроме того, непептидильный полимер по настоящему изобретению, связанный с Fc-областью иммуноглобулина, может представлять собой один тип полимеров или комбинацию разных типов полимеров.

Непептидильный полимер, используемый в настоящем изобретении, может иметь функциональную группу, которая может быть связана с Fc-областью иммуноглобулина и белковым лекарственным средством. Функциональные группы на обоих концах непептидильного полимера предпочтительно выбраны из группы, состоящей из реакционноспособной альдегидной группы, пропиональдегидной группы, бутиральдегидной группы, малеимидной группы и сукцинимидного производного. Сукцинимидное производное может представлять собой сукцинимидилпропионат, гидроксисукцинимидил, сукцинимидилкарбоксиметил или сукцинимидилкарбонат. В частности, когда непептидильный полимер имеет реакционноспособные альдегидные группы на обоих концах, это может минимизировать неспецифическое связывание и может делать эффективным связывание непептидильного полимера с физиологически активным полипептидом и иммуноглобулином на каждом конце. Конечный продукт, полученный посредством восстановительного алкилирования альдегидной связи, намного стабильнее продуктов, связанных амидной связью. Альдегидная функциональная группа селективно связывается с N-концом при низком pH и образует ковалентную связь с лизиновым остатком при высоком pH, например при pH 9,0.

Функциональные группы на двух концах непептидильного полимера могут быть одинаковыми или разными. Например, непептидильный полимер может иметь малеимидную группу на одном конце и альдегидную группу, пропиональдегидную группу или бутиральдегидную группу на другом конце. При использовании полиэтиленгликоля с гидроксигруппами на обоих концах в качестве непептидильного полимера гидроксигруппа может быть активирована с образованием различных функциональных групп известными химическими реакциями, или для получения длительно действующего конъюгата инсулина по настоящему изобретению может быть использован имеющийся в продаже полиэтиленгликоль с модифицированной функциональной группой.

Предпочтительно, непептидильный полимер может быть связан с N-концом бета-цепи инсулина.

Инсулин по настоящему изобретению может быть модифицирован с использованием непептидильного полимера.

При разработке длительно действующего конъюгата инсулина с использованием фрагмента иммуноглобулина, если физиологически активный полипептид модифицирован с использованием ПЭГ для увеличения продолжительности сохранения лекарственного средства без вызывания гипогликемии, это может снижать титр. Тем не менее снижение титра становится преимуществом длительно действующего конъюгата инсулина, и, таким образом, инсулин, модифицированный с использованием ПЭГ, может быть связан с Fc-областью иммуноглобулина через непептидильный полимер. Тип непептидильного полимера, который может быть использован при модифицировании инсулина, является таким же, как описано выше, и предпочтительно представляет собой полиэтиленгликоль (PEG, ПЭГ). В ПЭГ-модифицированном инсулине ПЭГ селективно связан с N-концом альфа-цепи инсулина или с определенным лизиновым остатком бета-цепи. ПЭГ, используемый для модифицирования инсулина, предпочтительно содержит на конце альдегидную группу или сукцинильную группу и более предпочтительно сукцинильную группу.

Способ получения и эффект длительно действующего конъюгата инсулина по настоящему изобретению раскрыты в публикациях корейских патентов №№10-2011-0134210, 10-2011-0134209 и 10-2011-0111267. Руководствуясь этими ссылками, специалисты в данной области могут получить длительно действующий конъюгат инсулина, используемый в настоящем изобретении. Кроме того, авторы настоящего изобретения ранее предложили способ получения длительно действующего конъюгата инсулина посредством моноПЭГилирования N-конца Fc-области иммуноглобулина и аналогичной модификации первого фенилаланина бета-цепи инсулина.

При использовании здесь «инсулинотропный пептид» относится к пептиду, обладающему функцией секреции инсулина, и он может стимулировать синтез или экспрессию инсулина в β-клетках поджелудочной железы. Инсулинотропный пептид предпочтительно представляет собой, без ограничения, глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1), GLP-2, эксендин-3 или эксендин-4. Инсулинотропный пептид включает нативный инсулинотропный пептид, а также его предшественники, агонисты, производные, фрагменты и варианты.

Производное инсулинотропного пептида по настоящему изобретению может относиться к производному, полученному посредством удаления N-концевой аминогруппы (или аминной группы) инсулинотропного пептида (то есть дезаминогистидильному производному); производному, полученному посредством замещения аминогруппы инсулинотропного пептида гидроксильной группой (то есть бета-гидроксиимидазопропионильному производному); производному, полученному посредством модификации аминогруппы инсулинотропного пептида двумя метильными группами (то есть диметилгистидильному производному); производному, полученному посредством замещения N-концевой аминогруппы инсулинотропного пептида карбоксильной группой (то есть бета-карбоксиимидазопропионильному производному); или производному, полученному посредством устранения положительного заряда аминогруппы инсулинотропного пептида удалением альфа-углерода N-концевого гистидинового остатка, оставляя только имидазоацетильную группу (имидазоацетильному производному). Кроме того, объем настоящего изобретения включает производные с другими формами модифицированной N-концевой аминогруппы.

В настоящем изобретении производное инсулинотропного пептида предпочтительно представляет собой производное, полученное посредством химической модификации N-концевой аминогруппы или аминокислотного остатка эксендина-4 и более предпочтительно производное эксендина-4, где альфа аминогруппа или альфа-углеродная группа при альфа-углероде гистидинового остатка, являющегося первым аминокислотным остатком на N-конце эксендина-4, замещена или удалена. Еще более предпочтительно производное инсулинотропного пептида представляет собой дезаминогистидилэксендин-4 (DA-эксендин-4), полученный посредством удаления N-концевой аминогруппы эксендина-4; бетагидроксиимидазопропионилэксендин-4 (HY-эксендин-4), полученный посредством замещения эксендина-4 гидроксильной группой или карбоксильной группой; бета-карбоксиимидазопропионилэксендин-4 (CX-эксендин-4); диметилгистидилэксендин-4 (DM-эксендин-4), полученный посредством модификации эксендина-4 двумя метильными группами; или имидазоацетилэксендин-4 (CA-эксендин-4), полученный посредством удаления альфа-углерода N-концевого гистидинового остатка.

GLP-1 представляет собой гормон, секретируемый тонкой кишкой и обычно функционирующий, стимулируя биосинтез и секрецию инсулина, подавляя секрецию глюкагона и стимулируя поглощение глюкозы клетками. В тонкой кишке предшественник глюкагона расщепляется на три пептида, представляющих собой глюкагон, GLP-1 и GLP-2. Здесь GLP-1 относится к GLP-1 (1-37), не обладающему функцией секреции инсулина, но активируемому при его процессинге с образованием формы GLP-1 (7-37). Аминокислотная последовательность GLP-1 (7-37) представляет собой следующее.

GLP-1 (7-37):

HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR G (SEQ ID NO: 3).

При использовании здесь «производное GLP-1» относится к пептиду, последовательность которого по меньшей мере на 80% гомологична нативному GLP-1, и который может быть представлен в химически модифицированной форме, демонстрируя в то же время по меньшей мере такую же или улучшенную активность секреции инсулина. При использовании здесь «фрагмент GLP-1» относится к форме пептида, где одна или более чем одна аминокислота на N-конце или С-конце нативного GLP-1 добавлена или удалена, где добавленная аминокислота может представлять собой аминокислоту, не встречающуюся в природе (например, аминокислоту D-типа). При использовании здесь термин «длительно действующий конъюгат инсулинотропного пептида» относится к пептиду, имеющему увеличенную продолжительность сохранения эффектов по сравнению с нативным инсулинотропным пептидом. Длительно действующий конъюгат инсулинотропного пептида может быть представлен в форме, где аминокислота нативного инсулинотропного пептида модифицирована, заменена, добавлена или удалена; в форме конъюгата, где инсулин связан с биоразлагаемым полимером, таким как ПЭГ; в форме конъюгата, где инсулин связан с белком с большой продолжительностью сохранения, таким как альбумин, иммуноглобулин и их фрагменты; в форме конъюгата, где инсулинотропный пептид связан с жирной кислотой, обладающей аффинностью связывания с альбумином в организме, или в форме инсулинотропного пептида, помещенной в биоразлагаемые наночастицы; но тип длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида не ограничен настоящим изобретением.

При использовании здесь «вариант GLP-1» относится к пептиду, аминокислотные последовательности которого имеют одно или более чем одно отличие от нативного GLP-1, обладающему функцией секреции инсулина.

Эксендин-3 и эксендин-4 представляют собой инсулинотропные пептиды, состоящие из 39 аминокислот, последовательность которых на 53% гомологична GLP-1. Аминокислотные последовательности эксендина-3 и эксендина-4 представляют собой следующее.

Эксендин-3:

HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS (SEQ ID NO: 4).

Эксендин-4:

HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS (SEQ ID NO: 5).

Агонист эксендина относится к веществу, имеющему такую же биологическую активность, как эксендин, связываясь с рецептором эксендина in vivo, независимо от его структурного сходства с эксендином. Производное эксендина относится к пептиду с по меньшей мере 80%-й гомологией последовательности нативному эксендину, где некоторые группы аминокислотных остатков могут быть химически замещены (например, альфа-метилирование, альфа-гидроксилирование), удалены (например, дезаминирование) или модифицированы (например, N-метилирование), и такое производное эксендина обладает функцией секреции инсулина.

Фрагмент эксендина относится к форме пептида, где одна или более чем одна аминокислота добавлена или удалена на N-конце или С-конце нативного эксендина, где могут быть добавлены аминокислоты, не встречающиеся в природе (например, аминокислота D-типа), и такой фрагмент эксендина обладает функцией секреции инсулина.

Вариант эксендина представляет собой пептид, аминокислотные последовательности которого имеют одно или более чем одно отличие от нативного эксендина, обладающий функцией секреции инсулина. Вариант эксендина включает пептид, полученный посредством замены 12-й аминокислоты эксендина, лизина, серином или аргинином. Способы получения такого агониста, производного, фрагмента и варианта эксендина можно применять по отдельности или в комбинации. Например, инсулинотропный пептид включает инсулинотропный пептид, аминокислотные последовательности которого имеют одно или более чем одно отличие от нативного пептида, и N-концевой аминокислотный остаток которого дезаминирован. Нативный инсулинотропный пептид и модифицированный инсулинотропный пептид, используемые в настоящем изобретении, могут быть синтезированы посредством твердофазного синтеза. Кроме того, большинство нативных пептидов, включая нативный инсулинотропный пептид, могут быть получены рекомбинантным способом.

Длительно действующий конъюгат инсулинотропного пептида, используемый в настоящем изобретении, имеет форму инсулинотропного пептида, связанного с фрагментом имуноглоублина, таким как Fc иммуноглобулина, через непептидильный линкер или пептидильный линкер с применением методики генетической рекомбинации. Непептидильный линкер является таким же, как описано выше. Длительно действующий конъюгат инсулинотропного пептида получают с использованием фрагмента иммуноглобулина, как в случае с длительно действующим конъюгатом инсулина. Длительно действующий конъюгат инсулинотропного пептида поддерживает физиологическую активность существующего инсулинотропного пептида, такую как стимуляция синтеза и секреции инсулина, подавление аппетита, индуцирование уменьшения массы тела, повышение чувствительности бета-клеток к глюкозе в сыворотке, стимуляция пролиферации бета-клеток, задержка опорожнения желудка и подавление глюкагона, и он также имеет увеличенную продолжительность сохранения эффектов in vivo, благодаря увеличенному периоду полувыведения инсулинотропного пептида из сыворотки. Поэтому длительно действующий конъюгат инсулинотропного пептида эффективен в лечении диабета и ожирения.

Для получения длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида, использованного в настоящем изобретении, можно воспользоваться следующими ссылками: корейский патент, регистрационный №10-0725315, публикация корейского патента №10-2009-0008151 и корейский патент, регистрационный №10-1058290. Руководствуясь этими ссылками, специалисты в данной области могут получить длительно действующий конъюгат инсулинотропного пептида, используемый в настоящем изобретении.

Кроме того, авторы настоящего изобретения ранее разработали способ получения длительно действующего конъюгата эксендина-4 сначала присоединением ПЭГ к лизиновому (Lys) остатку имидазоацетилэксендина-4 (СА эксендина-4) и связыванием ПЭГ-модифицированного эксендина-4 с Fc иммуноглобулина.

Инсулин и инсулинотропный пептид, используемые в настоящем изобретении, связаны с носителем через непептидильный полимер, используемый в качестве линкера. Носитель, который может быть использован в настоящем изобретении, может быть выбран из группы, состоящей из Fc-области иммуноглобулина, альбумина, трансферрина и ПЭГ, и предпочтительно представляет собой Fc-область иммуноглобулина.

Длительно действующий конъюгат инсулина и длительно действующий конъюгат инсулинотропного пептида по настоящему изобретению имеют инсулин или инсулинотропный пептид, связанные с Fc-областью иммуноглобулина через непептидильный линкер, и обладают продолжительностью сохранения и стабильностью. В настоящем изобретении Fc иммуноглобулина может быть использована взаимозаменяемо с фрагментом иммуноглобулина.

Кроме того, поскольку Fc-область иммуноглобулина имеет относительно небольшую молекулярную массу по сравнению с полноразмерной молекулой иммуноглобулина, ее применение может быть полезным для получения и очистки конъюгата, а также для получения высокого выхода. Кроме того, Fc-область иммуноглобулина не содержит Fab-фрагмента, являющегося очень неоднородным из-за различий аминокислотных последовательностей в соответствии с подклассами антител, и, таким образом, можно ожидать, что Fc-область иммуноглобулина обладает большей однородностью и менее антигенна.

При использовании здесь «Fc-область иммуноглобулина» относится к белку, содержащему константную область 2 тяжелой цепи (СН2) и константную область 3 тяжелой цепи (СН3) иммуноглобулина, исключая вариабельные области тяжелой и легкой цепей, константную область 1 тяжелой цепи (СН1) и константную область 1 легкой цепи (CL1) иммуноглобулина. Она может дополнительно содержать шарнирную область при константной области тяжелой цепи. Кроме того, Fc-область иммуноглобулина по настоящему изобретению может содержать всю Fc-область или ее часть, включая константную область 1 тяжелой цепи (СН1) и/или константную область 1 легкой цепи (CL1), за исключением вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, при условии, что она обладает физиологической функцией, по существу сходной или превосходящей функцию нативного белка. Кроме того, она может представлять собой фрагмент с делецией относительно большой части аминокислотной последовательности СН2 и/или СН3. То есть Fc-область иммуноглобулина по настоящему изобретению может содержать: (1) домен СН1, домен СН2, домен СН3 и домен СН4; (2) домен СН1 и домен СН2; (3) домен СН1 и домен СН3; (4) домен СН2 и домен СН3; (5) комбинацию одного или более доменов и шарнирной области иммуноглобулина (или части шарнирной области); и (6) димер каждого домена константных областей тяжелой цепи и константной области легкой цепи.

Кроме того, Fc-область иммуноглобулина по настоящему изобретению включает нативную аминокислотную последовательность и последовательности ее производных (мутантов). Аминокислотная последовательность производного отличается от нативной аминокислотной последовательности делецией, вставкой, неконсервативной или консервативной заменой одного или более аминокислотных остатков и их комбинациями. Например, в Fc IgG в качестве подходящей мишени для модификации могут быть использованы аминокислотные остатки, как известно, важные для связывания, в положениях 214-238, 297-299, 318-322 или 327-331.

Кроме того, возможны различные другие производные, включая производные с делецией области, способной образовывать дисульфидную связь, делецией нескольких аминокислотных остатков на N-конце нативной формы Fc или добавлением метионинового остатка к N-концу нативной формы Fc. Кроме того, для устранения эффекторных функций делеция может присутствовать в сайте связывания комплемента, таком как сайт связывания C1q, и сайте антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). Методики получения таких производных последовательности Fc-области иммуноглобулина раскрыты в WO 97/34631 и WO 96/32478.

В данной области известны аминокислотные замены в белках и пептидах, обычно не меняющие активность молекул (H. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Наиболее часто встречающимися заменами являются Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly в обоих направлениях. Если желательно, Fc-область может быть модифицирована фосфорилированием, сульфатированием, акрилированием, гликозилированием, метилированием, фарнезилированием, ацетилированием, амидированием и тому подобным.

Указанные выше производные Fc являются производными, обладающими биологической активностью, идентичной биологической активности Fc-области по настоящему изобретению, или повышенной структурной стабильностью, например, против нагревания, pH или тому подобного.

Кроме того, эти Fc-области могут быть получены из нативных форм, выделенных от людей и других животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок, или могут представлять собой их рекомбинанты или производные, полученные из трансформированных животных клеток или микроорганизмов. Здесь они могут быть получены из нативного иммуноглобулина посредством выделения полноразмерных иммуноглобулинов из организма человека или животного и их обработки протеолитическим ферментом. Папаин расщепляет нативный иммуноглобулин на Fab- и Fc-области, а обработка пепсином приводит к получению pF'c- и F(ab)2-фрагментов. Возможно проведение, например, гель-хроматографии этих фрагментов для выделения Fc или pF'c. Предпочтительно, Fc-область человеческого происхождения представляет собой рекомбинантную Fc-область иммуноглобулина, полученную из микроорганизма.

Кроме того, Fc-область иммуноглобулина по настоящему изобретению может быть в форме с нативными сахарными цепями, увеличенными сахарными цепями по сравнению с нативной формой, или уменьшенными сахарными цепями по сравнению с нативной формой, или может быть в дегликозилированной форме. Увеличение, уменьшение или удаление сахарных цепей Fc иммуноглобулина может быть осуществлено способами, известными в данной области, такими как химический способ, ферментативный способ и генно-инженерный способ с использованием микроорганизма. Удаление сахарных цепей из Fc-области приводит к резкому снижению аффинности связывания с комплементом (c1q) и снижению или утрате антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности или комплемент-зависимой цитотоксичности, что позволяет избежать ненужных иммунных ответов in vivo. В этом отношении, Fc-область иммуноглобулина в дегликозилированной или агликозилированной форме может быть более подходящей для задачи настоящего изобретения в качестве носителя лекарственного средства.

При использовании здесь термин «дегликозилирование» означает ферментативное удаление сахарных группировок из Fc-области, а термин «агликозилирование» означает, что Fc-область получена в негликозилированной форме с использованием прокариотического организма, предпочтительно Е. coli.

В то же время Fc-область иммуноглобулина может иметь происхождение от человека или животных, таких как коровы, козы, свиньи, мыши, кролики, хомяки, крысы, морские свинки и, предпочтительно, человек.

Кроме того, Fc-область иммуноглобулина может представлять собой Fc-область, имеющую происхождение от IgG, IgA, IgD, IgE и IgM, или полученную с использованием их комбинаций или гибридов. Предпочтительно, она имеет происхождение от IgG или IgM, являющихся одними из наиболее распространенных белков человеческой крови, и, наиболее предпочтительно, от IgG, о котором известно, что он увеличивает период полувыведения лиганд-связывающих белков.

При использовании здесь термин «комбинация» означает, что полипептиды, кодирующие одноцепочечные Fc-области иммуноглобулинов одного и того же происхождения, соединены с одноцепочечным полипептидом другого происхождения с образованием димера или мультимера. То есть возможно получение димера или мультимера из двух или более фрагментов, выбранных из группы, состоящей из Fc-фрагментов IgG, Fc-фрагментов IgA, Fc-фрагментов IgM, Fc-фрагментов IgD и Fc-фрагментов IgE.

При использовании здесь термин «гибрид» означает, что в одноцепочечной Fc-области иммуноглобулина присутствуют последовательности, кодирующие две или более Fc-области иммуноглобулинов разного происхождения. В настоящем изобретении возможны различные типы гибридов. То есть доменные гибриды могут состоять из от одного до четырех доменов, выбранных из группы, состоящей из СН1, CH2, СН3 и СН4 Fc IgG, Fc IgM, Fc IgA, Fc IgE и Fc IgD, и могут содержать шарнирную область.

С другой стороны, IgG делят на подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и настоящее изобретение включает их комбинации или гибриды. Предпочтительны подклассы IgG2 и IgG4, а наиболее предпочтительна Fc-область IgG4, редко обладающая эффекторными функциями, такими как комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC).

В качестве носителя лекарственного средства по настоящему изобретению наиболее предпочтительной Fc-областью иммуноглобулина является негликозилированная Fc-область, имеющая происхождение от человеческого IgG4. Fc-область, имеющая происхождение от человека, предпочтительнее Fc-области, имеющей происхождение от источника, не являющегося человеком, которая может действовать в организме человека как антиген и приводить к нежелательным иммунным ответам, таким как образование нового антитела против антигена.

Жидкая композиция комбинации длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида по настоящему изобретению содержит терапевтически эффективное количество длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида. Концентрация длительно действующего конъюгата инсулина, используемая в настоящем изобретении, составляет от 0,1 мг/мл до 200 мг/мл и предпочтительно от 10 мг/мл до 200 мг/мл. Концентрация длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида, используемая в настоящем изобретении, составляет от 0,1 мг/мл до 200 мг/мл и предпочтительно от 0,5 мг/мл до 150 мг/мл. Высококонцентрированная жидкая композиция длительно действующего конъюгата инсулина и конъюгата инсулинотропного пептида по настоящему изобретению содержит конъюгат инсулина и конъюгат инсулинотропного пептида в высокой концентрации на дозу по сравнению с существующими низкоконцентрированными жидкими композициями. Таким образом, она может стабильно обеспечивать организм инсулином, позволяя совместно вводить конъюгат инсулина и конъюгат инсулинотропного пептида в высокой концентрации и стабильно хранить их без преципитации, в отличие от существующей жидкой композиции.

При использовании здесь термин «стабилизатор» относится к веществу, позволяющему стабильно хранить длительно действующий конъюгат инсулина и длительно действующий инсулинотропный пептид. Термин «стабилизация» относится к тому, что потеря активного ингредиента меньше определенного количества, обычно меньше 10% за определенный период в определенных условиях хранения. Композицию считают стабильной, когда остаточная степень чистоты длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего инсулинотропного пептида в ней составляет 90% или более и более предпочтительно от 92 до 95% после хранения при 5±3°C на протяжении 2 лет, при 25±2°C на протяжении 6 месяцев или при 40±2°C на протяжении 1-2 недель. Для таких белков, как длительно действующий конъюгат инсулина и длительно действующий инсулинотропный пептид, их стабильность при хранении важна для обеспечения точного дозирования, а также для подавления возможного образования антигенных веществ против длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего инсулинотропного пептида. При хранении потеря 10% длительно действующего конъюгата инсулина или длительно действующего инсулинотропного пептида приемлема для достаточного введения, если она не вызывает образование в композиции агрегатов или фрагментов, приводящих к образованию антигенных соединений.

Стабилизатор по настоящему изобретению предпочтительно содержит буфер, сахарный спирт, хлорид натрия в качестве изотонического агента и неионное поверхностно-активное вещество для стабилизации комбинации длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида и может дополнительно содержать метионин.

Буфер поддерживает pH раствора, предотвращая резкое изменение pH в жидкой композиции для стабилизации комбинации длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида. Буфер может содержать щелочную соль (фосфат, гидрофосфат или дигидрофосфат натрия или калия), цитрат калия/лимонную кислоту, ацетат натрия/уксусную кислоту и любой другой фармацевтически приемлемый pH-буфер, известный в данной области, и их комбинацию. Предпочтительный пример такого буфера включает цитратный буфер, ацетатный буфер и фосфатный буфер. Среди них предпочтительны натрий-ацетатный буфер или натрий-цитратный буфер. Концентрация уксусной кислоты в натрий-ацетатном буфере составляет предпочтительно от 5 мМ до 100 мМ и более предпочтительно от 5 мМ до 50 мМ по общему объему раствора. pH буфера составляет предпочтительно от 4,0 до 8,0, более предпочтительно от 5,0 до 7,0 и еще более предпочтительно от 5,0 до 6,5.

Сахарный спирт действует, повышая стабильность комбинации длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида. В настоящем изобретении концентрация сахарного спирта предпочтительно составляет от 1 до 20% (масс./об.) по общему объему композиции и более предпочтительно в количестве от 1 до 15% (масс./об.) по общему объему композиции. Примеры сахарного спирта, полезного в настоящем изобретении, включают маннит и сорбит, и предпочтительным примером является маннит.

Изотонический агент оказывает эффект поддержания подходящего осмотического давления при введении комбинации длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида в организм. Кроме того, изотонический агент оказывает эффект дополнительной стабилизации комбинации в растворе. Изотонический агент обычно представляет собой водорастворимую неорганическую соль, включая хлорид натрия, сульфат натрия, цитрат натрия, и предпочтительно представляет собой хлорид натрия. Содержание изотонического агента можно надлежащим образом корректировать в соответствии с типом и количеством компонентов, включенных в композицию, таким образом, что жидкая композиция, содержащая всю смесь, может представлять собой изотонический раствор. Концентрация такого изотонического агента может составлять, без ограничения, от 0,5 мг/мл до 30 мг/мл по общему объему раствора.

Неионное поверхностно-активное вещество уменьшает поверхностное натяжение белкового раствора, предотвращая абсорбцию или агрегацию белков на гидрофобной поверхности. Примеры неионного поверхностно-активного вещества, полезного в настоящем изобретении, включают полисорбаты, полоксамеры и их комбинации, предпочтительно полисорбаты.

Неионными поверхностно-активными веществами-полисорбатами являются полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60 и полисорбат 80. Наиболее предпочтительным неионным поверхностно-активным веществом является полисорбат 20.

Использование неионного поверхностно-активного вещества в высокой концентрации в жидкой композиции не является подходящим из-за того, что неионное поверхностно-активное вещество в высокой концентрации вызывает мешающие эффекты при измерении концентрации белка и определении стабильности белка такими аналитическими методами, как UV-спектроскопия или изоэлектрическое фокусирование, затрудняя посредством этого точную оценку стабильности белка. Поэтому жидкая композиция по настоящему изобретению содержит неионное поверхностно-активное вещество предпочтительно в низкой концентрации менее 0,2% (масс./об.), более предпочтительно от 0,001% до 0,05% (масс./об.).

Метионин, содержащийся в стабилизаторе по настоящему изобретению оказывает эффект дополнительной стабилизации целевого белка, подавляя образование примесей, которое может происходить из-за окисления белка в растворе. Концентрация метионина составляет от 0,005% до 0,1% (масс./об.) по общему объему раствора и предпочтительно от 0,01% до 0,1% (масс./об.) по общему объему раствора.

Согласно одному примеру настоящего изобретения, было показано, что при добавлении хлорида натрия в качестве изотонического агента в присутствии буфера, сахарного спирта и неионного поверхностно-активного вещества стабильность комбинации длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида при хранении была существенно повышена. Это показывает, что использование хлорида натрия в качестве изотонического агента вместе с буфером, сахарным спиртом и неионным поверхностно-активным веществом оказывает синергические эффекты, улучшая посредством этого стабильность комбинации длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида.

Предпочтительно, чтобы стабилизатор по настоящему изобретению не содержал альбумина. Поскольку человеческий сывороточный альбумин, доступный в качестве стабилизатора белка, получают из человеческой сыворотки, всегда есть вероятность его заражения патогенными вирусами человеческого происхождения. Желатин или бычий сывороточный альбумин могут вызывать заболевания или могут иметь склонность к индуцированию аллергического ответа у некоторых пациентов. Не содержащий гетерологичных белков, таких как сывороточные альбумины человеческого или животного происхождения или очищенный желатин, стабилизатор по настоящему изобретению не может приводить к заражению вирусами.

Кроме того, стабилизатор по настоящему изобретению может дополнительно содержать сахара, полиспирт или нейтральные аминокислоты. Предпочтительные примеры сахаров, которые могут быть дополнительно добавлены для повышения стабильности комбинации длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида при хранении, включают моносахариды, такие как манноза, глюкоза, фукоза и ксилоза, и полисахариды, такие как лактоза, мальтоза, сахароза, раффиноза и декстран. Предпочтительные примеры полиспирта включают пропиленгликоль, низкомолекулярный полиэтиленгликоль, глицерин, низкомолекулярный полипропиленгликоль и их комбинацию.

Жидкая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать другие вещества и материалы, известные в данной области, селективным образом, в дополнение к описанным выше буферу, изотоническому агенту, сахарному спирту и неионному поверхностно-активному веществу, при условии отсутствия влияния на эффект настоящего изобретения.

Не содержащая альбумина высококонцентрированная жидкая композиция комбинации по настоящему изобретению, обеспечивающая стабильность комбинации длительно действующих конъюгата инсулина и конъюгата инсулинотропного пептида, не несет риска заражения вирусами, обеспечивая в то же время превосходную стабильность при хранении при простоте композиции, и, таким образом, настоящая композиция может быть обеспечена более выгодным с экономической точки зрения образом по сравнению с композициями, полученными с применением других стабилизаторов или лиофильной сушки.

Кроме того, поскольку жидкая композиция по настоящему изобретению содержит длительно действующие конъюгат инсулина и конъюгат инсулинотропного пептида с увеличенной продолжительностью сохранения физиологической активности по сравнению с нативным пептидом, она может быть использована в качестве эффективной лекарственной композиции, сохраняя активность белка в организме на протяжении более длительного периода по сравнению с обычной композицией инсулина и инсулинотропного пептида. Кроме того, настоящая жидкая композиция обеспечивает превосходную стабильность для хранения комбинации длительно действующих конъюгата инсулина и конъюгата инсулинотропного пептида в высокой концентрации.

Предпочтительно, жидкая композиция по настоящему изобретению может содержать длительно действующий конъюгат инсулина, где инсулин и инсулинотропный пептид связаны с фрагментом иммуноглобулина через полиэтиленгликоль, длительно действующий инсулинотропный пептид и не содержащий альбумина стабилизатор, который содержит ацетатный буфер, манит, полисорбат 20 и хлорид натрия. Кроме того, жидкая композиция может дополнительно содержать метионин.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ получения жидкой композиции по настоящему изобретению.

Стабильная жидкая композиция комбинации длительно действующих конъюгата инсулина и конъюгата инсулинотропного пептида может быть получена посредством получения длительно действующих конъюгата инсулина и инсулинотропного пептида и смешивания полученных длительно действующих конъюгата инсулина и инсулинотропного пептида со стабилизатором, содержащим буфер, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и изотонический агент.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложена композиция для предотвращения или лечения диабета, содержащая конъюгат инсулина и конъюгат инсулинотропного пептида.

Композиция по настоящему изобретению характеризуется тем, что она позволяет вводить длительно действующий конъюгат инсулина и длительно действующий конъюгат инсулинотропного пептида совместно.

При совместном введении длительно действующих конъюгата инсулина и конъюгата инсулинотропного пептида длительно действующий конъюгат инсулина действует на рецептор инсулина и длительно действующий конъюгат инсулинотропного пептида одновременно действует на рецептор глюкагоноподобного пептида-1. Поэтому совместное введение двух конъюгатов позволяет эффективнее снижать уровень глюкозы в крови, демонстрируя стабильные изменения, по сравнению с раздельным введением двух конъюгатов. Кроме того, при совместном введении двух конъюгатов это снижает риск гипогликемии, что может быть показано при введении инсулина самого по себе, уменьшает массу тела и также снижает общую дозу инсулина, благодаря присутствию инсулинотропного пептида. Кроме того, доза инсулинотропного пептида, такого как эксендин-4, может быть снижена, и, таким образом, совместное введение обладает преимуществами уменьшения побочных эффектов, таких как тошнота и рвота, которые можно наблюдать при введении эксендина-4 самого по себе. Применение длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида может существенно увеличивать период полувыведения и продолжительность сохранения лекарственного средства in vivo, что крайне полезно для лечения диабета, снижая частоту введения у пациента с хроническим диабетом, нуждающегося в ежедневном введении, улучшая посредством этого качество жизни пациента. Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению имеет превосходную продолжительность сохранения и титр in vivo, и ее использование позволяет существенно снизить дозу, применяя способ совместного введения.

Длительно действующий конъюгат инсулина и длительно действующий конъюгат инсулинотропного пептида можно вводить одновременно, последовательно или в обратном порядке. Кроме того, их можно вводить одновременно в форме комбинации двух компонентов в эффективном количестве. Предпочтительно, длительно действующий конъюгат инсулина и длительно действующий конъюгат инсулинотропного пептида могут быть помещены в один контейнер и затем введены совместно.

Кроме того, композиция для совместного введения длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида по настоящему изобретению может быть редставлена в форме набора для лечения диабета, изготовленного в одном контейнере. Такой набор может содержать фармацевтически приемлемый носитель и инструкцию по применению набора.

Мыши со стрептозотоцин (STZ)-индуцированной гипергликемией осуществляли совместное введение длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида и мониторинг изменений уровня глюкозы в крови. В результате при совместном введении конъюгатов изменения уровня глюкозы в крови были стабильнее, чем при раздельном введении конъюгатов. В другом эксперименте в модели диабета 2 типа мыши осуществляли совместное введение длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида раз в неделю и затем сравнивали изменение уровня глюкозы в крови натощак до и после введения. В результате, совместное введение продемонстрировало больший эффект по регуляции уровня глюкозы в крови по сравнению с раздельным введением двух конъюгатов, и после введения инсулина не наблюдали увеличения массы тела, подтверждая, что совместное введение позволяет снизить побочные эффекты увеличения массы тела, обусловленные инсулином.

При использовании здесь «диабет» относится к метаболическому заболеванию, при котором секреция инсулина недостаточна или инсулин не может правильно функционировать. Диабет можно лечить посредством совместного введения субъекту композиции по настоящему изобретению, регулируя уровень сахара в крови.

При использовании здесь термин «предотвращение» относится ко всем действиям, предотвращающим или задерживающим начало диабета посредством совместного введения композиции по настоящему изобретению. Термин «лечение» относится ко всем действиям, позволяющим облегчить или положительным образом изменить симптомы диабета посредством совместного введения композиции по настоящему изобретению. Лечение диабета может быть применено у любых млекопитающих, у которых возможно развитие диабета, и примеры таких млекопитающих включают, без ограничения, человека и приматов, а также домашних животных, таких как коровы, свиньи, овцы, лошади, собаки и кошки, и предпочтительно человека.

При использовании здесь термин «введение» относится к введению предопределенного количества вещества пациенту определенным подходящим способом. Композиции могут быть введены любым из обычных способов введения, при условии, что это позволяет достичь ткани-мишени. Способы введения включают, без ограничения, внутрибрюшинное, внутривенное, внутримышечное, подкожное, внутрикожное, пероральное, местное, интраназальное, внутрилегочное и интраректальное введение. Тем не менее из-за расщепления пептидов при пероральном введении активные ингредиенты композиции для перорального введения необходимо снабжать покрытием или изготавливать с защитой от расщепления в желудке. Предпочтительно, конъюгат может быть введен в форме для инъекций. Кроме того, композиции могут быть введены с использованием определенного устройства, способного транспортировать активные ингредиенты в клетку-мишень.

Кроме того, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению могут определять несколько факторов, включая типы заболеваний, подлежащих лечению, способы введения, возраст, пол и массу тела пациента, тяжесть заболевания, а также типы активного компонента лекарственного средства.

Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемые носители. При использовании здесь «фармацевтически приемлемый носитель» относится к носителю или разбавителю, не нарушающему физиологическую активность и свойства вводимого соединения без стимуляции субъекта. Для перорального введения фармацевтически приемлемый носитель может включать связывающий агент, смазывающий агент, разрыхлитель, эксципиент, солюбилизатор, диспергирующий агент, стабилизатор, суспендирующий агент, краситель и отдушку. Для композиции для инъекций фармацевтически приемлемый носитель может включать буферный агент, консервант, анальгетик, солюбилизатор, изотонический агент и стабилизатор. Для композиций для местного введения фармацевтически приемлемый носитель может включать основу, эксципиент, смазывающий агент и консервант.Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть изготовлена в различных формах посредством добавления фармацевтически приемлемых носителей. Например, для перорального введения фармацевтическая композиция может быть изготовлена в форме таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов или облаток. Для препаратов для инъекций фармацевтическая композиция может быть изготовлена в форме однодозовой ампулы или многодозового контейнера. Фармацевтическая композиция может также быть изготовлена в форме растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул и композиции с длительным высвобождением.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ предотвращения или лечения диабета, включающий введение композиции, содержащей длительно действующий конъюгат инсулина и длительно действующий конъюгат инсулинотропного пептида субъекту, у которого может развиться или уже развился диабет.

На стадии введения длительно действующий конъюгат инсулина и длительно действующий конъюгат инсулинотропного пептида могут быть введены совместно, где подходящее эффективное количество конъюгатов объединяют и вводят одновременно.

Композиция по настоящему изобретению, содержащая как длительно действующий конъюгат инсулина, так и длительно действующий конъюгат инсулинотропного пептида, может эффективно снижать уровень глюкозы в крови, даже при снижении частоты введения, и не приводит к побочному эффекту, такому как увеличение массы тела, и, таким образом, ее можно эффективно применять для предотвращения или лечения диабета.

ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на Примеры. Тем не менее эти Примеры приведены лишь в иллюстративных целях, и изобретение не следует ограничивать этими Примерами.

Пример 1: Оценка стабильности длительно действующего конъюгата инсулина

В качестве способа увеличения периода полувыведения лекарственного средства из сыворотки и предотвращения гипогликемии в организме был разработан длительно действующий конъюгат инсулина. Таким образом, конъюгат инсулина, полученный посредством сайт-специфичной конъюгации Fc-области иммуноглобулина, непептидильного полимера и инсулина через ковалентные связи, имеет увеличенный период полувыведения из сыворотки и снижает риск гипогликемии.

Для оценки стабильности такого длительно действующего конъюгата инсулина композиции получали согласно Таблице 1, хранили при 40°C на протяжении 2 недель и анализировали стабильность пептида в них посредством ионообменной хроматографии (IE-HPLC).

На данном этапе основными факторами, способствующими стабильности пептида, были pH, тип и концентрация буфера, тип изотонического агента, концентрация сахарного спирта, состоящего из маннита, тип поверхностно-активного вещества, концентрация поверхностно-активного вещества, состоящего из полисорбата 20, присутствие или отсутствие других добавок и совместное добавление метионина и хлорида натрия. Концентрация длительно действующего конъюгата инсулина в каждой композиции составляла 61,1 мг/мл, и эти композиции были использованы для эксперимента.

IE-HPLC (%) в Таблице 1 приведены как значение «% площади/% исходной площади», показывая остаточную степень чистоты длительно действующего конъюгата инсулина по сравнению с исходной степенью чистоты.

Как показано в Таблице 2, длительно действующий конъюгат инсулина был наиболее стабилен в жидкой композиции, содержащей буфер, состоящий из ацетата натрия, изотонический агент, состоящий из хлорида натрия, сахарный спирт, состоящий из маннита и поверхностно-активное вещество, состоящее из полисорбата 20, при pH 5,6 или 6,0.

Пример 2: Оценка стабильности длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида

Для подтверждения растворимости длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида при различных pH и в зависимости от присутствия стабилизатора получали различные жидкие композиции длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида следующего состава, как показано в Таблице 3, и хранили их при 40°C на протяжении 1 недели. Затем сравнивали стабильность конъюгата посредством мониторинга преципитации белка невооруженным глазом. В каждой композиции концентрация длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида составляла 10 мг/мл, и эксперимент проводили, используя эти композиции.

Продолжительность (в сутках) отсутствия преципитации белка на Фиг. 1 представляет собой время, в течение которого не происходило преципитации белка при хранении композиции при 40°С. Как показано выше, с ацетатом натрия, pH от 5,0 до 5,4 (№1, №2 и №3), или с 5% (масс./об.) маннита (№5) преципитация белка происходила за 4 суток хранения при 40°С. Тем не менее, при pH 5,6 и добавлении 10% (масс./об.) маннита в композицию растворимость повышалась и преципитации не происходило на протяжении 7 суток (Фиг. 1).

Пример 3: Оценка стабильности комбинации длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида

Основываясь на отдельной жидкой композиции, осуществляли сравнение стабильности комбинации длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида. Также было определено, как добавление хлорида натрия и метионина, которые важны для стабилизации длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида, соответственно, влияет на стабильность комбинации длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида.

Получали жидкие композиции длительно действующего конъюгата инсулина, длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида или комбинации длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида следующего состава, как показано в Таблице 4, и хранили их при 40°C на протяжении 4 недель. Затем проводили анализ стабильности композиции комбинации двух конъюгатов в сравнении со стабильностью отдельных конъюгатов, посредством мониторинга преципитации белка и посредством применения ионообменной хроматографии (IE-HPLC), гель-хроматографии (SE-HPLC) и высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RP-HPLC).

Концентрация длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида (контроль-1, №1-№4) и длительно действующего конъюгата инсулина (контроль-2, №1-№4) в каждой жидкой композиции составляла 10 мг/мл и 61,1 мг/мл, соответственно.

На Фиг. 2-3 приведены результаты IE-HPLC- и RP-HPLC-анализа как значения «% площади/% исходной площади», показывающие остаточную степень чистоты длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида по сравнению с исходной степенью чистоты. Среди них на Фиг. 2 показаны результаты IE-HPLC- и RP-HPLC-анализа длительно действующего конъюгата инсулина, в то время как на Фиг. 3 показаны результаты IE-HPLC- и RP-HPLC-анализа длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида.

Как показано выше, при сравнении стабильности комбинации длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида со стабильностью длительно действующего конъюгата инсулина или длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида было обнаружено, что длительно действующий конъюгат инсулина имел сходную степень чистоты и стабильность в комбинированных композициях (композиции №3 и №4) и раздельных композициях (Фиг. 2).

Тем не менее, при включении метионина в жидкую композицию, содержащую 10 мМ ацетата натрия, pH 6,0, 10 мг/мл хлорида натрия, 10% (масс./об.) маннита, 0,02% (масс./об.) полисорбата 20 (то есть композицию №4) стабильность длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида была улучшена по сравнению с таковой в композиции без метионина (Фиг. 3). Это может быть обусловлено тем фактом, что метионин действует, предотвращая окисление длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида. Провести сравнение с раздельной композицией длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида было невозможно из-за чрезмерной преципитации.

Как показано на Фиг. 4, в раздельной композиции длительно действующего конъюгата инсулина преципитация происходила за 2 недели, в то время как композиции комбинации длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида (композиции №3 и №4) имели повышенную растворимость и преципитация в них подавлялась на протяжении относительно более длительного периода времени продолжительностью до 4 недель.

Эти результаты показывают, что состав жидкой композиции по настоящему изобретению позволяет поддерживать высокую стабильность комбинации конъюгата инсулинотропного пептида и конъюгата инсулина в высокой концентрации.

Пример 4: Оценка стабильности комбинации длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида в зависимости от концентраций изотонического агента и сахарного спирта

Сравнивали стабильность комбинации длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида между комбинацией конъюгатов в жидкой композиции, содержащей от 4,8 до 6,7 мг/мл хлорида натрия в качестве изотонического агента, от 1 до 2% (масс./об.) маннита в качестве сахарного спирта и маннит, и комбинацией в жидкой композиции по Примеру 2 (10 мМ ацетата натрия, pH 6,0, 10 мг/мл хлорида натрия, 10% (масс./об.) маннита, 0,02% (масс./об.) полисорбата 20, 0,01% (масс./об.) метионина).

Получали жидкие композиции комбинации длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида следующего состава, как показано в Таблице 5, и хранили их при 25°C на протяжении 4 недель. Затем стабильность конъюгатов исследовали посредством IE-HPLC, SE-HPLC и RP-HPLC.

IE-HPLC (%) и RP-HPLC (%) в Таблицах 6 и 7 приведены как значение «% площади/% исходной площади», показывая остаточную степень чистоты комбинации длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида по сравнению с исходной степенью чистоты. Среди них в Таблице 6 показаны результаты IE-HPLC- и RP-HPLC-анализа длительно действующего конъюгата инсулина, в то время как в Таблице 7 показаны результаты IE-HPLC- и RP-HPLC-анализа длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида.

Как показано выше, при снижении концентрации хлорида натрия до 4,8 мг/мл и снижении концентрации маннита до 1-2% (масс./об.) (композиции №1 и №2) и при снижении концентрации хлорида натрия до 6,7 мг/мл и снижении концентрации маннита до 1-2% (масс./об.) (композиции №3 и №4) по сравнению с жидкой композицией по Примеру 3 (10 мМ ацетата натрия, pH 6,0, 10 мг/мл хлорида натрия, 10% (масс./об.) маннита, 0,02% (масс./об.) полисорбата 20, 0,01% (масс./об.) метионина), все четыре проанализированные композиции продемонстрировали высокую стабильность, сходную с жидкой композицией по Примеру 3.

Эти результаты показывают, что, если жидкая композиция по настоящему изобретению содержит хлорид натрия в качестве изотонического агента и маннит в качестве сахарного спирта, даже при низкой концентрации хлорида натрия в качестве изотонического агента и низкой концентрации маннита в качестве сахарного спирта, она может обеспечить такую же степень стабильности комбинации конъюгата инсулина и конъюгата инсулинотропного пептида.

На основании приведенного выше описания специалисту в данной области будет ясно, что возможны различные модификации и изменения без выхода за рамки объема и сущности изобретения. Поэтому следует понимать, что приведенное выше воплощение во всех аспектах является иллюстративным, но не ограничивающим. Объем изобретения определен в приложенной формуле изобретения, но не в предшествующем описании, и поэтому подразумевают, что формула изобретения включает все изменения и модификации, не выходящие за рамки границ и пределов формулы изобретения или эквивалентов таких границ и пределов.

Группа изобретений относится к области фармакологии и медицины и касается жидкой композиции, содержащей комбинацию длительно действующего инсулина в форме, в которой инсулин связан с Fc-областью иммуноглобулина и инсулинотропного пептида, который находится в форме, в которой пептид связан с Fc-областью иммуноглобулина. Композиция не содержит альбумина, а стабилизатор содержит буфер, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и изотонический агент. Заявлен также способ получения жидкой композиции. Группа изобретений обеспечивает превосходную стабильность при хранении композиции, содержащей конъюгат инсулина и конъюгат инсулинотропного пептида в высокой концентрации без риска заражения вирусами. 2 н. и 31 з.п. ф-лы, 4 пр., 7 табл.,4 ил.

1. Жидкая композиция комбинации длительно действующих инсулина и инсулинотропного пептида, содержащая длительно действующий конъюгат инсулина и длительно действующий конъюгат инсулинотропного пептида, и не содержащий альбумина стабилизатор, который содержит буфер, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и изотонический агент, где

длительно действующий конъюгат инсулина находится в форме, в которой инсулин связан с Fc-областью иммуноглобулина,

длительно действующий конъюгат инсулинотропного пептида находится в форме, в которой инсулинотропный пептид связан с Fc-областью иммуноглобулина, и

диапазон рН буфера составляет от 5,0 до 7,0.

2. Жидкая композиция по п. 1, где инсулин имеет такую же аминокислотную последовательность, как нативный инсулин.

3. Жидкая композиция по п. 1, где инсулин представляет собой производное инсулина, полученное из нативного инсулина посредством аминокислотной замены, делеции или вставки, или пептидный агонист, имеющий сходную с нативным инсулином активность.

4. Жидкая композиция по п. 1, где инсулинотропный пептид выбран из группы, состоящей из глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1), глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2), эксендина-3, эксендина-4, и их предшественников, агонистов, производных, фрагментов и вариантов и их комбинаций.

5. Жидкая композиция по п. 4, где вариант инсулинотропного пептида представляет собой имидазоацетилэксендин-4.

6. Жидкая композиция по п. 1, где Fc-область иммуноглобулина представляет собой Fc-область, имеющую происхождение от IgG, IgA, IgD, IgE или IgM.

7. Жидкая композиция по п. 6, где Fc-область иммуноглобулина представляет собой гибрид доменов из разных источников, имеющих происхождение от иммуноглобулинов, выбранных из группы, состоящей из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM.

8. Жидкая композиция по п. 6, где Fc-область иммуноглобулина представляет собой димер или мультимер, состоящий из одноцепочечных иммуноглобулинов, состоящих из доменов из одного и того же источника.

9. Жидкая композиция по п. 6, где Fc-область иммуноглобулина представляет собой Fc-область IgG4.

10. Жидкая композиция по п. 9, где Fc-область иммуноглобулина представляет собой человеческую агликозилированную Fc-область IgG4.

11. Жидкая композиция по п. 1, где каждый из инсулина в длительно действующем конъюгате инсулина и инсулинотропного пептида в длительно действующем конъюгате инсулинотропного пептида связан с Fc-областью иммуноглобулина с применением непептидильного полимера или рекомбинантной методики.

12. Жидкая композиция по п. 11, где непептидильный полимер представляет собой полиэтиленгликоль.

13. Жидкая композиция по п. 11, где непептидильный полимер выбран из группы, состоящей из биоразлагаемого полимера, такого как полипропиленгликоль, сополимер этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированный полиол, поливиниловый спирт, полисахарид, декстран, поливинилэтиловый эфир, полимолочная кислота (PLA) и сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA); липидного полимера; хитинов; гиалуроновой кислоты и их комбинации.

14. Жидкая композиция по п. 1, где концентрация длительно действующего конъюгата инсулина в фармацевтически эффективном количестве составляет от 10 мг/мл до 200 мг/мл и концентрация длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида составляет от 0,5 мг/мл до 150 мг/мл.

15. Жидкая композиция по п. 1, где сахарный спирт представляет собой один или более, выбранный из группы, состоящей из маннита и сорбита.

16. Жидкая композиция по п. 15, где концентрация сахарного спирта составляет от 1% (масс./об.) до 15% (масс./об.) по общему объему композиции.

17. Жидкая композиция по п. 1, где буфер представляет собой цитратный буфер, ацетатный буфер или фосфатный буфер.

18. Жидкая композиция по п. 1, где буфер представляет собой цитратный буфер или ацетатный буфер.

19. Жидкая композиция по п. 1, где буфер представляет собой ацетатный буфер.

20. Жидкая композиция по п. 1, где концентрация буфера составляет от 5 мМ до 50 мМ по общему объему композиции.

21. Жидкая композиция по п. 1, где диапазон рН буфера составляет от 5,6 до 6,5.

22. Жидкая композиция по п. 1, где диапазон рН буфера составляет от 5,5 до 7,0.

23. Жидкая композиция по п. 1, где диапазон рН буфера составляет от 5,5 до 6,5.

24. Жидкая композиция по п. 1, где изотонический агент выбран из группы, состоящей из хлорида натрия, сульфата натрия и цитрата натрия.

25. Жидкая композиция по п. 1, где концентрация изотонического агента составляет от 0,5 мг/мл до 30 мг/мл.

26. Жидкая композиция по п. 1, где неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат или полоксамер.

27. Жидкая композиция по п. 26, где концентрация неионного поверхностно-активного вещества составляет от 0,001% (масс./об.) до 0,05% (масс./об.).

28. Жидкая композиция по п. 1, где стабилизатор дополнительно содержит метионин.

29. Жидкая композиция по п. 28, где концентрация метионина составляет от 0,005% (масс./об.) до 0,1% (масс./об.) по общему объему композиции.

30. Жидкая композиция по п. 1, где стабилизатор дополнительно содержит одно или более чем одно вещество, выбранное из группы, состоящей из сахаров, полиспирта и аминокислот.

31. Жидкая композиция по п. 1, содержащая длительно действующий конъюгат инсулина и длительно действующий конъюгат инсулинотропного пептида, где каждый из инсулина и инсулинотропного пептида связан с Fc-областью иммуноглобулина через полиэтиленгликоль, и не содержащий альбумина стабилизатор, который содержит ацетатный буфер, маннит, полисорбат 20 и хлорид натрия.

32. Жидкая композиция по п. 1, дополнительно содержащая метионин.

33. Способ получения жидкой композиции по любому из пп. 1-32, включающий смешивание длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата инсулинотропного пептида со стабилизатором, содержащим буфер, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и изотонический агент, где

длительно действующий конъюгат инсулина находится в форме, в которой инсулин связан с Fc-областью иммуноглобулина,

длительно действующий конъюгат инсулинотропного пептида находится в форме, в которой инсулинотропный пептид связан с Fc-областью иммуноглобулина, и

диапазон рН буфера составляет от 5,0 до 7,0.