Способ получения наночастиц коллоидного золота со средним диаметром 25-30 нм Российский патент 2018 года по МПК B01J13/00 C01G7/00 B82B3/00 B82Y30/00 B22F9/24 

Изобретение относится к коллоидной химии и иммунохимии, а именно к области получения наночастиц коллоидного золота (НчКЗ) размером 25-30 нм, которые могут быть использованы в качестве маркеров в иммунохроматографии.

Известна методика получения НчКЗ заданного размера цитратным методом Френса [Frens G. // Nat. Phys. Sci. - 1973. - V. 241. - №105. P. 20-22]. К кипящему 0,01%-ному водному раствору золотохлористоводородной кислоты HAuCl₄⋅3H₂O (ЗХВК) добавляют 1%-ный водный раствор цитрата натрия в объеме, зависящем от требуемого размера частиц. Объем 1%-ного раствора цитрата натрия, который необходимо добавить на 100 мл золя для получения заданного размера НЧКЗ, рассчитывают по следующей формуле

,

где d - средний диаметр НчКЗ, нм; V - объем 1%-ного раствора цитрата натрия [Титов, А.А. Разработка и оптимизация иммунохроматографических тестов для выявления ботулинических токсинов / А.А. Титов, И.В. Шиленко, А.А. Морозов, С.П. Ярков, В.Н. Злобин // Прикладная биохимия и микробиология. - 2012. - Т. 48, №2. - C. 249-256].

Метод Френса позволяет получать сравнительно монодисперсные наночастицы золота с диаметром 10-60 нм [Уточкин С.Д. Синтез наночастиц золота, серебра и Au/Ag сплава цитратным методом / С.Д. Уточкин, Т.А. Шерстнева, М.Ю. Королева // Успехи в химии и химической технологии. - 2010. - Т. 24, №7 (112). - C. 122-126].

Цитратный метод Френса использован в работе Н.В. Бызовой [Бызова Н.В. Разработка иммунохроматографической тест-системы для детекции антигенов Helicobacter pylori / Н.А. Бызова, А.В. Жердев, П.Г. Свешников, Э.Г. Сыдыхов, Б.Б. Дзантиев // Прикладная биохимия и микробиология. - 2015. - Т. 51, №5. - С. 520-530]. Методику, использованную в данной работе, осуществляют следующим образом. К 97,5 мл деионизированной воды добавляют 1,0 мл 1% раствора золотохлористоводородной кислоты, доводят до кипения и при перемешивании добавляют 1,5 мл 1% раствора цитрата натрия. Смесь кипятят 25 мин, охлаждают и хранят при температуре 4-6°С. Размеры и однородность синтезированных НчКЗ оценивают с помощью просвечивающего электронного микроскопа типа СХ-100 («Jeol», Япония). При использовании данной методики удается получить препарат наночастиц, не содержащий конгломератов. Форма НчКЗ близка к сферической, средний диаметр составляет 34 нм.

Другим примером применения восстановления ЗХВК цитратом натрия является работа А.А. Титова и соавт. [Титов А.А. Разработка и оптимизация иммунохроматографических тестов для выявления ботулинических токсинов / А.А. Титов, И.В. Шиленко, А.А. Морозов, С.П. Ярков, В.Н. Злобин // Прикладная биохимия и микробиология. - 2012 - Том 48. - №2. - С. 249-256]. НчКЗ диаметром 25-47 нм получают по методу Френса восстановлением HAuCl₄ цитратом натрия. К 100 мл деионизованной воды добавляют 1 мл 1%-ного HAuCl₄, раствор доводят до кипения и при перемешивании добавляют 1%-ный цитрат натрия в объеме, зависящем от целевого диаметра наночастиц. Для НчКЗ с диаметром 25 нм вносят 2,0 мл, 31 нм - 1,25 мл, 47 нм - 1,0 мл 1%-ного раствора цитрата натрия. После чего растворы кипятят еще 5 мин и охлаждают до комнатной температуры. Препараты НчКЗ хранят при температуре плюс 4-6°C в темноте. Для проведения электронной микроскопии образцы НчКЗ наносят на медные сеточки, покрытые пленкой - подложкой из поливинилформаля. Снимки препаратов НчКЗ получают на электронном трансмиссионном микроскопе типа JEM1011 ("Jeol", Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ и увеличении 320000.

Наиболее близким к заявленному способу является способ получения частиц коллоидного золота диаметром 30 нм с помощью цитратного восстановления [Hermanson G. Bioconjugate Techniques. Second Edition / Greg.Hermanson // Academic Press. - 2008. - P. 924]. Готовят 1 мл 4%-ного раствора ЗХВК в деионизированной воде, 0,5 мл полученного раствора добавляют в 200 мл деионизированной воды, доводят до кипячения при перемешивании. В кипящую воду при быстром перемешивании вносят 3 мл 1%-ного раствора цитрата натрия и кипятят еще 30 мин. Признаком образования коллоидных частиц золота является переход цвета раствора с синего на красный.

Общим с заявленным способом является восстановление ЗХВК цитратом натрия, а также целевой диаметр наночастиц - 30 нм. Однако в вышеописанном способе отсутствует ряд данных, необходимых для его воспроизведения: не задан режим перемешивания (количество оборотов «перемешивающего» стержня в минуту и температура нагревания раствора на разных этапах получения НчКЗ), а также время и условия внесения реагентов, что не позволяет считать указанный способ релевантным по отношению к предлагаемому.

При анализе научной литературы также выявлено, что существуют различные модификации метода Френса. Например, в одних источниках хлористоводородную кислоту добавляют сразу, а цитрат натрия - при закипании, в других - и тот, и другой реагент вносят последовательно при закипании [Дыкман Л.А. Золотые наночастицы: синтез, свойства, биомедицинское применение / Л.А. Дыкман, В.А. Богатырев, С.Ю. Щеголев, Н.Г. Хлебцов. - М.: Наука. - 2008. - 319 с.].

Имеются расхождения по объему вносимого в раствор ЗХВК цитрата натрия для получения частиц с заданным размером. В таблице 1 представлен сравнительный анализ показателей из нескольких научно-исследовательских работ, в которых имеется информация по объему вносимого в раствор ЗХВК цитрата натрия для получения частиц с заданным размером при приготовлении его по методу Френса, и данных расчета объема цитрата натрия, который необходимо добавить в раствор ЗХВК, чтобы получить частицы соответствующего размера по формуле, также рекомендуемой для использования в отдельных работах [Dressier D. Botulinum toxin antibody testing: comparison between the immunoprecipitation assay and the mouse diaphragm assay / D. Dressier, G. Dirnberger / European Neurology. - 2001. - V. 45, №4. - P. 257-260].

Из данных, представленных в таблице 1, следует, что при приготовлении по методу Френса частиц НчКЗ большего диаметра количество цитрата натрия, добавляемого в раствор, уменьшается как по данным различных литературных источников, так и при расчете по формуле. Однако при сравнении данных литературы и данных, полученных при расчете объема цитрата натрия, добавляемого в раствор, по формуле для одного диаметра частиц наблюдается, что в первом случае цитрата натрия рекомендуют добавлять больше, чем во втором.

В иммунохроматографии (ИХА) применяют как препараты НчКЗ малого - 3-5 нм, так и большого диаметра - до 50 нм. Однако наибольший интерес для ИХА представляют НчКЗ с диаметром 25±5 нм. Именно частицы данного размера по данным статей являются наиболее оптимальными для эффективной сорбции антител, обеспечивают адекватную миграцию меченных коллоидным золотом антител через пористую структуру нитроцеллюлозной мембраны и визуальную детекцию сигнала в тестовой зоне [Бызова Н.В. Влияние состава конъюгата коллоидного золота с белками на эффективность их использования в иммунохроматографическом анализе / Н.В. Бызова, Д.В. Сотников // Современные проблемы науки и образования. - 2013 - №3. - С. 1-8].

Выявленное большое число модификаций цитратного метода Френса, а также отсутствие четких рекомендаций по приготовлению коллоидного золота, обуславливают целесообразность отработки пошагового способа получения НчКЗ среднего диметра 25-30 нм, оптимального для эффективной сорбции антител.

Технический результат изобретения заключатся в получении наночастиц коллоидного золота диаметром 25-30 нм.

Технический результат достигается путем отработки этапов приготовления коллоидного золота с учетом всех необходимых температурных и временных параметров, а также режимов перемешивания, установленных на каждом этапе, обеспечивающих получение кондиционного НчКЗ со средним диаметром частиц 25-30 нм, и включает следующие стадии: на магнитной мешалке устанавливают температуру 300°C и режим перемешивания 375 об/мин; в колбу Эрленмейера добавляют 49,23 мл деионизированной воды комнатной температуры и вносят «перемешивающий» стержень магнитной мешалки; колбу с водой устанавливают на магнитную мешалку; через 6 мин (время фиксируется секундомером от момента постановки колбы с содержимым на плитку и начала нагрева до начала стекания конденсата по стенкам дефлегматора и/или колбы) вносят 0,058 мл 10%-ного раствора ЗХВК, кипятят 2 мин и вносят 0,72 мл 1% раствора 5,5-водного цитрата натрия; при переходе цвета раствора с синего на красный меняют режим перемешивания на магнитной мешалке с 375 об/мин на 500 об/мин и снижают температуру с 300°C до 200°C, раствор кипятят еще в течение 20 мин; через 20 мин отсоединяют колбу от обратного холодильника и снимают с магнитной мешалки; колбу с раствором НчКЗ оставляют при комнатной температуре на 18 ч с целью визуальной оценки качества приготовленного препарата.

На этапах приготовления препаратов НчКЗ с заданным размером частиц учитывают параметры, оказывающие влияние на размер частиц, такие как число оборотов мешалки, температура, время внесения реагентов относительно появления первых признаков закипания деионизированной воды, условия внесения раствора ЗХВК и время кипячения (с момента появления красной окраски до окончания эксперимента).

С целью подтверждения объективности выбора оптимальных условий приготовления НчКЗ со средним диаметром частиц 25-30 нм приводим результаты оценки серий препаратов НчКЗ, полученных при отработке отдельных этапов.

В ходе изобретения было определено влияние на качество приготовления НчКЗ следующих условий:

1) определение температуры воды, при которой необходимо вносить ЗХВК (в холодную, подогретую или кипящую воду);

2) установление времени появления первых признаков закипания (3 или 6 мин), когда следует вносить необходимые реагенты (ЗХВК и/или цитрат натрия);

3) определение оптимального значения числа оборотов мешалки в начале эксперимента (375 или 800 об/мин) и при появлении красной окраски раствора (500 или 800 об/мин).

В работе была использована золотохлористоводородная кислота HAuCl₄⋅3H₂O («Sigma», США), дистиллированная вода (ГОСТ 6709-72), деионизированная вода (ГОСТ 11.029.003-80), соляная и азотная кислота, цитрат натрия 5,5- водный («Реахим», Россия).

Для взвешивания реагентов использовали весы электронные аналитические Adventurer (OHAUS, США). Все реагенты готовили на деионизированной воде. Для получения деионизированной воды применяли систему UF Arium 611 UF («Sartorius», Германия).

Наночастицы коллоидного золота готовили, используя магнитную мешалку с подогревом («Heidolph», Германия). Оптические параметры препаратов наночастиц оценивали на сканирующем спектрофотометре СПЕКС СПП-705-4 (ЗАО «Спектроскопические системы», Россия). При спектрофотометрии оценивали оптическую плотность раствора в диапазоне длин волн до 300 до 600 нм, определяя значение длины волны, при которой наблюдается максимальный пик поглощения. Размеры, дисперсионные свойства, электронную плотность частиц анализировали на электронном трансмиссионном микроскопе JEM-1011 («Jeol», Япония).

Для приготовления 10%-ного раствора золотохлористоводородной кислоты к 1 г ЗХВК добавляли 10 мл деионизированной воды. Готовый раствор хранили во флаконе из темного стекла в холодильнике при температуре 4°С.

Раствор 1%-ного цитрата натрия готовили непосредственно перед постановкой каждого опыта, для этого к 50 мл деионизированной воды, учитывая водность (Na₃C₆H₅O₇×5,5H₂O), добавляли 0,69 г цитрата натрия и фильтровали через шприцевую фильтрующую насадку с размером пор 0,22 мкм.

Всю лабораторную посуду, предназначенную для приготовления препаратов НчКЗ, предварительно обрабатывают «царской водкой» (смесь концентрированных кислот соляной и азотной в соотношении 3:1) в течение 5 мин с последующим промыванием посуды двукратно в дистиллированной и двукратно в деионизированной воде, сушкой на воздухе и обработкой в сухожаровом шкафу всех флаконов (колб и др.) с закрытыми фольгой горлышками. Режим обработки в сухожаровом шкафу: 180°C, 60 мин.

Для приготовления 50 мл коллоидного золота серий №№1-6 было взято 0,058 мл 10% раствора ЗХВК. В ходе работы были отработаны условия внесения раствора ЗХВК. При приготовлении серий коллоидного золота №№1-4 10% ЗХВК вносили в подогретую воду, кипятили 2 минуты, затем добавляли 0,72 мл цитрата натрия. При приготовлении серий коллоидного золота №№5, 6 10% раствор ЗХВК вносили непосредственно при закипании воды и кипятили 2 мин до добавления цитрата натрия. Кроме этого, на данном этапе также установили необходимый интервал времени для внесения реагентов относительно появления первых признаков закипания деионизированной воды. Необходимость отработки указанного параметра связана с отсутствием видимых признаков закипания у деионизированной воды при правильном ее приготовлении. Было выбрано 2 временных интервала закипания деионизированной воды - 3 мин (появление конденсата) и 6 мин (начало стекания конденсата по стенкам дефлегматора и/или колбы). При этом при приготовлении серий №1 и №3 1%-ного раствор цитрата натрия вносили через 3 мин, серий №2 и №4 - через 6 мин. При приготовлении серий №5 и №6 10%-ного раствор ЗХВК вносили, соответственно, через 3 мин и 6 мин. Кроме этого, при прочих равных условиях, при приготовлении коллоидного золота использовали разные режимы скорости перемешивания растворов в процессе варки: для серий №1 и №2 - весь период варки золота проводили при 800 об/мин; для серий №3 и №4 - 375 об/мин с последующим увеличением числа оборотов мешалки с момента появления красной окраски до 500 об/мин. Для серий №5 и №6 использовали режим перемешивания 375 об/мин с последующим увеличением числа оборотов мешалки с момента появления красной окраски до 500 об/мин, при этом также изменили объем вносимого в раствор ЗХВК 1%-ного раствора цитрата натрия с 0,72 мл на 1,44 мл, чтобы убедиться, что изменение объема цитрата натрия, добавляемого к раствору, влияет на диаметр наночастиц. Для всех серий препаратов наночастиц температура нагревания воды в начале эксперимента была равна 200°C, при появлении красной окраски температуру повышали до 300°C.

Условия получения препаратов наночастиц коллоидного золота представлены в таблице 2.

Полученные препараты наночастиц коллоидного золота оценивали визуально, методом спектрофотометрии и электронной микроскопии, результаты исследования представлены в таблице 3.

Из данных, представленных в таблице 3, можно сделать вывод, что препараты НчКЗ серий №1 и №2 некондиционны и не могут быть использованы для дальнейшей работы. При визуальной оценке препаратов серий №1 и №2 выявлено, что раствор коллоидный, имеет синий цвет. По данным электронной микроскопии полученные частицы коллоидного золота неоднородны по форме и размеру, образуют большое количество конгломератов. На графиках, полученных при спектральном анализе препаратов наночастиц серий №1 и №2, отсутствует четко сформированный пик поглощения, невозможно оценить его ширину, что также свидетельствует о неоднородности и плохих дисперсионных свойствах НчКЗ.

Наиболее кондиционными оказались препараты серий №№3-6. Наночастицы в указанных сериях препаратов, по данным электронной микроскопии, однородны по форме и размерам. По результатам спектрофотометрии получены равнобедренные пики поглощения, подтверждающие хороший дисперсионный состав наночастиц. Препараты указанных серий по размерам частиц (от 15 до 30 нм) оказались, в соответствии с данными литературы, пригодными для дальнейшей разработки иммунохроматографических тест-систем. Препарат серии №3 от препарата серии №4 и препарат серии №5 от препарата серии №6 отличает большая однородность частиц и оптимальная, близкая к 1 ед. оптическая плотность раствора коллоидного золота для серий №4 и №6, что, по данным литературных источников [Дыкман, Л.А. Золотые наночастицы: синтез, свойства, биомедицинское применение / Л.А. Дыкман, В.А. Богатырев, С.Ю. Щёголев, Н.Г. Хлебцов // Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН. - М.: Наука. - 2008. - 319 с.], является также одним из критериев кондиционности КЗ и возможности его успешного использования для разработки иммунохроматографических тест-систем.

По результатам эксперимента было установлено, что:

1) добавление ЗХВК в подогретую или кипящую воду принципиально не влияет на качество полученных НчКЗ;

2) лучшие результаты получены при добавлении ЗХВК через 6 минут от начала подогрева реакционной смеси (постановки колбы на магнитную мешалку) до появления первых признаков закипания - начало стекания конденсата по стенкам колбы;

3) оптимальным режимом перемешивания раствора является следующий: в начале эксперимента 375 об/мин с последующим увеличением числа оборотов мешалки до 500 об/мин с момента появления красной окраски;

4) время экспозиции для стабилизации частиц после появления красной окраски раствора в процессе синтеза НчКЗ должно составлять 20 мин.

Таким образом, методику получения препаратов коллоидного золота с диаметром наночастиц 25-30 нм в объеме 50 мл можно представить следующим образом:

1) в колбу Эрлейнмейера налить 49,23 мл деионизированной воды комнатной температуры и внести «перемешивающий» стержень магнитной мешалки;

2) надеть на колбу дефлегматор, поставить колбу с содержимым на магнитную мешалку и установить режим 375 об/мин и 300°C;

3) через 6 мин (от начала постановки колбы на магнитную мешалку до появления первых признаков закипания - начало стекания конденсата по стенкам дефлегматора и/или колбы) внести 0,058 мл 10% раствора ЗХВК, кипятить 2 мин, внести 0,72 мл 1%-ного раствора цитрата натрия;

4) при изменении цвета раствора с синего на красный изменить режим работы магнитной мешалки на следующий: 500 об/мин и 200°C;

5) кипятить раствор еще 20 мин, выключить нагрев, снять дефлегматор, удалить колбу с магнитной мешалки. Раствор НчКЗ остудить при комнатной температуре в течение суток, затем хранить в холодильнике при 4°С.

При необходимости получить другой объем препарата НчКЗ (более 50 мл) целесообразно пересчитать количество вносимых в него реагентов.

Изобретение иллюстрируется следующим примером

Пример

На магнитной мешалке устанавливают температуру 300°C и скорость перемешивания 375 об/мин. В колбу Эрленмейера добавляют 49,23 мл деионизированной воды комнатной температуры, в колбу добавляют «перемешивающий» стержень магнитной мешалки.

Через 6 мин (время от момента от начала нагрева, постановки колбы с содержимым на магнитную мешалку и включения магнитной мешалки, до начала стекания конденсата) вносят 0,058 мл 10% раствора ЗХВК, кипятят 2 мин и вносят 0,72 мл 1%-ного раствора 5,5-водного цитрата натрия.

При переходе цвета раствора с синего на красный изменяют режим перемешивания на магнитной мешалке с 375 об/мин на 500 об/мин и снижают температуру с 300°C до 200°C, раствор кипятят в течение 20 мин.

Через 20 мин отсоединяют колбу от обратного холодильника и снимают с мешалки. Колбу с раствором НчКЗ оставляют при комнатной температуре на 18 ч с целью визуальной оценки качества приготовленного препарата.

Работоспособность методики получения НчКЗ с диаметром частиц 25-30 нм была подтверждена при получении препаратов еще трех серий.

Результаты оценки препаратов НчКЗ методом электронной микроскопии и спектрофотометрии показали, что препараты всех серий, полученные по данной методике, кондиционны (таблица 4).

Изобретение может быть использовано при изготовлении маркеров в иммунохроматографии. Для получения наночастиц коллоидного золота проводят восстановление золотохлористоводородной кислоты цитратом натрия. На магнитной мешалке устанавливают температуру 300°С и режим перемешивания 375 об/мин. В колбу Эрленмейера добавляют 49,23 мл деионизированной воды комнатной температуры и вносят перемешивающий стержень магнитной мешалки. Колбу с водой устанавливают на магнитную мешалку, через 6 мин вносят 0,058 мл 10%-ного раствора золотохлористоводородной кислоты. Затем кипятят 2 мин и вносят 0,72 мл 1%-ного раствора 5,5-водного цитрата натрия. При переходе цвета раствора с синего на красный меняют режим перемешивания на магнитной мешалке с 375 об/мин на 500 об/мин и снижают температуру с 300°С до 200°С. Раствор кипятят в течение 20 мин, отсоединяют колбу от обратного холодильника и снимают с магнитной мешалки. Колбу с раствором наночастиц коллоидного золота оставляют при комнатной температуре на 18 ч. Полученный препарат наночастиц коллоидного золота хранят в холодильнике при температуре 4°C. Изобретение позволяет получать частицы коллоидного золота со средним диаметром 25-30 нм. 1 ил., 4 табл., 1 пр.

Способ получения наночастиц коллоидного золота путем восстановления золотохлористоводородной кислоты цитратом натрия, и включающий следующие стадии: на магнитной мешалке устанавливают температуру 300°С и режим перемешивания 375 об/мин; в колбу Эрленмейера добавляют 49,23 мл деионизированной воды комнатной температуры и вносят перемешивающий стержень магнитной мешалки; колбу с водой устанавливают на магнитную мешалку; через 6 мин вносят 0,058 мл 10%-ного раствора золотохлористоводородной кислоты, причем указанное время фиксируется секундомером от момента постановки колбы с содержимым на плитку и начала нагрева до начала стекания конденсата по стенкам дефлегматора и/или колбы, кипятят 2 мин и вносят 0,72 мл 1%-ного раствора 5,5-водного цитрата натрия; при переходе цвета раствора с синего на красный меняют режим перемешивания на магнитной мешалке с 375 об/мин на 500 об/мин и снижают температуру с 300°С до 200°С, раствор кипятят еще в течение 20 мин; через 20 мин отсоединяют колбу от обратного холодильника и снимают с магнитной мешалки; колбу с раствором наночастиц коллоидного золота оставляют при комнатной температуре на 18 ч.