СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДИАТОМОВОЙ ВОДОРОСЛИ CHAETOCEROS CALCITRANS - КОРМА ДЛЯ ЛИЧИНОК ГИГАНТСКОЙ УСТРИЦЫ CRASSOSTREA GIGAS Российский патент 2018 года по МПК A01K61/00 

Изобретение относится к марикультуре, точнее к биотехнологии микроводорослей, и может быть использовано при полупромышленном получении биомассы диатомовой водоросли Chaetoceros calcitrans.

Микроводоросли являются единственным полноценным кормом для личинок и спата двустворчатых моллюсков, выращиваемых в питомнике. Полупромышленное культивирование одноклеточных водорослей предусматривает получение их максимальных биомасс, используемых в качестве корма личинкам на разных стадиях развития и спата при подращивании в питомнике.

Диатомовая водоросль Chaetoceros calcitrans является хорошим кормовым объектом благодаря своим морфологическим и биохимическим характеристикам и поэтому широко используется в питомниках при выращивании двустворчатых моллюсков. Клетки водоросли цилиндрические, одиночные с хорошо развитыми щетинками, имеют тонкий панцирь; средняя длина клеток 9,2±0,43 мкм, ширина - 4,2±0,15 мкм, объем - 52,0±12,04 мкм³. Они легко заглатываются личинками двустворчатых моллюсков (мидий и устриц) и быстро перевариваются. Питательная ценность микроводоросли связана с высоким содержанием белка - 40,35%; липидов - 27,0%; углеводов - 21,32%.

Известен способ культивирования С. calcitrans [Kaspar Heinrich F., et. al. 2014], где в качестве культиваторов используют стеклянные бутыли (V=2-2,5 л), полиэтиленовые мешки (V=17 л) и резервуары больших объемов (V=100-500 л). Микроводоросль выращивают на питательной среде F/2, содержащей, г/л: NaNO₃ - 75; NaH₂PO₄⋅2Н₂O-5; Na₂SiO₃⋅9Н₂O - 30; FeCl₃⋅6Н₂O - 3,5; Na₂ЭДТА - 4,36; MnCl₂⋅4Н₂O - 1,8. При культивировании водоросли С. calcitrans в мешках (V=17 л) в полунепрерывном режиме на питательной среде F/2 при освещенности 2-5 клк максимальные концентрации клеток достигали 7,13×10⁶ кл/мл.

В питомнике IFREMER (Франция) [Helm et. al., 2004] при выращивании С. calcitrans в культиваторах V=2 л на среде F/2, концентрация клеток составляла 60×10³ кл/мл.

Общим недостатком приведенных способов является получение низких значений численности клеток и биомассы С. calcitrans, что существенно повлияет на темп роста личинок двустворчатых моллюсков. Личинкам необходимо будет профильтровать значительно больший объем морской воды, чтобы удовлетворить свои пищевые потребности. В результате энергетические затраты личинок увеличиваются, а темп роста и выживаемость снижаются. Вследствие этого продолжительность выращивания личинок увеличивается, что приведет к нерентабельности работы питомника (затраты человеческих ресурсов, электроэнергии, воды и т.д).

Известен способ подготовки кормов из микроводорослей для личинок дальневосточного трепанга (Патент RU 2 566672 С1), где в качестве корма используют микроводоросли Dunaliella salina и Chaetoceros muelleri. Способ заключается в одновременном культивировании микроводорослей на модифицированной питательной среде Уолна и Гольдберга при освещенности 30 клк, фотопериоде 18:6, температуре 22°C и периодическом перемешивании. Максимальная концентрации клеток диатомовой водоросли С. muelleri составляла 5,68×10⁶ кл/мл.

Недостатком данного способа является культивирование микроводорослей на питательных средах обедненных биогенными элементами и при высокой интенсивности света. При таких условиях культивирования адаптационный период культур значительно увеличивается, что экономически не целесообразно. Освещенность 30 клк способствует ингибированию ростовых процессов и частичной гибели клеток, что провоцирует развитие бактериоплактона в культуре, а такой корм, внесенный в выростные емкости, может привести к гибели личинок.

Наиболее близким к заявляемому по достигаемому техническому результату является способ [Krichnavaruk, et. al., 2005] выращивания микроводоросли в накопительном режиме в полиэтиленовых мешках (V=17 л) и колбах (V=2 л) на модифицированный питательной среде F/2 с двукратным увеличением концентраций диоксида кремния и фосфора, при интенсивности света 400 мкмоль фотонов м^-2 сек^-1 (≈56 клк). При таких условиях культивирования получены максимальные концентрации клеток 5,8×10⁶ кл/мл в колбах и 8,88×10⁶ кл./мл - в мешках.

Недостатками известного способа культивирования является получение низких значений численности клеток С. calcitrans при высокой интенсивности света (≈56 клк), что является экономически нерентабельно для питомников по выращиванию личинок гигантской устрицы.

Задачей изобретения Способ культивирования диатомовой водоросли Chaetoceros calcitrans - корма для личинок гигантской устрицы Crassostrea gigas является увеличение выхода биомассы водоросли путем модификации питательной среды и оптимизации условий культивирования.

Техническим результатом изобретения является получение полноценного корма и в достаточном количестве для личинок и спата моллюсков, выращиваемых в питомнике.

Поставленная задача и заявленный технический результат достигаются тем, что в способе культивирования диатомовой водоросли Chaetoceros calcitrans - корма для личинок гигантской устрицы Crassostrea gigas, включающем культивирование микроводоросли в накопительном режиме на питательной среде F/2, предусмотрены следующие отличия. Водоросль культивируют в течение 11 сут. при температуре 22-24°C, освещенности 10 клк, аэрации смесью воздуха и углекислого газа (2%). Кроме того, питательная среда F/2, приготовленная на стерильной морской воде соленостью , модифицируется, для чего содержание биогенных элементов пропорционально увеличивается до следующих значений, г/л: NaNO₃ - 600, NaH₂PO₄⋅2Н₂O - 40, FeCl₃⋅6Н₂O - 28, Na₂ЭДТА - 34,88, Na₂SiO₃⋅9Н₂O - 240, MnCl₂⋅4Н₂O - 1,8.

Изобретения поясняется иллюстрациями:

на Фиг. 1 - Динамика накопления биомассы микроводоросли Chaetoceros calcitrans на модифицированных питательных средах: 1 - среда 4F; 2 - среда Конвея;

на Фиг. 2 - Динамика роста личинок устрицы Crassostrea gigas при использовании в качестве корма микроводоросли Chaetoceros calcitrans, культивируемой на среде 4F (1) и среде Конвея (2).

В питомнике ИМБИ РАН в экспериментах для определения оптимальных условий культивирования микроводоросли С calcitrans использовались модифицированные питательные среды Конвея и Guillard F/2. Питательная среда F/2 является обедненной по многим биогенным элементам, поэтому их содержание было пропорционально увеличено до получения среды 4F. В среде Конвея увеличили концентрацию железа, т.к. его потребности в стандартной среде занижены и не достаточны для биосинтеза, что подтверждается низкими значениями биомассы водорослей (табл. 1).

Маточные растворы питательных сред готовили на дистиллированной воде. Рабочий раствор (т.е. питательная среда, на которой впоследствии культивировали водоросли) готовили на стерильной морской воде соленостью из расчета: на 1 л морской воды добавляли 1 мл маточного раствора питательной среды

Микроводоросль культивировали в накопительном режиме в колбах (V=2 л) при температуре 24°C, круглосуточном освещении 6 клк и постоянном барботаже воздухом. Максимальная концентрация клеток 18,41×10⁶ кл/мл получена на среде 4F, что почти в 18 раз больше, чем на модифицированной среде Конвея (табл. 2) и значительно больше, чем в других известных способах. Среднесуточный прирост клеток водоросли на среде 4 F и Конвея составлял 1,72 млн. кл.мл^-1сут^-1 и 0,03 млн. кл.мл^-1сут^-1 соответственно.

Для увеличения выхода биомассы микроводоросли С. calcitrans в питомнике ИМБИ РАН в качестве культиваторов использовали одноразовые полиэтиленовые мешки (V=20 л). Водоросль наращивали в накопительном режиме при температуре 22-24°C, освещенности 10 клк. и аэрации смесью воздуха и углекислого газа (2%) на питательной среде 4F и на среде Конвея. Динамика накопления биомассы микроводоросли С. calcitrans на модифицированных питательных средах показана на Фиг. 1. При таком режиме культивирования максимальная численность клеток и биомасса на питательной среде 4F также были значительно больше, чем на среде Конвея, и составляли соответственно 11,22×10⁶ кл/мл и 4,93 г/л (табл. 3). Максимальная продуктивность водоросли на модифицированной среде 4F наблюдалась на 5-6 сутки культивирования и составляла 3,9 г⋅л^-1⋅сут^-1.

Зависимость биомассы микроводоросли от содержания биогенов в среде 4F и Конвея определялась линейной функцией, при этом коэффициент детерминации R² составлял: 0,92 и 0,88 соответственно (Фиг. 1).

Накопительный режим культивирования позволил получить биомассу водоросли с максимальным содержанием липидов, необходимых личинкам на поздних стадиях развития и успешному прохождению метаморфоза.

Пример реализации способа

В питомнике ИМБИ РАН диатомовую водоросль С. calcitrans культивировали в полиэтиленовых мешках (V=20 л) в накопительном режиме на питательной среде 4F, приготовленной на стерильной морской воде соленостью , при следующих значениях компонентов среды, г/л: NaNO₃ - 600; NaH₂PO₄⋅2Н₂O - 40; FeCl₃⋅6Н₂O - 28; Na₂ЭДТА - 34,88; Na₂SiO₃⋅9Н₂O - 240; MnCl₂⋅4Н₂O - 1,8.

Водоросль культивировали при оптимальных условиях: температура 22-24°C, освещенность 10 клк, аэрация смесью воздуха и углекислого газа (2%). Максимальная численность клеток и биомасса получены на 11 сутки и составляли соответственно 11,22×10⁶ кл/мл и 4,93 г/л. Культура находилась на стационарной фазе роста и содержала максимальное количество липидов - 27,0%. Таким образом, продолжительность культивирования водоросли С. calcitrans в накопительном режиме составляла 11 суток.

При выращивании личинок и спата гигантской устрицы в питомнике микроводоросль С. calcitrans является основным кормом и входит в состав рациона на всех стадиях развития. Среднесуточный темп роста личинок гигантской устрицы, в рацион которых входила водоросль, культивируемая на среде 4F, был значительно выше (43,6 мкм сут^-1), чем на среде Конвея (25,2 мкм сут^-1). При этом личинки достигали максимальных размеров 385 мкм уже на 19 сутки выращивания. Когда личинок устриц кормили водорослью С. calcitrans, культивируемой на среде Конвея, максимального размера 392 мкм они достигали только на 23 сутки выращивания (Фиг. 2).

Таким образом, питательная среда 4F и предложенные условия выращивания при температуре 22-24°C и освещенности 10 клк. являются оптимальными при культивировании микроводоросли С. calcitrans в питомнике ИМБИ и способствуют максимальному накоплению биомассы водоросли. Использование водоросли в качестве корма для личинок гигантской устрицы способствовало их высокому темпу роста.

Источники информации

1. Ким Г.Н., Журба Е.К., Калинина Г.Г., Советкина А.С., Азьмука Т.М. Способ подготовки кормов из микроводорослей для личинок дальневосточного трепанга (Патент RU 2566672 С1, опубл.: 27.10.2015, бюл. №30)

2. Kaspar Heinrich F., Keys Elizabeth F., King Nick, Smith Kirsty F., Kesarcodi-Watson Aditya, Miller Matthew R. Continuous production of Chaetoceros calcitrans in a system suitable for commercial hatcheries // Aquaculture. - 2014. - V. - 420-421. - P. 1-9.

3. Krichnavaruk Sontaya, Loataweesup Worapannee, Powtongsook Sorawit, Pavasant Plasert. Optimal growth conditions and the cultivation of Chaetoceros calcitrans in airlift photobioreactor // Chemical Engineering Journal. - 2005. - V. 105, №3. - P. 91-98.

4. Helm Michael M., Bourne Neil. Hatchery culture of bivalves // A practical manual. FAO FISHERIES TECHNICAL PAPER, 2004. - 471 p.

Способ предусматривает культивирование водоросли в течение 11 суток при температура 22-24°C, освещенности 10 клк, аэрации смесью воздуха и углекислого газа (2%), на модифицированной питательной среде на основе стерильной морской воды. Содержание биогенных элементов пропорционально увеличивают до следующих значений, г/л: NaNO₃ 600, NaH₂PO₄⋅2Н₂O 40, FeCl₃⋅6Н₂O 28, Na₂ЭДТА 34,88, Na₂SiO₃⋅9Н₂O 240, MnCl₂⋅4Н₂O 1,8. Способ обеспечивает максимальное накопление биомассы водоросли. 3 табл., 2 ил.

Способ культивирования диатомовой водоросли Chaetoceros calcitrans - корма для личинок гигантской устрицы Crassostrea gigas, включающий культивирование микроводоросли в накопительном режиме на питательной среде F/2, отличающийся тем, что водоросль культивируют в течение 11 сут. при температура 22-24°С, освещенности 10 клк, аэрации смесью воздуха и углекислого газа (2%), на модифицированной питательной среде на основе стерильной морской воды соленостью 18, для чего содержание биогенных элементов пропорционально увеличивают до следующих значений, г/л:

NaNO₃ 600 NaH₂PO₄⋅2Н₂O 40 FeCl₃⋅6Н₂O 28 Na₂ЭДТА 34,88 Na₂SiO₃⋅9Н₂O 240 MnCl₂⋅4Н₂O 1,8