Состав и способ получения золотосодержащего водного геля гиалуроновой кислоты Российский патент 2025 года по МПК A61K9/00 A61K33/242 A61K47/36 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к составам и способам получения гелей водорастворимых высокомолекулярных полисахаридов в виде коллоидных систем с распределенными в них частицами металла, в частности, к водным гелям гиалуроновой кислоты (ГК) с наночастицами золота (НЧЗ). Подобные золотосодержащие гели могут быть использованы в фармакологии и косметологии.

Уровень техники

Коллоидное золото в той или иной форме применяется в косметической медицине достаточно давно. Один из самых ценных эффектов наночастиц золота - стимуляция ферментов, ускоряющих синтез основного белка кожи коллагена. Коллоид частиц золота в ГК воздействует на внутриклеточные структуры эпидермиса, активируя жизненные функции кожи и восстанавливая четкость контура лица. НЧЗ, проникая в кожу, стимулирует рост молодых клеток базального слоя, усиливают синтез собственного коллагена, улучшают дыхание и питание кожи. Золото способствует быстрому проникновению молекул кислорода, что улучшает восстановительные функции клеток, кожа подтягивается, становится эластичной, выравнивается микрорельеф. НЧЗ улучшают внутриклеточные связи и перезапускают обменные процессы, устраняют эффект усталой кожи, При этом нет риска побочного действия нитей: образования келлоидных рубцов и длительного заживления мест введения. [Хабаров В.Н., Кветной И.М., Линькова Н.С., Пальцев М.А. Препараты гиалуроновой кислоты регулируют экспрессию коллагена I типа и матриксной металлопротеиназы-9 в коже человека - Молекулярная медицина, 2020; (4); Хабаров В.Н., Пальцев М.А., Родичкина В.Р., Кветной И.М. Молекулярная косметология.

Сигнальные механизмы старения кожи, таргетная профилактика и терапия. Санкт-Петербург: Эко-Вектор, 2021, ISBN 978-5-907201-46-0, 191 с].

Применение НЧЗ предпочтительней в силу их минимальной токсичности, химической инертности, доступности технологий получения НЧЗ и их комплексов с другими биомолекулами [Alex S, Tiwari A. Functionalized Gold Nanoparticles: Synthesis, Properties and Applications - a review. J Nanosci Nanotechnol. 15(3): 1869-94, (2015).]. Одни из главных клеток иммунитета - макрофаги не узнают НЧЗ, исключая локальные воспалительные процессы [Bastus N.G, et. al. Peptides conjugated to gold nanoparticles induce macrophage activation. Molecular Immunology.46:743-48 (2009).].

НЧЗ способны подавлять воспалительный процесс в организме как, например, это продемонстрировано у мышей с частицами диаметром 21 нм. Диаметр в 20-80 нм является также наиболее эффективным и для стимуляции дифференциации дермальных мезинхимальных стромальных клеток (MCK). [Shang L, et.al. Engineered nanoparticles interacting with cells: size matters. J Nanobiotechnology. 12:5-9 (2014).].

Основной задачей разработчиков косметических препаратов на основе НЧЗ является поиск составов и способов их получения, обеспечивающих максимальную биодоступность НЧЗ к клеткам, ответственным за здоровье кожи.

Известные гидрозоли гели на основе гиалуроновой кислоты (ГК) в смеси с НЧЗ получают смешением изготовленных заранее водных коллоидов НЧЗ с водными растворами ГК и функциональными добавками. Многочисленные составы гидрозолей гелей ГК+НЧЗ, используемые в коммерческой косметике, содержат взвеси наночастиц золота в воде, полученные отдельно одним из известных способов (дисперсионным, восстановительным), смешанные и гомогенизированные механически с ГК и с ароматическими и функциональными смягчающими кожу добавками гелей, масел, экстрактов и т.п., (процессы смешения, перетирания и иные) до консистенции товарного продукта [см, например, сыворотки для лица Premium 24К Gold Hyaluronic Ampoule фирмы MEDB Корея; BioAqua 24k gold Bioaqua, фирмы SHARY Китай; крем с коллоидным золотом, гиалуроновой кислотой Revitalizing Gold Cream омолаживающий, фирмы TETe Cosmeceutical, Швейцария]. Перечисленные косметические средства оказывают недостаточное влияние на механизмы восстановительных процессов в коже и ее регенерацию в связи с медленной и неполноценной доставкой питательных и увлажняющих веществ в эпидермис кожи, в частности в области, имеющие незначительные объемы полостей, лишенных воды. Это обусловлено неконтролируемым размером НЧЗ в широком диапазоне - от 5 нм до нескольких мкм. Кроме того, увлажняющий эффект от поверхностного применения косметических средств, содержащих ее, не является продолжительным. Данные гидрозоли гели НЧЗ не пригодны для инвазивных косметических процедур.

Эффективность и качество косметических препаратов, получаемых смешением исходных водных коллоидов НЧЗ с водными гелями ГК, зависит от способа получения исходных гидроколлоидов НЧЗ.

Известные способы получения исходных водных коллоидов НЧЗ сводятся к получению непосредственно наночастиц металлического золота в водной среде в виде нановзвеси либо дисперсионным методом, основанным на диспергировании частиц металла в жидкости, либо конденсационным методом, когда частицы золота образуются восстановлением из соответствующих солей.

Анализ известных дисперсионных способов получения коллоидов наночастиц золота в водной среде, включающих:

- либо процесс электролитического разложения в присутствии катализатора, роль которого выполняет смесь цитратного раствора C₆H₈O₇ и аммиачного раствора NH3, при молярном соотношении смеси-катализатора к общему объему дистиллированной воды 1:100 [Способ получения наноразмерных частиц золота в водной среде - Патент RU 2654861, МПК С25 В 1/00, B82Y 40/00, опубликован 23.05.2018],

- либо лазерную абляцию в водных средах, представляющую собой метод удаления материала с твердой мишени в виде НЧЗ испарением под действием лазерного луча в воде [А.Е Urusov, А.V Petrakova et.al. Application of gold nanoparticles produced by laser ablation for immunochromatographic assay labeling - Anal Biochem/ 2015 Dec 15;491:65-71. Epub 2015 Sep 25], показал, что первичный образующийся водный коллоид золота быстро становится нестабильным и агломерирует (обычно в течение 30 дней), а полученные дисперсными способами наночастицы золота имеют большой разброс по размерам частиц.

Таким образом, смеси полученных дисперсионным способом водных коллоидов НЧЗ с гелем гиалуроновой кислоты нестабильны и малодоступны в биологическом аспекте, что обусловлено недостатками дисперсионного способа получения НЧ3-широким разбросом по фракциям размеров НЧЗ (1-500 нм), невозможностью контролировать форму частиц, повышенным агрегатообразованием НЧЗ и коагуляцией, снижая возможность их применения для получения биомедицинских гидрозолей, особенно инвазивного применения. [Zhao, P., Li, N. and Astruc, D. (2013) State of the Art in Gold Nanoparticle Synthesis. Coordination Chemistry Reviews, 257, 638-665].

В ходе поиска проанализирован также смесовой способ получения гидрозоля геля ГК со стабильными коллоидами НЧЗ, полученными известным методом химического восстановления до металла из ионов солей золота.

Известен способ получения водного коллоида наночастиц золота путем восстановления золотохлористоводородной (III) кислоты цитратом натрия, перемешиванием в течение 6 минут на магнитной мешалке при скорости 375 об/мин 0,058 мл 10%-ного раствора золотохлористоводородной (III) кислоты в 49,23 мл деионизированной воды комнатной температуры, с последующим кипячением раствора в течение 2 минут и внесением 0,72 мл 1%-ного раствора 5,5-водного цитрата натрия. При переходе цвета раствора с синего на красный меняют режим перемешивания на магнитной мешалке с 375 об/мин на 500 об/мин. Раствор кипятят еще в течение 20 минут. Колбу с раствором наночастиц коллоидного золота оставляют при комнатной температуре на 18 ч. Способ позволяет получать наночастицы коллоидного золота со средним диаметром 25-30 нм, однако требует использования только свежеприготовленных растворов. [Способ получения наночастиц коллоидного золота со средним диаметром 25-30 нм - Патент RU 2644466, МПК B01J 13/00, C01G 7/00, В82 В 3/00, B82Y 30/00, B22F 9/24, опубликован 22.02.2018].

Известен способ получения коллоида наночастиц золота, включающий восстановление золотохлористоводородной (III) кислоты тригидрата восстановителем, выбранным из группы: цитрат натрия и боргидрид натрия, в присутствии предложенного стабилизатора НЧЗ α-, β- или γ-циклодекстрина. Золотохлористоводородную кислоту тригидрат растворяют в воде с получением раствора. Затем к раствору добавляют немодифицированный порошок α, β- или γ-циклодекстрина и раствор нагревают до кипения. Добавляют к раствору цитрат натрия при кипячении с обратным холодильником, а борогидрид натрия добавляют к медленно смешиваемому раствору золотохлористоводородной (III) кислоты, содержащего немодифицированный α-, β- или γ-циклодекстрин. Недостатком известного способа получения металлических наночастиц является большой разброс размеров получаемых наночастиц и крайняя неустойчивость системы/ [см. патент US 7232474, МПК B22F 9/24, B01J 35/00, B0D 7/00, B22F 1/00, опубликован 19.06.2007].

Таким образом, в качестве восстановителя в способах получения водных коллоидов НЧЗ химическим синтезом используют либо цитраты, либо бораты, а процессы проводят при повышенной температуре, используя отдельные стабилизирующие добавки. Агломерация и коагуляция НЧЗ в полученных коллоидах - основной недостаток известных способов, требующих особых условий хранения, что исключает их применение для производства косметических золотосодержащих гидрогелей, особенного инвазивного типа, в косметике. Это обстоятельство не позволяет применить способ смешения отдельно полученного водного коллоидного состава НЧЗ с водным гелем ГК, для получения устойчивых и оптимальных по размерам НЧЗ золотосодержащих гелевых косметических композиций на основе ГК, особенно инвазивного применения.

Для решения проблемы стабильности золотосодержащих гидрозолей их получают синтезом в присутствии восстановителя непосредственно в водном растворе либо синтетического, либо биополимера. Поскольку в этом случае частицы золота сразу после возникновения покрываются за счет адсорбционных эффектов защитным полимером, подобные золи стабильны при хранении, как правило, они используются в качестве устойчивых биоспецифических маркеров для изучения проникновения наночастиц в клетки, конъюгации с лекарственными средствами и ДНК (РНК) для доставки целевых молекул в органы и ткани организма. Известна водная композиция поливинилпирролидона (ПВП) с золотохлористоводородной кислотой, при этом ПВП используется как единственный восстановитель иона золота, в результате получают очень стабильный золь с размерами НЧЗ 6-17 нм в течение короткого (10 мин) времени при комнатной температуре. [М Zhou, В Wang, Z Rozynek, Z Xie, JO Fossum, X. Yu, S Raaen, -Minute synthesis of extremely stable gold nanoparticles - Nanotechnology 20, 505606, 2009].

Наиболее близкими к заявленному техническому решению, в части способа получения, являются способы получения золотосодержащих гидрозолей с использованием полисахаридов в качестве защитной оболочки, формируемой в ходе синтеза НЗЧ и обеспечивающей достаточную устойчивость к агломерации. Одним из вариантов является их использование в качестве дополнительных восстановителей при синтезе НЧЗ.

Так, из смеси пектина, в количестве 1,0 мл 0,5% вес.водного раствора, с 3 мл 0,001М раствора HAuCl₄ и с 1 мл 0,1 М раствора цитрата натрия, перемешиваемой при 80°С, при добавлении 0,1М раствора NaOH до рН 11, были получены стабильные гидрозоли гели пектина с НЧЗ размером 5-10 нм. Пектин также использовался в качестве восстановителя в варианте смешения 3 мл 0,5% вес.водного раствора и 3 мл 0,001М раствора HAuCl₄ в 24 мл дистиллированной воды при перемешивании и нагреве до кипения. Реакцию и нагрев прекращали при изменении цвета раствора до красного. [K.Nigoghossian, M.V.dos Santos, H.e.S Barud, R.R.da Silva, L.A.Rocha, et al. Orange Pectin Mediated Growth and Stability of Aqueous Gold and Silver Nanocolloids. Applied. Surface Science, 2015, 341, pp.28-36].

Известно также техническое решение с использованием деацетилированного полисахарида хитозана для получения золотосодержащей композиции. Деацетилированный на 85% хитозан со средней молекулярной массой 300 000 (2% раствор в 1% уксусной кислоте) смешивался с 0,01- 1 мл золотохлористоводородной кислотой HAuCl₄, из расчета 4:1-2:1 в молярном соотношении, чтобы достигнуть рН 4.5 в реакционной среде, при перемешивании и при 75°С до появления красной окраски.

[E. Strupiechonski, M. Moreno-Rios, E.O. Ávila-Dávila, R. Román-Doval, E. Prokhorov, Y. Kovalenko, D.G. Zárate-Triviño, D.I. Medina, and G. Luna-Barcenas - Relaxation Phenomena in Chitosan-Au Nanoparticle Thin Films - Polymers (Basel). 2021 Oct; 13(19): 3214] Аналогичное решение: Y. KAHLOUS et al /Preparation and Characterization of Chitosan and Inclusive Compound-Layered Gold Nanocarrier Preparation of gold nanoparticles, Turk J Pharm Sci 2022;19(4):391-399].

Известно также техническое решение использования в качестве восстановителя хитозана в модифицированной форме и исходного полисахарида для получения НЧЗ с узким распределением размеров частиц. В растворах хитозана со спиральной структурой макромолекул хитозана синтез НЧЗ из HauCl₄ в кислой среде при рН 3,2 характеризуется формированием наночастиц Au с меньшими средними размерами ~ 2 нм и более узким распределением от 1 до 7 нм, по сравнению со статистической макромолекулярной структурой, где средний размер ~5 нм; с распределением от 2 до 14 нм, Форма частицы в обоих случаях близко к сферической. Нанодисперсия в виде геля совокупно стабильна не меньше 160 дней. [L.A. Smirnova, Т A. Gracheva, A.E. Mochalova, Т.А Kuz'micheva & E.N. Fedoseeva - Peculiarities of gold nanoparticle formation in chitosan solutions doped with HAuC14. Nanotechnologies in Russia volume 5, pages78-82 (2010)].

Известно техническое решение способа получения НЧЗ из золотохлористоводородной кислоты с использованием в качестве восстановителя аминодекстрана. В типичном эксперименте 8,57-грамм исходного раствора HAuCl₄ (содержащего 1,97 г или 0,01 моля Au) смешивали при перемешивании с 500 см³ деионизированной воды, при 50°С при рН 12,2±0.1 и 2,30 г аминодекстрана, заранее растворенного в 50 см3 деионизированной воды. Смесь непрерывно перемешивалась при 50°С в течение 7,5 ч, за это время ионы Au(III) были полностью восстановлены, формируя стабильную золотую соль. Процесс восстановления контролировали по уменьшению поглощения на длине волны 318 нм, которая характерна для сложных ионов [AuCl₄-]. Далее стабилизировали дисперсию нагревом при 84°С в течение 4 ч, и фильтровали, выделяя сублимацией, при необходимости, НЧЗ в сухом виде. [B.J. Morrow et al. - Preparation and stabilization of monodisperse colloidal gold by reduction with aminodextran / Journal of Colloid and Interface Science 335 (2009) 62-69].

Как следует из приведенного анализа, использование полисахаридов в качестве восстановителей ионов золота в водных растворах для создания композиций коллоидного золота применимо либо в сильнокислой (рН 3,5-4,), либо в щелочной среде (рН 11-12) при повышенной температуре. Известные решения не позволяют применить полученные среды для создания косметических средств с нейтральной средой (рН 6,8-7,1), контактирующих с кожей, тем более инвазивного характера.

В результате патентного поиска не выявлено известных технических решений, позволяющих получить функциональные составы золотосодержащих гидрогелей ГК, растворимых в воде, с совмещенным положительным эффектом:

эффективности в части терапевтического и профилактического действия при отсутствии в гидрогеле посторонних примесей и при нейтральном рН среды;

способности создать в тканях трехмерную структуру каркасного типа;

и стабильности структуры со связанным металлом во времени, обуславливающей

пролонгированный эффект в тканях организма.

Специально синтезированные коллоидные растворы НЧЗ не решают эту проблему. Так, в известном техническом решении - композиции водного раствора - геля гиалуроновой кислоты с НЧЗ в виде ультрадисперсных частиц с размером частиц от 10 нм до 300 нм в количестве, % по массе: ГК от 0,5 до 5,0, коллоидный водный раствор частиц золота «Биозолото» 0,5-1,5, пептиды 0,5-1,0, эластин 0,3-0,6, прополис 1,0-6,0, глицерин 1,0-5,0, алоэ Barbadensis 2,0-4,0, метилхлороизотиазолинон 0,1-0,3, метилизотиазолинон 0,1-0,3, вода остальное, сохраняются указанные недостатки. Композицию получают смешением и перемешиванием компонентов в течение 2-3 часов. При этом отмечается, что отдельно синтезированный коллоидный раствор частиц золота «Биозолото» создает "эффект проводимости" для питания кожи и повышает ее способность к поглощению активных ингредиентов повышая эффективность восстановительных процессов в коже [Способ омоложения кожи - Патент RU 2383341 С2, МПК А61 К 31/498; А61 Р 43/00, опублик. 10.03.2010]. Как отмечают сами авторы разработки, недостатком известного технического решения является нестабильность композиции, связанная с наличием крупных НЧЗ и необходимостью применения их в относительно высокой концентрации (до 1,5% масс.) в геле, что приводит к коагуляции, расслоению и нестабильности гелевой композиции в целом, исключающей применение композиции для инвазивных прпоцедур. Недостатком является также необходимость проведения отдельного процесса получения водного коллоида «Биозолота» по одному из известных способов.

Наиболее близким известным техническим решением является композиция низковязкого геля низкомолекулярной ГК (молекулярная масса не более 7 кДа) с гидрозолем НЧЗ размером 15-25 нм, используемая в качестве инертного носителя нерастворимого в воде лекарственного средства с содержанием последнего до 70%, совместимого с организмом с оптимальной биодоступностью. Способ получения этой композиции состоит в синтезе гидрозоля со стабилизированными НЧЗ размером 15-25 нм непосредственно в присутствии низкомолекулярной ГК. На первой стадии золотохлористоводородную (III) кислоту тригидрат (HAuCl₄).3Н₂О) в количестве 24 мг вносят вместе с 0,4 мг низкомолекулярной фракции гиалуроновой гислоты (4-7 кДа) в 10 мл дистиллированной воды и аккуратно перемешивают, после чего в раствор вносят 2 мг боргидрата натрия (восстановитель золота) вместе с 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО) с растворенным в нем лекарственным средством, затем перемешивают раствор в течение 24 ч при комнатной температуре до появления красного цвета раствора. Отмечается устойчивость геля при использовании полученного лекарственного средства в течение периода лечения, а также дополнительный терапевтический эффект НЧЗ [Н.М. Kim, Y.I.Choi, J-M. Oh, J. Park - Hyaluronic acid-coated gold nanoparticles as a controlled drug delivery system for poorly water-soluble drugs - RSC Advances, 2023, vol.13, pp.5529-5537].

Раскрытие сущности изобретения

На основе результатов анализа известных технических решений и собственных экспериментов авторами сделан вывод о целесообразности применения для получения золотосодержащего водного геля гиалуроновой кислоты способа «on the spot» (немедленно на месте), когда синтез НЧЗ проводится с использованием специально подобранного состава исходной смеси ГК с солью золотохлористоводородной кислоты непосредственно в ее водном растворе, получая при этом покрытые гиалуроновой кислотой и стабилизируемые ею частицы золота, исключая агломерацию частиц и коагуляцию гидрозоля. Использование соли золотохлористоводородной кислоты (как правило- слабого основания) вместо кислоты позволило достичь нейтральной среды гидрогеля.

Технический результат изобретения - разработка состава и способа для получения золотосодержащего водного геля гиалуроновой кислоты с наночастицами золота оптимального размера 20-50 нм с повышенной биодоступностью, эффективностью в части терапевтического и профилактического действия, при отсутствии в геле посторонних примесей и при нейтральном рН среды, стабильного с пролонгированным эффектом в тканях организма.

Для достижения технического результата использовали гиалуроновую кислоту (натриевую соль), полученную методом микробной ферментации, с молекулярной массой 1,5-1,8 МДа, тетрахлораурат натрия (III) дигидрат (Au 49-50%) Na[AuCl₄]*2H2O (далее в формуле изобретения и реферате - тетрахлораурат натрия дигидрат), молекулярная масса: 361.8, растворимость в воде, 0,7 г/100 мл), цитрат натрия трехзамещенный дигидрат (двуводный) Ha₃C₆H₅O₇*2Н₂О (далее дигидрат цитрата натрия, молекулярная масса: 294.1, растворимость в воде, 77 г/100 мл), воду дистиллированную деионизированную.

Экспериментально авторами были найдены границы соотношения: гиалуроновая кислота: тетрахлораурат натрия (III) дигидрат, позволяющие, с одной стороны, стабилизировать возникающие наночастицы золота, а, с другой стороны, исключить избыток стабилизатора, что может привести к формированию второго слоя из его молекул, ориентированных противоположным образом, что снижает устойчивость системы НЧ3-ГК. Недостаточное количество добавленного полимера ГК также может снизить устойчивость системы, так как одна макромолекула может сорбироваться несколькими частицами, что инициирует их флокуляцию.

Свойства используемой в данном случае гиалуроновой кислоты помимо молекулярной массы полимера, оказались уникальными, поскольку она, как полимер, содержит как кислотные, так и основные группы, то есть является полиамфолитом -макромолекулой с рН-зависимым защитным действием, и является наиболее эффективным средством стабилизации гидрозолей золота. Использование полиамфолитов для стабилизации коллоидных НЧЗ ранее было исследовано и доказано [см. Mayer A.S.R., Mark J.E. Colloidal gold nanoparticles protected by cationic polyelectrolites -Pure Appl.Chem, 1997, v. 11, pp.2151-64]. Помимо этого гиалуроновая кислота, как полисахарид, проявила себя слабым восстановителем ионов золота до металла (см. выше анализ известных решений), что позволило подобрать соотношения компонентов состава для синтеза НЧЗ методом «оп the spot» в ее растворе.

В ходе разработки изобретения было определено влияние на качество приготовления и стабильность НЧЗ следующих параметров и условий:

1) соотношение концентраций реагентов в исходном составе для получения гидрозоля с НЧЗ;

2) соотношение объемов реагентов и последовательность их введения в раствор ГК;

3) режимы рН, определяемые добавкой цитрата натрия трехзамещенного дигидрата, для поддержания рН 6,8-7,2, степени нагрева раствора и времени его перемещивания с введенными реагентами до момента появления красной окраски (формирования стабилизированных НЧЗ).

Технический результат достигается путем применения оригинального состава для получения золотосодержащего водного геля гиалуроновой кислоты, содержащего гиалуроновую кислоту с молекулярной массой 1,5-1,8 МДа, цитрат натрия трехзамещенный дигидрат, золотосодержащий компонент - тетрахлораурат натрия (III) дигидрат и воду, при соотношении исходных компонентов из расчета на объем геля 1000 мл, г:

гиалуроновая кислота (натриевая соль) 8-16 цитрат натрия трехзамещенный дигидрат 1,5-2,5 тетрахлораурат натрия (III) дигидрат (Au 49-50%) 0,005-0,015 вода дистиллированная до 1000 мл,

а также следующим способом получения золотосодержащего гидрогеля смешением компонентов приведенного состава с одновременным синтезом наночастиц золота в следующей последовательности:

- предварительное приготовление раствора 1,5-2,5 г цитрата натрия трехзамещенного дигидрата в 50 мл воды с перемешиванием до полного растворения;

- предварительное приготовление водного раствора 0,005-0,015 г тетрахлораурата натрия (III) дигидрата в 50 мл воды с перемешиванием до полного растворения;

- приготовление раствора гиалуроновой кислоты (натриевой соли) растворением 8-16 г в 900 мл воды при перемешивании при комнатной температуре в течение 3 часов;

- подогрев полученного раствора гиалуроновой кислоты до 35-40°С;

- введение в подогретый раствор гиалуроновой кислоты последовательно при перемешивании в течение 0,5-1 часа 50 мл приготовленного раствора цитрата натрия трехзамещенного дигидрата с дальнейшим введением 50 мл приготовленного раствора тетрахлораурата натрия (III) дигидрата при медленном перемешивании в течение 3-5 часов до достижения красной окраски гидрогеля.

Для подтверждения новизны и полезности проведены экспериментальные исследования созданного согласно заявленному техническому решению золотосодержащего водного геля гиалуроновой кислоты.

Записаны и проанализированы спектры поглощения образованного продукта. Известно, что спектрофотометрический метод, основанный на известной зависимости максимума поглощения света металлическими золями золота от размера частиц часто используется для оценки размера и концентрации НЧЗ. Наночастицы золота обладают специфическим резонансным поглощением, положение максимума зависит от размера наночастицы, а величина поглощения от их количества. Известна калибровочная кривая, основанная на наилучшей сглаженности полиномиальной аппроксимации спектрофотометрических и данных электронной микроскопии, для определения размера сферических золотых частиц диаметром 5-50 нм, полученных нитратным методом [см. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Мельников А.Г. Оптические свойства коллоидного золота и его конъюгатов с биоспецифическими макромолекулами // Коллоид. Журн. - 1995. - 57. - С. 412-23]. Надежность этой калибровки подтверждена другими авторами в независимых экспериментах [Scaffardi L.B., Tocho J.O. Size dependence of refractive index of gold nanoparticles // Nanotechnology. - 2006. - 17. - P. 1309-15.] Для некоторых размеров НЧЗ данные о максимуме поглощения образующихся золей представлены в таблице 1.

Спектры поглощения растворов, полученных согласно изобретению, измеряли на спектрофотометре Shimadzu UV-2501 PC. Ширина щели 2 нм, длина оптического пути 1 см (это толщина кюветы). Диапазон длин волн при измерении 200-800 нм, шаг 1 нм. Для растворов высокой оптической плотности измерения проводили в кюветах с меньшей длиной оптического пути (1,2,5 мм) с последующим приведением величины оптической плотности (поглощения) к длине оптического пути 1 см. Измерения проводились при комнатной температуре. На фиг. 1 приведены данные для кюветы 1 см. Максимумы поглощения растворов с разной концентрацией раствора ГК с НЧЗ определены на длине волны 520-530 нм, что соответствует размеру НЧЗ 15-35 нм (табл. 1). Данными, полученными методом динамического рассеяния света (ДРС), подтвержден размер полученных НЧЗ в диапазоне 15-50 мкм с максимальным содержанием НЧЗ с размерами 20-35 нм (см. фиг. 2). Результаты просвечивающей электронной микроскопии (фиг. 3) подтверждают размеры и однородность диаметра НЧЗ в полученных гидрозолях.

Результаты термогравиометрии - спектров ТГА свидетельствуют об адсорбированных звеньях ГК на НЧЗ: при росте концентрации ГК падает потеря веса композиции при нагреве. Это подтверждает факт стабилизации НЧЗ оболочками ГК (фиг. 4).

Стабильность золей подтверждена спектрофотометрическими измерениями. На спектрах, записанных через разные интервалы времени после синтеза, не определены дополнительные максимумы на больших длинах волн. Это свидетельствует об отсутствии процессов агрегации НЧЗ (даже спустя три месяца никаких изменений спектра не обнаружено). Все полученные спектры полностью идентичны первоначальным, записанным непосредственно после приготовления гидрогелевых композиции. Более того, введение в образцы 0,1 М раствора хлорида натрия в физиологических концентрациях также не привело к сколь-нибудь заметному изменению спектральных характеристик исследуемых образцов. Таким образом, был сделан вывод, что полученные композиции стабильны в течение длительного времени.

Экспериментально показана эффективность применения полученных гидрозолей ГК+НЧЗ для регенерации кожи. Для этого на минисвиньях породы «светлогорская» изучали резорбцию и тканевую реакцию при внутрикожном введении гелей ГК с НЧЗ (контроль - нативная ГК). Сроки наблюдения -1,3,5 суток. Электронно-микроскопическое исследование проводили на 3 и 5-и сутки после введения гелей ГК.

В интактной коже минисвиньи видны относительно редкие капилляры, артериолы и венулы. (см. 5А). При этом в сосочковом слое этих элементов больше, чем в сетчатом. В дерме видны также волосяные фолликулы и располагающиеся вблизи фолликулов сальные железы. Клеточные элементы в дерме кожи свиньи малочисленны. Они представлены в основном фибробластами, имеющими веретеновидную либо звездчатую форму. В сосочковом слое, кроме фибробластов, обнаруживаются немногочисленные лимфоциты, макрофаги (гистиоциты) и тучные клетки. Все эти клеточные элементы располагаются в основном вблизи сосудов

На 5 сутки после введения гидрозоля ГК+НЧЗ фибробласты приобретают более вытянутую форму (фиг. 5Б). Следовательно, часть клеток закончила пролиферацию, перешла в дифференцированное состояние, сформировала фокальные контакты с фибриллами коллагена межклеточного матрикса и приступили к активному синтезу нового коллагена. Таким образом, препарат с НЧЗ увеличивает популяцию молодых фибробластов (которые синтезируют новый матрикс в дерме) и ускоряет омоложение кожи.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Спектры оптического поглощения гидрогелевых композиций ГК-Au при различной концентрации ГК и НЧЗ

1- 0,8% раствор гиалуроновой кислоты+НЧЗ

2- 1,6% раствор гиалуроновой кислоты+НЧЗ

Фиг. 2. Распределение НЧЗ по размерам в полученном золе

Фиг. 3. Результаты просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) исследуемых гидрогелей ГК с НЧЗ.

Фиг. 4. Термограммы композиций ГК-Au при разном соотношении ГК/Au

1- исходное соотношение ГК:тетрахлораурат натрия (III) тригидрат, мас.=1066:1

2- исходное соотношение ГК:тетрахлораурат натрия (III) тригидрат, мас.=1200:1

3- исходное соотношение ГК:тетрахлораурат натрия (III) тригидрат, мас.=1600:1

Фиг. 5 Резорбция и тканевая реакция при внутрикожном введении гелей ГК с НЧЗ (контроль - нативная ГК)

А) Интактная кожа свиньи (контроль). Характерное для дермы плетение пучков коллагеновых волокон. Относительно редкие клеточные элементы - фибробласты.

Окраска гематоксилином и эозином, увел. Х400

Б) 5-е сутки после введения геля ГК+НЧЗ (0,8% ГК). Участок пролиферации фибробластов на месте инъекции. Окраска гематоксилином и эозином, увел. X 400

В) Ультратонкий срез кожи свиньи. 5-и сутки после введения геля ГК+НЧЗ (1,6% ГК). Очаги геля, прорастающие макрофагами, фибробластами и сосудами. Окраска толуидиновым синим, увел. Х400.

Осуществление изобретения

Заявленное техническое решение может быть проиллюстрировано следующими примерами. Пример 1.

Для взвешивания реагентов использовали весы электронные аналитические Adventurer («OHAUS», США). Все реагенты готовили на дистиллированной деионизированной воде. Для ее получения применяли систему UF Arium 611 UF («Sartorius», Германия). Всю лабораторную посуду, предназначенную для приготовления реагентов предварительно тщательно промывали и обрабатывали в сухожаровом шкафу при температуре 180°С в течение 60 мин.

Предварительно готовили раствор 1,5 г цитрата натрия трехзамещенного дигидрата в 50 мл деионизованной воды с перемешиванием до полного растворения.

Также предварительно готовили раствор 0,005 г тетрахлораурата натрия (III) дигидрата в 50 мл деионизованной воды с перемешиванием до полного растворения.

Далее в колбе Эрленмейера на 1000 мл готовили раствор гиалуроновой кислоты (натриевой соли) растворением 8 г в 900 мл деионизованной воды при перемешивании при комнатной температуре в течение 3 часов, используя для этого магнитную мешалку с подогревом («Heidolph», Германия). Полученный раствор подогревали до 35°С, после чего, при постоянном перемешивании в течение 0,5 часа при этой температуре вводили с помощью стеклянной пипетки Simax (на полный слив, 50 мл, AS класс) последовательно 50 мл ранее приготовленного раствора цитрата натрия трехзамещенного дигидрата, а затем 50 мл ранее приготовленного раствора тетрахлораурата натрия (III) дигидрата, продолжая перемешивание в течение 3 часов до достижения постоянной красной окраски гидрогеля.

Анализировали спектр поглощения полученного гидрогеля, измеренный на спектрофотометре Shimadzu UV-2501 PC, при ширина щели 2 нм, в кювете толщиной 1 см в диапазоне длин волн 200-800 нм с шагом 1 нм. Спектр приведен на фиг.1, нижняя кривая 1. Максимум поглощения определен на длине волны 524 нм, что соответствует среднему размеру НЧЗ 25 нм.

Распределение по размерам и форму НЧЗ в полученном гидрогеле исследовали методом динамического рассеяния света (ДРС) с использованием оптического микроскопа. На фиг. 2 приведено полученное распределение НЧЗ в гидрогеле. Наиболее вероятный размер НЧЗ составляет 25-28 нм. На фиг. 3 приведена фотография НЧЗ в полученном гидрогеле с использованием просвечивающего электронного микроскопа JEOL JEM-2000 FXII (Япония) при ускоряющем напряжении 200 кВ и специальным программным обеспечением Digital Micrograph Ink. (JEOL, Япония). Полученные изображения преобразовывали в универсальный графический формат TIF. Размер частиц около 22-25 нм.

рН водного геля, измеренный с помощью лабораторного рН-метра WTW inoLab рН 7110, составил 7,1-7,2.

Результаты термогравиометрии - спектров ТГА свидетельствуют об адсорбированных звеньях ГК на НЧЗ: при росте концентрации ГК падает потеря веса композиции при нагреве, кривая 1 на фиг. 4. Это подтверждает факт стабилизации НЧЗ оболочками ГК.

Метод электронной микроскопии также использовали для анализа эффекта на кожу свиньи после инъекции полученного гидрогеля с НЧЗ. Метод описан выше При изучении ультраструктуры кожи в местах инъекции гелей ГК определяли относительную электронную плотность видимых объектов, размеры, функциональное состояние, взаимное расположение и ориентацию клеточных и волокнистых элементов. Отмечали наличие или отсутствие признаков патологических изменений структуры кожи. На 5 сутки после введения гидрозоля ГК+НЧЗ фибробласты приобретают более вытянутую форму (фиг. 5Б), по сравнению с исходной интактной кожей (фиг. 5А). Следовательно, часть клеток закончила пролиферацию, перешла в дифференцированное состояние, сформировала фокальные контакты с фибриллами коллагена межклеточного матрикса и приступили к активному синтезу нового коллагена. Таким образом, препарат с НЧЗ увеличивает популяцию молодых фибробластов (которые синтезируют новый матрикс в дерме) и ускоряет омоложение кожи.

Пример 2.

Аналогично примеру 1 предварительно готовили раствор 2,0 г цитрата натрия трехзамещенного дигидрата в 50 мл деионизованной воды с перемешиванием до полного растворения.

Также предварительно готовили раствор 0,010 г тетрахлораурата натрия (III) дигидрата в 50 мл деионизованной воды с перемешиванием до полного растворения.

Далее в колбе Эрленмейера на 1000 мл готовили раствор гиалуроновой кислоты (натриевой соли) растворением 12 г в 900 мл деионизованной воды при перемешивании при комнатной температуре в течение 3 часов, используя для этого магнитную мешалку с подогревом («Heidolph», Германия). Полученный раствор подогревали до 37-38°С, после чего, при постоянном перемешивании в течение 0,7 часа при этой температуре вводили с помощью стеклянной пипетки Simax (на полный слив, 50 мл, AS класс) последовательно 50 мл ранее приготовленного раствора цитрата натрия трехзамещенного дигидрата, а затем 50 мл ранее приготовленного раствора тетрахлораурата натрия (III) дигидрата, продолжая перемешивание в течение 4 часов до достижения постоянной красной окраски гидрогеля.

Параметры и свойства полученного гидрогеля с НЧЗ анализировали аналогично примеру 1 с использованием того же оборудования. Спектр поглощения, полученный аналогично примеру 1, гидрогеля практически совпадает со спектром кривая 1 Фиг. 1, т.е соответствует размеру НЧЗ 25-27 нм (табл. 1). Распределение по размерам НЧЗ также схоже с аналогичным по примеру 1 (фиг. 2). Фотография НЧЗ в полученном гидрогеле с использованием просвечивающего электронного микроскопа дала данные по размеру НЧЗ 22-27 нм. Измеренный аналогично примеру 1 рН водного геля, составил 7,0.

О наличии стабилизирующей НЧЗ оболочки из ГК свидетельствует результат анализа ДТА - при росте концентрации ГК падает потеря веса композиции при нагреве. При увеличении концентрации ГК по сравнению с примером 1 потеря веса происходит более интенсивно (кривая 2 на фиг. 4). Это подтверждает факт стабилизации НЧЗ оболочками ГК.

При введении препарата подкожно в условиях примера 1 наблюдали пролиферацию клеток кожи, переход части клеток в дифференцированное состояние, сформирование фокальных контактов с фибриллами коллагена межклеточного матрикса, свидетельствующих о переходе к активному синтезу нового коллагена. Эффект схож с описанным в примере 1.

Пример 3

Аналогично примеру 1 предварительно готовили раствор 2,5 г цитрата натрия трехзамещенного дигидрата в 50 мл деионизованной воды с перемешиванием до полного растворения.

Также предварительно готовили раствор 0,015 г тетрахлораурата натрия (III) дигидрата в 50 мл деионизованной воды с перемешиванием до полного растворения.

Далее в колбе Эрленмейера на 1000 мл готовили раствор гиалуроновой кислоты (натриевой соли) растворением 16 г в 900 мл деионизованной воды при перемешивании при комнатной температуре в течение 5 часов, используя для этого магнитную мешалку с подогревом («Heidolph», Германия). Полученный раствор подогревали до 40°С, после чего, при постоянном перемешивании в течение 1,0 часа при этой температуре вводили с помощью стеклянной пипетки Simax (на полный слив, 50 мл, AS класс) последовательно 50 мл ранее приготовленного раствора цитрата натрия трехзамещенного дигидрата, а затем 50 мл ранее приготовленного раствора тетрахлораурата натрия (III) дигидрата, продолжая перемешивание в течение 5 часов до достижения постоянной красной окраски гидрогеля.

Спектр поглощения полученного гидрогеля соответствует кривой 2 на фиг. 1, с максимумом 520 нм, что соответствует среднему размеру НЧЗ 17-20 нм (табл. 1). Распределение по размерам НЧЗ также схоже с аналогичным по примеру 1 (фиг. 2). Фотография НЧЗ в полученном гидрогеле с использованием просвечивающего электронного микроскопа дала данные по размеру НЧЗ 22-27 нм (фиг 3). Измеренный аналогично примеру 1 рН водного геля, составил 6,8-6,9.

О наличии стабилизирующей НЧЗ оболочки из ГК свидетельствует результат анализа ДТА - при росте концентрации ГК падает потеря веса композиции при нагреве. При увеличении концентрации ГК по сравнению с примерами 1 и 2 потеря веса происходит более интенсивно (кривая 3 на фиг. 4). Это подтверждает факт стабилизации НЧЗ оболочками ГК.

На 5-е сутки после подкожной инъекции в условиях, аналогичных примеру 1, наблюдали более выраженные эффекты, вероятно, обусловленные увеличенной по сравнению с примерами 1 и 2 концентрацией ГК в полученном гидрогеле: количество измененных фибробластов, более вытянутой формы (фиг. 5В), по сравнению с исходной интактной кожей несколько больше, чем для гидрогелей по примерам 1 и 2. Также наблюдается пролиферация клеток кожи, переход части клеток в дифференцированное состояние, сформирование фокальных контактов с фибриллами коллагена межклеточного матрикса, свидетельствующих о переходе к активному синтезу нового коллагена.

Информация о результатах исследований применения гидрозолей ГК+НЧЗ, согласно заявленному техническому решению, в качестве медицинского изделия - подкожного имплантата

Проведенное исследование экспериментального применения гидрозолей ГК+НЧЗ, согласно заявленному техническому решению, в косметической медицинской практике: 30 процедур с использованием гидрогеля ГК+НЧЗ с концентрацией ГК 0,8% масс. и 29 процедур с использованием препарата ГК+НЧЗ с концентрацией ГК 1,6% масс. Ожидаемые побочные эффекты были аналогичны таковым при выполнении любых инъекционных внутрикожных методов - гиперемия, незначительный отек, петехии. Отсроченных побочных эффектов, аллергических реакций, общесоматических явлений зарегистрировано не было.

Препараты можно считать безопасным для клинического использования, что в сочетании с положительным клиническим результатом, проявившемся в улучшении качественных характеристик кожи, делает соотношение рисков и пользы при использовании заявленных гидрогелей ГК+НЧЗ благоприятным для рекомендаций их к клиническому применению.

Исследование показало, что сравнительная оценка показателей состояния кожи, в частности, профилометрии, кутометрии, корнеометрии до начала процедур и после их завершения через 60 дней от начала проведения с использованием препаратов ГК+НЧЗ выявила определенное увеличение средних значений показателей кутометрии (на 2,5%) и корнеометрии (на 61%). Средние значения размеров морщин (длина, ширина) до начала исследований и после их завершения через 60 дней от начала работ, различались несущественно, при этом глубина морщин уменьшилась на 37%. Для определения уровня значимости, статистической достоверности и сравнения между собой полученных результатов по показателям кутометрии, корнеометрии, профилометрии до начала процедур и через 60 дней применения препаратов ГК+НЧЗ, с целью выявления различий проводили вычисления с помощью парного t-критерия Стьюдента при сравнении связанных совокупностей. При этом было показано следующее:

Кутометрия (эластичность):

Среднее значение признака до эксперимента составляет 45.950±0.876. Среднее значение признака после эксперимента составляет 47.100±0.829.

Корнеометрия (влажность):

Среднее значение признака до эксперимента составляет 20.000±3.614. Среднее значение признака после эксперимента составляет 32.150±2.578.

Профилометрия (длина морщин):

Среднее значение признака до эксперимента составляет 6.930±0.456. Среднее значение признака после эксперимента составляет 6.945±0.438.

Профилометрия (ширина морщин):

Среднее значение признака до эксперимента составляет 2.895±0.739. Среднее значение признака после эксперимента составляет 2.845±0.649.

Профилометрия (глубина морщин):

Среднее значение признака до эксперимента составляет 0.705±0.126. Среднее значение признака после эксперимента составляет 0.445±0.070.

Выявленные изменения являются статистически значимыми (р<0,05).

Таким образом, показатели кутометрии (эластичность) и корнеометрии (влажность) через 60 дней от начала проведения процедур с использованием препаратов ГК+НЧЗ, согласно заявленному техническому решению, показали увеличение средних значений показателей кутометрии (на 2,5%) и корнеометрии (на 61%), подтвердив эффективность и полезность заявленного технического решения.

Группа изобретений относится к составу для получения золотосодержащего водного геля на основе гиалуроновой кислоты и золотосодержащего компонента, содержащему натриевую соль гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 1,5-1,8 МДа, золотосодержащий компонент - тетрахлораурат натрия дигидрат, цитрат натрия трехзамещенный дигидрат и воду, при соотношении исходных компонентов из расчета на объем геля 1000 мл, г: натриевая соль гиалуроновой кислоты 8-16, цитрат натрия трехзамещенный дигидрат 1,5-2,5, тетрахлораурат натрия дигидрат 0,005-0,015, вода дистиллированная до 1000 мл, и также относится к способу получения золотосодержащего геля смешением компонентов состава с одновременным синтезом наночастиц золота, включающему следующие этапы: предварительное приготовление раствора 1,5-2,5 г цитрата натрия трехзамещенного дигидрата в 50 мл воды с перемешиванием до полного растворения; предварительное приготовление водного раствора 0,005-0,015 г тетрахлораурата натрия дигидрата в 50 мл воды; приготовление раствора натриевой соли гиалуроновой кислоты растворением 8-16 г в 900 мл воды при перемешивании при комнатной температуре в течение 3 ч; подогрев полученного раствора натриевой соли гиалуроновой кислоты до 35-40°С; введение в подогретый раствор натриевой соли гиалуроновой кислоты последовательно при перемешивании в течение 0,5-1 ч 50 мл приготовленного раствора цитрата натрия трехзамещенного дигидрата с дальнейшим введением 50 мл приготовленного раствора тетрахлораурата натрия дигидрата при медленном перемешивании в течение 3-5 ч до достижения красной окраски гидрогеля. Группа изобретений обеспечивает разработку состава и способа для получения золотосодержащего водного геля гиалуроновой кислоты с наночастицами золота оптимального размера 20-50 нм с повышенной биодоступностью, эффективностью в части терапевтического и профилактического действия, при отсутствии в геле посторонних примесей и при нейтральном рН среды, стабильного с пролонгированным эффектом в тканях организма. 2 н.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 3 пр.

1. Состав для получения золотосодержащего водного геля на основе гиалуроновой кислоты и золотосодержащего компонента, содержащий натриевую соль гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 1,5-1,8 МДа, золотосодержащий компонент - тетрахлораурат натрия дигидрат, цитрат натрия трехзамещенный дигидрат и воду, при соотношении исходных компонентов из расчета на объем геля 1000 мл, г:

натриевая соль гиалуроновой кислоты 8-16;

цитрат натрия трехзамещенный дигидрат 1,5-2,5;

тетрахлораурат натрия дигидрат 0,005-0,015;

вода дистиллированная до 1000 мл.

2. Способ получения золотосодержащего геля смешением компонентов состава по п.1 с одновременным синтезом наночастиц золота, включающий следующие этапы:

- предварительное приготовление раствора 1,5-2,5 г цитрата натрия трехзамещенного дигидрата в 50 мл воды с перемешиванием до полного растворения;

- предварительное приготовление водного раствора 0,005-0,015 г тетрахлораурата натрия дигидрата в 50 мл воды;

- приготовление раствора натриевой соли гиалуроновой кислоты растворением 8-16 г в 900 мл воды при перемешивании при комнатной температуре в течение 3 ч;

- подогрев полученного раствора натриевой соли гиалуроновой кислоты до 35-40°С;

- введение в подогретый раствор натриевой соли гиалуроновой кислоты последовательно при перемешивании в течение 0,5-1 ч 50 мл приготовленного раствора цитрата натрия трехзамещенного дигидрата с дальнейшим введением 50 мл приготовленного раствора тетрахлораурата натрия дигидрата при медленном перемешивании в течение 3-5 ч до достижения красной окраски гидрогеля.