НЕЙРОТОКСИНЫ, ПРОЯВЛЯЮЩИЕ УКОРОЧЕННУЮ БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ Российский патент 2018 года по МПК C07K14/47 

Настоящее изобретение относится к фармацевтической области. В частности, оно охватывает полинуклеотид, кодирующий нейротоксичный полипептид, обладающий укороченной продолжительностью биологического эффекта у субъекта, где указанный полипептид содержит по меньшей мере один мотив узнавания E3 лигазы в легкой цепи, где мотив узнавания E3 лигазы предпочтительно представляет собой связывающий мотив для E3 лигазы MDM2. Настоящее изобретение дополнительно относится к полипептиду, кодируемому полинуклеотидом в соответствии с настоящим изобретением, а также полипептиду, содержащему одну или несколько аминокислотных замен. Дополнительно включенными в объем настоящего изобретения являются векторы и клетки-хозяева, содержащие указанные полинуклеотиды, полипептиды, кодируемые таким образом, и антитела, специфически связывающиеся с полипептидом. Более того, настоящее изобретение относится к лекарственным средствам, содержащим указанные полинуклеотиды и полипептиды, а также конкретным терапевтическим применениям вышеуказанного. Более того, настоящее изобретение рассматривает способы получения полипептидов и лекарственных средств.

Clostridium botulinum и Clostridium tetani продуцируют сильнодействующие нейротоксины, т.е. ботулинические токсины (BoNTs) и токсин столбняка (TeNT), соответственно. Эти нейротоксины клостридий (CNTs) специфически связываются с нервными клетками и нарушают высвобождение нейромедиаторов. Каждый токсин синтезируются в виде неактивного в непроцессированного приблизительно в 150 кДа одноцепочечного белка. Посттрансляционный процессинг включает образование дисульфидных мостиков и ограниченный протеолиз (никование) посредством бактериальной протеазы(протеаз). Активный нейротоксин состоит из двух цепей, N-концевой легкой цепи приблизительно 50 кДа, и тяжелой цепи приблизительно 100 кДа, связанных дисульфидной связью. CNTs состоят из трех доменов, то есть, каталитической легкой цепи, тяжелой цепи, охватывающей область транслокации (N-концевая половина), и рецептор-связывающего домена (С-концевая половина), см. Krieglstein 1990, Eur J. Biochem. 188, 39; Krieglstein, 1991, Eur J. Biochem. 202, 41; Krieglstein 1994, J. Protein Chem. 13, 49. Ботулинические нейротоксины синтезируются в виде молекулярных комплексов, содержащих нейротоксический белок на 150 кДа и связанные с ними нетоксичные комплексообразующие белки. Комплекс имеет размеры, отличающиеся на основе штамма Clostridial и различных серотипов нейротоксина в диапазоне от 300 кДа до 900 кДа. Комплексообразующие белки в их комплексах стабилизируют нейротоксин и защищают его от деградации, см. Chen 1998, Infect. Immun. 66(6): 2420-2425.

Clostridium botulinum секретирует семь отличающихся по антигенам серотипов, обозначаемых от А до G ботулинического нейротоксина (BoNT). Все серотипы вместе с соответствующим столбнячным нейротоксином (TeNT), секретируемым Clostridium tetani, являются Z²⁺-эндопротеазами, которые блокируют синаптический экзоцитоз посредством расщепления SNARE-белков, см. Couesnon, 2006, Microbiology, 152, 759. BoNTs вызывают паралич периферических мышц, наблюдаемый при ботулизме, см. Fischer 2007, PNAS 104,10447.

Несмотря на токсические эффекты, ботулинические токсины были использованы в качестве терапевтических агентов для большого числа заболеваний или расстройств. Ботулинический токсин серотипа А одобрен для использования человеком в Соединенных Штатах в 1989 году для лечения косоглазия, блефароспазма и других расстройств. Он является коммерчески доступным в виде ботулинического нейротоксина А с комплексообразующими белками, например, под торговым названием BOTOX (Allergan Inc.) или под торговым названием DYSPORT (Ipsen Ltd.). Усовершенствованный препарат, свободный от комплекса, полипептид нейротоксина А доступен под торговой маркой XEOMIN (Merz Pharmaceuticals LLC). Действие ботулинического токсина является лишь временным, что является причиной, почему повторное введение ботулинического токсина может потребоваться для поддержания терапевтического эффекта.

Нейротоксины Clostridial ослабляют силу произвольно сокращающихся мышц и являются эффективными средствами для лечения косоглазия, фокусной дистонии, в том числе цервикальной дистонии, и доброкачественного эссенциального блефароспазма. Они, как было показано в дальнейшем, облегчают гемифациальный спазм и фокусную спастичность и, более того, являются эффективными в широком диапазоне других показаний, таких как желудочно-кишечные расстройства, гипергидроз, и коррекции косметических морщин, см. Jost 2007, Drugs 67, 669.

Однако ослабление силы и сокращения мышц также желательно для медицинских состояний или заболеваний: таких как заживление ран, иммобилизация для костей и лечения разрывов сухожилия, послеоперационной иммобилизации, в частности, в связи с удалением геммороя, внедрение дентальных имплантатов, или замены тазобедренного сустава (эндопротезирование), артропластика коленного сустава, офтальмологическая хирургия, угревая сыпь, синдром раздраженной толстой кишки, вагинизм, боли в пояснице или доброкачественная гиперплазия предстательной железы. Нейротоксины обычно демонстрируют свой биологический эффект в течение периода времени большего, чем действительно необходим для эффективного лечения указанных заболеваний или состояний. Длительный паралич мышц, однако, является вредным или по меньшей мере менее предпочтительным в терапии указанных медицинских состояний или заболеваний. Нейротоксины, демонстрирующие свой биологический эффект только на протяжении желаемого периода времени, однако пока не являются доступными.

Соответственно, технической задачей, лежащей в основе настоящего изобретения, можно рассматривать как обеспечение средств и способов для удовлетворения указанных выше потребностей. Техническая задача решается с помощью вариантов выполнения, приведенных в формуле изобретения и ниже в настоящем описании.

Настоящее изобретение, соответственно, относится к полинуклеотиду, кодирующему нейротоксический полипептид, обладающему уменьшенной продолжительностью биологического эффекта у субъекта, в котором указанный полипептид содержит по меньшей мере один мотив узнавания E3 лигазы в легкой цепи, в котором указанный мотив узнавания E3 лигазы предпочтительно является мотивом связывания для E3 лигазы MDM2. Уменьшенная продолжительность биологической активности модифицированных полипептидов проиллюстрирована для BoNT/E-MDM2. Кроме того, указанный нейротоксический полипептид был дополнительно оптимизировать посредством сайт-направленного мутагенеза конкретных аминокислотных остатков в легкой цепи. С этой целью были идентифицированы посредством трехмерного структурного анализа экспонированные аминокислотные остатки в легкой цепи нейротоксина, находящиеся в пространственной близости к введенному мотиву узнавания E3 лигазы MDM2. Впоследствии идентифицированные аминокислотные остатки в легкой цепи нейротоксина были заменены остатками лизина. Этот оптимизационный подход привел к еще более быстрой деградации мутантных полипептидов BoNT/E-MDM2, по сравнению с немутированным полипептидом BoNT/E-MDM2, как это продемонстрировало в следующих примерах.

Соответственно, такие модифицированные или мутантные нейротоксические полипептиды в соответствии с настоящим изобретением особенно полезны для терапии заболеваний, которые требуют короткой или уменьшенной продолжительностью биологического действия нейротоксина.

Термин "полинуклеотид", используемый в настоящем изобретении, относится к молекулам, одно- или двухцепочечных ДНК, а также к молекулам РНК. Охватываемые указанным термином являются геномная ДНК, кДНК, гяРНК, мРНК, а также все встречающиеся в природе или искусственно модифицированные производные таких молекулярных видов. Полинуклеотид может быть в некотором варианте выполнения настоящего изобретения линейной или кольцевой молекулой. Более того, в дополнение к последовательностям нуклеиновой кислоты, кодирующей вышеуказанные нейротоксические полипептиды, полинуклеотид настоящего изобретения может содержать дополнительные последовательности, необходимые для правильных транскрипции и/или трансляции: такие как 5' или 3'UTR последовательности. Полинуклеотид в соответствии с настоящим изобретением кодирует модифицированный нейротоксический полипептид, получаемый из одного из антигенно различных серотипов ботулинического нейротоксина, т.е. ΒοΝТ/А, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G или столбнячного нейротоксина (TeNT).

В одном варианте выполнения настоящего изобретения указанный полинуклеотид включает (перед модификацией в соответствии с настоящим изобретением, т.е. модификацией легкой цепи по меньшей мере одного мотива узнавания E3 лигазы) последовательность нуклеиновой кислоты, как показано в SEQ ID NO: 1 (BoNT/A), SEQ ID NO: 3 (BoNT/B), SEQ ID NO: 5 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 7 (BoNT/D), SEQ ID NO: 9 или 81 (BoNT/E), SEQ ID NO: 11 (BoNT/F), SEQ ID NO: 13 (BoNT/G) или SEQ ID NO: 15 (TeNT). Более того, охватывается, в некотором варианте выполнения настоящего изобретения, полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность (перед модификацией в соответствии с настоящим изобретением, т.е. модификации легкой цепи посредством по меньшей мере одного мотива узнавания E3 лигазы), как показано в любом из SEQ ID NO: 2 (BoNT/A), SEQ ID NO: 4 (BoNT/B), SEQ ID NO: 6 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 8 (BoNT/D), SEQ ID NO: 10 или 82 (BoNT/E), SEQ ID NO: 12 (BoNT/F), SEQ ID NO: 14 (BoNT/G) или SEQ ID NO: 16 (TeNT). В другом варианте выполнения настоящего изобретения указанный полинуклеотид является вариантом указанного выше полинуклеотида, содержащего одну или более нуклеотидных замен, делеций и/или вставок, которые в еще одном варианте выполнения настоящего изобретения могут приводить к закодированной аминокислоте, имеющей одну или более аминокислотных замен, делеций и/или вставок. Более того, вариантный полинуклеотид в соответствии с настоящим изобретением должен в другом варианте выполнения настоящего изобретения содержать вариант последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% идентичность или 100% идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, как показано в любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 81, 11, 13 или 15, или вариант последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% идентичности или 100% идентичности с аминокислотной последовательностью, как показано в любой из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 82, 12, 14, 16. В некотором варианте выполнения настоящего изобретения каждый из вышеупомянутых вариантов полинуклеотидов кодируют вариантный полипептид, сохраняющий одно или нескольких биологических свойств, и в другом варианте выполнения настоящего изобретения все биологические свойства соответствующего нейротоксического полипептида, то есть BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, ΒοΝT/Ε, BoNT/F, BoNT/G или столбнячного нейротоксина (TeNT). Специалистам в данной области техники будет понятно, что полная биологическая активность сохраняется только после активации протеолитической активности, хотя вполне возможно, что непроцессированный предшественник может проявлять некоторые биологические функции или быть частично активным. Термин "биологические свойства", используемый в настоящем изобретении, относится к: (а) связыванию рецептора, (b) интернализации, (с) транслокации через мембрану эндосом в цитозоль, и/или (d) эндопротеолитическому расщеплению белков, участвующих в слияния мембран синаптической везикулы. В дополнительном варианте выполнения настоящего изобретения вариантные полинуклеотиды могут кодировать вариантные полипептиды, имеющие улучшенные или измененные биологические свойства, например, они могут содержать сайты расщепления, которые улучшены для ферментного узнавания или могут быть улучшены для связывания с рецептором или другие вышеуказанные свойства. В еще одном дополнительном варианте выполнения настоящего изобретения вариантные полинуклеотиды должны кодировать слитые нейротоксические полипептиды, содержащие часть по меньшей мере двух нейротоксических полипептидов различных серотипов, например, слитый нейротоксин, содержащий тяжелую цепь BoNT/A и легкую цепь BoNT/E или связывающий домен BoNT/E и транслокационный домен и легкую цепь BoNT/A.

Термин "идентичный", используемый в настоящем изобретении, относится к идентичности последовательностей, характеризующихся посредством определения числа одинаковых аминокислот в двух последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей, в которых последовательности, выровнены таким образом, что получается самая высокая степень совпадений. Она может быть рассчитана, при использовании опубликованных методик или способов, кодифицированных в компьютерных программах, таких как, например, BLASTP, BLASTN или FASTA (Altschul, 1990, J. Mol Biol 215, 403). Значения процентной идентичности в одном аспекте рассчитывается по введенной аминокислотной последовательности. Серия программ на основе различных алгоритмов является доступной специалисту в данной области техники для сравнения различных последовательностей. В этом контексте алгоритмы Needleman и Wunsch или Smith и Waterman дают особенно надежные результаты. Для выполнения выравнивания последовательностей могут быть использованы программа PileUp (Higgins 1989, CABIOS 5, 151) или программы Gap и BestFit (Needleman 1970, J. Mol. Biol. 48; 443; Smith 1981, Adv. Appl. Math. 2, 482), которые являются частью пакета программного обеспечения GCG (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711). Значения идентичности последовательностей, представленные выше в процентах (%), должны быть определены в другом аспекте настоящего изобретения, с помощью программы GAP во всей области последовательности со следующими настройками: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10.000 and Average Mismatch: 0.000, которые, если не указано иное, всегда должны использоваться в качестве стандартных настроек для выравнивания последовательностей.

Выражения «активность», «функция», «биологическая активность», «биологическая функция» или «биологический эффект» нейротоксина, как используемые в настоящем изобретении, обозначает количество клеточного экзоцитоза, ингибируемого из клетки в единицу времени, такие как экзоцитоз нейромедиатора, например ацетилхолина, из клетки-мишени, такой как нейрон. В частности, это относится к биологической активности зрелого двухцепочечного нейротоксического полипептида, демонстрирующего a) связывание с рецептором, b) интернализацию, с) транслокацию через эндосомную мембрану в цитозоль, и/или d) эндопротеолитическое расщепление белков, участвующих в слияние синаптических везикул. Выражение "продолжительность биологического действия (нейротоксина) в субъекте", используемый в настоящем изобретении, означает период времени биологической активности нейротоксина у субъекта, к которому нейротоксин был применен. Исследования in vivo для анализа на биологическую активность включают определение ЛД50 для мыши и ex vivo исследование на мышиной гемидиафрагме, описанное Pearce et al. (Pearce 1994, Toxicol. Appl. Pharmacol. 128: 69-77) и Dressier et al. (Dressier 2005, Mov. Disord. 20:1617-1619, Keller 2006, Neuroscience 139: 629-637). Биологическая активность также может быть оценена с помощью анализа на основе клеток, как описано, например, Whitemarsh et al. (Whitemarsh et al. 2012, Toxicol. Sci. 126: 426-435).

Биологическая активность обычно выражается в мышиных единицах (MU). Как используется в настоящем изобретении, 1 MU соответствует такому количеству нейротоксического компонента, который убивает 50% определенной популяции мышей после внутрибрюшинной инъекции, т.е. внутрибрюшинное LD50 для мыши. Термин "субъект", как используется в настоящем изобретении, означает млекопитающее, предпочтительно человек.

Более того, слитые полипептиды, дополнительно содержащие обнаруживаемые маркерные пептиды или метки, охватываются в других вариантах нейротоксического полипептида в соответствии с настоящим изобретением, обладающего сокращенной продолжительностью биологического эффекта у субъекта, вследствие по меньшей мере одного мотива узнавания E3 лигазы в легкой цепи. В одном варианте выполнения настоящего изобретения пригодными метками, которые также позволяют более эффективную очистку меченного полипептида, являются, например, FLAG метки, Myc метки, His-метки, HA-метки и GST-метки. Обнаруживаемые маркерные пептиды, в некотором варианте выполнения настоящего изобретения, включают флуоресцентные белки: например, GFP, BFP, YFP и тому подобное. Указанный слитый полипептид может содержать дополнительные домены полипептида в некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения. Например, нейротоксический полипептид в соответствии с настоящим изобретением может содержать пептидный домен, который опосредует проникновение, чтобы получить доступ к месту действия легкой цепи нейротоксина, т.е. в цитоплазму нейрональной клетки-мишени. С этой целью, например, полиаргининовый пептид может быть использован для слияния с нейротоксическим полипептидом в соответствии с настоящим изобретением, который хорошо известен в данной области техники.

Нейротоксический полипептид (кодируемый полинуклеотидом) в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержит по меньшей мере один мотив узнавания E3 лигазы в своей легкой цепи. Как изложено в другом месте более подробно и как продемонстрировало в следующих примерах, на продолжительность биологического действия нейротоксина у субъекта можно влиять, т.е. изменять, посредством введения по меньшей мере одного мотива узнавания E3 лигазы в легкой цепи или добавлением по меньшей мере одного мотива узнавания E3 лигазы в N- или С-конец легкой цепи. Таким образом, в одном варианте выполнения настоящего изобретения нейротоксический полипептид в соответствии с настоящим изобретением содержит по меньшей мере один внутренне или терминально введенный мотив узнавания E3 лигазы в легкой цепи. Такая модификация приводит к уменьшению продолжительности биологического действия нейротоксина в соответствии с настоящим изобретением у субъекта, по сравнению с нейротоксином, не содержащим мотив узнавания E3 лигазы. В другом варианте настоящего изобретения указанную легкую цепь нейротоксического полипептида, кодируемого полинуклеотидом в соответствии с настоящим изобретением, получают путем модификации из легкой цепи, которая кодируется полинуклеотидом, содержащим любую из вышеупомянутых специфических последовательностей нуклеиновых кислот или их вариантов, описанных выше. Как описано выше и хорошо известно в данной области техники, легкие цепи нейротоксических полипептидов генерируются посредством протеолитического расщепления полипептида-предшественника. Легкая цепь представляет собой N-концевую часть полипептида-предшественника, которая получается в результате указанного протеолитического расщепления. Аминокислотные последовательности легких цепей нейротоксических полипептидов, упомянутых выше, могут быть выведены в одном варианте выполнения настоящего изобретения из сайтов расщепления нейротоксинов дикого типа, указанных в таблице 1. В рекомбинантных нейротоксинах сайты расщепления (например, сайт расщепления тромбином или сайт расщепления энтерокиназой) вводятся в последовательность между двумя цистеинами, образующими дисульфидный мостик между тяжелой и легкой цепями, предпочтительно в линкер, как определено в настоящем описании в других местах.

Термин «мотив узнавания E3 лигазы», как используется в настоящем изобретении, относится к: (а) модификации(ям) легкой цепи нейротоксического полипептида в соответствии с настоящим изобретением, которые приводят к ускоренной деградации нейротоксического полипептида посредством эндогенных путей деградации, присутствующих в субъекте, к которому нейротоксин был применен. Мотив узнавания E3 лигазы представляет собой структурный мотив, который позволяет узнавание мотива и связывание с мотивом E3 лигазы. Дополнительные сигналы пептидной деградации, опосредующие клеточную деградации белков известны в данной области техники, и включают в себя, например, PEST мотивы, WW мотивы или WD40 мотивы. Путь деградации может быть протеасомным путем деградации или лизосомальным путем деградации. В другом варианте выполнения настоящего изобретения один из путей деградации может просто привести к частичной деградации нейротоксического полипептида в соответствии с настоящим изобретением, например, посредством одной или нескольких стадий протеолитического расщепления. Указанный мотив узнавания E3 лигазы может быть введен в легкую цепь, т.е. располагаться (внутренне) внутри легкой цепи или присоединяться к ней либо на N-, либо на С-конце. В последнем случае нейротоксический полипептид в соответствии с настоящим изобретением может, например, нести мотив узнавания E3 лигазы, который располагается между легкой цепи нейротоксина и тяжелой цепи нейротоксина. Например, такая конструкция может в одном варианте выполнения настоящего изобретения иметь расположение, от N-конца к С-концу: легкая цепь нейротоксина - мотив узнавания E3 лигазы - тяжелая цепь нейротоксина. Альтернативно, доменное расположение может быть, от N- к С-концу: тяжелая цепь нейротоксина - мотив узнавания E3 лигазы - легкая цепь нейротоксина. В дополнительном варианте выполнения настоящего изобретения дополнительный линкер, такой как, например, полиглициновый линкер, может быть использован для соединения легкой и тяжелой цепей нейротоксина. Такая конструкция может быть организована от N- к С-концу: легкая цепь нейротоксина - мотив узнавания E3 лигазы - линкер - тяжелая цепь нейротоксина. Кроме того, доменное расположение может быть от N- к С-концу: тяжелая цепь нейротоксина - линкер - мотив узнавания E3 лигазы - легкая цепь нейротоксина. Линкер предпочтительно содержит сайт расщепления протеазой, например, сайт расщепления энтерокиназой или сайт расщепления тромбином. Положение мотива узнавания E3 лигазы предпочтительно - С-конец первого цистеина легкой цепи, образующего дисульфидный мостик, и N-конец сайта расщепления протеазой; см. Фиг. 1. После расщепления посредством соответствующей протеазы, легкая цепь нейротоксина (содержащая мотив узнавания E3 лигазы) высвобождается из вышеуказанной конструкции. В других вариантах выполнения настоящего изобретения нейротоксический полипептид в соответствии с настоящим изобретением содержит не только один мотив узнавания E3 лигазы в или присоединенным к природной рекомбинантной легкой цепи, а два, три, четыре или даже больше мотивов узнавания E3 лигазы. Термин "модифицированный" нейротоксический полипептид, обладающий пониженной продолжительность биологического эффекта у субъекта, как используется в настоящем изобретении, означает, что нейротоксический полипептид в соответствии с настоящим изобретением содержит по меньшей мере один мотив узнавания E3 лигазы в или присоединенным к природной рекомбинантной легкой цепи, предпочтительно в комбинации с одной или более мутаций в легкой цепи нейротоксина. Еще более предпочтительно указанная мутация в легкой цепи нейротоксина является аминокислотной заменой, как определено в настоящем изобретении в других местах.

Специалисту в данной области техники хорошо известны подходящие мотивы узнавания E3 лигазы и, как ввести или связать их с легкой цепью нейротоксического полипептида. Кроме того, специалист в данной области техники может генерировать полинуклеотиды, кодирующие такие нейротоксические полипептиды, по меньшей мере с одним мотивом узнавания E3 лигазы посредством применения рекомбинантных молекулярно-биологических методик или химических модификаций. Например, сайт-направленный мутагенез может быть использован для введения мотивов узнавания E3 лигазы, описываемых в настоящем изобретении. С другой стороны, последовательность нуклеиновой кислоты для полинуклеотида, содержащая кодирующие последовательности для нейротоксического полипептида и предполагаемого мотива узнавания E3 лигазы, могут быть разработаны и весь полинуклеотид может впоследствии быть химически синтезирован.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения указанный мотив узнавания E3 лигазы является по меньшей мере внутренне или терминально введенным мотивом узнавания E3 лигазы и/или мотивом, связывающим Е3-лигазу. Предпочтительно, узнающий и связывающий мотивы для соответствующей E3 лигазы являются идентичными, то есть указанный мотив используется как для узнавания, так и для связывания E3 лигазы. В этом варианте выполнения настоящего изобретения мотив узнавания E3 лигазы нацеливает легкою цепь нейротоксического полипептида в соответствии с настоящим изобретением на клеточную деградацию через протеасомный путь убиквитин-опосредованной деградации. Деградация через убиквитин-протеасомный путь состоит из двух дискретных и последовательных стадий: (i) ковалентное присоединение множества молекул убиквитина к легкой цепи нейротоксического полипептида в соответствии с настоящим изобретением с формированием полиубиквитиновой цепи и (ii) деградация таким образом помеченной легкой цепи нейротоксического полипептида посредством пути 26S протеасомы. Как описано в этой области техники, убиквитин, высоко консервативный белок из 76 аминокислот, конъюгируется с белком-мишенью посредством трехстадийного механизма. Первоначально С-концевая карбоксильная группы убиквитина активируется посредством убиквитин-активирующего фермента (E1). Тиоэфир, образующийся при присоединении убиквитина к ферменту E1, затем переносится посредством реакции транс-ацилирования к убиквитин-конъюгирующему ферменту (Е2). В зависимости от вовлеченной E3 лигазы убиквитин затем либо непосредственно переносится к E3 лигазе (RING E3 лигазы), либо комплекс Е2-убиквитин связывается с E3 лигазой (RING E3 лигазы). Наконец, в обоих случаях E3 лигаза специфически связывается с субстратом и катализирует последнюю стадию в процессе конъюгации, которая является ковалентным присоединением убиквитина к субстрату, в настоящем случае, к легкой цепи нейротоксического полипептида в соответствии с настоящим изобретением (Marmor and Yarden 2004, Oncogene 23: 2057-2070). Последовательные конъюгации убиквитина с внутренними лизинами предварительно добавленных убиквитиновых молекул приводят к образованию полиубиквитиновых цепей. Полиубиквитинированный целевой белок затем узнается 26S протеасомой и элиминируется (Schrader 2009, Nat. Chem. Biol. 5: 815-22). Предпочтительно, мотив узнавания E3 лигазы, как определено в настоящем изобретении, опосредует необратимую деградацию. Такая необратимая деградация была описана, например, для пептидной деградации сигнального домена "ALAPYIP" (SEQ ID NO: 25). В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения мотив узнавания E3 лигазы и/или связывающий мотив представляет собой пептид или пептидомиметик, имеющий длину меньше чем 50 остатков аминокислот, длину меньше чем 40 остатков, длину меньше чем 30 остатков, длину меньше чем 20 остатков, или длину меньше чем 15 остатков. Конкретные примеры мотивов узнавания Е3-лигазы приведены в таблице 2 или мотивов узнавания Е3-лигазы, включающие аминокислотную ETFSDLWKLLPE (SEQ ID NO: 26), TSFAEYWNLLSP (SEQ ID NO: 27), LTFEHYWAQLTS (SEQ ID NO: 28), LTFEHWWAQLTS (SEQ ID NO: 29), LTFEHSWAQLTS (SEQ ID NO: 30), ETFEHNWAQLTS (SEQ ID NO: 31), LTFEHNWAQLTS (SEQ ID NO: 32), LTFEHWWASLTS (SEQ ID NO: 33), LTFEHWWSSLTS (SEQ ID NO: 34), LTFTHWWAQLTS (SEQ ID NO: 35), ETFEHWWAQLTS (SEQ ID NO: 36), LTFEHWWSQLTS (SEQ ID NO: 37), LTFEHWWAQLLS (SEQ ID NO: 38), ETFEHWWSQLLS (SEQ ID NO: 39), RFMDYWEGL (SEQ ID NO: 40), MPRFMDYWEGLN (SEQ ID NO: 41), SQETFSDLWKLLPEN (SEQ ID NO: 42) и/или LTFEHNWAQLEN (SEQ ID NO: 78).

Предпочтительно, чтобы мотив узнавания E3 лигазы опосредовал бы деградацию по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90%, более предпочтительно 100% легкой цепи нейротоксических полипептидов в соответствии с настоящим изобретением внутри клетки. Деградация может быть определена с помощью анализов, описанных в данной области техники, например, с помощью анализов in vitro, наподобие количественных анализов на клеточной основе или in vivo анализов: таких как, исследование на бегающих мышах, анализ отведения пальца (DAS), или анализ силы захвата крысы.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения мотив узнавания E3 лигазы представляет собой связывающий мотив для E3 лигазы MDM2. Соответствующие последовательностей нуклеиновых кислот и аминокислотных последовательностей человека приведены в номерах доступа NM 002392 и NP 002383, соответственно. Предпочтительно, указанный связывающий мотив для E3 лигазы MDM2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из ETFSDLWKLLPE (SEQ ID NO: 26), TSFAEYWNLLSP (SEQ ID NO: 27), LTFEHYWAQLTS (SEQ ID NO: 28), LTFEHWWAQLTS (SEQ ID NO: 29), LTFEHSWAQLTS (SEQ ID NO: 30), ETFEHNWAQLTS (SEQ ID NO: 31), LTFEHNWAQLTS (SEQ ID NO: 32), LTFEHWWASLTS (SEQ ID NO: 33), LTFEHWWSSLTS (SEQ ID NO: 34), LTFTHWWAQLTS (SEQ ID NO: 35), ETFEHWWAQLTS (SEQ ID NO: 36), LTFEHWWSQLTS (SEQ ID NO: 37), LTFEHWWAQLLS (SEQ ID NO: 38), ETFEHWWSQLLS (SEQ ID NO: 39), RFMDYWEGL (SEQ ID NO: 40), MPRFMDYWEGLN (SEQ ID NO: 41), SQETFSDLWKLLPEN (SEQ ID NO: 42) и/или LTFEHNWAQLEN (SEQ ID NO: 78). Еще более предпочтительно, указанный связывающий мотив для E3 лигазы MDM2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности LTFEFINWAQLTS (SEQ ID NO: 32) или LTFEHNWAQLEN (SEQ ID NO: 78). Также предпочтительно, чтобы длина связывающего мотива для E3 лигазы MDM2 составляла от 9 до 15 аминокислотных остатков, более предпочтительно она составляла 12 аминокислотных остатков в длину. Фиг. 1 иллюстрирует пример нейротоксического полипептида в соответствии с настоящим изобретением, содержащего связывающий мотив для E3 лигазы MDM2 (MDM2 мотив). Фиг. 2 показывает, что взаиморасположение связывающего мотива для E3 лигазы MDM2 между легкой цепью и тяжелой цепью нейротоксина, как показано на Фиг. 1, позволяет узнавание и связывание E3 лигазы MDM2 к таким образом модифицированной легкой цепи нейротоксина, что приводило к убиквитинированию остатков лизина, экспонированных на окружающей поверхности и ускоренной деградации легкой цепи убиквитинированного нейротоксина в соответствии с настоящим изобретением посредством клеточной протеасомной системы. В объем настоящей заявки включено, что последовательность указанных мотивов связывания для E3 лигазы MDM2 может быть дополнительно модифицирована, например, посредством одного или нескольких нуклеотидных замен, делеций и/или вставок, которые в еще одном варианте выполнения настоящего изобретения могут привести к закодированной аминокислотной последовательности, имеющей одну или более аминокислотных замен, делеций и/или вставок. Указанные модификации могут быть осуществлены для того чтобы изменить (например, улучшить) связывание E3 лигазы MDM2 с указанными связывающими мотивами, что привело бы к еще более усиленной деградации нейротоксического полипептида в соответствии с настоящим изобретением по пути убиквитин-опосредованной протеасомной деградации.

В дополнительном варианте выполнения настоящего изобретения указанный полинуклеотид в соответствии с настоящим изобретением содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из:

a) последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 51 или 79;

b) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52 или 80; и

c) последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 40%, предпочтительно по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью нуклеиновой кислоты а) или b).

Как продемонстрировало в следующих примерах, нейротоксический полипептид (кодируемый полинуклеотидом) в соответствии с настоящим изобретением, содержащей по меньшей мере один мотив узнавания E3 лигазы в легкой цепи, демонстрирует уменьшенную продолжительность биологического эффекта у субъекта при введении по сравнения с немодифицированным нейротоксическим полипептидом (не содержащим один или более мотив(ов) узнавания E3 лигазы в легкой цепи). Уменьшенная продолжительность биологической активности таким образом модифицированного полипептида была примером для BoNT/E-MDM2. Уменьшенная продолжительность биологического эффекта нейротоксического полипептида в соответствии с настоящим изобретением является результатом более быстрой деградации нейротоксического полипептида (т.е. каталитической легкой цепи нейротоксина) с помощью протеасомной системы в нейроне субъекта.

Вышеупомянутый полипептид BoNT/E-MDM2 был дополнительно улучшен авторами настоящего изобретения посредством сайт-направленного мутагенеза экспонированных аминокислотных остатков в легкой цепи, которые находятся в пространственной близости к мотиву узнавания MDM2. "Экспонированные аминокислотные остатки" при использовании в настоящем изобретении означает, что аминокислотные остатки расположены на поверхности легкой цепи нейротоксина, например, в легкой цепи BoNT/E, а боковые цепи указанных аминокислотных остатков не вовлечены во внутримолекулярные взаимодействия. Указанные экспонированные аминокислотные остатки в пределах легкой цепи были сначала определены посредством трехмерного структурного анализа, а затем замещены остатками лизина. Эта процедура оптимизации привела в еще более ускоренной деградации мутантных полипептидов BoNT/E-MDM2 по сравнению с немутированными полипептидами BoNT/E-MDM2, содержащими мотив узнавания E3 лигазы. Неожиданно было обнаружено, что замены при Q53, N72, N378, N379, R394 и/или Т400 на лизин приводили к более быстрой деградации BoNT/E-MDM2 посредством протеасомой системы. Указанное положение аминокислотного остатка основано на нумерации в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO. 52. В частности, мутанты BoNT/E-MDM2, в которых (i) Q53, N72, N378, N379, R394 и Т400 (SEQ ID NO. 57); (ii) Q53, N378 и N379 (SEQ ID NO. 58); (iii) N72, N378 и N379 (SEQ ID NO. 61); или (iv) N378, N379 и T400 (SEQ ID NO. 75) в легкой цепи были заменены остатками лизина, показали уменьшенный биологический эффект на культивируемые нейроны коры головного мозга. В противоположность этому, другие многочисленные мутации не показали какого-либо уменьшения продолжительности биологического эффекта, как продемонстрировано на Фиг. 3. Соответственно, в дополнительном варианте выполнения настоящего изобретения полипептиды в соответствии с настоящим изобретением содержат или состоят из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

а) аминокислотной последовательности, как показано в SEQ ID NO: 57, 58, 61 или 75; и

b) аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 40%, предпочтительно 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности а).

Предпочтительно, чтобы аминокислотная последовательность b) несла бы тот же самый набор мутаций, как SEQ ID NO: 57 (Q53, N72, N378, N379, R394 и Т400), 58 (Q53, N378 и N379), 61 (N72, N378 и N379) или 75 (N378, N379 и Т400) в легкой цепи. В другом варианте выполнения настоящего изобретения настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему аминокислотные последовательности а) или b), приведенные выше.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения биологический эффект нейротоксического полипептида в соответствии с настоящим изобретением, наблюдаемый в субъекте, вызывает паралич мышц, т.е. (обратимую) инактивацию способности мышц к сокращению. В дополнительном варианте выполнения настоящего изобретения уменьшение продолжительности биологического эффекта нейротоксического полипептида в соответствии с настоящим изобретением у человека сохраняется меньше 5, 4, 3, 2 недель или даже меньше, чем 1 неделя. В другом варианте выполнения настоящего изобретения эффекты могут быть исследованы in vivo посредством так называемого исследования на бегающих мышах (Keller 2006, Neuroscience 139: 629-637), анализ отведения пальца (Aoki 2001, Toxicon 12: 1815-20) или анализа силы сцепления крысы (Torii 2011, Toxicon 57 (1): 93-9). Биологические эффекты могут быть определены специалистом в данной области техники без дальнейших хлопот. Уменьшенная продолжительность биологического действия в некотором аспекте относится к статистически значимой уменьшенной продолжительности. Является ли уменьшенная продолжительность эффекта статистически значимой, может быть определено специалистами в этой области техники при использовании стандартных статистических тестов, например, определение доверительных интервалов, определение p-значения, Т-критерия Стьюдента, теста Манна-Уитни и т.д. Предпочтительными доверительными интервалами являются по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере, 99%. р-Значения, предпочтительно равны 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 или 0,0001. Предпочтительно, чтобы вероятность предусмотренная настоящим изобретением, позволяла бы сделать правильный диагноз по меньшей мере для 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% субъектов в данной группе или популяции. В некотором варианте выполнения настоящего изобретения указанная уменьшенная продолжительность сохраняется менее чем 75%, менее чем 70%, менее чем 65%, менее чем 60%, менее чем 55%, менее чем 50%, менее чем 45%, менее чем 40%, менее чем 30% или менее чем 20% от нормальной продолжительности, т.е. продолжительности, наблюдаемой для немодифицированного нейротоксического полипептида (не содержащего ни одного мотива узнавания E3 лигазы в легкой цепи или присоединенного к легкой цепи). В некотором варианте выполнения настоящего изобретения нормальная продолжительность сохраняется в течение приблизительно 4 месяца в случае BoNT/A, 2 месяца в случае BoNT/B, приблизительно от 3 до 4 месяцев в случае BoNT/C или приблизительно от 4 до 6 недель в случае из BoNT/E (Foran, J. Biol. Chem. 278(2): 1363-1371, Eleopra 1998, Neurosci. Lett. 13, 256(3): 135-138, Eleopra Neurosci. Lett. 14,224(2): 91-94, Sloop 1997, Neurology 49(1): 189-194, Washbourne J. Physiol. Paris 92(2): 135-139). Должно быть понятно, что длительность эффекта зависит от индивидуальных влияний в субъекте: такие как генетический фон, возраст, образ жизни и т.д. Поэтому приблизительная длительность, как понимается в настоящем изобретении, относится к продолжительности, как указано выше для соответствующих нейротоксических полипептидов (например, 4 месяца для BoNT/A или от 4 до 6 недель для BoNT/E) со стандартным отклонением 25% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее или 5% или менее.

Предпочтительно обнаружить в соответствии с настоящим изобретением, что нейротоксический полипептид может быть модифицирован для проявления укороченного биологического эффекта у субъекта при введении. Это может быть достигнуто посредством введения или связывания мотива узнавания E3 лигазы с легкой цепью указанного нейротоксического полипептида, так как было установлено, что сохранение легкой цепи коррелирует с продолжительностью биологического эффекта. Сокращенная продолжительность биологического эффекта, вызываемого нейротоксическими полипептидами в соответствии с настоящим изобретением, является полезным для различных медицинских приложений, изложенных в других местах в настоящем описании, которые требуют уменьшенной продолжительности биологического эффекта указанного нейротоксина. Такая уменьшенная продолжительность особенно важна в случае краткосрочного или острого лечения с нейротоксином, например, при лечении хирургических ран, с тем чтобы облегчить быстрое и безболезненное заживление ран без формирования рубцов, или при параличе мышцы глазного века больных в искусственной коме, чьи глаза могут получить повреждение посредством высыхания. Дополнительные применения нейротоксического полипептида в соответствии с настоящим изобретением перечислены в другом месте настоящего описания.

Настоящее изобретение предусматривает вектор, содержащий полинуклеотид в соответствии с настоящим изобретением.

Термин «вектор» предпочтительно включает в себя фаговые, плазмидные, вирусные или ретровирусные векторы, а также искусственные хромосомы, например, бактериальные или дрожжевые искусственные хромосомы. Более того, термин также относится к нацеливающим конструкциям, которые позволяют случайную или сайт-направленную интеграцию нацеливающей конструкции в геномную ДНК. Такие таргетные конструкции предпочтительно содержат ДНК достаточной длины либо для гомологичной, либо гетерологичной рекомбинации, как подробно описано ниже. Вектор охватывающий полинуклеотиды в соответствии с настоящим изобретением в некотором варианте выполнения настоящего изобретения дополнительно содержит селектируемые маркеры для размножения и/или селекции в хозяине. Вектор может быть инкорпорирован в клетку-хозяина с помощью различных методов, хорошо известных в данной области техники. Например, плазмидный вектор может быть введен в виде преципитата, такого как преципитат фосфата кальция или преципитат хлорида рубидия, или в комплексе с заряженным липидом или в кластерах на основе углерода, таких как: фуллерены. В качестве альтернативы плазмидный вектор может быть введен посредством методик теплового шока или электропорации.

Если вектор на основе вируса, он может быть упакован in vitro с использованием пакующей клеточной линии перед применением к клеткам-хозяевам. Ретровирусные векторы могут быть реплицированы компетентными или дефектными по репликации. В последнем случае вирусное размножение обычно будет происходить только в комплементирующих хозяевах/клетках. Более того, в некотором варианте выполнения настоящего изобретения полинуклеотид функционально связан с последовательностями, контролирующими экспрессию в прокариотических или эукариотических клетках, позволяющими экспрессию в прокариотических и эукариотических клетках-хозяевах или их изолированных фракциях в указанном векторе. Экспрессия полинуклеотида включает транскрипцию полинуклеотида в транслируемую мРНК. Регулирующие элементы, обеспечивающие экспрессию в клетках-хозяевах, хорошо известны в данной области техники. В некотором варианте выполнения настоящего изобретения они содержат регуляторные последовательности, обеспечивающие инициацию транскрипции и/или поли-А-сигнал, обеспечивающий завершение транскрипции и стабилизацию транскрипта. Дополнительные регуляторные элементы могут включают транскрипционные, а также трансляционные энхансеры. Возможные регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию в прокариотических клетках-хозяевах, содержат, например, lac-, trp- или tac-промотор в E.coli, и примерами для регуляторных элементов, обеспечивающих экспрессию в эукариотических клетках-хозяевах, являются АОХ1- или GAL1-промотор в дрожжах или CMV-, SV40-, RSV-промотор (вируса саркомы Рауса), CMV-энхансер, SV40-энхансер или глобиновый интрон в клетках млекопитающих и других животных. Более того, могут быть использованы индуцибельные контролирующие экспрессию последовательности в экспрессирующем векторе, которые охватываются настоящим изобретением. Такие индуцибельные векторы могут включать tet или lac операторные последовательности или последовательности, индуцируемые посредством теплового шока или других факторов окружающей среды. Подходящие контролирующие экспрессию последовательности хорошо известны в данной области техники. Кроме элементов, которые ответственны за инициирование транскрипции, такие регуляторные элементы могут также содержать сигналы терминации транскрипции, такие как, сайт SV40-поли-A или сайт tk-поли-А, ниже по течению от полинуклеотида. В этом контексте пригодные экспрессирующие векторы известны в этой области техники: такие как Okayama-Berg кДНК экспрессионный вектор pcDV1 (Pharmacia), pBluescript (Stratagene), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen) или pSPORT1 (Invitrogen). Предпочтительно, чтобы указанный вектор является бы экспрессирующим вектором и переносчиком генов или направленный вектор. Экспрессирующие векторы, полученные из вирусов, таких как ретровирусы, вирус коровьей оспы, адено-ассоциированный вирус, вирусы герпеса или вирус папилломы крупного рогатого скота, могут быть использованы для доставки полинуклеотида или вектора в соответствии с настоящим изобретением в популяцию клеток-мишеней. Методы, которые являются хорошо известными специалистам в данной области техники, могут быть использованы для конструирования рекомбинантных вирусных векторов; см., например, методики, описанные в Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) N.Y. и Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994).

Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей полинуклеотид или вектор в соответствии с настоящим изобретением.

Термин "клетка-хозяин", используемый в настоящем изобретении, охватывает прокариотические и эукариотические клетки-хозяева. Предпочтительно клетка-хозяин является изолированной прокариотической или эукариотической клеткой-хозяином. В некотором варианте выполнения настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку, а в другом варианте выполнения настоящего изобретения, бактериальную клетку Firmicutes. В одном варианте выполнения настоящего изобретения указанная бактериальная клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина Е. coll. В другом варианте выполнения настоящего изобретения это клетка-хозяин Clostridium. В дополнительном варианте выполнения настоящего изобретения указанная клетка-хозяин Clostridium представляет собой клетку-хозяина Clostridium botulinum, в еще одном дополнительном варианте выполнения настоящего изобретения клетка одного из вышеупомянутых семи различных серотипов Clostridium botulinum. В еще одном варианте выполнения настоящего изобретения бактериальная клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина Clostridium botulinum. В дополнительном варианте выполнения настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина Bacillus и в конкретном варианте выполнения настоящего изобретения клетку-хозяина Bacillus megaterium. Эукариотическая клетка-хозяин в некотором варианте выполнения настоящего изобретения представляет собой клетку из линии клеток животных, подходящую для производства токсических белков или грибковую клетку-хозяина, например, дрожжевую клетку-хозяина.

Таким образом, настоящим изобретением охватывается полипептид, кодируемый полинуклеотидом в соответствии с настоящим изобретением. В некотором варианте полипептида в соответствии с настоящим изобретением, полипептид дополнительно содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в легкой цепи нейротоксического полипептида (но не в MDM2-связывающем мотиве, как определено в настоящем изобретении). Предпочтительно, чтобы замещение встречающейся в природе аминокислоты в легкой цепи происходило лизином. Более предпочтительно, чтобы указанный полипептид содержал по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из Q53K, N72K, N378K, N379K, R394K и T400K. Полипептид может содержать не только одну из указанных аминокислотных замен, но также две, три, четыре, пять, шесть или даже больше аминокислотных замен. BoNT/E-MDM2-мутанты, в которых (i) Q53, N72, N378, N379, R394 и Т400 (SEQ ID NO. 57), (ii) Q53, N378 и N379 (SEQ ID NO. 58), (iii) N72, N378 и N379 (SEQ ID NO. 61) или (iv) N378, N379 и T400 (SEQ ID NO. 75) в легкой цепи были заменены остатками лизина, являются особенно предпочтительными. В других вариантах полипептидов в соответствии с настоящим изобретением полипептид может содержать в дополнение к вышеупомянутым заменам аминокислотной последовательности в легкой цепи, одну или более замен аминокислотных последовательностей в MDM2-связывающим мотиве, например, для того, чтобы улучшить связывание Е3-лигазы MDM2 с полипептидом в соответствии с настоящим изобретением.

Термин "полипептид", как используется в настоящем изобретении включает изолированный или по существу очищенный полипептид, по существу свободный от других полипептидов, включая комплексообразующие белки (НА70, НА17, НА33 или NTNH (NBP) Clostridium botulinum или полипептидные препараты, содержащие дополнительно другие белки. Более того, термин включает рекомбинантные и химически модифицированные полипептиды. Такие модификации могут быть искусственными модификациями или встречающимися в природе модификациями. Как указано на выше, полипептид в соответствии с настоящим изобретением имеет биологические свойства нейротоксического полипептида, указанного на выше. Кроме того, он должен демонстрировать сокращенную продолжительность биологического эффекта у субъекта при введении. Дополнительно полипептид в соответствии с настоящим изобретением может быть составлен из ботулинического токсина с новым связывающим доменом для нацеливания на другие типы клеток. Полипептид в соответствии с настоящим изобретением в некотором варианте выполнения настоящего изобретения может быть получен посредством способа получения полипептида, как описано в другом месте настоящего описания более подробно. В некотором варианте выполнения настоящего изобретения настоящего изобретения предусматривается полипептидный препарат, который содержит комплекс нейротоксического полипептида и его комплексообразующих белков.

Более того, настоящее изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с полипептидом настоящего изобретения. В дополнительном варианте выполнения настоящего изобретения антитело специфически связывается с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 52, 57, 58, 61 или 75.

Антитела против полипептидов в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены посредством хорошо известных способов с помощью очищенного полипептида в соответствии с настоящим изобретением или подходящего фрагмента, полученного из него в качестве антигена. Фрагмент, который пригоден в качестве антигена, может быть идентифицирован посредством алгоритмов, определяющих антигенность, хорошо известных в данной области техники. Такие фрагменты могут быть получены либо из полипептидов в соответствии с настоящим изобретением посредством протеолитического расщепления, либо могут быть синтетическим пептидом. В некотором варианте выполнения настоящего изобретения антитело в соответствии с настоящим изобретением представляет собой моноклональное антитело, поликлональное антитело, одноцепочечное антитело, человеческое или гуманизированное антитело или приматизированное антитело, химеризированное антитело или фрагмент вышеперечисленного. Также в качестве антител в настоящем изобретении представляют собой биспецифическое или биспецифическое одноцепочечные антитело, синтетическое антитело, фрагмент антитела такие как Fab, Fv или scFv-фрагмент и т.д., или химически модифицированное производного любого из них. Антитело настоящего изобретения будет специфически связываются (т.е. перекрестно не реагировать с другими полипептидами или пептидами) с полипептидом в соответствии с настоящим изобретением. В частности, антитело также не должны перекрестно реагировать с немодифицированным нейротоксическим полипептидом (не несущим MDM2-связывающий мотив). Кроме того, антитело не должно перекрестно реагировать с E3 лигазой MDM2. Специфическое связывание может быть проверено с помощью различных хорошо известных методик. Антитела или их фрагменты могут быть получены с помощью методов, которые описаны, например, в Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Моноклональные антитела могут быть получены с помощью методик, впервые описанных Köhler et al. (Köhler 1975, Nature 256:495) и Galfré (Galfré 1981, Meth. Enzymol. 73), которые включает слияние клеток миеломы мыши со спленоцитами, полученными от иммунизированных млекопитающих, которые были иммунизированы антигеном, то есть полипептидом в соответствии с настоящим изобретением или его иммуногенным фрагментом. Антитела могут быть использованы, например, для иммунопреципитации и иммунолокализации полипептида в соответствии с настоящим изобретением, а также для мониторинга присутствия указанного полипептида, например, в рекомбинантных организмах, а также для идентификации соединений, взаимодействующих с белками в соответствии с настоящим изобретением. Например, поверхностный плазмонный резонанс, как используется в системе BIAcore, может быть использован для увеличения эффективности фаговых антител для связывания с эпитопом белка в соответствии с настоящим изобретением (Schier 1996, Human Antibodies Hybridomas 7:97-105; Malmborg 1995, J. Immunol. Methods 183:7-13). В другом варианте выполнения настоящего изобретения антитело в соответствии с настоящим изобретением специфически связывается с одной или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из Q53K, N72K, N378K, N379K, R394K и T400K, в соответствии с положением в нумерации соответствующей нумерации SEQ ID NO: 52.

Полинуклеотид или полипептид в соответствии с настоящим изобретением может быть использован в качестве лекарственного средства, как правило.

Термин "лекарственное средство", используемое в настоящем изобретении, относится в одном варианте выполнения настоящего изобретения к фармацевтической композиции, содержащей биологически активный нейротоксический полипептид в соответствии с настоящим изобретением или полинуклеотид, кодирующий его в качестве фармацевтического активного вещества. Указанное лекарственное средство может быть использовано для терапии различных заболеваний или расстройств человека или животного в терапевтически эффективной дозе. Лекарственное средство может быть составлено с помощью различных методик в зависимости от желаемых целей применения. Различные варианты лекарственного средства в соответствии с настоящим изобретением указаны в настоящем изобретении ниже.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения лекарственное средство включает биологически активный нейротоксический полипептид настоящего изобретения, один или больше фармацевтически приемлемый носитель в виде фармацевтической композиции. Фармацевтически приемлемый носитель(и) должен быть приемлемым в смысле совместимости с другими ингредиентами состава и не быть вредным для реципиента. Используемый фармацевтический носитель может включать твердое вещество, гель или жидкость. Примерами твердых носителей являются лактоза, каолин, сахароза, тальк, желатин, агар, пектин, аравийская камедь, стеарат магния, стеариновая кислота и тому подобное. Примерами жидких носителей являются глицерин, забуференный фосфатом солевой раствор, вода, эмульсии, различные типы смачивающих агентов и тому подобное. Подходящие носители включают носители, которые упомянуты выше и другие, хорошо известные в данной области техники, см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. Следует иметь в виду, что носитель также может быть вирусом или ретровирусом, подходящим для генной терапии, в частности, если активный ингредиент лекарственного средства является полинуклеотидом в соответствии с настоящим изобретением.

Лекарственное средство, в некотором варианте выполнения настоящего изобретения будет растворяться в разбавителе перед введением. Разбавитель выбирают таким образом, чтобы не повлиять на биологическую активность комбинации. Примерами таких разбавителей являются дистилированная вода или физиологический раствор. Кроме того, фармацевтическая композиция или состав могут так включать другие носители или нетоксичные, нетерапевтические, неиммуногенные стабилизаторы и тому подобное. Таким образом, нейротоксический полипептид в соответствии с настоящим изобретением может присутствовать в некотором варианте выполнения настоящего изобретения в жидкой или лиофилизированной форме. В некотором варианте выполнения настоящего изобретения он может присутствовать вместе с глицерином, белковыми стабилизаторами (ЧСА) или небелковыми стабилизаторами, такими как: поливинилпирролидон (ПВП), гиалуроновая кислота или свободные аминокислоты. В некотором аспекте пригодные небелковые стабилизаторы раскрыты в WO 2005/007185 или WO 2006/020208.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения лекарственное средство будет обеспечиваться в виде раствора, содержащего нейротоксический полипептид. Более того, раствор может включать также в себя носители или стабилизаторы, упомянутые выше. Стабильная жидкая композиция нейротоксического полипептида может быть обеспечена в некотором аспекте, как раскрыто в патенте США 7211261.

Фармацевтическая композиция в одном варианте выполнения настоящего изобретения является вводимой местно. Обычно лекарственное средство будет вводиться внутримышечно или подкожно (около желез) в зависимости от желаемых медицинских показаний. Однако в зависимости от природы и способа действия соединения фармацевтическая композиция может вводиться также другими способами.

Терапевтически эффективная доза относится к количеству нейротоксического полипептида или полинуклеотида в соответствии с настоящим изобретением, которая предотвращает, облегчает или лечит симптомы, сопровождающие состояние или болезнь, указанные в этом описании. Терапевтическая эффективность и токсичность соединения может быть определена с помощью стандартных фармацевтических процедур на клеточных культурах или на экспериментальных животных, например, ED50 (доза, терапевтически эффективная в 50% популяции) и LD50 (доза, летальная для 50% популяции). Соотношение между дозами терапевтического и токсического эффектов представляет собой терапевтический индекс, и оно может быть выражено как отношение LD50/ED50. Лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением будет содержать в некотором варианте выполнения настоящего изобретения рекомендации дозирования в инструкциях для медицинских работников или для пользователей для того, чтобы предвидеть корректировку дозирования в зависимости от индивидуального реципиента.

Лекарственное средство, как упоминается в настоящем изобретении, разрабатываются для введения по меньшей мере один раз для лечения или облегчения заболевания или состояния или предотвращения болезни или состояния, перечисленных в этом описании. Однако указанное лекарственное средство может вводиться более одного раза.

Лекарственные средство в соответствии с настоящим изобретением может в дополнительном варианте выполнения настоящего изобретения настоящего изобретения содержать лекарственные субстанции в дополнение к биологически активному нейротоксическому полипептиду, которые добавляются к фармацевтической композиции во время его составления.

Более того, настоящее изобретение относится к применению полинуклеотида или полипептида согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения заживления ран, иммобилизации для лечения переломов кости и разрыва сухожилия, постхирургической иммобилизации, в частности, в связи с удалением геморроя, внедрение дентальных имплантатов, замена тазобедренного сустава (эндопротезирование), эпикондилит, артропластика коленного сустава, офтальмологическая хирургия, угревая сыпь, синдром раздраженной толстой кишки, вагинизм, боли в пояснице или доброкачественной дисплазии предстательной железы.

Симптомы, связанные с вышеупомянутыми медицинскими состояниями или заболеваниями, хорошо известны специалистам в данной области техники, и описаны в стандартных учебниках по медицине, таких как: Stedman или Pschyrembel.

Более того, настоящее изобретение также относится к применению полинуклеотида или полипептида в соответствии с настоящим изобретением для приготовления диагностического лекарственного средства для определения будет ли субъект чувствителен для нейротоксиновой терапии.

Диагностическое лекарственное средство, упомянутое выше, является нейротоксическим полипептидным лекарственным средством, как об этом говорится в выше. Тем не менее, лекарственное средство, предназначенное для применения в течение некоторого времени и режима дозирования, позволяющего всего лишь определить, отвечает ли субъект на нейротоксический полипептид вообще, или определить подходящий режим дозирования. Так как вышеописанный нейротоксический полипептид - хотя также имеющий терапевтический потенциал - основополагающе используется для диагностической цели, а не для лечения или облегчения в этом аспекте, лекарственное средство, содержащее его, называют "диагностическим лекарственным средством". Таким образом, такой предварительный скрининг, ограниченный во времени, с модифицированным нейротоксическим полипептидом в соответствии с настоящим изобретением будет оказывать помощь в выборе субъектов, восприимчивых к терапии с использованием немодифицированного нейротоксина, а также при определении подходящей дозировки. Потенциальные побочные эффекты терапии на основе немодифицированного нейротоксина, который обычно сохраняется в течение более длительного времени, может быть уменьшен вследствие сокращения продолжительности биологического эффекта, вызываемого модифицированным нейротоксическим полипептидом настоящего изобретения.

Настоящее изобретение охватывает способ получения нейротоксического полипептида, кодируемого полинуклеотидом в соответствии с настоящим изобретением, содержащий стадии:

a) культивирование клетки-хозяина в условиях, которые позволяют экспрессию нейротоксического полипептида, кодируемого полинуклеотидом в соответствии с настоящим изобретением, и

b) получение нейротоксического полипептидпа, кодируемого полинуклеотидом в соответствии с настоящим изобретением из культуры клеток-хозяев а).

Полипептид может быть получен из культуры в некотором варианте выполнения настоящего изобретения посредством любых обычных методик очистки, включая аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, гель-проникающую хроматографию, высокоэффективную жидкостную хроматографии (ВЭЖХ), и методик преципитации, включая преципитации антителами. В другом варианте выполнения настоящего изобретения нейротоксический полипептид может быть получен, как комплекс, содержащий в дополнение к нейротоксическому полипептиду комплексообразующие белки. Более того, получение, как используется в настоящем изобретении, в некотором варианте выполнения настоящего изобретения включает в себя активацию нейротоксического полипептида. Это может быть достигнуто посредством протеолитического расщепления (одноцепочечного) нейротоксического полипептида-предшественника либо внутриклеточно посредством эндогенной или экзогенной (например, рекомбинантно экспрессируемой) протеазы, либо вне клетки, посредством контактирования нейротоксического полипептида, например, перед, в течение или после вышеупомянутой очистки с протеазой при условиях, позволяющих расщепление.

Более того, предполагается способ для производства лекарственного средства в соответствии с настоящим изобретением, указанный способ, содержащий стадии вышеупомянутого способа в соответствии с настоящим изобретением, и дополнительную стадию формулирования нейротоксического полипептида, кодируемого полинуклеотидом в соответствии с настоящим изобретением в качестве лекарственного средства.

Следует понимать, что такой способ для изготовления лекарственного средства осуществляется в соответствии со стандартам GMP для лекарственных средств в целях обеспечения качества, фармацевтической безопасности и эффективности лекарственного средства. Подходящие составы лекарственного средства описаны в данном описании. Специалисту в данной области техники, однако, хорошо известно, как такие составы могут быть изготовлены.

Настоящее изобретение также охватывает способ получения косметической композиции, включающий стадии способа в соответствии с настоящим изобретением, и дополнительную стадию включения нейротоксического полипептида в качестве косметической композиции.

«Косметическая композиция», как используется в настоящем изобретении, может быть приготовлена и использована, как описано в фармацевтической композиции выше. Для косметической композиции, подобным образом предполагается, что соединение настоящего изобретения находится в некотором варианте выполнения настоящего изобретения по существу в чистой форме. Примеси, однако, могут быть менее критичными, чем для лекарственного средства. Косметические композиции в другом варианте выполнения настоящего изобретения могут применяться внутримышечно. В еще одном варианте выполнения настоящего изобретения косметические композиции, содержащие нейротоксин, могут быть составлены в качестве средства против морщин.

Настоящее изобретение также относится к такой косметической композиции и к применению полинуклеотида или полипептида в соответствии с настоящим изобретением для приготовления косметической композиции для использования в качестве средства против морщин.

Все ссылки, приведенные в данном описании, включены посредством ссылки относительно всего их содержания, раскрывающего сущность изобретения и содержание раскрывающего сущность изобретения специально упомянутое в этом описании.

Чертежи:

Фиг. 1: Модифицированный ботулинический нейротоксин, несущий MDM2-связывающий мотив. Иллюстрация модифицированного ботулинического нейротоксина со связывающим мотивом для E3 лигазы MDM2, вставленным между легкой цепью и тяжелой цепью ботулинического нейротоксина, содержащий, от N- к С-концу, легкую цепь ботулинического нейротоксина, MDM2-связьтающий мотив, линкер, содержащий сайт расщепления протеазой, и тяжелую цепь ботулинического нейротоксина. Легкая цепь и тяжелая цепь ботулинического нейротоксина взаимосвязаны дисульфидным мостиком.

Фиг. 2: Введение MDM2-связывающих мотивов. Взаиморасположение связывающего мотива для E3 лигазы MDM2 между легкой цепью и тяжелой цепью ботулинического нейротоксина, как показано на Фиг. 1, позволяет узнавание и связывание E3 лигазы MDM2 с таким образом модифицированным ботулиническим нейротоксином, что приводит к убиквитинированию указанной окружающей поверхности, экспонирующей остатки лизина, и более быстрой деградации убиквитинированного ботулинического нейротоксина посредством протеосомной клеточной системы. Иллюстрируется MDM2-связывающий консенсусный мотив XXFXXXWXXLXX (SEQ ID NO: 43, с "X", представляющим любую из природных аминокислот).

Фиг. 3: Создание и анализ продолжительности биологической активности BoNT/E-MDM2 мутантов. Показан эффект на продолжительность биологической активности в лобной коре головного мозга мутантов BoNT/E-MDM2 клеток мыши в сравнении с немутированным BoNT/E-MDM2 (SEQ ID NO. 52). Указаны остатки соответствующих аминокислот, которые заменены лизином, соответственно. В результате мутанты BoNT/E-MDM2, в которых (i) Q53, N72, N378, N379, R394 и Т400 (SEQ ID NO. 57), (ii) Q53, N378 и N379 (SEQ ID NO. 58) (iii) N72, N378 и N379 (SEQ ID NO. 61) или (iv) N378, N379 и T400 (SEQ ID NO. 75) в легкой цепи были заменены остатками лизина, что привело к уменьшению продолжительности биологического эффекта на нейронах коры головного мозга. Следовательно, введение остатков лизина в BoNT/E-MDM2 нейротоксина в указанные положения привело к более быстрой деградации мутантной легкой цепи нейронов коры головного мозга. В противоположность этому, многочисленные другие исследованные аминокислотные замены и их комбинации в легкой цепи не показали эффекта на продолжительность биологической активности нейротоксина. Сокращение "н.д." означает (пока) не детектировали.

Фиг. 4: Активация очищенного BoNT/E-MDM2 (SEQ ID NO: 52) посредством расщепления протеазой. Очищенный одноцепочечный BoNT/E расщеплялся тромбином, в соответствии с примером 2, протеазу удаляли и активированный BoNT/E анализировали с помощью SDS-PAGE и окрашивания Кумасси. Дорожка 1: очищенный одноцепочечный BoNT/E-MDM2; Дорожка 2: активированный BoNT/E-MDM2; Дорожка 3: активированный BoNT/E-MDM2, тромбин удалили.

Фиг. 5: Сравнение BoNT/E-MDM2 (SEQ ID NO: 52) с рекомбинантным диким типом BoNT/E (RWT) (SEQ ID NO: 82) в нейронах лобной коры головного мозга. Нейроны лобной коры головного мозга инкубировали с эквипотентными дозами rWT (SEQ ID NO: 82) и BoNT/E-MDM2 (SEQ ID NO: 52). В определенных временных точках, анализировали отношение расщепленных к общему SNAP-25, которое является мерой присутствия легкой цепи в нервной клетке.

Фиг. 6: Сравнение BoNT/E-MDM2 (SEQ ID NO: 52) с рекомбинантным диким типом BoNT/E (SEQ ID NO: 82) в анализе отведении пальца (DAS). Эквипотентные дозы rWT (SEQ ID NO: 82) и BoNT/E-MDM2 (SEQ ID NO: 52) вводили в икроножную мышцу мышей и паралич анализировали в DAS-анализе.

Фиг. 7: Активация очищенного BoNT/E-MDM2 (SEQ ID NO: 80) с помощью протеазного расщепления. Очищенный одноцепочечный BoNT/E расщепляли тромбином в соответствии с примером 6, протеазу удаляли и активированный BoNT/E анализировали с помощью SDS-PAGE и окрашивали Кумасси. Дорожка 1: очищенный одноцепочечный BoNT/E-MDM2; Дорожка 2: активированный BoNT/E-MDM2; Дорожка 3: активированный BoNT/E-MDM2, тромбин удалили.

Фиг. 8: Сравнение BoNT/E-MDM2 (SEQ ID NO: 80 с рекомбинантным диким типом BoNT/E (SEQ ID NO: 82) в фото-анализе отведении пальца (DAS). Эквипотентные дозы rWT (SEQ ID NO: 82) и BoNT/E-MDM2 (SEQ ID NO: 80) вводили в икроножную мышцу мышей и паралич анализировали в фото-DAS. В отличие от анализа DAS (рис. 5), эффект в данном анализе был показан как разность 1 - отношение ширины к длине инъецированной лапы.

Примеры:

Настоящее изобретение будет далее проиллюстрировано следующими примерами, которые, однако, не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения.

Пример 1: Конструирование, экспрессия и очистка рекомбинантного BoNT/E, содержащего мотив узнавания MDM2 (BoNT/E-MDM2; SEQ ID NO: 52)

Кодирующая последовательность ботулинического нейротоксина типа Ε (BoNT/E), несущая связывающий мотив MDM2 "LTFEHNWAQLTS", как показано в SEQ ID NO: 32, была синтезирована в виде гена, и субклонирована в экспрессионный вектор Е. coli добавлением С-концевых меток для выделения (например, His-tag). Белок (с аминокислотной последовательностью, показанный в SEQ ID NO: 52, BoNT/E-MDM2) экспрессировали в E. coli BL21 с использованием LB среды в течение 24 ч при 16°С. Экспрессированный нейротоксин очищали с использованием трехступенчатого хроматографического протокола (например, аффинной хроматографией с использованием С-концевых аффинных меток, таких как His-tag, ионообменной хроматографией и/или гель-фильтрацией). Метки были впоследствии удалены с использованием протеазного расщепления С-концевого сайта расщепления протеазой (например, сайт расщепления тромбином) и чистоту белков, анализировали с помощью SDS-PAGE.

Пример 2: Активация очищенной BoNT/E посредством протеазного расщепления

Очищенный ботулический нейротоксин (см. пример 1) с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 52, несущий сайт расщепления тромбином в линкере между легкой и тяжелой цепями, инкубировали с биотинилированным тромбином, которые при 20°С в течение ночи. Биотинилированный тромбин удаляли с помощью аффинной хроматографии, (например, инкубации со стрептавидин-агарозой) и активированный токсин анализировали с помощью SDS-PAGE с последующим окрашиванием Кумасси (см. Фиг. 4) и иммуноблоттингом. Конечную концентрацию активированного нейротоксина определяли посредством ELISA с использованием кроличьего антитела против BoNT/E антитела для захвата и анти-BoNT/E антитело морской свинки для обнаружения. Тестирование мощности осуществляли с помощью гемидиафрагмального анализа (HDA).

Пример 3: Определение персистентности in vitro

Ткани лобной коры головного мозга собирали из эмбриональных мышей на 15-16 день. Клетки суспендировали в среде Neurobasal™ при плотности 0,5×10⁶ клеток в мл, и 2000 мкл высевали на 6-луночные планшеты. Культуры инкубировали при 37°С в атмосфере 4% СО₂ в течение 3,5 недель. Культуры обрабатывали 5-фтор-2'-дезоксиуридином (25 мкМ) и уридином (63 мкМ) для предотвращения дальнейшей глиальной пролиферации. Затем культуры обрабатывали либо 10 пМ BoNT/E дикого типа (SEQ ID NO: 82), либо BoNT/E, содержащим мотив узнавания MDM2 (SEQ ID NO: 52; пример 2) в течение точно 18 ч и промывали после этого с кондиционированной клеточной культуральной средой. В этот момент времени и через 3 дня, 7 дней, 10 дней, 14 дней и 21 дней клетки собирали и определяли отношение расщепленного к общему SNAP25 в Вестерн-блоте, с использованием мышиного моноклонального антитела (Synaptic Systems # 111111). Было установлено, что отношение расщепления в клеточных культурах, обработанных с BoNT/E, содержащих мотив узнавания MDM2 (SEQ ID NO. 52), достигал 50% отношения (t₅₀) в момент времени на около 25% короче по сравнению с диким типом BoNT/E (SEQ ID NO: 82); см. Фиг. 5. Это показывает, что персистентность легкой цепи в нейронных клетках уменьшалась на 25%, что демонстрировало, что продолжительность биологического действия снижается на 25%.

Пример 4: Определение восстановления in vivo

BoNT/E-MDM2, как описано в примере 2 (SEQ ID NO: 52), анализировали в анализе отведении пальца (DAS) (Aoki, 2001 Toxicon (12): 1815-20). Эквипотенциальную дозу дикого типа и мутанта BoNT/E, содержащую MDM2-mothb, вводили в икроножную мышцу 10 мышей. Мыши ранжировались в соответствии со шкалой, описанной в Aoki 2001 Toxicon. (12):1815-20. Время восстановления мышей, обработанных BoNT/E-MDM2 (пример 2, SEQ ID NO. 52), уменьшалась на 20% по сравнению с диким типом BoNT/E (SEQ ID NO: 82); см. Фиг. 6.

Пример 5: Конструирование, экспрессия и очистка рекомбинантного BoNT/E, содержащего мотив узнавания MDM2 (BoNT/E-MDM2, SEQ ID NO: 80)

Кодирующая последовательность ботулинического нейротоксина типа Ε (BoNT/E), несущая связывающий мотив MDM2 "LTFEHNWAQLEN", как показано в SEQ ID NO: 78, была синтезирована в виде гена, и субклонирована в экспрессионный вектор Е. coli добавлением C-концевых меток для выделения (например, His-tag). Белок (с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 80, BoNT/E-MDM2) экспрессировался в Ε. coli BL21 с использованием LB среды в течение 24 ч при 16°С. Экспрессированный нейротоксин очищали с использованием трехступенчатого хроматографического протокола (например аффинной хроматографией с использованием C-концевых аффинных меток, таких как His-tag, ионообменной хроматографией и/или гель-фильтрацией). Метки были впоследствии удалены с использованием протеазного расщепления C-концевого сайта расщепления протеазой (например, сайт расщепления тромбином) и чистоту белков, анализировали с помощью SDS-PAGE.

Пример 6: Активация очищенной BoNT/E посредством протеазного расщепления

Очищенный ботулинический нейротоксин (пример 5) с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 80, несущий сайт расщепления тромбином в линкере между легкой и тяжелой цепями, инкубировали с биотинилированным тромбином при 20°С в течение ночи. Биотинилированный тромбин удаляли с помощью аффинной хроматографии (например, с помощью инкубации со стрептавидинагарозой) и активированный токсин анализировали с помощью SDS-PAGE с последующим окрашиванием Кумасси (см. Фиг. 7) и иммуноблоттинга. Конечную концентрацию активированного нейротоксина определяли посредством ELISA с использованием кроличьего антитела против BoNT/E антитела для захвата и анти-BoNT/E антитела морской свинки для обнаружения. Тестирование мощности осуществляли с помощью гемидиафрагмального анализа (HDA).

Пример 7: Определение персистентности in vitro

Ткани лобной коры головного мозга собирали из эмбриональных мышей на 15-16 день. Клетки суспендировали в среде Neurobasal™ при плотности 0,5×10⁶ клеток в мл, и 2000 мкл высевали на 6-луночные планшеты. Культуры инкубировали при 37°С в атмосфере 4% СО₂ в течение 3,5 недель. Культуры обрабатывали 5-фтор-2'-дезоксиуридином (25 мкМ) и уридином (63 мкМ) для предотвращения дальнейшей глиальной пролиферации. Затем культуры обрабатывали либо 10 пМ BoNT/E дикого типа (SEQ ID NO: 82), либо BoNT/E, содержащим мотив узнавания MDM2 (SEQ ID NO: 52; пример 2) в течение точно 18 ч и промывали после этого с кондиционированной клеточной культуральной средой. В этот момент времени и через 3 дня, 7 дней, 10 дней, 14 дней и 21 дней клетки собирали и определяли отношение расщепленного к общему SNAP25 в Вестерн-блоте, с использованием мышиного моноклонального антитела (Synaptic Systems # 111111). Было установлено, отношение расщепления в клеточных культурах, обработанных с BoNT/E, содержащих мотив узнавания MDM2 (SEQ ID NO. 52), достигал 50% отношения (t₅₀) во момент времени на около 25% короче по сравнению с диким типом BoNT/E (SEQ ID NO: 82). Это показывает, что персистентность легкой цепи в нейронных клетках уменьшалась на 25%, что демонстрировало, что продолжительность биологического действия снижается на 25%.

Пример 8: Определение восстановления in vivo

В несколько модифицированных установках DAS анализа (см. [0071]), бальную оценку заменили вычислениями разности между 1 - отношением ширины к длине инжектированной лапы. Время восстановления мышей, обработанных BoNT/E-MDM2 (пример 6, SEQ ID NO 80.), была уменьшена на около 25% по сравнению с диким типом BoNT/E (SEQ ID NO: 82) см. Фиг. 8.

Пример 9: Генерирование мутантов BoNT/E-MDM2

Генерирование двух различных полипептидов BoNT/E-MDM2 (SEQ ID NO. 52 и SEQ ID NO: 80) было описано в примерах 1 и 5. Впоследствии экспонированные аминокислотные остатки в легкой цепи BoNT/E, расположенные в пространственной близости от мотива узнавания MDM2, были идентифицированы посредством анализа трехмерной структуры легкой цепи BoNT/E. "Экспонированные аминокислотные остатки", как используется на настоящем изобретении, означает, что аминокислотные остатки расположены на поверхности легкой цепи BoNT/E, и боковые цепи указанных аминокислотных остатков не вовлечены во внутримолекулярные взаимодействия. Экспонированные аминокислотные остатки были идентифицированы посредством симуляции молекулярной динамики (МД) и расчета площади поверхности доступной растворителю (SASA). Значение SASA выше, чем 60% (в основном) было выбрано в качестве специфической отсечки. Замена экспонированных аминокислотных остатков в идентифицированных положениях на остатки лизина, как показано на Фиг. 3, осуществляли с помощью сайт-направленного мутагенеза с использованием набора для мутагенеза QuikChange™, в сочетании со специфическими парами праймеров, которые предназначенных для этой цели. Замена на остатки лизина идентифицированных аминокислотных остатков, не вовлеченных во внутримолекулярные взаимодействия, была осуществлена, поскольку E3 лигазы, включая MDM2, убиквитилируют свои субстраты при лизиновых остатках. С этой целью E3 лигаза сначала связывается со мотивом, связывающим E3 лигазы в субстрате, например, MDM2-связывающим мотивом в белке BoNT/E-MDM2, как описано в настоящем изобретении, а затем "обнаруживает" остатки лизина в пространственной близости к связывающему мотиву в субстрате, который может быть модифицирован посредством убиквитиновых молекул. Соответственно, эффективность протеасомной деградации увеличивается за счет введения дополнительных остатков лизина в легкую цепь нейротоксического полипептида в соответствии с настоящим изобретением, содержащую связывающий мотив E3 лигазы MDM2. Полученными ДНК-конструкциями трансформировали в экспрессионный штамм Е. coli (BL21), и таким образом модифицированные рекомбинантные ботулинические нейротоксины экспрессировали. Мутантные рекомбинантные ботулинические нейротоксины очищали из клеточных лизатов Е. coli с помощью аффинной хроматографии (например, His-tag), ионообменной хроматографией и/или эксклюзионной хроматографией. Указанные мутированные нейротоксины активировали посредством протеолитического расщепления с помощью протеазы тромбина и последующим удалением протеазы. В дальнейшем таким образом очищенный и активированный мутированный нейротоксин анализировали, как показано в следующем примере.

Пример 10: Анализ деградации мутантов BoNT/E-MDM2 в системе клеточной культуры

С этой целью была создана культура клеток лобной коры головного мозга мыши, как указано в примере 3. Одну × 10⁶ клеток обработали с 20 пМ BoNT/E-MDM2 (SEQ ID NO. 52) и с соответствующими мутантами BoNT/E-MDM2 (см. Фиг. 3) в течение 18 часов на шестилуночных планшетах. После 18 часов, 3 дней, 7 дней, 10 дней, 14 дней и 21 дня образцы выделяли и анализировали методом вестерн-блоттинга с использованием в антитела, которое распознает как SNAP-25, так и SNAP-25, расщепленного BoNT/E (Synaptic Systems # 111111). Отношение расщепленного к нерасщепленному SNAP-25 было взято в качестве измерения для биологической активности легкой цепи ботулинического нейротоксина в клетках лобной коры головного мозга, которые получили в течение их концентрирования. В результате было обнаружено, что протеолитическая активность и, следовательно, концентрация легкой цепи мутантов BoNT/E-MDM2 уменьшалась значительно быстрее по сравнению с активностью BoNT/E-MDM2; см. Фиг. 3. В частности, мутанты BoNT/E-MDM2, в которых (i) Q53, N72, N378, N379, R394 и Т400 (SEQ ID NO. 57), (ii) Q53, N378 и N379 (SEQ ID NO. 58), (iii) N72, N378 и N379 (SEQ ID NO. 61) или (iv) N378, N379 и T400 (SEQ ID NO. 75) в легкой цепи были заменены остатками лизина, показали уменьшение биологического эффекта на нейроны коры головного мозга. Следовательно, введение остатков лизина в нейротоксины BoNT/E-MDM2 приводит к более быстрой деградации мутантной легкой цепи в нейронах коры головного мозга. В противоположность этому многочисленные другие протестированные аминокислотные замены и их комбинации в легкой цепи не показали влияние на продолжительность биологической активности нейротоксина.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая полинуклеотид, кодирующий нейротоксический полипептид BoNT/E, вектор для экспрессии вышеуказанного полинуклеотида, клетку-хозяина для экспрессии полинуклеотида, нейротоксический полипептид BoNT/E, способ получения нейротоксического полипептида BoNT/E, способ получения лекарственного средства. В одном из вариантов нейротоксический полипептид BoNT/E демонстрирует уменьшенную продолжительность биологического эффекта у субъекта, указанный биологический эффект вызывает паралич мышц у субъекта. Изобретение расширяет арсенал средств для получения эффекта паралича мышц. 6 н. и 5 з. п. ф-лы, 8 ил., 2 табл., 10 пр.

1. Полинуклеотид, кодирующий нейротоксический полипептид BoNT/E, который демонстрирует уменьшенную продолжительность биологического эффекта у субъекта, где указанный нейротоксический полипептид BoNT/E содержит по меньшей мере один мотив узнавания Е3 лигазы в легкой цепи, где указанный мотив узнавания Е3 лигазы является связывающим мотивом для Е3 лигазы MDM2, где легкая цепь нейротоксического полипептида BoNT/E получена посредством модификации из легкой цепи, кодируемой полинуклеотидом, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из:

a) последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 9 или 81;

b) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 10 или 82, где указанный связывающий мотив для Е3 лигазы MDM2 выбирается из группы, состоящей из ETFSDLWKLLPE (SEQ ID NO: 26), TSFAEYWNLLSP (SEQ ID NO: 27), LTFEHYWAQLTS (SEQ ID NO: 28), LTFEHWWAQLTS (SEQ ID NO: 29), LTFEHSWAQLTS (SEQ ID NO: 30), ETFEHNWAQLTS (SEQ ID NO: 31), LTFEHNWAQLTS (SEQ ID NO: 32), LTFEHWWASLTS (SEQ ID NO: 33), LTFEHWWSSLTS (SEQ ID NO: 34), LTFTHWWAQLTS (SEQ ID NO: 35), ETFEHWWAQLTS (SEQ ID NO: 36), LTFEHWWSQLTS (SEQ ID NO: 37), LTFEHWWAQLLS (SEQ ID NO: 38), ETFEHWWSQLLS (SEQ ID NO: 39), RFMDYWEGL (SEQ ID NO: 40), MPRFMDYWEGLN (SEQ ID NO: 41), SQETFSDLWKLLPEN (SEQ ID NO: 42) и/или LTFEHNWAQLEN (SEQ ID NO: 78),

где указанный полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из

а) последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 51 или 79;

b) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 52 или 80.

2. Полинуклеотид по п. 1, в котором указанный биологический эффект вызывает паралич мышц у субъекта.

3. Полинуклеотид по п. 1, в котором уменьшенная продолжительность составляет менее чем 5, 4, 3, 2 недели или менее 1 недели у субъекта, предпочтительно у человека.

4. Вектор для экспрессии полинуклеотида по любому из пп. 1-3, содержащий полинуклеотид по любому из пп. 1-3.

5. Клетка-хозяин для экспрессии полинуклеотида по любому из пп. 1-3, содержащая полинуклеотид по любому из пп. 1-3 или вектор по п. 4, где указанная клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку, клетку из линии клеток животных или грибковую клетку.

6. Клетка-хозяин по п. 5, в которой указанная прокариотическая клетка является клеткой Е. coli или клеткой Clostridium или Bacillus.

7. Нейротоксический полипептид BoNT/E, который демонстрирует уменьшенную продолжительность биологического эффекта у субъекта, где указанный нейротоксический полипептид BoNT/E содержит по меньшей мере один мотив узнавания Е3 лигазы в легкой цепи, где указанный мотив узнавания Е3 лигазы является связывающим мотивом для Е3 лигазы MDM2, где нейротоксический полипептид BoNT/E выбирается из группы, состоящей из:

а) нейротоксического полипептида BoNT/E, где легкая цепь нейротоксического полипептида BoNT/E получена посредством модификации из легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 10 или 82; и где указанный связывающий мотив для Е3 лигазы MDM2 выбирается из группы, состоящей из ETFSDLWKLLPE (SEQ ID NO: 26), TSFAEYWNLLSP (SEQ ID NO: 27), LTFEHYWAQLTS (SEQ ID NO: 28), LTFEHWWAQLTS (SEQ ID NO: 29), LTFEHSWAQLTS (SEQ ID NO: 30), ETFEHNWAQLTS (SEQ ID NO: 31), LTFEHNWAQLTS (SEQ ID NO: 32), LTFEHWWASLTS (SEQ ID NO: 33), LTFEHWWSSLTS (SEQ ID NO: 34), LTFTHWWAQLTS (SEQ ID NO: 35), ETFEHWWAQLTS (SEQ ID NO: 36), LTFEHWWSQLTS (SEQ ID NO: 37), LTFEHWWAQLLS (SEQ ID NO: 38), ETFEHWWSQLLS (SEQ ID NO: 39), RFMDYWEGL (SEQ ID NO: 40), MPRFMDYWEGLN (SEQ ID NO: 41), SQETFSDLWKLLPEN (SEQ ID NO: 42) и/или LTFEHNWAQLEN (SEQ ID NO: 78);

b) нейротоксического полипептида BoNT/E, имеющего аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 52 или 80; и

c) нейротоксического полипептида BoNT/E согласно а) или b), дополнительно содержащего по меньшей мере одну аминокислотную замену на лизин в легкой цепи нейротоксического полипептида, где указанная аминокислотная замена выбрана из группы, состоящей из Q53K, N72K, N378K, N379K, R394K и Т400К в SEQ ID NO: 52.

8. Полипептид BoNT/E по п. 7, предназначенный в качестве лекарственного средства, обеспечивающего уменьшенную продолжительность биологического эффекта, оказываемого на субъект.

9. Полипептид BoNT/E по п. 8, где лекарственное средство предназначено для лечения медицинских состояний или заболеваний, при которых желательна уменьшенная продолжительность паралича мышц и которые представляют собой заживление ран, иммобилизацию костей и лечение разрыва сухожилий, послеоперационную иммобилизацию, в частности, в связи с удалением геморроя, внедрения зубных имплантатов или замены тазобедренного сустава (эндопротезирование), эпикондилит, артропластику коленного сустава, офтальмологическую хирургию, угревую сыпь, синдром раздраженной толстой кишки, вагинизм, остеохондроз или доброкачественную гиперплазию предстательной железы.

10. Способ получения нейротоксического полипептида BoNT/E, кодируемого полинуклеотидом по любому из пп. 1-3, включающий следующие стадии:

a) культивирование клетки-хозяина по п.5 или 6 в условиях, допускающих экспрессию нейротоксического полипептида BoNT/E, кодируемого полинуклеотидом по любому из пп. 1-3, и

b) получение нейротоксического полипептида BoNT/E, кодируемого полинуклеотидом по любому из пп. 1-3, из клетки-хозяина а).

11. Способ получения лекарственного средства, включающий стадии:

a) культивирования клетки-хозяина по п. 5 или 6 в условиях, допускающих экспрессию нейротоксического полипептида BoNT/E, кодируемого полинуклеотидом по любому из пп. 1-3,

b) получения нейротоксического полипептида BoNT/E, кодируемого полинуклеотидом по любому из пп. 1-3, из клетки-хозяина а) и

c) изготовления лекарственной формы, содержащей нейротоксический полипептид BoNT/E, полученный на стадии b), и один или более фармацевтически приемлемых носителей с получением лекарственного средства.