СПОСОБ ПОДДЕРЖАНИЯ В КУЛЬТУРЕ СПЕРМАТОГОНИЙ ТИПА А ХРЯКА: ВЫДЕЛЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ IN VITRO Российский патент 2018 года по МПК C12N5/00 C12N5/76 

Способ поддержания в культуре сперматогоний типа А хряка: выделение и культивирование in vitro

Изобретение относится к области клеточной биологии и биологии развития, в частности, к поддержанию сперматогоний типа А хряка in vitro, выделенных из тестикул хряков с высокой степенью очистки от других клеточных типов. Использование клеток Сертоли для совместного культивирования сперматогоний способствует процессу дифференцировки сперматогоний в направлении сперматогенеза и получению in vitro высокоспециализированных гамет хряка. Изобретение решает также задачу поддержания в культуре ранних половых клеток хряка без признаков дифференцировки. Может найти применение в сельскохозяйственной биотехнологии для получения трансгенных животных, сохранения генома редких, высокопродуктивных животных и в ветеринарной вирусологии.

Сперматогенез млекопитающих поддерживается немногочисленной популяцией сперматогониевых стволовых клеток (СпСК), представленных сперматогониями типа А (А₀ или A_s), которые располагаются на базальной мембране внутри семенных канальцев и обладают способностью к самообновлению и дифференцировке, что обеспечивает непрерывную продукцию спермиев в течение всей жизни взрослой особи (de Rooij D.G., Russell L.D. 2000. All you wanted to know about spermatogonia but were afraid to ask. J Androl. 21: 776-798). В последние годы мужские половые стволовые клетки (СК) снова привлекли внимание из-за разработки двух методологий. Во-первых, серией успешных экспериментов было показано, что СпСК у грызунов можно длительно поддерживать в культуре. Так, появились сообщения о культивировании сперматогоний мыши, крысы и хомяка, которые были названы линиями половых СК (Kanatsu-Shinohara М., Ogonuki N., Inoue K.. Miki Н., Ogura A., Toyokuni S., Shinohara Т.. 2003. Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells. Biol Reprod. 69: 612-616; Nagano M., Ryu B.Y., Brinster C.J., Avarbock M.R., Brinster R.L. 2003. Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro. Biol Reprod. 68: 2207-2214). Во-вторых, было установлено, что СпСК, которые находятся длительное время in vitro, при переносе в семенник реципиента с выключенным сперматогенезом, способны возобновить экзогенный сперматогенез (Brinster R.L., Zimmermann J.W. 1994. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. PNAS. 91: 11298-11302; Dobrinski I. 2005. Germ cell transplantation and testis tissue xenografting in domestic animals. Anim Reprod Sci. 89: 137-145).

Ценность этих исследований определяется не только их значением для изучения биологии СпСК, но и возможностью получения новых знаний, представляющих интерес для регенерации тканевой системы: преодоление мужского бесплодия, изучение последствий действия повреждающих факторов окружающей среды, радио- и химиотерапии. Выделение, культивирование, трансплантация СпСК млекопитающих открывают перспективы в исследованиях фундаментальных аспектов сперматогенеза. Создание линий половых СК позволит решить проблему сохранения редких и исчезающих видов животных. Разработка и оптимизация условий поддержания сперматогоний типа А хряка in vitro являются актуальными для сельскохозяйственной биотехнологии, и, в первую очередь, для создания трансгенных животных. Трансгенные свиньи представляют собой перспективный материал для решения многих медико-биологических проблем, в том числе могут рассматриваться как потенциальный источник тканей и органов для ксенотрансплантации человеку. Наличие стабильной культуры половых клеток хряка актуально для ветеринарной биотехнологии. Известно, что многие вирусы обладают тропизмом к половым клеткам. В связи с этим СпСК хряка представляют собой новую клеточную систему для вирусологических исследований. Однако линии половых СК хряка еще не созданы. Одной из причин этого является недостаточное знание условий культивирования сперматогоний типа А хряка и влияния различных факторов роста на половые клетки in vitro.

Несмотря на то, что эксперименты по выделению СпСК ведутся давно, следует заметить, что до сих пор существует проблема получения культур сперматогониевых клеток, в том числе сельскохозяйственных животных. Причин для этого несколько.

Одной из них является недостаточные знания о появлении сперматогоний в тестикулах хряков. Основным критерием классификации сперматогоний хряка в настоящее время является временной фактор, т.е. соответствие циклу семенного эпителия в яичке (Frankenhuis М.Т., Kramer М.F., de Rooij D.G. 1982. Spermatogenesis in the boar. The Veterinary Quarterly. 4: 57-61). В отличие от грызунов, в тестикулах хряков сперматогонии появляются позже, только к 2-месячному возрасту (Takagi Y., Talbot N.С, Rexroad С.Е. 1997. Identification of pig primordial germ cells by immunocytochemistry and lectin binding. Mol Reprod Dev. 46: 567-580). К сожалению, имеется недостаточно данных о стадиях и времени перехода гоноцитов в сперматогонии у этого вида животных. Основная серия работ по выделению сперматогоний хряка, на которых мы остановимся подробнее ниже, включает использование тестикул хряков более ранних возрастов (от 3 сут до 2 нед), что свидетельствует о попытках выделить гоноциты хряка. В работе Коржиковой (Коржикова С.В. Выделение, характеристика и трансплантация сперматогоний типа А хряка: Автореферат дис. канд. биол. наук. Дубровицы. 2002. 28 с.) впервые было установлено, что возраст хряков местной помесной породы в интервале 60-80 сут является оптимальным для получения обогащенной культуры сперматогоний типа А. Наши исследования, которые мы продолжили в данном направлении продемонстрировали, что эти показатели могут сильно варьировать. В семенниках 80 сут хряков уже обнаруживаются более дифференцированные формы сперматогоний и сперматоциты 1-го порядка. Самыми главными критериями, на наш взгляд, являются возраст животного и вес семенника с придатком. Поэтому для получения культур, обогащенных сперматогониями хряка типа А, мы предлагаем использовать тестикулы хряков более ранних возрастов с определенным весом.

Следующим важным моментом при получении культур клеток, представленных сперматогониями, является вопрос их очистки от соматических клеток. Известно, что СпСК в семеннике очень малое количество (около 1,33%). Основная популяция представлена клетками Сертоли, Лейдига, миоидными клетками, стромальными и гемопоэтическими клетками. В связи с этим получить очищенную популяцию ранних половых клеток сложно. В настоящий момент используют несколько способов такой очистки.

Разделение с помощью антител, меченных флуорохромами, используя флуоресцентно-активированный клеточный сортинг FACS (Shinohara Т., Orwig K.Е., Avarbock М.R. et al. Spermatogonial stem cell enrichment by multiparameter selection of mouse testis cells // PNAS USA. 2000. V. 97(15). P. 8346-8351; Herrid M., Davey R.J., Hutton K. et al. A comparison of methods for preparing enriched populations of bovine spermatogonia // Reproduction, Fertility and Development. 2009.V. 21(3). P. 393-399; Lo K.C., Brugh V.M., Parker I.M. et al. Isolation and enrichment of murine spermatogonial stem cells using rhodamine 123 mitochondrial dye // Biology of Reprod. 2005. V. 72(3). 767-771; Izadyar F., Spierenberg G.T., Creemers L.B. et al. Isolation and purification of type A spermatogonia from the bovine testis // Reproduction. 2002. V. 124. P. 85-94.64). К другому, не более перспективному способу относится метод магнитно-активированной клеточной сепарации (MACS), который использовали для очистки мышиных (Giuili G., Tomljenovic A., Labrecque N. et al. Murine spermatogonial stem cells: targeted transgene expression and purification in an active state // EMBO Reports. 2002. V. 3(8). P. 753-759], крысиных [Gassei K., Ehmcke J., Schlatt S.. Efficient enrichment of undifferentiated GFR alpha 1⁺ spermatogonia from immature rat testis by magnetic activated cell sorting // Cell and Tissue Research. 2009. V. 337(1). P. 177-183) и хомяковых ранних половых клеток (von Schonfeldt, Krishnamurthy Н., Foppiani L., et al. Magnetic cell sorting is a fast and effective method of enriching viable spermatogonia from djungarian hamster, mouse, and marmoset monkey testes // Biol of Reprod. 1999. V. 61(3). P. 582-589).

К недостаткам данных методов относится такое требование как оснащение лаборатории дорогим оборудованием, а именно, клеточным сортером и наличием панели Ат, которые также недешевые. Использование этих методов для сельскохозяйственных и диких животных невозможно из-за отсутствия специфичных Ат, которые бы можно было рассматривать в качестве маркеров ранних половых клеток - сперматогоний типа А.

Наиболее часто для очистки половых от соматических клеток используются методы разделения клеток в разных градиентах плотности веществ, таких как: фиколл, перколл, бычий сывороточный альбумин (БСА) и т.д..

В первом сообщении о выделении из тестикул 80-суточного хряка сперматогоний в 1999 г были использованы 2% и 4% градиенты плотности БСА для очистки сперматогоний от соматических клеток (Dirami G., Ravindranath N., Pursel V. et al. Effects of stem cell factor and granulocyte macrophagecolony stimulating factor on survival of porcine type a spermatogonia cultured in KSOM // Biology of Reprod 1999. V. 61(1). P. 225-230). Авторам удалось собрать за 90 сек 35 фракций, которые содержали различные типы клеток и получить, таким образом, клеточную популяцию, представленную на 95-98% сперматогониями типа А. Однако в полученных клетках была выявлена экспрессия гена, характерная для более поздних дифференцированных форм половых клеток хряка. Также БСА сложно и трудоемко готовить (из-за его растворимости) и поэтому в настоящий момент чаще используют перколл для создания различных градиентов с целью очистки половых клеток от соматических. Серией экспериментов было показано, что перколл не токсичен для ранних половых клеток разных видов животных: крыс, мышей (van Pelt A.M., Morena A.R., van Dissel-Emilian F.M., Boitani C., Gaemers I.C., de Rooij D.G. et al., 1996. Isolation of the synchronized A spermatogonia from adult vitamin A-deficient rat testes. Biol Reprod 55(2): 439-444), человека (Liu S., Tang Z., Xiong Т., Tang W.. 2011. Isolation and characterization of human spermatogonial stem cells. Reprod Biol Endocrinol. 9: 141-150), быка (Izadyar F., Spierenberg G.T., Creemers L.В., den Ouden K., de Rooij D.G. 2002. Isolation and purification of type A spermatogonia from the bovine testis. Reproduction. 124: 85-94), козла (Heidari В., Gifani M., Shirazi A., Zarnani A.H., Baradaran В., Naderi M.M. Behzadi В., Borjian-Boroujeni S., Sarvari A., Lakpour N., Akhondi M.M.. 2014. Enrichment of undifferentiation type A spermatogonia from goat testis using discontinuous Percoll density gradient an differential plating. Avicenta J Med Biotech. 6: 94-103) и свиньи (Marret С, Durand P. Culture of porcine spermatogonia: effects of purification of the germ cells, extracellular matrix and fetal calf serum on their survival and multiplication // Reprod Nutr Dev. 2000. V. 40. P. 305- 319.145). Применение перколла позволило авторам очистить сперматогенные стволовые клетки крыс, свиней, человека, собранных между 31-32%, 30-45% и 27-35% фракций перколла на 80±6%, 83,62% и 86,7%, соответственно. Очистку ранних половых клеток хряка (гоноцитов), выделенных из 5-10 сут возраста тестикул (Ландрас х Дюрок х Йоркширская пород) на перколле (15, 30, 45 и 60% градиентах) использовали и другие авторы (Han S.Y., Gupta М.K., Uhm S.J., Lee Н.Т. 2009. Isolation and in vitro culture of pig spermatogonial stem cell. Asian-Aust. J. Anim. Sci. 22: 187-193). В результате были собраны клетки между градиентами перколла 45-60%, которые были представлены гоноцитами свиньи на 95,9%, а клетки собранные между градиентами перколла 30-45% были представлены гоноцитами на 83,62%,.

Следующие способы очистки можно объединить в группу, где для очистки используется селекция по способности связываться с экстраклеточным матриксом, компонентами которого являются коллаген, фибронектин, ламинин, желатин (Rodriguez-Sosa J.R., Dobson H., Hahnel A. Isolation and transplantation of spermatogonia in sheep // Theriogenology. 2006 V. 66(9). P. 2091-2103; Herrid M., Davey R.J., Hutton K. et al. A comparison of methods for preparing enriched populations of bovine permatogonia // Reproduction, Fertility and Development. 2009. V. 21(3). P. 393-399; Luo J., Megee S., Rathi R. et al. Protein gene product 9.5 is a spermatogonia-specific marker in the pig testis: application to enrichment and culture of porcine spermatogonia // Molec Reprod and Develop. 2006. V.73(12). P. 1531-1540). Хотя они просты в исполнении, но степень очистки половых от соматических клеток при этом невысокая. Некоторые авторы пытаются комбинировать вышеперечисленные методы. Все это позволяет получить у сельскохозяйственных животных клеточную популяцию, обогащенную СпСК на 75%. Вследствие контаминации соматическими клетками такая культура в процессе культивирования подвергается селекции в результате чего половые клетки вытесняются соматическими.

Следующий важный этап, это подбор условий in vitro для поддержания в культуре сперматогоний хряка. Для этого используют различные методические подходы.

Первое сообщение о выделении сперматогоний типа А из яичек 80-ти суточного возраста Йоркширских хряков появилось в 1999 г. (Dirami G., Ravindranath N., Pursel V., Dym M. 1999. Effects of stem cell factor and granulocyte macrophage-colony stimulating factor on survival of porcine type A spermatogonia cultured in KSOM. Biol Reprod. 61: 225-230). Было показано, что среда KSOM, содержащая фактор стволовых клеток (SCF) и колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов, способствует выживанию и пролиферации типа А сперматогоний in vitro в течение 120 ч. Потом описали несколько факторов, которые влияют на сперматогонии хряка в культуре и показали, что сыворотка крови плодов коров (СКПК) и внеклеточный матрикс (ВКМ) играют важную роль в поддержании этих клеток in vitro (Marret С., Durand Ph. 2000. Culture of porcine spermatogonia:effects of purification of the germ cells, extracellular matrix and fetal calf serum on their survival and multiplication. Reprod. Nutr. Dev. 40: 305-319). Другие авторы (Luo J., Megee S., Rathi R., Dobrinski I. 2006. Protein gene product 9.5 is a spermatogonia-specific marker in the pig testis: application to enrichment and culture of porcine spermatogonia. Mol Reprod Dev. 73: 1531-1540) продемонстрировали возможность культивирования сперматогоний хряка более длительное время (до 2-х нед) в простой среде без дополнительных факторов. Сперматогонии хряка в культуре также изучались и в других работах (Савченкова И.П., Коржикова С.В., Костерева Н.В., Эрнст Л.К. 2006. Культивирование и трансплантация сперматогоний типа А хряков. Онтогенез. 37 (4): 292-300; Савченкова И.П., Викторова Е.В., Эрнст Л.К. 2011. Влияние ингибирующего активность дифференцировки, лейкемию (DIA/LIF) и глиального нейротрофического (GDNF) факторов на сперматогенные клетки хряка в культуре. Доклады РАСХН. 4: 47-50; Савченкова И.П., Полякова М.В., Викторова Е.В., Кулешов К.В. 2012. Длительное культивирование сперматогоний типа А хряка. Доклады РАСХН. 5: 46-49; Kuijk Е.W., Colenbrander В., Bernard R.A.J. 2009. The effects of growth factors on in vitro-cultured porcine testicular cells. Reproduction. 138: 721-731).

Считается, что ростовые факторы играют важную роль в поддержании сперматогониевых клеток (de Rooij D.G., Mizrak S.С. 2008. Deriving multipotent stem cells from mouse spermatogonial stem cells: a new tool for developmental and clinical research. Development. 135: 2207-2213). Среди них выделяют глиальный нейротрофический фактор (GDNF), фактор стволовых клеток (SCF), фактор, ингибирующий лейкемию (LIF), фактор роста фибробластов (FGF), фактор роста эпидермиса (EGF). Соматические клетки тестикул млекопитающих продуцируют многие из этих факторов. Паракринная регуляция осуществляется на уровне гонад и включает сеть взаимодействий между основными клетками семенника: клетками Сертоли, клетками Лейдига, перитубулярными мышечными клетками и половыми клетками, расположенными в семенном канальце и, возможно, клетками кровеносных сосудов. Согласно современным представлениям, регуляция самообновления и дифференцировки СпСК - сложный процесс, в котором важную роль играют клетки Сертоли. Они являются своеобразными медиаторами взаимодействий между соматическими и половыми клетками организма. Мы предлагаем способ поддержания в культуре сперматогоний типа А, который включает выделение их из тестикул хряка, очистку от соматических клеток и культивирование в разных условиях с целью получения как высокоспециализированных гамет, так и размножения ранних половых клеток без признаков дифференцировки in vitro, основанный на огромном опыте и результатах исследований, проводимых нами в этом направлении на протяжении многих лет. Это позволяет считать предложение заявителя соответствующим критерию «промышленная применимость».

В качестве прототипа был взят способ, описанный нами ранее [Савченкова И.П., Коржикова С.В., Костерева Н.В., Эрнст Л.К. 2006. Культивирование и трансплантация сперматогоний типа А хряков // Онтогенез. 37(4): 292-300]. Суть метода заключалась в выделении из семенников хряков 60-80 сут возраста сперматогоний типа А с последующей очисткой их от соматических клеток семенника по адгезии и краткосрочном культивировании на монослое мышиных эмбриональных фибробластов линии STO в среде, которая используется для культивирования эмбриональных стволовых клеток мыши.

Для получения культур сперматогенных клеток использовали семенники от неполовозрелых помесных хряков. Кастрацию животных проводили под местной анестезией. Для инфильтрационной анестезии подкожной клетчатки животных использовали 0,5%-ный, а для проводниковой анестезии семенных канатиков 2%-ный растворы новокаина. После декапсуляции тестикулы подвергались механической, а затем ферментативной обработкам. Отобранные 15-25 г семенника измельчали хирургическими ножницами на кусочки размером 1-2 мм, трехкратно промывали в физиологическом, а затем в фосфатно-солевом без ионов Са²⁺ и Mg²⁺ (ФСР) растворах, дополненными 2-кратным содержанием антибиотиков (100 мкг/мл стрептомицина и 200 МЕ/мл пенициллина). Промывание в ФСР сопровождали тщательным пипетированием и осаждением (250 g, 10 мин) клеток. Ферментативную обработку осуществляли с применением раствора (1 мг/мл) коллагеназы 1-го типа ("Sigma", США). Для очистки сперматогоний от других клеточных типов использовали методический прием, основанный на разных адгезивных способностях клеток (Савченкова И.П., Приданцева Т.А., Сергеев Н.И., Эрнст Л.К. 2000. Выделение примордиальных половых клеток из зародышей мышей и их очистка // Сельскохозяйственная биология. №2: 119-122.). После выделения клеточную суспензию культивирования (2-4 ч) в чашках, предварительно покрытых 0,1%-ным раствором желатина. Не прикрепившиеся клетки переносили в центрифужные пробирки и осаждали (200 g, 10 мин). Осадок ресуспендировали в ростовой среде и высевали в чашки на монослой соматических клеток, митоз которых был предварительно заблокирован митомицином С. В качестве фидерных слоев использовали перевиваемые эмбриональные фибробласты мыши линии STO и клетки Сертоли, выделенные из семенников 4 месячных хряков.

Основной средой для культивирования сперматогоний была среда ДМЕМ с 4,5 г/л глюкозы, 15% сыворотки крови плода коровы (СКПК), 0,1 мМ 2-меркаптоэтанола, 2 мМ α-глутамина, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 50 мкг/мл гентамицина.

Способ, взятый в качестве прототипа, позволял очистить сперматогонии от соматических клеток на 76% и получить культуру клеток обогащенную сперматогониями типа А хряка, а также поддерживать их в культуре в течение 7-10 сут без признаков дифференцировки на фидерном слое, представленном монослоем клеток линии STO (мышиные эмбриональные фибробласты). Без фидерного слоя сперматогонии сохраняли свою жизнеспособность только на протяжении 24-48 ч.

Изобретение решает задачу поддержания сперматогоний типа А хряка in vitro, выделенных из тестикул хряков с более высокой степенью очистки (99%) от других клеточных типов. Использование клеток Сертоли для совместного культивирования сперматогоний способствует процессу дифференцировки сперматогоний в направлении сперматогенеза и получению in vitro высокоспециализированных гамет хряка, таких как удлиненные сперматиды и спермин. Изобретение решает также задачу поддержания в культуре ранних половых клеток хряка без признаков дифференцировки длительное время (до 4-х месяцев). Способ быстрый, не дорогостоящий, легкий в исполнении и при повторе дает высокую воспроизводимость и безопасен.

Мы предлагаем способ, который отличается от прототипа на всех этапах

Во-первых, поскольку для культивирования важна степень очистки клеточной популяции (в данном случае половых клеток от соматических) с целью получения клеточной популяции, обогащенной сперматогониями типа А хряка, мы предложили использовать тестикулы хряков более ранних возрастов (50-60 сут после рождения). Это обусловлено тем, что ранее, в прототипе для подсчета клеток сперматогенного эпителия, в том числе клеток Сертоли и сперматогоний мы использовали метод исследования гистологических срезов семенников хряков. Несмотря на большое количество проанализированных срезов (более 280) нами не было обнаружено в семенниках 80 сут хряков наличие половых клеток на других этапах своего развития, вероятно, из-за того, что на срезах семенных канальцев сперматогенез строго компартментализирован в соответствии со стадийностью процесса в виде «волны» сперматогенеза вдоль семенного канальца. Каждый отдельный срез семенного канальца - одна из стадий сперматогенеза со строгим соответствием количества различных типов сперматогенных клеток. В настоящем исследовании для оценки состояния сперматогенеза использовали количественный цитоморфологический метод, который позволил рассчитать абсолютное число различных типов клеток, выделенных из семенников с высокой воспроизводимостью результатов. Цитоморфологический метод заключается в приготовлении мазков и окрашивании их по Романовскому-Гимзе. Абсолютное количество клеток сперматогенного эпителия в 1 г тестикулярной ткани вычисляется путем математических пропорций, с использованием абсолютного числа половых клеток хряка и клеток Сертоли. Полученные данные были статистически обработаны с использование U-критерия Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия при р<0,05.

С помощью цитологического количественного метода мы провели идентификацию клеточной популяции, данные которой представлены в таблице 1. Было установлено, что с увеличением возраста животного, у которых были взяты семенники, увеличивается вес семенника и общее количество клеток, как половых, так и соматических. Однако, при одинаковом количестве сперматогоний типа А в клеточной популяции, выделенной из семенников 70 и 80 сут возрастов выявляются более дифференцированные половые клетки: сперматогонии типа Б (1%) и 16 (%), соответственно. Кроме того, в клеточной популяции, выделенной из тестикул 80 сут хряков, обнаруживаются сперматоциты 1-го типа (5,5%) на этапе прелептотенных преобразований хроматина. В ядрах таких клеток отчетливо прослеживаются хроматиновые глыбки неправильной формы, соединенные между собой тонкими волокнами, присутствие которых является одним из основных признаков, четко отличающих этап прелептотенной конденсации (спирализации) хромосом от метафазных митотических хромосом. Как видно из результатов, представленных в таблице, максимальное число сперматогоний типа А по отношению к общему числу выделяемых клеток из тестикул хряка, является 50 сут после рождения. Вес семенника с придатком при этом составляет 20 г. Также было отмечено, что у некоторых животных в возрасте 60 сут вес семенника составлял 30 г. В таких семенниках обнаруживались более дифференцированные половые клетки (1,3% сперматогонии типа Б). В связи с этим, мы предлагаем учитывать не только возраст животного, но и вес семенника перед выделением сперматогоний.

Следующий параметр, который отличает наш способ от прототипа, является применение для разделения половых клеток от соматических комбинированного метода. На фигуре представлен сравнительный анализ степени очистки сперматогоний типа А от других клеточных типов посредством разных методов разделения.

Примечание. Различия статистически достоверны (р<0,05)

И последнее отличие от прототипа, эта же клеточная суспензия может представлять источник для получения клеток Сертоли хряка, которые необходимы для поддержания сперматогоний хряка в культуре с целью получения более дифференцированных гамет. Мы впервые обнаружили на клетках Сертоли наличие липидного пузырька, который можно окрасить специфическим красителем жировым красным О. Это метод, в отличие от используемых на сегодняшний день прост, не требует наличия дорогих и специфичных Ат.

Для решения первой части поставленной задачи в способе выделения сперматогоний типа А и клеток Сертоли из тестикул хряка 50-60 сут возрастов весом не более 25 г с придатком, включающем измельчение и ферментативную обработку тканей раствором коллагеназы 1-го типа (конечная концентрация 1 мг/мл) в среде Игла в модификации Дюльбекко (ДМЕМ), с последующей последовательной фильтрацией полученной суспензии через нейлоновые ситечки 80 и 40 мкм, предлагается разделение полученной клеточной суспензии в градиентах разной плотности перколла с последующей дополнительной очисткой по адгезивным способностям клеток на желатине.

Способ осуществляют следующим образом:

Тестикулы неполовозрелых местных помесных хряков (50-60 сут возрастов), получают кастрацией животных, которую проводят под местной анестезией. Для инфильтрационной анестезии подкожной клетчатки животных используется 0.5%-ный, а для проводниковой анестезии семенных канатиков 2%-ный раствор новокаина. После кастрации семенники в холодном (4°С) ФСР с антибиотиками (стрептомицин и пенициллин в конечной концентрации 100 мкг/мл и 100 ед/мл, соответственно), транспортируются в лабораторию. После макроскопической оценки и взвешивания семенники (вес семенников должен быть в пределах 20-25 г) их обрабатывают 70% спиртом и декапсулируют.

Выделение и очистка сперматогоний. После декапсуляции ткань семенника дважды промывают в физиологическом растворе с двойной дозой антибиотика (стрептомицин и пенициллин в конечной концентрации 100 мкг/мл и 100 ед/мл, соответственно) и механически измельчают до кусочков размером 1-2 мм, вновь трижды промывают в ФСР путем осаждения клеток (500 g, 5 мин). Затем полученные кусочки ткани обрабатывают ферментативно в течение 40 мин при 37°С раствором коллагеназы I типа (Gibco, Invitrogene, Life Technologies, США). Конечная концентрация коллагеназы на основе среды ДМЕМ (Gibco, Invitrogene, Life Technologies, США) составляет 1 мг/мл. Действие коллагеназы нейтрализуют эквивалентным объемом среды ДМЕМ, которая содержит 5% СКПК (FBS, HyClone, Perbio, Бельгия). Клетки осаждают высокоскоростным центрифугированием при 1000 g в течение 10 мин. К осадку добавляют ДМЕМ, тщательно разбивают до получения однородной клеточной суспензии, а затем пропускают последовательно через нейлоновые ситечки с размером пор 80 и 40 мкм для удаления соматических клеток. После фильтрации очищенные клетки осаждают центрифугированием (300 g, 5 мин)

Далее очистку сперматогоний выполняют, используя разные градиенты перколла. Для этого предварительно перколл разбавляют ФСР для получения его в разных концентрациях: 19, 27, 35 и 43%. Перколл (2 мл каждой в концентрации) вносится последовательно на дно 15-миллилитровой стерильной центрифужной пробирки (от более высокой концентрации к низкой). Клеточную суспензию наслаивают осторожно на верхний слой градиента перколла и осаждают центрифугированием (800 g, 30 мин). Клетки собирают между градиентами перколла 27 и 35%, промывают дважды ФСР, разбавляют в ростовой среде и высевают в чашки Петри, предварительно покрытые 0,1% раствором желатина, в плотности 3⋅10⁴/см² и культивируют при 37°С и 5% СО₂.

Основной средой для культивирования сперматогоний на этом этапе является среда ДМЕМ с 4.5 г/л глюкозы, 10% СКПК, 50 мкг/мл стрептомицина и 50 Ед./мл пенициллина (в конечной концентрации).

После непродолжительного культивирования (2 ч) в чашках Петри, покрытых 0.1%-ным раствором желатина, не прикрепившиеся клетки переносят в центрифужные пробирки и осаждают (200 g, 10 мин). Очищенные клетки, обогащенные сперматогониями на этом этапе можно замораживать или культивировать. Для подтверждения отсутствия в полученной клеточной популяции клеток крови, часть клеток после очистки окрашивают поликлональными антителами против CD45. В качестве вторых антител испольуют меченные пероксидазой анти-кроличьи IgG (Becton Dickinson, США) в разведении 1:50. Клетки оценивают с помощью фазово-контрастного микроскопирования на микроскопе.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры:

Пример 1

Семенники 50-60-сут хряков местной помесной породы (крупная белая х Ландрас) получают кастрацией животных, которую проводят под местной анестезией. Для инфильтрационной анестезии подкожной клетчатки животных используется 0.5%-ный, а для проводниковой анестезии семенных канатиков 2%-ный раствор новокаина. После кастрации семенники в холодном (4°С) ФСР с антибиотиками, транспортируются в лабораторию. После макроскопической оценки и взвешивания (вес яичек с придатком составлял не больше чем 25 г) семенники промывают трижды и удаляют оболочки. Семенники весом более 25 г выбраковывают.

После удаления ФСР к осадку добавляют раствор коллагеназы 1-го типа в ДМЕМ (конечная концентрация 1 мг/мл) и инкубируют в течение 40 мин при 37°С. Клеточную массу энергично перемешивают периодически. После нейтрализации коллагеназы средой ДМЕМ, которая содержит 5% СПК, клетки осаждают (1000 g, 10 мин).

Надосадочную жидкость сливают, а к образовавшемуся осадку добавляют ростовую среду, которая представляет собой ДМЕМ с 10%-ми СКПК, 2х-ным раствором незаменимых аминокислот и антибиотиками (в конечной концентрации 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина), и тщательно перемешивают. Процедуру повторяют 2 раза

Полученную клеточную суспензию фильтруют последовательно через нейлоновые ситечки с размером пор 80 мкм, а затем 40 мкм. После фильтрации очищенные клетки осаждают центрифугированием (300 g 5 мин).

К осажденным клеткам добавляют ростовую среду, перемешивают и наслаивают осторожно на верхний слой градиента перколла. 15 мл центрифужные пробирки с разными градиентами перколла готовят предварительно. Для этого перколл разбавляют ФСР для получения его в разных концентрациях: 19, 27, 35 и 43%. Перколл (2 мл каждой в концентрации) вносится последовательно на дно 15-миллилитровой стерильной центрифужной пробирки (от более высокой концентрации к низкой). Клеточную суспензию наслаивают осторожно на верхний слой градиента перколла и осаждают центрифугированием (800 g, 30 мин). Клетки собирают между градиентами перколла 27 и 35%, промывают дважды ФСР, разбавляют в ростовой среде и высевают в чашки Петри, предварительно покрытые 0,1%-ным раствором желатина, в плотности 3⋅10⁴/см². Основной средой для культивирования сперматогоний на этом этапе среда ДМЕМ, содержащая 4.5 г/л глюкозы, 10% СКПК, 50 мкг/мл стрептомицина и 50 Ед./мл пенициллина (в конечной концентрации).

Далее для очистки полученных сперматогоний от других клеточных типов используют непродолжительное культивирование (2 ч) в чашках Петри, предварительно покрытых 0.1%-ным раствором желатина. Не прикрепившиеся клетки переносят в центрифужные пробирки и осаждают (200 g, 10 мин). Количество полученных клеток оценивают подсчетом в камере Горяева, и переносят в предварительно подготовленные чашки Петри с фидерными слоями для культивирования или замораживают.

Для подтверждения отсутствия в полученной клеточной популяции клеток крови, часть клеток после очистки окрашивают поликлональными антителами против CD45. В качестве вторых антител используют меченные пероксидазой анти-кроличьи IgG (Becton Dickinson, США) в разведении 1:50. Клетки оценивают с помощью фазово-контрастного микроскопирования на микроскопе Carl-Zeiss с программным обеспечением Axio Vision Rel. 4.8.

Выделение и очистка клеток Сертоли. Клетки Сертоли получают из этой же клеточной суспензии. Однако клетки Сертоли собирают между градиентами Перколла 19 и 27%. Для подтверждения фенотипа клеток Сертоли их окрашивают жировым красным О. Клетки фиксируют ледяным метанолом и окрашивают жировым красным О в течение 10-15 мин.

Пример 2

Семенники 50-60-сут хряков местной помесной породы (крупная белая х Ландрас) получают кастрацией животных, которую проводят под местной анестезией. Для инфильтрационной анестезии подкожной клетчатки животных используется 0.5%-ный, а для проводниковой анестезии семенных канатиков 2%-ный раствор новокаина. После кастрации семенники в холодном (4°С) ФСР с антибиотиками, транспортируются в лабораторию. После макроскопической оценки и взвешивания (вес яичек с придатком составлял не больше чем 25 г) семенники промывают трижды и удаляют оболочки. Семенники весом более 25 г выбраковывают.

После удаления ФСР к осадку добавляют раствор коллагеназы 1-го типа в ДМЕМ (конечная концентрация 1 мг/мл) и инкубируют в течение 40 мин при 37°С. Клеточную массу энергично перемешивают периодически. После нейтрализации коллагеназы средой ДМЕМ, которая содержит 5% СПК, клетки осаждают (1000 g, 10 мин).

Надосадочную жидкость сливают, а к образовавшемуся осадку добавляют ростовую среду, которая представляет собой ДМЕМ с 10%-ми СКПК, 2х-ным раствором незаменимых аминокислот и антибиотиками (100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина), и тщательно перемешивают. Процедуру повторяют 2 раза

Полученную клеточную суспензию фильтруют последовательно через нейлоновые ситечки с размером пор 80 мкм, а затем 40 мкм. После фильтрации очищенные клетки осаждают центрифугированием (300 g 5 мин).

К осажденным клеткам добавляют ростовую среду, перемешивают и наслаивают осторожно на верхний слой градиента перколла. 15 мл центрифужные пробирки с разными градиентами перколла готовят предварительно. Для этого перколл разбавляют ФСР для получения его в разных концентрациях: 19, 27, 35 и 43%. Перколл (2 мл каждой в концентрации) вносится последовательно на дно 15-миллилитровой стерильной центрифужной пробирки (от более высокой концентрации к низкой). Клеточную суспензию наслаивают осторожно на верхний слой градиента перколла и осаждают центрифугированием (800 g, 30 мин). Клетки собирают между градиентами перколла 19 и 27%, промывают дважды ФСР, разбавляют в ростовой среде и высевают в чашки Петри, предварительно покрытые 0,1%-ным раствором желатина, в плотности 3⋅10⁴/см². Основной средой для культивирования клеток Сертоли на этом этапе является среда ДМЕМ, содержащая 4.5 г/л глюкозы, 10% СКПК, 50 мкг/мл стрептомицина и 50 Ед./мл пенициллина (в конечной концентрации) (Gibco, США).

Клетки Сертоли непродолжительно культивируют (2 ч) в чашках Петри, предварительно покрытых 0.1%-ным раствором желатина. Не прикрепившиеся клетки переносят в стерильные новые чашки Петри, а к прикрепленным клеткам Сертоли добавляют новую ростовую среду и продолжают культивировать до образования монослоя. Когда клетки, достигнут монослоя (1-2 сут) их пересевают, размножают или замораживают. Количество полученных клеток оценивают подсчетом в камере Горяева и переносят во флаконы. Часть клеток окрашивают специфическим красителем. Клетки оценивают с помощью фазово-контрастного микрокопирования на микроскопе Carl-Zeiss с программным обеспечением Axio Vision Rel. 4.8.

Окраска липидов жировым красным О (Oil Red О):

0,5 г красителя Oil Red О (Sigma-Aldrich) вносят в 100 мл 98%-го изопропанола (исходный раствор). Перед окраской разводят 6 мл исходного раствора в 4 мл воды, оставляют на 24 час. Краситель фильтруют (бумагу Ватман №42) и применяют фильтрат для окраски немедленно. Клетки фиксируют ледяным метанолом (-20°С) в течение 5-6 мин, промывают 50%-ным этанолом (по объему) и окрашивают свежим профильтрованным раствором жирового красного в течение 10-15 мин при комнатной температуре. Избыток красителя удаляют 50%-ным этанолом. Затем клетки промывают дистиллированной водой, докрашивают гематоксилином в течение 1-2 мин и оценивают под микроскопом. Липиды окрашиваются в красный цвет.

Приготовление фидерных слоев для культивирования сперматогоний типа А хряка. Для приготовления фидерных слоев клетки Сертоли высевают в чашки Петри и инкубируют при 37°С и 5% СО₂. Когда клетки достигают 90% монослоя, их обрабатывают митомицином С (конечная концентрация 10 мкг/мл) в течение 3-х ч, затем трижды отмывают раствором ФСР и добавляют ростовую среду. На следующий день клетки Сертоли с заблокированным митозом используют для культивирования сперматогоний (также готовят фидерные слои из стромальных клеток, выделенных из костного мозга овец и свиней).

Способ решает основную задачу поддержания в культуре сперматогоний типа А хряка, с целью получения как высокоспециализированных гамет, так и недифференцированных сперматогониевых клеток хряка, отличающийся от прототипа тем, что культивирование in vitro сперматогоний типа А осуществляется на фидерных слоях, представленных клетками Сертоли или мезенхимными стромальными клетками в средах, дополненных на каждом этапе культивирования определенными факторами, которые препятствуют дифференцировке или ускоряют ее.

Способ осуществляется следующим образом. Для получения гомогенной популяции высокоспециализированных половых клеток требуется краткосрочное (12 сут) культивирование сперматогоний в среде (ДМЕМ с 4,5 г/л глюкозы, 10% СКПК и антибиотиками: стрептомицин и пенициллин в конечной концентрации 50 мкг/мл и 50 Ед./мл, соответственно) на фидерных слоях, представленных монослоями клеток Сертоли хряка (собранных на границе раздела фаз 27% и 35% перколла, и идентифицированных специфическим красителем Oil Red О) у которых предварительно блокируется митоз (обработка клеток Сертоли митомицином С в конечной концентрации 10 мкг/мл в течение 3 ч) без смены среды. На 12 сут такого культивирования образуются суспензионные клеточные кластеры. Сформированные суспензионные кластеры клеток переносят для культивирования на пластик (чашки Петри без фидерного слоя) и одновременно меняют питательную среду на ДМЕМ/F12 в соотношении 1:2, которую дополняют 3%-ми СКПК, антибиотиками (стрептомицин и пенициллин в конечной концентрации 50 мкг/мл и 50 Ед./мл, соответственно), 10%-ми сыворотки крови половозрелого хряка или же тестостероном (конечная концентрация 0,1 мкг/мл) и ретиноевой кислотой (в конечной концентрации 10 мкМ.

Примечание. Число удлиненных сперматид рассчитывали из 200 клеток в трех повторах.

Установлено (таблица 2), что такой способ поддержания сперматогоний хряка в культуре позволяет получить на 20 сут культивирования, при добавлении в среду тестостерона и ретиноевой кислоты, удлиненные сперматиды (91%), и на 33 сут спермин (89%).

Для поддержания сперматогониевых клеток без признаков дифференцировки требуется культивирование очищенных сперматогоний типа А на фидерных слоях, представленных монослоем стромальных клеток, выделенных из костного мозга свиньи или барана (с заблокированным митозом) с добавлением в основную среду ДМЕМ с 4,5 г/л глюкозы, содержащую 10% сыворотки крови плода коровы (СКПК), 2 мМ α-глутамина, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 50 мкг/мл стрептомицина и 50 Ед/мл пенициллина, 25% кондиционированной среды, собранной при культивировании клеток печени крысы линии BRL, которая продуцирует различные факторы в культуре, в том числе фактор, подавляющий дифференцировку (DIA).

В этих условиях формируются небольшие, округлые по форме, приплюснутые клеточные клоны, которые прочно прикрепляются к фидерному слою. В этих клонах обнаруживается продукт экспрессии (мРНК) генов Nanog и Plzf (ПЦР-РВ).

Данный способ культивирования позволяет получать колонии недифференцированных сперматогоний, которые можно пассировать и размножать до необходимого количества.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры:

Пример 3

Для получения высокоспециализированных гамет in vitro, очищенные сперматогонии хряка в плотности 3⋅10⁴ кл./см², высевают в чашки Петри (диаметр 6 мм) с монослоем клеток Сертоли, митоз которых предварительно заблокируют митомицином С, и культивируют при 37°С во влажной атмосфере 5% СО₂, без смены среды в течение 12 сут. Средой на этом этапе является среда ДМЕМ с 4,5 г/л глюкозы, 10% СКПК и антибиотиками: стрептомицин и пенициллин в конечной концентрации 50 мкг/мл и 50 Ед./мл, соответственно.

На 12 сут сформированные суспензионные кластеры клеток переносят для культивирования на пластик (чашки Петри без фидерного слоя) и одновременно меняют питательную среду на ДМЕМ/F12 в соотношении 1:2, которую дополняют 3%-ми СКПК, антибиотиками (стрептомицин и пенициллин в конечной концентрации 50 мкг/мл и 50 Ед./мл, соответственно), 10%-ми сыворотки крови половозрелого хряка или же тестостероном (конечная концентрация 0,1 мкг/мл) и ретиноевой кислотой (в конечной концентрации 10 мкМ).

Процесс формирования удлиненных сперматид наблюдается на 20 сут, а спермиев на 33 сут культивирования в этих условиях.

Такой способ позволяет получить гомогенную популяцию клеток, представленную высокоспециализированными гаметами хряка. На этом этапе клетки можно использовать для искусственного оплодотворения, проведения процедуры ИКСИ, и замораживать для сохранения генома.

Пример 4

Для получения сперматогониевых колоний с признаками стволовых, сперматогонии в плотности 3 10⁴ кл/см² высевают в чашки Петри, с предварительно приготовленными фидерными слоями, представленных монослоем стромальных клеток, выделенных из КМ свиньи или барана с добавлением в основную среду фактора, ингибирующего дифференцировку (DIA) в виде 25% кондиционированной среды клеток BRL. Фидерные слои готовят также как описано выше для клеток Сертоли.

Основной средой для культивирования сперматогоний на этом этапе является среда ДМЕМ с 4,5 г/л глюкозы, 10% сыворотки крови плода коровы (СКПК), 2 мМ α-глутамина, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 50 мкг/мл стрептомицина и 50 Ед/мл пенициллина.

Культивируют клетки со сменой среды каждые 4 сут. На 12 сут наблюдают формирование небольших, округлых по форме, клеточных колоний, которые прочно прикреплены к фидерному слою. В этих клонах выявляется (помощью ПЦР в реальном времении) мРНК генов, чья экспрессия характерна для половых стволовых клеток: Nanog, Plzf.

Полученные колонии размножают в культуре (субкультивируют в соотношении 1:5), в описанных нами условиях, длительное время без признаков дифференцировки до 4 месяцев.

Эти стабильные диплоидные клетки можно генетически трансформировать и использовать для получения трансгенных животных или хранить в жидком азоте длительное время при -196°С.

Преимущества перед другими способами

1. Заявляемый способ позволяет выделить из семенников хряка ранние диплоидные половые клетки сперматогонии типа А и очистить их на 99% от соматических клеток, присутствующих в семеннике. Способ позволяет из этой же клеточной суспензии получить гомогенную фракцию клеток, представленную клетками Сертоли, фенотип которых может быть подтвержден окраской жировым красным О. Эти гомогенные популяции клеток могут представлять ценность для проведения манипуляций in vitro (генетической трансформации, вирусной трансдукции, ИКСИ, ко-культивирование, а также криоконсервации с целью сохранения генома высокопродуктивных животных).

2. Заявляемый способ позволяет, с одной стороны, поддерживать в культуре длительное время сперматогонии хряка без признаков дифференцировки в виде колоний сперматогониевых клеток, в которых обнаруживается мРНК генов Nanog, Plzf, а с другой стороны, позволяет получить гомогенные не контаминированные другими клеточными типами высокоспециализированные гаметы для проведения манипуляций in vitro (генетической трансформации, вирусной трансдукции, ИКСИ, а также криоконсервации с целью сохранения генома высокопродуктивных животных).

Представленное изобретение относится к области клеточной биологии, в частности к выделению из семенников хряка ранних половых клеток сперматогоний типа А, очистке их на 99% от соматических клеток и поддержанию in vitro. Заявленный способ позволяет поддерживать в культуре длительное время сперматогоний хряка без признаков дифференцировки и получить гомогенную популяцию гамет, не контаминированную другими клеточными типами, для проведения манипуляций in vitro. Способ может быть использован в сельскохозяйственной биотехнологии для получения и сохранения редких животных, а также в ветеринарной вирусологии. 1 ил., 2 табл., 4 пр.

Способ поддержания в культуре сперматогоний типа А хряка: выделение и культивирование in vitro, включающий выделение из семенников хряков сперматогоний типа А, клеток Сертоли, их разделение, очистку от других клеточных типов и поддержание в культуре, отличающийся тем, что выделение производят из семенников хряков 50-60 сут возрастов (вес семенника с придатком 20-25 г) посредством механического измельчения ткани, затем ее ферментативной обработкой (раствором коллагеназы 1-го типа) с последующей фильтрацией через нейлоновые ситечки с размером пор 80 и 40 мкм соответственно, разделение клеток осуществляется в ступенчатых градиентах перколла 19, 27, 35 и 43%, при этом сперматогоний типа А хряка собирают на границе раздела фаз 27% и 35% перколла, а клетки Сертоли на границе раздела фаз 19% и 27% перколла с последующей очисткой половых от соматических клеток по адгезии посредством краткосрочного культивирования (2 часа) в чашках Петри, предварительно покрытых 0,1%-ным раствором желатина в питательной среде, а затем очищенные сперматогонии типа А краткосрочно культивируют без смены среды in vitro (12 сут) в культуральных флаконах с заранее приготовленными фидерными слоями, представленными монослоем клеток Сертоли хряка (собранных на границе раздела фаз 27% и 35% перколла и идентифицированных специфическим красителем Oil Red О) с заблокированным митозом, в среде ДМЕМ с 4,5 г/л глюкозы, 10% СКПК, антибиотиками (стрептомицин и пенициллин в конечной концентрации 50 мкг/мл и 50 Ед./мл, соответственно) с последующим переносом их в чашки Петри (без фидерного слоя) и одновременной сменой питательной среды на среду ДМЕМ/Р12 в соотношении 1:2, которую дополняют 3% СКПК, антибиотиками (в конечной концентрации 50 мкг/мл стрептомицина и 50 Ед/мл, соответственно), 10% сыворотки крови половозрелого хряка или тестостероном (конечная концентрация 0,1 мкг/мл) и ретиноевой кислотой (в конечной концентрации 10 мкМ) или же очищенные сперматогонии типа А сразу культивируют на фидерных слоях, представленных монослоем стромальных клеток, выделенных из костного мозга свиньи или барана (с заблокированным митозом) с добавлением в основную среду ДМЕМ с 4,5 г/л глюкозы, содержащую 10% сыворотки крови плода коровы (СКПК), 2 мМ α-глутамина, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 50 мкг/мл стрептомицина и 50 Ед/мл пенициллина, 25% кондиционированной среды, собранной при культивировании клеток печени крысы линии BRL.