Способ определения стадии грибовидного микоза Российский патент 2018 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматовенерологии, и может быть использовано для определения стадии грибовидного микоза, наиболее часто встречаемой нозологической разновидности первичных кожных лимфом.

Грибовидный микоз (ГМ) - форма первичной эпидермотропной Т-клеточной лимфомы кожи, характеризующаяся пролиферацией малых и средних Т-лимфоцитов с наличием церебриформных ядер и сопровождающаяся этапностью развития клинических проявлений в виде пятен, бляшек и опухолей [1, 2, 3]. Согласно рекомендациям Международного общества по лимфомам кожи и Европейской организации по изучению и лечению рака (ISLE-EORTC) выделяют ранние и поздние стадии развития ГМ (таблица 1). Определение стадии ГМ базируется на 4 характеристиках злокачественного процесса: Т - tumor (лат.) - «опухоль», N - nodus (лат.) - «узел», М - metastasis (лат.) - «перемещение» - наличие метастазов, В - blood «кровь» (анг.). Когда описывают стадию ГМ, под каждой буквой указывают число - оно характеризует морфологические элементы (пятна, папулы, бляшки, опухоли) и распространенность кожных проявлений, вовлечение в патологический процесс лимфатических узлов, внутренних органов и крови.

где

T₁ - ограниченные пятна, папулы, и/или бляшки, покрывающие <10% кожного покрова,

Т₂ - пятна, папулы, и/или бляшки, покрывающие >10% кожного покрова,

Т₃ - один или более узлов (≥1 см в диаметре),

Т₄ - сливающаяся эритема, покрывающая ≥80% поверхности тела,

N₀ - нет увеличения периферических лимфатических узлов, их биопсия не требуется,

N₁ - периферические лимфатические узлы увеличены; гистопатология Dutch grade 1 или NCILN_0-2,

N₂ - периферические лимфатические узлы увеличены; гистопатология Dutch grade 2 или NCILN₃,

N₃ - периферические лимфатические узлы увеличены; гистопатология Dutch grade 3-4 или NCILN₄, клон-позитивны или негативны,

М₀ - нет вовлечения внутренних органов,

М₁ - вовлечение внутренних органов (с уточнением органа и морфологическим подтверждением).

В₀ - отсутствие значительного вовлечения крови: атипичные (Сезари) клетки составляют ≤5% лимфоцитов периферической крови,

B₁ - умеренное вовлечение крови: атипичные (Сезари) клетки составляют >5% лимфоцитов периферической крови,

В₃ - значительное вовлечение крови: ≥1000/μL клеток Сезари с позитивным клоном.

Особенно сложной задачей для практикующего врача является дифференциальная диагностика перехода ранних стадий ГМ в поздние, так как между IIA и IIB стадиями заболевания в классификации очень много общего и при отсутствии изменения периферических лимфоузлов (N0-2), вовлечения крови (В0-1) и внутренних органов (М0), кардинальным отличием IIB стадии заболевания является появление хотя бы одного узла на коже. В тоже время, при почти одинаковой инфильтрации и размерах морфологических элементов на коже больного отсутствуют объективные критерии различия «бляшки» и «узла». Поэтому своевременная диагностика и правильное установление стадии развития ГМ являются приоритетными задачами дерматовенеролога и гематолога (онколога), поскольку имеют принципиальное значение при выборе оптимальной тактики лечения больного и определяют долгосрочный прогноз' заболевания. Так, терапия ранних (I-IIA) стадий ГМ предусматривает консервативный подход с постепенным наращиванием потенциала лечебных методов и технологий от тактики «наблюдай и жди» и наружной терапии топическими глюкокортикостероидами до применения ретиноидов, интерферона-α, метотрексата, ультрафиолетового облучения спектра В (311 нм), ПУВА-терапии и локальной лучевой терапии, тогда как, осуществление специализированной медицинской помощи больным с поздними (IIB-III) стадиями ГМ в учреждениях онкогематологического профиля предусматривает уже «агрессивный» подход с применением арсенала системной химиотерапии, биологических препаратов, электронно-лучевой терапии и аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток [1, 2, 4].

Диагностический процесс при ГМ предусматривает ряд логически связанных этапов, сочетающих оценку анамнеза и клинических проявлений заболевания, анализ данных морфологических и иммуногистохимических (ИГХ) исследований, фиксирующих наличие злокачественной лимфоидной (клональной) пролиферации в коже. Проведение только гистоморфологических исследований биоптата кожи позволяет установить диагноз ГМ на ранних стадиях заболевания лишь в 16% случаев, тогда как Применение иммуноморфологического исследования клеток лимфоидного инфильтрата повышает возможность диагностики ГМ до 90% случаев. Поэтому иммуногистохимические исследования биоптата кожи считаются «золотым стандартом» диагностики ГМ, на что указывают клинические рекомендации Европейских стран и России [1, 2, 4, 5].

Анализ результатов иммуногистохимических исследований биоптата кожи в диагностике ГМ проводится на основании оценки позитивности определенных маркеров опухолевых клеток - антигенов кластеров дифференцировки (CD) на поверхности лимфоцитов. При этом врач-патоморфолог, анализирующий иммуногистохимические реакции, использует описательные и качественные приемы оценки выраженности окрашивания маркеров с применением критериев «отрицательная/положительная реакция».

Тем не менее, в литературе встречаются и усовершенствованные методики, направленные на объективизацию способа оценки иммуногистохимических маркеров с использованием критериев и балльной шкалы в зависимости от процента окрашивания опухолевых клеток (полуколичественные методы). Методика с использованием критериев предполагает следующие условные (субъективные) оценки: «0» - отсутствие окрашивания или окрашивание менее 10% опухолевых клеток с любой интенсивностью; «1+» - слабое неполное мембранное окрашивание более 10% опухолевых клеток; «2+» - от слабого до умеренного окрашивания всей цитоплазматической мембраны более 10% опухолевых клеток; «3+» - сильное окрашивание всей цитоплазматической мембраны более 10% опухолевых клеток [6].

Из числа полуколичественных методов оценки ИГХ-маркеров одним из наиболее широко применяемых в онкомаммологии и гинекологии является расчет диагностических баллов по Allred D.C. Данная методика суммарной бальной оценки состоит из двух разделов, где раздел «а» - доля окрашенных опухолевых клеток от 0 до 5 баллов (0 баллов - отсутствие окрашивания; 1 балл - количество окрашенных клеток >0, но меньше 1/100; 2 балла - от >1/100 до 1/10; 3 балла - от >1/10 до 1/3; 4 балла - от >1/3 до 2/3; 5 баллов - от >2/3 до 1); раздел «б» - оценка интенсивности окраски опухолевых клеток (от 0 до 3 баллов). Далее вычисляется суммарный балл, состоящий из доли и интенсивности окраски изучаемых клеток, однако, определение процента и интенсивности окрашивания ИГХ-маркеров также продолжает основываться на субъективной оценке исследователя [7, 8].

В отечественной практике Сыдиковым А.А., Заславским Д.В. и соавторами для анализа результатов иммуногистохимических реакций был использован полуколичественный метод, где экспрессия исследуемого маркера расценивалась как слабая «+» при наличии окрашенных гранул в 1-50 клетках, умеренная «++» - в 51-100 клетках, и резко выраженная «+++» - в 101 и более клетках, в четырех полях зрения, также основанный на субъективной оценке данных врачом-патоморфологом [9].

Известен патент на изобретение, выполненный Поповым Ю.В., Бурыкиной П.Н. и соавторами в 2015 году, где для оценки результатов иммуногистохимических реакции у пациенток с миомой матки был использован 6-балльный полуколичественный метод: отсутствие иммуноокрашенных клеток - 0 баллов; менее 5% иммуноокрашенных клеток - 0,5 балла, менее 20% иммуноокрашенных клеток - 2 балла; от 20 до 40% окрашенных клеток - 4 балла; и более 40% окрашенных клеток - 6 баллов [10].

Описанные качественные и полуколичественные приемы оценки выраженности окрашивания клеток маркерами не лишены субъективной составляющей врача-патоморфолога, в связи с этим, использование методов количественной оценки результатов иммунофенотипирования клеток позволит объективизировать диагностический процесс, что соотносится с современными критериями доказательной медицины, своевременностью и точностью верификации диагноза.

Наиболее близким по существу к рассматриваемой проблеме является метод количественной оценки пролиферативной активности лимфоцитов в коже больных ГМ, разработанный Жуковым А.С., Белоусовой И.Э., Хайрутдиновым В.Р. и соавторами, с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из светооптического микроскопа, цифровой камеры и персонального компьютера с интегрированным программным обеспечением «Морфология 5.2» [11].

Указанный метод был использован для оценки пролиферативной активности лимфоцитов в коже у 18 больных ГМ, группу которых составили 9 больных с I стадией, 7 больных со II стадией и 2 больных с III стадией заболевания. В каждом случае проводился анализ по 3 полям зрения при увеличении 200, выбранных с учетом наибольшей позитивности исследуемых клеток. Данный метод позволил авторам получить статистически значимые различия в относительной площади экспрессии CD3 и Ki67 клеток в дерме у больных ГМ в зависимости от стадии заболевания (7,16±0,31 и 18,8±0,61 - при ГМ I стадии, 0,39±0,21 и 0,89±0,18 - при ГМ II+III стадии соответственно).

Недостатками указанного метода является следующее:

- в проведенных авторами исследованиях были объединены в одну группу больные со II и III стадиями ГМ, тогда как, именно нахождение статистических различий в позитивности лимфоцитов кожи при IIA и IIB стадиях развития онкопроцесса имеет принципиальное значение для определения дальнейшей тактики лечения больного и прогноза заболевания;

- в данной работе был использован автоматизированный анализ позитивной окраски лишь двух иммуномаркеров CD3 и Ki67, то есть была проведена оценка только общей популяции всех зрелых Т-лимфоцитов и их пролиферативной активности, тогда как при развитии первичных лимфом кожи патогенетически значимым является изучение дисбаланса между пролиферирующими лимфоцитами и процессами их апоптоза, в чем участвуют CD8 цитотоксические клетки, в том числе с продукцией Granzyme В,

- не были изучены субпопуляции Т-лимфоцитов в дерме, а именно Т-хелперная субпопуляция лимфоцитов (CD4+), соотношение хелперно-индукторной субпопуляции лимфоцитов и супрессорно-цитотоксической (CD4+/CD8+),

- данный метод применим только для научного изучения диагностической значимости пролиферативной активности лимфоцитов эпидермиса и дермы у больных грибовидным микозом и бляшечным парапсориазом, тогда как дифференциальная диагностика между IIA и IIB стадиями ГМ важна в практическом смысле и определяет подходы к терапии и степень ее «агрессивности».

Задачей изобретения является разработка способа определения стадии ГМ на основании количественной оценки позитивности иммуногистохимических маркеров биоптата кожи.

Технический результат, который будет достигнут от использования данного изобретения заключается в повышении объективности и точности диагностирования стадии ГМ.

Технический результат достигается тем, что в способе определения стадии грибовидного микоза, включающем проведение у больного биопсии кожи из очага поражения, проведение иммуногистохимических исследований с использованием моноклональных антител CD3 и Ki67, их количественную оценку и установление на этом основании стадии заболевания, для исследований дополнительно используют моноклональные антитела CD4 и CD8, определяют значения объемных долей позитивного окрашивания моноклональными антителами CD3, CD4, CD8 и Ki67 путем компьютерной морфометрии, затем усредняют данные показатели и рассчитывают суммарную удельную значимость иммунопозитивности данных антител по формуле:

F=0,75⋅X1+1,9⋅X2+2,99⋅X3+10,53⋅X4+0,22,

где

F - суммарная удельная значимость иммунопозитивности указанных моноклональных антител,

X1 - среднее значение объемной доли позитивной окраски CD3,

Х2 - среднее значение объемной доли позитивной окраски CD4,

Х3 - среднее значение объемной доли позитивной окраски CD8,

Х4 - среднее значение объемной доли позитивной окраски Ki67,

0,75; 1,9; 2,99; 10,53 и 0,22 - поправочные коэффициенты.

При значении F от 0,220 до 1,969 диагностируют ранние (I-IIA) стадии, а при значении F от 1,970 до 4,973 - поздние (IIB-III) стадии ГМ.

Сущность изобретения состоит в реализованном в формуле изобретения подходе к диагностике стадий ГМ, учитывающим объективный вклад каждого из оцениваемых показателей в общую результирующую диагностики, позволяющую дифференцировать ранние и поздние стадии заболевания.

Из анализа научно-технической и патентной литературы заявляемой совокупности используемых моноклональных антител CD3, CD4, CD8 и Ki67 для оценки стадии грибовидного микоза по предлагаемой формуле нами не выявлено, что позволяет сделать выводы о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

В клинике ГБУ СО «УрНИИДВиИ» с целью улучшения процесса диагностики ГМ и объективизации результатов иммуногистохимических исследований были изучены имиджи биоптатов кожи 36 человек: 30 больных ГМ I, II и III стадий, 6 - контрольной группы (здоровые лица). Диагноз ГМ у каждого больного был установлен на основании анамнеза, клинической картины, результатов патоморфологического, иммуногистохимического и морфометрического методов исследования.

Изобретение поясняется фиг. 1-8, где

на фиг. 1 показаны исходные оцифрованные изображения биоптата кожи больного ГМ с наличием позитивного окрашивания CD3, CD4, CD8 и Ki67 МКА;

на фиг. 2 - автоматизированная обработка изображений иммунофенотипирования биоптата кожи больного ГМ с точным выделением иммунопозитивных Т-лимфоцитов: CD3, CD4, CD8 и Ki67 (зеленый цвет) в дермальном инфильтрате, увеличение 400;

на фиг. 3 - распределение значений функции F от значений доли позитивной окраски иммуномаркера CD3 у всех групп больных;

на фиг. 4 - распределение значений функции F от значений доли позитивной окраски иммуномаркера CD4 у всех групп больных;

на фиг. 5 - распределение значений функции F от значений доли позитивной окраски иммуномаркера CD8 у всех групп больных;

на фиг. 6 - распределение значений функции F от значений доли позитивной окраски иммуномаркера Ki67 у всех групп больных;

на фиг. 7 - больной К., пятна и бляшки на коже туловища;

на фиг. 8 - больной Г., пятна и бляшки на коже.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Иммунофенотипирование объектов исследования проводили в стандартных условиях на аппарате для иммуногистохимии Bond-maX LEICA (Германия) с использованием парафиновых срезов толщиной 4 мкм.

Патоморфологические и морфометрические исследования выполнены с использованием аппаратно-программного комплекса, состоящего из светового микроскопа для медико-биологических исследований Axio Imager М2, цифровой камеры AxioCam MRc 5 и специальной программы ZEN 2012 для ввода изображений, проведения измерений и документирования (ZEISS, Германия). Также в составе данного комплекса использованы персональный компьютер Intel Core i5-3570 3.4 GHz и автоматизированная система анализа изображений «SIAMS Photolab» (Россия, свидетельство об утверждении типа средства измерений RU.C.31.058.A, №40862 от 28.07.2015 г., срок действия до 28.07.2020 г.).

Обработка изображений в системе «SIAMS Photolab» производится в цепочке взаимосвязанных ячеек, содержащих исходный имидж, результаты промежуточных этапов обработки, конечное обработанное изображение и результаты измерений в виде чисел, графиков и гистограмм. В системе предусмотрена генерация отчетов формата MS Word и экспорт изображений, числовых и текстовых данных в наиболее распространенные форматы.

Использование модуля колорометрической оценки результатов иммуногистохимических реакций системы анализа изображений «SIAMS Photolab» позволило получить квантифицированную оценку площади иммунопозитивности маркеров и объективизировать процесс диагностики ГМ.

В дерме больных ГМ на стандартной площади срезов кожи нами изучены параметры позитивности моноклональных антител (МКА) CD3, CD4, CD8, Ki67 и Granzyme В. Для данных исследований использованы по 5 имиджей в каждом наблюдении.

Результаты исследований поясняются с фиг. 1-8.

Примеры исходных оцифрованных изображений биоптата кожи больного ГМ с наличием позитивного окрашивания CD3, CD4, CD8 и Ki67 МКА представлены на фиг. 1.

Обработка оцифрованных изображений иммуногистохимических реакций у больных ГМ в системе анализа изображений «SIAMS Photolab» проводилась в несколько этапов: 1 - предобработка и первичное выделение маски, 2 - разделение масок, 3 - пороговая сегментация, 4 - измерение исследуемых объектов.

На завершающем этапе обработки изображений предусматривалось их контрастирование и более точное выделение определенным цветом измеряемых иммунопозитивных объектов с помощью функции пороговой сегментации (фиг. 2).

В результате автоматизированных измерений выделенных на изображениях объектов по каждому из 5 исследуемых имиджей определялись следующие параметры (в мкм²):

1. Проанализированная площадь гистологического среза кожи.

2. Занимаемая площадь позитивного окрашивания иммуномаркером.

3. Объемная доля позитивного окрашивания иммуномаркером.

На основании обработки 5 имиджей формируется заключительный отчет по выполненному исследованию, содержащий гистограмму распределения объемных долей и таблицу формата MS Word с включением следующих данных:

1. Число проанализированных полей.

2. Проанализированная площадь гистологического среза кожи (мкм²).

3. Занимаемая площадь позитивного окрашивания иммуномаркером (мкм²).

4. Объемная доля позитивного окрашивания иммуномаркером.

5. Средняя объемная доля позитивного окрашивания иммуномаркером.

6. Среднеквадратичное отклонение объемной доли позитивного окрашивания иммуномаркером.

Предварительный анализ данных показал значительную вариабельность площади позитивной окраски иммуномаркерами в дерме у больных при стадийном развитии ГМ.

Для построения модели определения стадии заболевания исходными данными являлись значения площади позитивной окраски иммуномаркерами в дерме у больных ГМ. На основании фактических данных, полученных в результате заполнения стандартизованных карт, была создана электронная база данных в формате таблиц программы Microsoft Excel.

Дальнейшая разработка модели определения стадии ГМ осуществлялась в несколько этапов.

На первом этапе методом вероятностного анализа было проведено выявление нетипичных представителей для каждой из групп исследуемых больных ГМ, присутствие которых в выборке могло существенным образом исказить результаты анализа [12].

Произведен пересчет полученных фактических данных площади позитивной окраски иммуномаркерами в дерме у больных ГМ в безразмерные величины (доля площади иммуномаркеров x_i). Для этого находилось отношение площади иммуномаркера S_им данного вида к общей площади среза S_ср по формуле: x_i= S_им/S_ср.

Далее определяли основные статистические характеристики значений доли площади иммуномаркеров: среднее значение , среднеквадратичное отклонение (СКО) S_x, ошибка выборки данных Δx для одного больного и одного иммуномаркера. Расчет производится по стандартным формулам вариационной статистики:

, , Δx=t⋅S_x,

где x_i - доля площади иммуномаркера в выборке данных данного пациента с определенной стадией заболевания, N - количество срезов одного иммуномаркера у данного пациента, t - коэффициент Стьюдента.

Вычисления проводились при уровне значимости р=0,001 и р=0,01.

* - p<0,00 при сравнении между группами больных ГМ.

** - р<0,001 при сравнении между группами больных ГМ.

При обобщении данных таблицы 2, было отмечено, что изучение иммуноморфологических характеристик клеток дермального инфильтрата в биоптате кожи у больных ГМ продемонстрировало закономерные изменения их популяционного состава в динамике прогрессирования заболевания. Как видно из представленной таблицы 2, в группе больных с поздними (IIB-III) стадиями ГМ наблюдалось достоверное увеличение количества всех зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) и Т-хелперной субпопуляции лимфоцитов (CD4+), хелперно-индукторной субпопуляции лимфоцитов над супрессорно-цитотоксической (CD4+/CD8+) при сопоставлении с аналогичными показателями дермального инфильтрата у больных ранними (I-IIA) стадиями заболевания. Кроме этого было обнаружено, что у больных ГМ в IIB-III стадии показатели объемной доли позитивности Ki67 (0,053±0,004) в 2,9 раза превышали аналогичные показатели у больных I-IIA стадиями заболевания, что свидетельствовало о высокой пролиферативной активности исследованных клеток дермального инфильтрата при поздних стадиях заболевания. В исследуемых группах больных ГМ отсутствовали изменения позитивной экспрессии Granzyme В+ на клетках инфильтрата и отмечалась недостоверная тенденция к увеличению количества Т-цитотоксической субпопуляции лимфоцитов (CD8+) при развитии последующих стадий заболевания.

На втором этапе нами был проведен расчет коэффициентов корреляций изучаемых клинико-лабораторных показателей у всех больных ГМ для выявления разнонаправленных векторов у пациентов, входящих в одну группу. Были выявлены разнонаправленные векторы значений площади позитивного окрашивания иммуномаркерами у больных ГМ (таблица 3).

В соответствии с данными таблицы 3, у больных ГМ обнаружены сильные положительные корреляционные параллели между количеством CD3 и CD4, CD3 и CD8, CD3 и Ki67, CD4 и Ki67, CD4 и CD8. Согласно методам доказательной статики обнаружена линейная зависимость между CD3, CD4 и Ki67. Количество Т-хелперной субпопуляции лимфоцитов (CD4) и показатель пролиферативной активности исследованных клеток дермального инфильтрата (Ki67) не имели существенной корреляционной связи с маркером апоптоза (Granzyme В).

Методами нелинейной динамики [13, 14] определялись пороговые значения объемной доли позитивности ИГХ маркеров биоптата кожи у больных ГМ в зависимости от стадии заболевания (таблица 4).

* - p<0,01 при сравнении между группами больных ГМ.

** - р<0,001 при сравнении между группами больных ГМ.

На третьем этапе все отобранные информативные признаки приняли участие в выработке «решающих правил» диагностики. При помощи процедуры пошагового отбора переменных удалось снизить размерность «решающего правила» при сохранении максимальной правильности распознавания образов. Согласно таблицам 3 и 4, выделены четыре базисных показателя (CD3, CD4, CD8 и Ki67), которые максимально характеризуют векторную динамику стадийного развития заболевания.

Методом наименьших квадратов с учетом пороговых значений показателей были построены линейные функции F от объемной доли позитивной окраски иммуномаркерами CD3, CD4, CD8 и Ki67 у больных ГМ (фиг. 3-6).

На фиг. 3 показано распределение значений функции F от значений доли позитивной окраски иммуномаркера CD3 у всех групп больных (точками обозначены данные по CD3 из таблицы 2).

На фиг. 4 показано распределение значений функции F от значений доли позитивной окраски иммуномаркера CD4 у всех групп больных (точками обозначены данные по CD4 из таблицы 2).

На фиг. 5 показано распределение значений функции F от значений доли позитивной окраски иммуномаркера CD8 у всех групп больных (точками обозначены данные по CD8 из таблицы 2).

На фиг. 6 показано распределение значений функции F от значений доли позитивной окраски иммуномаркера Ki67 у всех групп больных (точками обозначены данные по Ki67 из таблицы 2).

Регрессионным анализом и методом наименьших квадратов с учетом пороговых значений показателей была построена результирующая линейная функция F от объемной доли позитивной окраски иммуномаркерами (моноклональными антителами) CD3, CD4, CD8 и Ki67 у больных ГМ для определения стадии заболевания:

F=0,75⋅Х1+1,9⋅Х2+2,99⋅Х3+10,53⋅Х4+0,22,

где

F - суммарная удельная значимость иммунопозитивности указанных моноклональных антител,

X1 - среднее значение объемной доли позитивной окраски CD3,

Х2 - среднее значение объемной доли позитивной окраски CD4,

Х3-среднее значение объемной доли позитивной окраски CD8,

Х4 - среднее значение объемной доли позитивной окраски Ki67,

0,75; 1,9; 2,99; 10,53 и 0,22 - поправочные коэффициенты.

Поправочные коэффициенты удельной значимости перед переменными X1, Х2, Х3, Х4 и коэффициент 0,22 в функции F были подобраны экспериментальным путем.

В результате для каждой стадии ГМ были получены следующие значения функции F:

ГМ I-IIA (ранние стадии): 0,220≤F≤1,969;

ГМ IIB-III (поздние стадии): 1,970≤F≤4,973.

Данные значения интервалов были получены с уровнем значимости р<0,05.

Способ осуществляется следующим образом:

1. После подписания больным информированного согласия на исследование проводится инцизионная биопсия кожи на участке с наиболее выраженными клиническими проявлениями дерматоза.

2. По стандартным методикам изготавливаются парафиновые блоки и гистопрепараты кожи, выполняется ИФТ с использованием панели МКА, рекомендованной для диагностики ГМ [1].

3. Выполняется оцифровка изображений и отбор 5 имиджей для количественных исследований по критерию максимального содержания в них иммунопозитивных лимфоцитов.

4. Проводится автоматизированная обработка каждого из 5 исследуемых изображений в системе «SIAMS Photolab» с вычислением значений средних объемных долей позитивного окрашивания моноклональных антител CD3, CD4, CD8 и Ki67.

5. Для определения стадии ГМ у больного рассчитывается суммарная удельная значимость и значение каждого из исследуемых иммуномаркеров, подставив в уравнение значения соответствующих признаков по формуле:

F=0,75⋅Х1+1,9⋅Х2+2,99⋅Х3+10,53⋅Х4+0,22,

где X1 - среднее значение объемной доли позитивной окраски CD3, Х2 - среднее значение объемной доли позитивной окраски CD4, Х3 - среднее значение объемной доли позитивной окраски CD8, Х4 - среднее значение объемной доли позитивной окраски Ki67.

6. Сравнив между собой полученное значение переменной F у конкретного больного и пороговые значения обучающей выборки, делается заключение о наличии у больного соответствующей стадии ГМ.

Клинико-диагностическая апробация заявленного способа определения стадии ГМ:

Описываемый способ определения стадии заболевания нами был применен в клинике ГБУ СО «УрНИИДВиИ» у 30 больных ГМ. В таблице 5 приведены данные сопоставления правильности определения стадии заболевания у больных ГМ заявленным способом с экспертной оценкой и патоморфологической верификацией.

Примечание: группа I - больные ГМ I-IIA ст. (ранние стадии), группа II - больные ГМ IIB-III ст. (поздние стадии).

Как следует из представленной таблицы 5, совпадение результатов проведенных тестов на обучающей выборке (когорта больных с ранее установленным и верифицированным диагнозом и стадиями ГМ) с экспертной оценкой и патоморфологической верификацией диагноза у больных свидетельствует о специфичности разработанного нами способа определения стадии ГМ и разделения на ранние и поздние стадии. Достоверность подобного разделения больных ГМ на стадии заболевания составила в среднем 97,3%, причем 100% достоверность была зафиксирована у больных ГМ IIB-III ст., а 94,73% - при ранних стадиях заболевания (I-IIA ст.).

В качестве иллюстрации применения способа определения стадии ГМ у больных приводим следующие клинические наблюдения.

Больной К., 1973 г. рождения, поступил в клинику ГБУ СО «УрНИИДВиИ» для уточнения диагноза с жалобами на распространенные пятна и бляшки на коже туловища и конечностей, сопровождающиеся периодическим зудом, покалыванием и стягиванием кожи. Болеет в течение 4 лет, когда впервые заметил единственное пятно на коже левого плеча. Через год в связи с появлением многочисленных пятен на коже туловища и верхних конечностей впервые обратился к дерматологу по месту жительства. Для уточнения заболевания дважды амбулаторно проводились стандартные гистологические исследования кожи, больной находился под наблюдением дерматолога с диагнозом бляшечный парапсориаз, назначались Н₁ антигистаминные препараты, наружно - топические глюкокортикостероиды. Сезонности обострений заболевания не отмечал, а на фоне инсоляции наблюдалось усиление окраски пятен и появление умеренного зуда. За предыдущий год отмечает прогрессирование заболевания - усиление кожного зуда и появление новых бляшек на коже, часть из которых была наиболее инфильтрирована.

Анамнез жизни, аллергоанамнез и профессиональный маршрут у больного без особенностей. Наследственность по кожным заболеваниям и онкопатологии не отягощена. При общем осмотре патологических отклонений по системам и органам не выявлено. Подмышечные лимфатические узлы диаметром до 1,5-2 см, мягкие, безболезненные и подвижные при пальпации. Физиологические отправления в норме.

Локальный статус: кожный процесс имеет распространенный характер. На коже плеч, предплечий, груди, живота, спины и правого бедра присутствуют розовато-красные пятна и умеренно инфильтрированные бляшки диаметром до 3,5 см, округлой формы, с четкими границами и шероховатой поверхностью. На поверхности бляшек отсутствует рост волос, имеются экскориации с точечными геморрагическими корочками. Кроме этого, на коже правой половины живота имеются 4 округлых высыпания, максимально возвышающихся над уровнем кожи, которые за счет своей выраженной инфильтрации не позволяют их отнести к бляшками или опухолями. Дермографизм белый (фиг. 7).

Лабораторные данные. Общий анализ крови: Hb - 139 г/л, эр. - 4,7×10¹²/л, лейк. - 8,5×10⁹/л, нейтр. - 5,4×10⁹/л, эоз. - 0,2×10⁹/л, лимф. - 2,2×10⁹/л, мон. - 0,5×10⁹/л, СОЭ - 14 мм/ч. В общем анализе мочи, биохимической гепатограмме и иммунограмме отклонений не выявлено. Комплекс серологических реакций к Treponema pallidum отрицательный. Антитела к ВИЧ, гепатитам В и С не обнаружены.

Патоморфологическое исследование биоптата кожи больного: Эпидермис неравномерно гиперплазирован, с. гиперкератозом и небольшим акантозом. В верхних отделах дермы присутствуют полосовидные эпидермотропные инфильтраты из лимфоидных клеток малого и среднего размера. Дермоэпидермальная граница нечеткая, с формированием небольших единичных скоплений в эпидермисе типа микроабсцессов Потрие.

Иммуногистохимическое исследование биоптата кожи больного: опухолевый инфильтрат имеет Т-клеточный иммунофенотип: клетки экспрессируют CD3, CD4 и CD8; В-лимфоциты (CD20) - в виде единичных скоплений среди опухолевых клеток.

Иммуногистохимические препараты биоптата кожи больного были подвергнуты морфометрии с использованием компьютерной программы «SIAMS-Photolab», вычисленные показатели составили: среднее значение объемной доли позитивной окраски CD3=0,263, среднее значение объемной доли позитивной окраски CD4=0,152, среднее значение объемной доли позитивной окраски CD8=0,078, среднее значение объемной доли позитивной окраски Ki67=0,017.

Для определения у больного стадии ГМ указанным способом в уравнение были подставлены значения соответствующих признаков:

F=0,75⋅0,263+1,9⋅0,152+2,99⋅0,078+10,53⋅0,017+0,22.

У данного больного было получено значение F=1,118, что при сравнении с обучающей выборкой имело числовые параметры, характерные для ранней стадии ГМ (0,220 ≤ F≤ 1,969).

На основании анамнеза, клинической картины, данных гистологического и иммуногистохимического методов исследования биоптата кожи и результатов, полученных заявленным способом, больному был установлен окончательный диагноз: первичная лимфома кожи, грибовидный микоз, IIА стадия (T2N1M0B0).

Больной Г., 1950 г. рождения, поступил в клинику ГБУ СО «УрНИИДВиИ» с жалобами на распространенные высыпания на коже предплечий, груди, живота и спины, сопровождающиеся периодическим интенсивным зудом и стягиванием кожи. Болеет в течение 6 лет, когда впервые возникли пятна на коже правого предплечья. В течение последующих нескольких лет обращал внимание на постепенное появление аналогичных пятен на коже туловища. Наблюдался у дерматовенеролога по месту жительства с диагнозом крупнобляшечный парапсориаз, где в результате проводимой терапии (Н1-антигистаминные средства, десенсибилизирующая терапия, наружно - топические глюкокортикостероиды) больной отмечал кратковременное улучшение в виде исчезновения зуда высыпаний. За предыдущие 5-6 месяцев отметил ухудшение течения заболевания - появление новых пятен и усиление кожного зуда, в связи с чем был госпитализирован в отделение хронических дерматозов ГБУ СО «УрНИИДВиИ.

Анамнез жизни, аллергоанамнез и профессиональный маршрут у больного без особенностей. Наследственность по кожным заболеваниям и онкопатологии не отягощена. При общем осмотре патологических отклонений по системам и органам не выявлено. Подмышечные и паховые лимфатические узлы диаметром до 1,5-2,0 см, мягкие, безболезненные и подвижные при пальпации. Физиологические отправления в норме.

Локальный статус: непораженные участки кожных покровов физиологической окраски, нормальной влажности и тургора. Видимые слизистые влажные, физиологической окраски. Кожный процесс имеет распространенный характер, поражены - грудь, живот, спина, плечи и предплечья. На коже груди, живота, предплечий и поясничной области имеются многочисленные пятна бледно-красного цвета, диаметром до 2-3 см, с четкими границами, без шелушения и экскориаций. На коже живота и спины присутствуют округлые бляшки, кирпично-красного цвета, диаметром до 6 см, с точечными геморрагическими корочками в местах экскориаций. На поверхности бляшек отсутствует рост волос, имеются единичные трещинки в местах физиологических складок кожи и незначительное мелкопластинчатое шелушение. На коже левой половины живота имеются 2 наиболее инфильтрированных образования, округлой формы, диаметром 1,8 см и 2,5 см, насыщенно-красного цвета, с гладкой поверхностью, которые по своей морфологии и размерам не позволяют их отнести либо к бляшкам, либо к опухолям. Дермографизм белый (фиг. 8).

Лабораторные данные. Общий анализ крови: Hb - 146 г/л, эр. - 4,86×10¹²/л, лейк. - 8,1×10⁹/л, нейтр. - 2,8×10⁹/л, эоз. - 0,3×10⁹/л, лимф. - 2,0×10⁹/л, мон. - 0,4×10⁹/л, СОЭ - 10 мм/ч. В общем анализе мочи и иммунограмме отклонений не выявлено. В биохимической гепатограмме - повышение общего билирубина до 24,3 мкмоль/л. Комплекс серологических реакций к Treponema pallidum отрицательный. Антитела к ВИЧ, гепатитам В и С не обнаружены.

Патоморфологическое исследование биоптата кожи больного: в дерме присутствует плотный, полосовидный, эпидермотропный инфильтрат из лимфоидных клеток разных размеров, «размывающий» дермоэпидермальную границу и проникающий в эпидермис, в котором прослеживается очаговая деструкция. Определяются микроабсцессы Потрие. Митотическая активность клеток достаточно высокая.

Иммуногистохимические препараты биоптата кожи больного были подвергнуты морфометрии с использованием компьютерной программы «SIAMS-Photolab», вычисленные показатели составили: среднее значение объемной доли позитивной окраски CD3=0,606, среднее значение объемной доли позитивной окраски CD4=0,56, среднее значение объемной доли позитивной окраски CD8=0,24, среднее значение объемной доли позитивной окраски Ki67=0,059.

Для определения у больного стадии ГМ указанным способом в уравнение были подставлены значения соответствующих признаков:

F=0,75⋅0,606+1,9⋅0,56+2,99⋅0,24+10,53⋅0,059+0,22.

У данного больного было получено значение F=3,07, что при сравнении с обучающей выборкой имело числовые параметры, характерные для поздних стадий ГМ (1,970≤F≤4,973).

На основании анамнеза, клинической картины, результатов патоморфологического, иммуногистохимического и морфометрического методов исследования биоптата кожи и данных, полученных заявленным способом, больному Г. был установлен окончательный диагноз: первичная лимфома кожи, грибовидный микоз, IIB стадия (T3N1M0B0). С целью назначения профильной терапии больной был направлен к гематологу.

Использованная литература

1. Федеральные клинические рекомендации. Дерматовенерология 2015: Болезни кожи. Инфекции, передаваемые половым путем. - 5-е изд., перераб. и доп. - М.: Деловой экспресс, 2016. - 768 с.

2. Малишевская Н.П., Кохан М.М., Соколова А.В., Куклин И.А. и соавт. Дерматоонкология (злокачественные новообразования кожи, первичные лимфомы кожи): Атлас / Под общ. ред. Н.В. Кунгурова. – Екатеринбург, Изд-во Урал. Ун-та, 2016. - 168 с.

3. Вольф К., Голдсмит Л.А., Кац С.И. Дерматология Фицпатрика в клинической практике. Пер. с англ. М.: Изд. Панфилова. БИНОМ; 2012. - Т. 2. - С. 1514-1531.

4. Willemze R. Primary cutaneous lymphoma: ESMO Clinical Recommendations for diagnosis, treatment and follow-up / R. Willemze, M. Dreyling // Annals of Oncology. - 2009. - Vol. 20. - P. 115-118.

5. Dulmage В. The biomarker landscape in mycosis fungoides and syndrome / B. Dulmage, L. Geskin, J. Guitart, O. Akilov // Exp. Dermatol. - 2017. - Vol. 26 (8). - P. 668-676.

6. Сафонова Г.Д. Оптимизация диагностики и перспективы патогенетических исследований первичных лимфом кожи (обзор литературы) / Г.Д. Сафонова, М.М. Кохан, Н.В. Зильберберг, О.Г. Римар, И.А. Куклин // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2014. - №12. - С. 264-268.

7. Qureshi A. Allred scoring for ER reporting and it's impact in clearly distinguishing ER negative from ER positive breast cancers / A. Qureshi, S. Pervez // Journal Pakistan Medical Association. - 2010. - Vol. 60 (5). - P. 350-353.

8. Allred D.C. Assessment of prognostic and predictive factors in breast cancer by immunohistochemistry // Connection. - 2005. - Vol. 9. - P. 4-5.

9. Сыдиков А.А. Иммуногистохимические критерии диагностики мелкобляшечного парапсориаза, крупнобляшечного парапсориаза и грибовидного микоза / А.А. Сыдиков, Д.В. Заславский, B.C. Зайцев, Р.А. Насыров // Современные проблемы, науки и образования. - 2013. - №6. - С. 568-575.

10. Патент РФ №2553340, МПК G01N 33/48, опубл. 10.06.2015, бюл. №16.

11. Жуков А.С. Уровень пролиферативной активности лимфоцитов при грибовидном микозе и бляшечном псориазе / Жуков А.С., Белоусова И.Э., Хайрутдинов В.Р. и соавт. // Вестник дерматологии и венерологии. - 2014. - №1. - С. 30-36.

12. Арнольд В.И. Математические методы классической механики. - 5-е изд., стереот. - М.: Едиториал УРСС, 2003. - 416 с.

13. Самарский А.А., Курдюмов С.П., Ахромеева Т.С., Малинецкий Г.Г. // Информатика и научно-технический прогресс. - М.: Наука, 1987. - С. 69-91.

14. Сергиенко В.И., Бондарева И.Б. // Математическая статистика в клинических исследованиях. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001. - 256 с.

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматовенерологии, и может быть использовано для определения стадии грибовидного микоза. Сущность способа: у больного проводят биопсию кожи из очага поражения, затем проводят иммуногистохимические исследования с использованием моноклональных антител CD3, CD4, CD8 и Ki67 путем компьютерной морфометрии, затем усредняют данные показатели и рассчитывают суммарную удельную значимость иммунопозитивности указанных моноклональных антител по формуле: F=0,75⋅Х1+1,9⋅Х2+2,99⋅Х3+10,53⋅Х4+0,22, где F - суммарная удельная значимость иммунопозитивности моноклональных антител CD3, CD4, CD8 и Ki67; X1 - среднее значение объемной доли позитивной окраски CD3; Х2 - среднее значение объемной доли позитивной окраски CD4; Х3 - среднее значение объемной доли позитивной окраски CD8; Х4 - среднее значение объемной доли позитивной окраски Ki67; 0,75; 1,9; 2,99; 10,53 и 0,22 - поправочные коэффициенты. При значении F от 0,220 до 1,969 диагностируют ранние I-IIA стадии, а при значении F от 1,970 до 4,973 - поздние IIВ-III стадии грибовидного микоза. Изобретение обеспечивает повышение объективности и точности диагностирования стадии грибовидного микоза. 8 ил., 5 табл.

Способ определения стадии грибовидного микоза, включающий проведение у больного биопсии кожи из очага поражения, проведение иммуногистохимических исследований с использованием моноклональных антител CD3 и Ki67, их количественную оценку и установление на этом основании стадии заболевания, отличающийся тем, что для исследований дополнительно используют моноклональные антитела CD4 и CD8, определяют значения объемных долей позитивного окрашивания моноклональными антителами CD3, CD4, CD8 и Ki67 путем компьютерной морфометрии, затем усредняют данные показатели и рассчитывают суммарную удельную значимость иммунопозитивности указанных моноклональных антител по формуле:

F=0,75⋅Х1+1,9⋅Х2+2,99⋅Х3+10,53⋅Х4+0,22,

где F - суммарная удельная значимость иммунопозитивности моноклональных антител CD3, CD4, CD8 и Ki67;

X1 - среднее значение объемной доли позитивной окраски CD3,

Х2 - среднее значение объемной доли позитивной окраски CD4,

Х3 - среднее значение объемной доли позитивной окраски CD8,

Х4 - среднее значение объемной доли позитивной окраски Ki67,

0,75; 1,9; 2,99; 10,53 и 0,22 - поправочные коэффициенты,

и при значении F от 0,220 до 1,969 диагностируют ранние I-IIA стадии, а при значении F от 1,970 до 4,973 - поздние IIB-III стадии грибовидного микоза.