Способ диагностики хронического эндометрита различной степени выраженности у пациенток с аномальными маточными кровотечениями, при отсутствии эндометриопатии в анамнезе, посредством иммуногистохимического исследования нарушения клеточного иммунитета в эндометрии Российский патент 2024 года по МПК G01N33/53 A61B5/00 

Область техники

Изобретение относится к области медицины, а именно к патологической анатомии, репродуктологии, акушерству и гинекологии и может быть использовано для диагностики нарушения клеточного иммунитета и степени выраженности хронического эндометрита (ХЭ) у женщин с аномальным маточным кровотечением, расстройством впоследствии менструального цикла маточного генеза на основании оценки иммуногистохимической реакции (ИГХ) с маркерами: плазматических клеток, натуральных киллерных клеток (NK-клетки), В-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов, а так же соотношения Т-хелперных клеток к цитотоксическим Т-лимфоцитам.

Уровень техники

Термин аномальное маточное кровотечение (АМК) характеризует любое маточное кровотечение, не соответствующее нормальной менструации женщины репродуктивного возраста. По данным мировой литературы распространенность АМК достигает более 35% [15, 16, 17].

Одним из факторов аномального АМК является ХЭ. Распространенность ХЭ у женщин репродуктивного периода варьирует в широких пределах [3-5, 15, 16]. Данное заболевание характеризуется латентным течением и скрытой клинической картиной, что вызывает определенные трудности его ранней диагностики [1, 2, 10-14].

ХЭ нарушает децидуализацию, инициирует резистентность к прогестерону, а также приводит к нарушению баланса факторов адгезии эндометрия [6-9]. Аномалии эндометриального компартмента (эндометриопатии) становятся причиной повышенного пролиферативного потенциала при сниженной способности к дифференцировке, асинхронной перистальтики матки, вызывая АМК, а также дальнейшее нарушение менструального цикла. Методы диагностики АМК у пациенток с верифицированным ХЭ далеки от идеала, так как не имеют рационального анализа специфичных маркеров. Вышеизложенное определяет актуальность данной проблемы и свидетельствует о необходимости разработки новых способов диагностики и прогнозирования исходов ХЭ у пациенток, страдающими АМК.

Как известно, в основе патогенеза имплантационной несостоятельности эндометрия лежит иммунологический дисбаланс в строме эндометрия у женщин репродуктивного возраста, субстратом которого являются недостаточные концентрации проангиогенных NK-клеток, регуляторных супрессивных Т-хелперов, а также повышение плотности цитотоксического класса NK- клеток и Т-киллеров. Это формирует два ключевых звена - снижение иммунологической толерантности к полуаллогенной бластоцисте и нарушение процессов нормального ангиогенеза в строме эндометрия женщин [18].

Существует способ диагностики ХЭ, описанный в патенте РФ 2236013 от 10.09.2004 года, сущность которого заключается в том, что с помощью ИГХ окрашивания срезов эндометриальной ткани определяют показатели местного иммунитета: количество лимфоцитов, экспрессирующих маркеры естественных киллерных клеток, CD56+, CD16+ и маркеры активации HLA-DR(II)+, и тем самым диагностируют различные варианты течения ХЭ.

Недостатком данного метода является отсутствие комплекса ИГХ оценки нарушения клеточного иммунитета и степени выраженности ХЭ, а также отсутствие данных об АМК и нарушениях менструального цикла эндометриального генеза.

Известен способ диагностики ХЭ у пациенток после прерывания неразвивающейся беременности и с неблагоприятными потерями беременности в анамнезе (патент РФ 2697195 от 18.05.2018 г.). Суть метода заключается в исследовании менструальной крови на содержание в ней эндометриального белка гликоделина. Исследование проводится на 1-2 день менструального цикла. Полученный материал исследуется методом ИФА. Уровень эндометриального гликоделина менее 22,2 мкг/мл свидетельствует о ХЭ.

Недостатком данного метода является отсутствие комплексного определения специфических маркеров, присущих персистирующему воспалительному процессу в эндометрии, а также отсутствие данных об АМК и последующих нарушениях менструального цикла.

Известен способ диагностики и прогнозирования развития ХЭ у пациенток (патент РФ 2587325 от 20.06.2016 г.). У женщин репродуктивного возраста посредством ИГХ исследования срезов эндометрия, по проценту позитивно окрашенных клеток эндометрия в баллах, определяют показатели локального врожденного иммунитета TLR2, TLR4, TLR9. Полученная ИГХ картина экспрессии TLR2, TLR4, TLR9 совместно с морфологическими данными позволяет диагностировать либо отсутствие ХЭ, либо наличие факторов риска и предрасположенности к его развитию, а также либо наличие и прогрессирование заболевания, либо стадию ремиссии данного состояния; либо наличие длительно персистирующего воспаления эндометрия, течение которого характеризуется развитием склеротических изменений сосудов и фиброзом стромы эндометрия различной степени выраженности.

Недостатком данного метода является отсутствие комплексной ИГХ оценки нарушения клеточного иммунитета и степени выраженности ХЭ, отсутствие данных об АМК и нарушениях менструального цикла.

Существует способ определения стадии клинического течения ХЭ, степени активности воспаления и выраженности фиброза с установлением прогноза имплантации и нарушения рецептивности эндометрия, описанный в патенте РФ 2674155 от 27.09.2017 года. Сущность метода заключается в оценке наличия воспалительной лимфоцитарной инфильтрации и определении выраженности фиброза, по количественной оценке, распространенности и наличию его в основных топографических зонах эндометрия в баллах, по сумме которых определяют индексы активности ХЭ и выраженности фиброза, по величине которых выделяют по три стадии активности и клинического течения ХЭ.

Недостатком данного метода является отсутствие системного определения маркеров, присутствующих при хроническом воспалительном процессе в эндометрии, а также ориентация на наличие одного только фиброза, в отсутствие других надежных маркеров, отсутствие данных об АМК и нарушениях менструального цикла.

Известен способ оценки рецептивности эндометрия в период "имплантационного окна" (патент РФ 2651762, 23.04.2018 г.). Для достижения этой цели исследователи методом пайпель-биопсии эндометрия на 20-23 день менструального цикла проанализировали на основании метода ИГХ с использованием двухэтапного стрептавидин-биотин-пероксидазного метода с демаскировкой антигена и с применением ключевых биомолекул, отвечающих за имплантацию: стандартный набор моноклональных и поликлональных антител ERa в строме, PR в строме, р53 в железах, bcl2 в строме, CD95 в строме, Ki67 в строме, LIFR в железах, LIF в железах эндометрия. На основании полученных результатов исследования авторы рассчитали прогноз рецептивности эндометрия по формуле: d=-1,3 89x1 + 0,022x2 - 0,044x3 - 0,019x4 + 0,041x5 + 0,006x6 + 0,015x7 - 3,248, где x1 - индекс ER/PR в строме эндометрия (баллы H-score для определения ядерной экспрессии ER и PR), х2 - р53 в железах эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения), х3 - bcl 2 в строме эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения), х4 - CD95+ в строме эндометрия (% окрашенных клеток), х5 - Ki67 в строме эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения), х6 - LIF-R в железах эндометрия (баллы H-score), х7 - LIF в железах эндометрия (баллы H-score). При значениях d>0 эндометрий характеризовали как рецептивный, при d≤0 эндометрий характеризуется как нерецептивный.

Недостатками данного метода являлось отсутствие данных об АМК и нарушениях менструального цикла.

Существует способ определения степени выраженности хронического эндометрита у женщин с маточным фактором бесплодия после неудачного экстракорпорального оплодотворения в анамнезе, описанный в патенте РФ 2748191 от 21.01.2021 года. Сущность метода заключается в разработке двух способов, основанных на комплексном патоморфологическом исследовании эндометрия в среднюю стадию фазы пролиферации, включающем в первом способе гистологическую окраску гематоксилином и эозином, ИГХ исследование с антителами к CD138, CD56, а во втором способе - гистологическая окраска гематоксилином и эозином, ИГХ исследование с антителами к CD138, CD56 и гистохимическую окраску по Маллори на определение выраженности фиброза.

Недостатком данного метода является отсутствие данных о связи ХЭ, нарушение клеточного иммунитета и АМК, а также нарушениях менструального цикла.

Раскрытие сущности изобретения

Предлагаемый способ позволяет устранить указанные недостатки: повышение точности патологоанатомической диагностики нарушения клеточного иммунитета и степени выраженности ХЭ в эндометрии у женщин с АМК и последующими расстройствами менструации.

Вследствие отсутствия высокоспецифичных и чувствительных способов диагностики нарушения клеточного иммунитета и степени выраженности ХЭ у пациенток с АМК в анамнезе, последующим нарушением менструального цикла эндометриального генеза, характеризующееся как хроническое маточное кровотечение, мы предлагаем способ, основанный на комплексном патологоанатомическом анализе параметров неполноценности функционального слоя эндометрия, который расширяет возможности диагностики нарушения клеточного иммунитета и степени выраженности ХЭ в данной когорте пациенток.

Сущность предлагаемого способа определения степени выраженности хронического эндометрита (ХЭ) заключается в том, что проводят биопсию эндометрия или гистероскопию, диагностическое выскабливание слизистой полости матки в среднюю стадию фазы пролиферации - на 7-11 дни 28-дневного менструального цикла в спонтанном цикле, осуществляют пайпель-биопсию эндометрия с помощью одноразового аспирационного зонда, полученный материал после гистологической проводки в автоматической гистопроцессоре заливают в парафин, затем на срезах толщиной 4-6 мкм проводят окраску гематоксилином и эозином и гистохимическую окраску по Маллори, проводят иммуногистохимическое окрашивание на депарафинизированных и дегидратированных срезах толщиной 4-6 мкм с использованием авидин-биотинового иммунопероксидазного метода, определяют уровни экспрессии CD138+, CD56+, CD20+, CD4+, CD8+ в эндометрии, производят подсчет процента позитивно окрашенных клеток, при этом проводят оценку иммуногистохимической реакции:

• если число CD138+ клеток равно нулю - 0 баллов; если встречаются единичные позитивно-окрашенные клетки - 1 балл; если 2-3 клетки - 2 балла; если клеток более или равно 4 - 3 балла;

• если число CD56+ клеток от 1 до 10-0 баллов; если число клеток от 11 до 20 - 1 балл; если число клеток от 21 до 30 - 2 балла; если число клеток от 31 и более - 3 балла;

• если число CD20+ клеток от 1 до 3 - 0 баллов; если число клеток от 4 до 6 - 1 балл; если число клеток 7 до 9 - 2 балла; если число клеток от 10 и более - 3 балла;

• если число CD4+ клеток от 1 до 10 - 0 баллов; если число клеток от 11 до 20 - 1 балл; если число клеток от 21 до 30 - 2 балла; если число клеток от 31 и более - 3 балла;

• если число CD8+клеток от 1 до 10 - 0 баллов; если число клеток от 11 до 20 - 1 балл; если число клеток от 21 до 30 - 2 балла; если число клеток от 31 и более - 3 балла;

далее оценивают состоятельность клеточного иммунитета по соотношению маркеров CD4+/CD8+ в эндометрии и наличию фиброза:

• если соотношение уровней экспрессии маркеров CD4+/CD8+ в эндометрии менее 1,5 - снижение клеточного иммунитета эндометрия - 2 балла; если соотношение более 2,5 - гиперреактивный клеточный иммунитет эндометрия - 1 балл;

• оценка на наличие фиброза эндометрия: отсутствие фиброза - 0 баллов; есть фиброз - 1 балл;

производят подсчет суммы полученных баллов и определяют выраженность ХЭ:

• при 15 и более баллов - выраженный ХЭ;

• при 9-14 баллов - умеренно выраженный ХЭ;

• при 5-8 баллов - слабо выраженный ХЭ

• при 0-4 баллов - ХЭ мало вероятен.

Было проведено собственное исследование, в котором продемонстрирована высокая специфичность предлагаемого нами комплексного патологоанатомического метода в диагностике выраженности ХЭ и нарушения клеточного иммунитета с АМК в анамнезе, нарушения менструального цикла эндометриального генеза, основанном на оценке изменений клеточного иммунитета функционального слоя эндометрия. Комплексное изучение состояло из гистологических, гистохимических, иммуногистохимических методов исследований образцов. Полученные результаты позволили достоверно выявить нарушения клеточного иммунитета и определить степень выраженности ХЭ у пациенток с АМК.

Предлагаемый способ является комплексным

патологоанатомическим исследованием эндометрия в среднюю стадию фазы пролиферации, включающем гистологическую окраску гематоксилином и эозином, гистохимическую окраску по Маллори и с последующим ИГХ применением моноклональных антител к CD138, CD56, CD20, CD4, CD8 и соотношение CD4+/CD8+ в сочетании с наличием фиброза.

Комплекс ИГХ исследований включает анализ уровней экспрессии ключевых маркеров: CD138+ - плазматическая клетка, CD56+ - натуральные киллерные клетки, CD20+ - В-лимфоциты - высокоинформативный биомаркер для ранней диагностики ХЭ [3], CD4+/CD8+ - соотношение Т-хелперных клеток к цитотоксическим Т-лимфоцитам.

CD138+ - трансмембранный гепарансульфат протеогликан, участвующий в регуляции цикличных изменений эндометрия, используется для прогнозирования репродуктивных исходов в качестве специфического и чувствительного антигена плазмоцитов [9, 10].

CD56+ - маркер натуральных киллерных клеток. В фазу пролиферации доля CD56+ клеток составляет 8% от всех клеток эндометрия, а в секреторную фазу - 60-70%. В норме NK-клетки под воздействием прогестерона мигрируют в эндометрий и конститутивно в нем присутствуют. В эндометрии женщин с нарушением репродуктивной функции увеличение числа CD56+ клеток характеризует высокую интенсивность персистирующего процесса воспаления в ткани и является неблагоприятным фактором, препятствующим нормальной адгезии и имплантации бластоцисты [11].

CD4+ - Т-хелперы выступают в качестве стимулятора иммунного ответа, они активируют Т- и В-лимфоциты, моноциты и NK - клетки.

CD8+ - Т-киллеры - обнаруживаются при заражении вирусами или внутриклеточными патогенами, именно CD8+ имеет высокую диагностическую значимость при оценке хронического воспаления в эндометрии. Для иммуносупрессивного состояния характерно снижение CD4+ и повышение CD8+, в тоже время нарушение соотношения CD4+/CD8+ с увеличением количества CD8+ может возникать при различных инфекциях.

CD20+ - В-лимфоцитарный антиген - белок, корецептор, расположенный на поверхности В-лимфоцитов. Установленные при ИГХ исследовании количественные особенности CD20+В-лимфоцитов в эндометрии позволяют его использовать как высокочувствительный и значимый маркер ранней диагностики ХЭ.

Таким образом, предлагаемый способ ИГХ диагностики нарушения клеточного иммунитета и степени выраженности ХЭ у женщин с АМК и нарушением менструального цикла в последствии, без эндометриопатии в анамнезе, основанный на определении патогномоничных маркеров, обусловливающих особенности заболевания и дисфункции иммунного статуса эндометрия, следует рассматривать как дополненный вариант диагностики нарушения клеточного иммунитета и степени выраженности ХЭ.

Технический результат, достигаемый с помощью изобретения - повышение чувствительности верификации нарушения клеточного иммунитета и определения степени выраженности ХЭ, позволяющего прогнозировать положительный исход наступления и вынашивания беременности, у пациенток с АМК в анамнезе и с нарушением менструального цикла.

Для осуществления способа необходимо уточнение из анамнестических данных о наличии эндометриопатии, которая могла быть диагностирована при предыдущих диагностических или лечебных выскабливаниях, а также оценена по уменьшению размера М-ЭХО при проведении ультразвукового исследования органов малого таза.

Данный метод диагностики заключается в том, что в среднюю стадию фазы пролиферации (на 7-11 дни 28-дневного менструального цикла) производят пайпель-биопсию эндометрия или гистероскопию, раздельное диагностическое выскабливание слизистой оболочки полости матки. После в патологоанатомическом отделении проводят стандартную гистологическую проводку операционного материала и подготавливают стеклопрепараты. Полученные гистологические срезы окрашивают гематоксилином и эозином, а также проводят гистохимическую окраску по Маллори, после чего материал исследуют методом ИГХ с применением наборов моноклональных антител к следующим маркерам: CD138, CD56, CD4, CD8, CD20. Трактовка ИГХ реакции проводится следующим способом:

- CD138+ - положительная реакция в виде темно-коричневого окрашивания плазматических клеток с подсчетом среднего числа на одно поле зрения при увеличении 400, и в зависимости от полученного числа разделяются на 4 группы: 0 клеток, 1 клетка, 2-3 клетки, 4 и более клеток.

- CD56+, CD4+, CD8+, CD20+ - положительная реакция в виде темно-коричневого окрашивания и подсчет числа окрашенных клеток.

- CD4+/CD8+ - соотношение числа положительно окрашенных темно-коричневых клеток CD4+ к числу положительно окрашенных темно-коричневых клеток CD8+.

ИГХ исследование проводилось с использованием двухэтапного стрептавидин-биотин-пероксидазного метода с демаскировкой антигена. ИГХ окрашивание производилось в иммуностейнере Ventana BenchMark ULTRA IHC/ISH (США) на парафиновых срезах по стандартной методике с использованием антител CD138 - CD138/syndecan-l (В-А38) и CD56 «Cell-Marque» (США); CD20, CD4, CD8 «Ventana» (США) (таблица 1).

Первый этап. Проводится анализ наличия фиброза и подсчет числа CD138+ плазматических клеток в расчете на 1 поле зрения при увеличении 400. После чего материал разделяют на группы (Таблица 2):

- ХЭ различной степени выраженности в зависимости от числа плазматических клеток CD138+;

- без CD138+ клеток - нарушение клеточного иммунитета эндометрия (Таблица 2).

Второй этап. Анализируется ИГХ реакция и оценивается число CD56+, CD4+, CD8+, CD20+, а также соотношение CD4+/CD8+ (Таблица 2).

При ИГХ исследовании биоптатов эндометрия женщин с ХЭ (с АМК в анамнезе и нарушением менструального цикла эндометриального генеза впоследствии), полученных в среднюю стадию фазы пролиферации менструального цикла (на 7-11 дни 28-дневного менструального цикла), CD138+ клетки обнаруживаются в 100%.

Превышение значений CD56+ - при выраженном ХЭ встречается в 100%, при умеренно-выраженном ХЭ - в 98%), при слабо-выраженном ХЭ - в 100%.

Превышение значений CD20+ - при выраженном ХЭ обнаруживается в 80%, при умеренно-выраженном ХЭ - в 70%, при слабо-выраженном ХЭ в 35%.

Превышение значений CD4+ - при выраженном ХЭ встречается в 95%, при умеренно-выраженном ХЭ встречается в 85%, при слабо-выраженном ХЭ - 70%.

Превышение значений CD8+ - при выраженном ХЭ встречается в 100%, при умеренно-выраженном ХЭ - 100%, при слабо-выраженном ХЭ - 100%.

Фиброз стромы встречается при выраженном ХЭ в 70%, при умеренно-выраженном ХЭ - в 45%, при слабовыраженном ХЭ - в 55%.

Соотношение CD4+/CD8+ <1,5 (снижение клеточного иммунитета эндометрия) - при выраженном ХЭ обнаруживается в 60%, при умеренно-выраженном ХЭ - 50%, при слабо-выраженном ХЭ - 55%.

При ИГХ исследовании биоптатов эндометрия женщин с АМК в анамнезе и нарушением менструального цикла эндометриального генеза впоследствии, у которых CD138+ клетки не были обнаружены, превышение значений CD56+ встречается в 90%, превышение значений CD20+ - в 9%, превышение значений CD4+ - в 90%, превышение значений CD8+ - в 98%, отклонение соотношения CD4+/CD8+ обнаруживается в 64%, фиброз стромы - 55%. Эти изменения расцениваются как нарушение клеточного иммунитета.

Среди биоптатов эндометрия здоровых женщин единичные CD 138+клетки наблюдаются в 9,5% пациенток, в то время как экспрессии маркеров CD56+, CD20+, CD4+, CD8+, а также значение CD4+/CD8+ находятся в рамках референсных значений (Таблица 3).

Таблица 3. Результаты ИГХ и гистохимического исследований в среднюю стадию фазы пролиферации эндометрия женщин с АМК в анамнезе и нарушением менструального цикла эндометриального генеза впоследствии, и здоровых женщин.

Таким образом, по результатам проведенных патоморфологических исследований материала в среднюю стадию фазы пролиферации менструального цикла ХЭ верифицируется по совокупности наличия фиброза эндометрия, плазматических клеток, натуральных киллеров, В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов - хелперов, цитотоксических Т лимфоцитов - супрессоров, а также по соотношению Т-лимфоцитов - хелперов к цитотоксическим Т лимфоцитам -супрессорам.

Можно предположить, что эндометриопатия в виде нарушения клеточного иммунитета является принципиально важным звеном для регуляции репродуктивной и менструальной функции, соответственно выявленное изменение местного иммунитета в эндометрии в фазе пролиферации у пациенток с ХЭ может быть одним из ведущих патогенетических механизмов развития функциональной несостоятельности эндометрия.

В эндометрии в среднюю стадию фазы пролиферации у пациенток с АМК в анамнезе и нарушением менструального цикла эндометриального генеза впоследствии в сравнении с биоптатами эндометрия женщин без АМК в анамнезе, проходившие плановое диспансерное наблюдение, нами были установлены достоверные ИГХ и гистохимические детерминанты. На фоне нарушения клеточного иммунитета определяется повышение экспрессии CD4+ и CD8+, а также изменение соотношения CD4+/CD8+ (Т-лимфоцитов - хелперов к цитотоксическим Т лимфоцитам - супрессорам) в основной группе относительно группы сравнения.

При ИГХ исследовании биоптатов эутопического эндометрия у женщин с АМК в анамнезе и нарушением менструального цикла эндометриального генеза впоследствии, были установлены патогномоничные пределы чувствительности для обнаружения фиброза эндометрия, маркера плазматических клеток (CD138+), натуральных киллерных клеток (CD56+), В-лимфоцитов (CD20+), Т-лимфоцитов -хелперов (CD4+), цитотоксических Т лимфоцитов - супрессоров (CD8+), соотношение Т-лимфоцитов - хелперов к цитотоксическим Т лимфоцитам - супрессорам (CD4+/CD8+) (таблицы 4, 5), а также оценена распространенность снижения клеточного иммунитета эндометрия в подгруппах выраженности ХЭ (таблица 6).

Способ диагностики осуществляют следующим образом.

Проводится биопсия эндометрия или гистероскопия, раздельное диагностическое выскабливание слизистой полости матки в среднюю стадию фазы пролиферации (на 7-11 дни 28-дневного менструального цикла) в спонтанном цикле, пайпель - биопсия эндометрия проводится с помощью одноразового аспирационного зонда - Rampipella. Полученный материал после гистологической проводки в автоматическом гистопроцессоре Leica ASP 30, заливают в парафин на станции Leica EG 1150 (Германия). На срезах толщиной 4-6 мкм проводят окраску гематоксилином и эозином и гистохимическую окраску по Маллори. ИГХ окрашивание производят в иммуностейнере Ventana BenchMark ULTRA IHC/ISH (США) на депарафинизированных и дегидратированных срезах толщиной 4-6 мкм с использованием авидин -биотинового иммунопероксидазного метода. Оценивают уровни экспрессии CD138+, CD56+, CD20+, CD4+, CD8+ в эндометрии и определяют в соответствие с описанными выше методиками. Производится подсчет процента позитивно-окрашенных клеток. Трактовка ИГХ реакции для описанных маркеров проводится путем сравнения полученных данных со следующими параметрами:

• если число CD138+клеток равно нулю, то вероятность наличия ХЭ минимальна - 0 баллов, если встречаются единичные позитивно-окрашенные клетки, то ХЭ слабо выражен - 1 балл, если 2-3 - умеренно выражен - 2 балла, если ≥4 - ХЭ выражен - 3 балла;

• если обнаруживается от 1 до 10 CD56+клеток, то вероятность наличия ХЭ минимальна - 0 баллов, если число клеток превышено в интервале от 11 до 20, то ХЭ слабо выражен - 1 балл, если число клеток превышено в интервале от 21 до 30- умеренно выражен -2 балла, если число клеток превышено в интервале от 31 и более - ХЭ выражен - 3 балла;

• если обнаруживается от 1 до 3 CD20+ клеток, то вероятность наличия ХЭ минимальна - 0 баллов, если число клеток превышено в интервале от 4 до 6, то ХЭ слабо выражен - 1 балл, если число клеток превышено в интервале от 7 до 9 - умеренно выражен - 2 балла, если число клеток превышено в интервале от 10 и более - ХЭ выражен - 3 балла;

• если обнаруживается от 1 до 10 CD4+ клеток, то вероятность наличия ХЭ минимальна - 0 баллов, если число клеток превышено в интервале от 11 до 20, то ХЭ слабо выражен - 1 балл, если число клеток превышено в интервале от 21 до 30- умеренно выражен -2 балла, если число клеток превышено в интервале от 31 и более

- ХЭ выражен - 3 балла;

• если обнаруживается от 1 до 10 CD8+ клеток, то вероятность наличия ХЭ минимальна - 0 баллов, если число клеток превышено в интервале от 11 до 20, то ХЭ слабо выражен - 1 балл, если число клеток превышено в интервале от 21 до 30- умеренно выражен -2 балла, если число клеток превышено в интервале от 31 и более - ХЭ выражен - 3 балла;

• если соотношение уровней экспрессии маркеров CD4+/CD8+ в эндометрии менее 1,5 - наблюдается снижение клеточного иммунитета эндометрия - 2 балла, если соотношение более 2,5 - наблюдается гиперреактивный клеточный иммунитет эндометрия - 1 балл.

• Отсутствие фиброза - вероятность наличия ХЭ минимальна, низкий риск нарушения клеточного иммунитета; выраженный фиброз эндометрия - ХЭ выражен, высокий риск нарушения клеточного иммунитета. Оценка на наличие фиброза эндометрия: отсутствие фиброза - 0 баллов; есть фиброз - 1 балл.

Таким образом, для определения выраженности ХЭ проводят подсчет полученных баллов по маркерам CD138+, CD56+, CD20+, CD4+, CD8+ и CD4+7 CD8+ в эндометрии и делаются следующие заключения:

• 15 и более баллов - выраженный ХЭ;

• 9-14 баллов - умеренно выраженный ХЭ;

• 5-8 баллов - слабо выраженный ХЭ;

• 0-4 баллов - ХЭ мало вероятен.

Далее с целью оценки состоятельности клеточного иммунитета сопоставляется соотношение маркеров CD4+/CD8+ в эндометрии и наличие фиброза:

• соотношение маркеров CD4+/CD8+ в эндометрии менее 1,5 - снижение клеточного иммунитета эндометрия;

• соотношение маркеров CD4+/CD8+ в эндометрии равно 2,5 и более - гиперреактивный клеточный иммунитет эндометрия;

• фиброза эндометрия нет - низкий риск нарушения клеточного иммунитета эндометрия;

• фиброз эндометрия есть - умеренный и высокий риск нарушения клеточного иммунитета эндометрия;

В данном способе под интервалом понимается весь диапазон значений. Например, если обнаруживается от 1 до 10, то имеются в виду все значения, от 1 до 10 включительно.

Осуществление изобретения

Клинический пример 1.

Пациентка С. 23 лет, обратилась с жалобами на межменструальные кровяные выделения до 7 дней в течение 6 месяцев, из анамнеза - эпизод аномального маточного кровотечения 1 год назад. Гарднереллез, уреаплазмоз - пролечен в 2020 г., 2021 г., 2022 г. дважды. Эндометриопатии в анамнезе нет. Беременностей не было. Диагноз: Аномальное маточное кровотечение в анамнезе, нарушение менструального цикла. С целью дифференциальной диагностики был проведен ряд исследований - гормональные исследования крови - в пределах референсных значений, в генетическом исследовании крови на мутации системы гемостаза нарушений не выявлено, по данным УЗИ органов малого таза патологии в полости матки не выявлено. Произведена пайпель-биопсия эндометрия на 8 день 28-дневного менструального цикла.

На основании проведенного комплексного патологоанатомического исследования, включавшего гистологическую окраску гематоксилином и эозином, окраску по Маллори с последующим ИГХ исследованием, были получены следующие данные: CD138+ = 6 клеток - 3 балла; значение CD56+ составляет 82 клетки - 3 балла, значение CD20+ составляет 55 клеток - 3 балла, значение CD4+ составляет 63 клетки - 3 балла, значение CD8+составляет 76 клеток - 3 балла. Наличие фиброза эндометрия при окрашивании по Маллори определяется - 1 балл. Соотношение уровней экспрессии маркеров CD4+/CD8+ в эндометрии составляет менее 1,5 - наблюдается снижение клеточного иммунитета эндометрия - 2 балла.

Сумма баллов составила 18, что свидетельствует о выраженном ХЭ.

Клинический пример 2.

Пациентка Т. 32 лет, обратилась с жалобами на посткоитальные кровотечения в течение 8 месяцев, ранее в анамнезе аномальное маточное кровотечение в 30 лет. Гинекологические заболевания: эксцизия шейки матки по поводу CIN II 2018 г. Беременностей не было. ВМС в течение 5 лет с целью контрацепции (2017-2022 г.г.). Эндометриопатией ранее не страдала. С целью дифференциальной диагностики был проведен ряд исследований - гормональные исследования крови - в пределах референсных значений, в генетическом исследовании крови на мутации системы гемостаза нарушений не выявлено, по данным УЗИ органов малого таза патологии в полости матки не выявлено. Жидкостная цитология NILM. Произведена пайпель-биопсия эндометрия на 9 день 28-дневного менструального цикла.

На основании проведенного комплексного патологоанатомического исследования, включавшего гистологическую окраску гематоксилином и эозином, окраску по Маллори с последующим ИГХ исследованием, были получены следующие данные: CD138+ = 3 клетки - 2 балла; значение CD56+ составляет 24 клетки - 2 балла, значение CD20+ составляет 9 клеток - 2 балла, значение CD4+ составляет 23 клетки - 2 балла, значение CD8+ составляет 27 клеток - 2 балла. Наличие фиброза эндометрия при окрашивании по Маллори определяется - 1 балл. Соотношение уровней экспрессии маркеров CD4+/CD8+ в эндометрии менее 1,5 - наблюдается снижение клеточного иммунитета эндометрия - 2 балла.

Сумма баллов составила 13, что свидетельствует об умеренно-выраженном ХЭ.

Клинический пример 3.

Пациентка Ж., 27 лет, обратилась с жалобами на посткоитальные кровотечения в течение 6 месяцев, ранее в анамнезе аномальное маточное кровотечение в 26 лет. Гинекологические заболевания: Хламидиоз пролечен в 2019 г. Беременностей не было. Эндометриопатии не обнаружено. С целью дифференциальной диагностики был проведен ряд исследований - гормональные исследования крови - в пределах референсных значений, в генетическом исследовании крови на мутации системы гемостаза нарушений не выявлено, по данным УЗИ органов малого таза патологии в полости матки не выявлено. Жидкостная цитология NILM. Произведена пайпель-биопсия эндометрия на 9 день 28-дневного менструального цикла.

На основании проведенного комплексного патологоанатомического исследования, включавшего гистологическую окраску гематоксилином и эозином, окраску по Маллори с последующим ИГХ исследованием, были получены следующие данные: CD138+ = 1 клетка - 1 балл; значение CD56+ составляет 15 клеток - 1 балл, значение CD20+ составляет 6 клеток - 1 балл, значение CD4+ составляет 29 клеток - 2 балла, значение CD8+ составляет 11 клеток - 1 балл. Наличие фиброза эндометрия при окрашивании по Маллори определяется - 1 балл. Соотношение уровней экспрессии маркеров CD4+/CD8+ в эндометрии равно 2,6 - наблюдается гиперреактивный клеточный иммунитет эндометрия - 1 балл.

Сумма баллов составила 8, что свидетельствует о слабо-выраженном ХЭ.

Клинический пример 4.

Пациентка В., 25 лет, обратилась с жалобами на посткоитальные кровотечения в течение 5 месяцев, ранее в анамнезе аномальное маточное кровотечение в 24 года. Гинекологические заболевания: Уреаплазмоз пролечен в 2017 г., 2018 г. Беременностей не было. Эндометриопатии в анамнезе нет. С целью дифференциальной диагностики был проведен ряд исследований - гормональные исследования крови - в пределах референсных значений, в генетическом исследовании крови на мутации системы гемостаза нарушений не выявлено, по данным УЗИ органов малого таза патологии в полости матки не выявлено. Жидкостная цитология NILM. Произведена пайпель-биопсия эндометрия на 9 день 28-дневного менструального цикла.

На основании проведенного комплексного патологоанатомического исследования, включавшего гистологическую окраску гематоксилином и эозином, окраску по Маллори с последующим ИГХ исследованием, были получены следующие данные: CD138+ = не обнаружено - 0 баллов; значение CD56+ составляет 15 клеток - 1 балл, значение CD20+ составляет 3 клетки - 0 баллов, количество CD4+ составляет 11 клеток - 1 балл, значение CD8+ составляет 9 клеток - 0 баллов. Наличие фиброза эндометрия при окрашивании по Маллори не определяется - 0 баллов. Соотношение уровней экспрессии маркеров CD4+/CD8+ в эндометрии менее 1,5 -наблюдается снижение клеточного иммунитета эндометрия - 2 балла.

Сумма баллов составила 4, ХЭ маловероятен, присутствует нарушение клеточного иммунитета эндометрия.

Источники информации:

1. Толибова Г.Х., Траль Т.Г., Клещев М.А. и др. Эндометриальная дисфункция: алгоритм гистологического и иммуногистохимического исследования. Журн. акушерства и женских болезней.- 2015; 64 (4): 69-77.

2. Радзинский В.Е., Петров Ю.А., Полина М.Л. Хронический эндометрит: современные аспекты // Кубанский научный медицинский вестник. - 2017; No 24 (5). С.69-74.

3. Оразов М.Р., Михалева Л.М, Семенов П.А. Хронический эндометрит: патогенез, диагностика, лечение и его связь с бесплодием//Клиническая и экспериментальная морфология. - 2020; 9 (2): 16-25. DOI: 10.31088/СЕМ2020.9.2.16-25.

4. Puente Е, Alonso L, Lagana AS, Ghezzi F, Casarin J, Carugno// J. Chronic endometritis: old problem, novel insights and future challenges. Int JFertil Steril. -2020; 13(4):250-6. DOI: 10.22074/ijfs.2020.5779.

5. Cherng Sh., Young J., Ma H. // The Journal of AmericanTScience. - 2008; Vol.4 (4). - P. 7-9.

6. Kimura F, Takebayashi A, Ishida M, et al. Review: Chronic endometritis and its effect on reproduction// J Obstet Gynaecol Res. -2019, May; 45(5):951-960. doi: 10.111 l/jog.13937. Epub 2019 Mar 6.

7. Creus M., Ordi J. The effect of different hormone therapies on integrin expression and pinopode formation in the human endometrium: a controlled study //Hum. Reprod. - 2003; Vol.18. - P. 683-693.

8. Haouzi D., Mahmoud K., Fourar M. Identification of new biomarkers of human endometrial receptivity in the natural cycle // Hum. Reprod. - 2009; Vol.24, №1.-P. 198-205.

9. Толибова Г.Х., Траль Т.Г., Айламазян Э.К., Коган И.Ю. Молекулярные механизмы циклической трансформации эндометрия// Журн. акушерства и женских болезней. - 2019; 68 (1): 5-12.

10. Song D, Feng X, Zhang Q, et al. Prevalence and confounders of chronic endometritis in premenopausal women with abnormal bleeding or reproductive failure// Reprod Biomed Online.- 2018; 36:78-83. DOI: 10.1016/j.rbmo.2017.09.008.

11. Zargar M, Ghafourian M Nikbakht R, et al. Evaluating Chronic Endometritis in Women with Recurrent Implantation Failure and Recurrent Pregnancy Loss by Hysteroscopy and Immunohistochemistry// J Minim Invasive Gynecol. - 2020; 27(1):116-121. DOI: 10.1016/j.jmig.2019.02.016.

12. Kitaya K, Matsubayashi H, Yamaguchi K, Nishiyama R, Takaya Y, Ishikawa T et al. Chronic endometritis: potential cause of infertility and obstetric and neonatal complications// Am J Reprod Immunol. - 2016; 75(1): 13-22. DOI: 10.1111/aji. 12438.

13. Wu D, Kimura F, Zheng L et al. Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells// Reprod Biol Endocrinol.- 2017; 15: 16.

14. Fan X, Li X, Li Y, Liao J, Chen H, Li Y, Lu GX, Lin G, Gong F. Endometrial CD 138 count appears to be a negative prognostic indicator for patients who have experienced previous embryo transfer failure// Fertil Steril. - 2019 Dec;l 12(6):1103-1111. DOI: 10.1016/j.fertnstert.2019.08.006.

15. Тамазян Г.В., Серова О.Ф., Лазарев А.П., Болтовская М.Н., Милованов А.П., Седая Л.В., Шутикова Н.В. Оптимизация тактики ведения пациенток в программе экстракорпорального оплодотворения// Эффективная фармакотерапия.- 2014; №38.- С.18-23.

16. Mikhaleva L., Mikhalev S., Boltovskay M., Starosvetskaya N. Evalyation of cyclic glicodelin production in endometrium of patients with chronic endometritis /. //27th European Congress of Pathology, 5-9 September 2015, Sava Centar, Belgrad, Serbia, Virkhows Archiv, European Journal of Pathology. - 2015; Vol.467, Supplement 1. - P.134.

17. Савельева Г.М., Михалев С.А., Коноплянников А.Г., Михалева Л.М., Бабиченко И.И., Болтовская М.Н. Хронический эндометрит - показание для прегравидарной подготовки //Клиническая практика. - 2018; Т.9. - №2. - С.36-41.

18. Михалева Л.М., Оразов М.Р., Силантьева Е.С., Камилова Д.П., Мидибер К.Ю., Орехов Р.Е. Повторные неудачи имплантации. Патогенез иммунологических нарушений в эндометрии// Gynecology. Vol.21. - 2022. - №1 - - С.22-26. DOI: 10.31550/1727-2378-2022-21-1-21-26.

Изобретение относится к области медицины и касается способа определения степени выраженности хронического эндометрита (ХЭ). Проводят биопсию эндометрия или гистероскопию, диагностическое выскабливание слизистой полости матки в среднюю стадию фазы пролиферации - на 7-11 дни 28-дневного менструального цикла в спонтанном цикле. Осуществляют пайпель-биопсию эндометрия с помощью одноразового аспирационного зонда. Полученный материал после гистологической проводки в автоматическом гистопроцессоре заливают в парафин, затем на срезах толщиной 4-6 мкм проводят окраску гематоксилином и эозином и гистохимическую окраску по Маллори. Проводят иммуногистохимическое окрашивание на депарафинизированных и дегидратированных срезах с использованием авидин-биотинового иммунопероксидазного метода. Определяют уровни экспрессии CD138+, CD56+, CD20+, CD4+, CD8+ в эндометрии. Производят подсчет процента позитивно окрашенных клеток с присвоением баллов, при этом проводят оценку иммуногистохимической реакции. Далее оценивают состоятельность клеточного иммунитета по соотношению маркеров CD4+/CD8+ в эндометрии и наличию фиброза с присвоением баллов. Производят подсчет суммы полученных баллов и определяют выраженность ХЭ: при 15 и более баллах - выраженный ХЭ; при 9-14 баллах - умеренно выраженный ХЭ; при 5-8 баллах - слабовыраженный ХЭ, при 0-4 баллах - ХЭ маловероятен. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности верификации нарушения клеточного иммунитета и определения степени выраженности ХЭ, позволяющего прогнозировать положительный исход наступления и вынашивания беременности, у пациенток с АМК в анамнезе и с нарушением менструального цикла. 6 табл., 4 пр.

Способ определения степени выраженности хронического эндометрита (ХЭ), заключающийся в том, что проводят биопсию эндометрия или гистероскопию, диагностическое выскабливание слизистой полости матки в среднюю стадию фазы пролиферации - на 7-11 дни 28-дневного менструального цикла в спонтанном цикле, осуществляют пайпель-биопсию эндометрия с помощью одноразового аспирационного зонда, полученный материал после гистологической проводки в автоматическом гистопроцессоре заливают в парафин, затем на срезах толщиной 4-6 мкм проводят окраску гематоксилином и эозином и гистохимическую окраску по Маллори, проводят иммуногистохимическое окрашивание на депарафинизированных и дегидратированных срезах толщиной 4-6 мкм с использованием авидин-биотинового иммунопероксидазного метода, определяют уровни экспрессии CD138+, CD56+, CD20+, CD4+, CD8+ в эндометрии, производят подсчет процента позитивно окрашенных клеток, при этом проводят оценку иммуногистохимической реакции:

• если число CD138+ клеток равно нулю - 0 баллов; если встречаются единичные позитивно-окрашенные клетки - 1 балл; если 2-3 клетки - 2 балла; если клеток более или равно 4 - 3 балла;

• если число CD56+ клеток от 1 до 10 - 0 баллов; если число клеток от 11 до 20 - 1 балл; если число клеток от 21 до 30 - 2 балла; если число клеток от 31 и более - 3 балла;

• если число CD20+ клеток от 1 до 3 - 0 баллов; если число клеток от 4 до 6 - 1 балл; если число клеток от 7 до 9 - 2 балла; если число клеток от 10 и более - 3 балла;

• если число CD4+ клеток от 1 до 10 - 0 баллов; если число клеток от 11 до 20 - 1 балл; если число клеток от 21 до 30 - 2 балла; если число клеток от 31 и более - 3 балла;

• если число CD8+ клеток от 1 до 10 - 0 баллов; если число клеток от 11 до 20 - 1 балл; если число клеток от 21 до 30 - 2 балла; если число клеток от 31 и более - 3 балла;

далее оценивают состоятельность клеточного иммунитета по соотношению маркеров CD4+/CD8+ в эндометрии и наличию фиброза:

• если соотношение уровней экспрессии маркеров CD4+/CD8+ в эндометрии менее 1,5 - снижение клеточного иммунитета эндометрия - 2 балла; если соотношение более 2,5 - гиперреактивный клеточный иммунитет эндометрия - 1 балл;

• оценка на наличие фиброза эндометрия: отсутствие фиброза - 0 баллов; есть фиброз - 1 балл;

производят подсчет суммы полученных баллов и определяют выраженность ХЭ:

• при 15 и более баллах - выраженный ХЭ;

• при 9-14 баллах - умеренно выраженный ХЭ;

• при 5-8 баллах - слабовыраженный ХЭ

• при 0-4 баллах - ХЭ маловероятен.