Новые пептиды и их аналоги для применения при лечении мукозита полости рта Российский патент 2018 года по МПК C07K7/06 C07K5/11 A61K38/08 A61K38/07 A61P31/04 A61P1/02 

Родственные заявки

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №61/877767, поданной 13 сентября 2013 г., содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки.

Введение

Система врожденного иммунитета

Врожденный иммунный ответ представляет собой эволюционно закрепившуюся защитную систему, связанную с барьерами между тканями и внешней средой, такими как кожа, слизистая оболочка от полости рта до желудка и дыхательные пути. Обеспечивая быстрое распознавание и уничтожение проникших патогенов, а также ответ на повреждение клеток, врожденный иммунный ответ часто связан с воспалительными ответами и является ключевым участником активации приобретенного иммунитета. Врожденная защита запускается путем связывания патоген-ассоциированных и/или ассоциированных с повреждением молекул (РАМР, англ.: pathogen-associated molecular patterns или DAMP, англ.: danger-associated molecular patterns) с паттерн-распознающими рецепторами, включая Toll-подобные рецепторы ((TLR) англ.: Toll-like receptors). Паттерн-распознающие рецепторы обнаружены внутри и на поверхности многих типов клеток, расположенных по всему телу, как в циркулирующих, так и в тканевых резидентных компартментах, и служат для обеспечения ранних сигналов «опасности», которые приводят к высвобождению неспецифических антимикробных молекул, цитокинов, хемокинов, а также белков и пептидов для защиты организма-хозяина, а также к рекрутированию иммунных клеток (нейтрофилов, макрофагов, моноцитов) высоко организованным образом (Janeway 2002; Beutler 2003; Beutler 2004; Athman 2004; Tosi 2005; Doyle 2006; Foster 2007; Matzinger 2002). Кроме того, система врожденного иммунитета непосредственно участвует в выработке толерантности к комменсальной микробиоте в желудочно-кишечном тракте и в репарации и иммунной защите желудочно-кишечного тракта (Santaolalla, 2011; Molloy 2012).

Мукозит

Мукозит представляет собой клинический термин для обозначения повреждения слизистой оболочки, происходящего в результате противораковой терапии. Он может возникнуть на любом участке слизистой оболочки, но чаще всего возникает во рту, на втором месте - тонкий кишечник. Несмотря на то, что в клинической практике применяют множество шкал оценки тяжести мукозита, двумя наиболее часто применяемыми шкалами являются шкала, разработанная Национальным раковым институтом США (шкала NCI) и шкала ВОЗ.

Механизмы мукозита были тщательно изучены, и недавно была установлена его связь со взаимодействием химиотерапии и/или лучевой терапии с системой врожденного иммунитета (Sonis 2010). Бактериальное инфицирование язвенных поражений в настоящее время рассматривают как вторичное последствие нарушения регуляции локального воспаления, вызванного индуцированной лечением клеточной смертью, а не в качестве основной причины поражений. В США мукозит поражает 500000 человек в год и возникает у 40% пациентов, получающих химиотерапию. (Sonis 2010, Curr. Op.). Мукозит почти всегда возникает у пациентов с раком головы и шеи, которых подвергали лучевой терапии (>80% случаев тяжелого мукозита) (Elting et al. 2008). Мукозит часто встречается (40-100% случаев) у пациентов, подвергавшихся химиотерапии в высоких дозах и трансплантации стволовых клеток (ТСК), причем частота возникновения и тяжесть мукозита в значительной степени зависит от характера режима кондиционирования, применяемого для миелоаблации (Murphy 2007). В частности отмечено, что общепринятые химиотерапевтические препараты, 5-FU и иринотекан, вызывают мукозит, но он также возникает при применении более новых агентов, таких как ингибиторы mTOR и ингибиторы киназ (Mateus et al. 2009; Sankhala et al. 2009). Мукозит может серьезно ослаблять организм и вызывать инфекцию, сепсис, необходимость парентерального питания и наркотическую аналгезию. Повреждения кишечного тракта вызывают острую диарею. Эти симптомы могут ограничивать дозы и продолжительность лечения рака, что приводит к субоптимальным исходам лечения, включая снижение выживаемости. По оценкам, прямые и косвенные последствия мукозита добавляют примерно по 18 тысяч долларов к стоимости лечения каждого пациента, страдающего раком (Nonzee et al. 2008). Мукозит возникает через 3-12 недель после начала облучения или через 3-12 дней после начала химиотерапии и проходит через 2-3 недели при условии отсутствия дальнейшего проведения химиотерапии или лучевой терапии.

RIVPA (SEQ ID NO. 5) представляет собой регулятор врожденного иммунитета IDR (англ: innate defense regulator), новый класс коротких синтетических пептидов с новым механизмом действия. Разработанные для имитации одной из недавно открытых функций природных защитных пептидов слизистой оболочки, IDR не обладают непосредственной антибиотической активностью, но они модулируют реакции организма-хозяина, увеличивая выживаемость после инфицирования широким спектром грамотрицательных и грамположительных патогенов, а также ускоряя заживление повреждения тканей, возникшего в результате воздействия различных агентов, включая бактериальные патогены, травмы, а также химио- или лучевую терапию.

На основании данных доклинических испытаний, полученных на моделях индуцированного химиотерапией мукозита, индуцированного облучением мукозита, нейтропенической инфекции и колита, можно сделать вывод, что мукозит полости рта является показанием, для которого перспективно применение RIVPA (SEQ ID NO. 5) и других IDR. Так как лекарственное средство будут применять вскоре после химиотерапевтической инфузии или облучения, лекарственная форма RIVPA (SEQ ID NO. 5) для внутривенного введения хорошо подходит для назначения при мукозите. Результаты оценки эффективности, полученные для RIVPA (SEQ ID NO. 5) в ходе доклинических испытаний на моделях мукозита у мышей и хомяков, свидетельствуют о том, что введение данного лекарственного средства раз в три дня должно обеспечивать перекрытие «окна» мукозита количеством доз от семи до четырнадцати в зависимости от длительности воздействия химиотерапии или облучения.

Что касается рака молочной железы, ~20% пациентов, получающих АСТ-терапию, страдают язвенным мукозитом в течение их первого курса химиотерапии, но у ~70% этой группы пациентов будет язвенный мукозит во время их второго курса химиотерапии (Sonis 2010). Они представляют собой популяцию пациентов с «высоким риском», для которых будет благоприятным лечение RIVPA (SEQ ID NO. 5). В настоящее время не существует системных агентов, одобренных для улучшения состояния при мукозите в данной популяции.

Пациенты, подвергающиеся химиотерапии в высоких дозах и ТСК для лечения гематологических видов рака, представляют собой популяцию с подавленным иммунитетом, имеющую высокий риск инфицирования. При таком лечении высокие дозы химиотерапии (иногда в комбинации с облучением), «режим кондиционирования», применяют, чтобы убить большую часть раковых клеток. Такие лечебные дозы вызывали бы летальную миелосупрессию, если бы затем не вводили стволовые клетки (из костного мозга или крови) для восстановления клеток крови. В аутологичных трансплантатах для этой цели используют собственные стволовые клетки пациента, в то время как в аллогенных трансплантатах используют клетки совместимого здорового донора. Аутологичные трансплантаты чаще всего применяют при лечении множественной миеломы (ММ) и неходжкинской лимфомы (НХЛ). Аллогенные трансплантаты, как правило, применяют при лечении лейкозов, таких как острый миелоидный лейкоз (ОМЛ).

Что касается ТСК, до недавнего времени результатом всех разнообразных режимов химиотерапии, применяемых при кондиционировании, была относительно высокая доля мукозита полости рта (40-100%), и в большинстве медицинских центров США таких пациентов наблюдают в условиях стационара. Мукозит полости рта, связанный с облучением и/или химиотерапией при раке головы и шеи, является одной из основных проблем, при этом из 85% субъектов, страдающих мукозитом в какой-либо степени, у 42% присутствует мукозит 3 или 4 степени.

Острая лучевая болезнь

Острая лучевая болезнь (ОЛБ) представляет собой серьезное заболевание, возникающее при облучении всего тела (или большей его части) высокой дозой радиации, как правило, за короткий период времени. Многие выжившие после атомной бомбардировки Хиросимы и Нагасаки в 1940-х и многие из ликвидаторов аварии, первыми откликнувшиеся после аварии на Чернобыльской АЭС в 1986 году, заболели ОЛБ (CDC 2013).

У лиц, подвергнутых воздействию облучения, ОЛБ возникнет только в случае, если:

- доза облучения была высокой (дозы облучения при медицинских процедурах, таких как рентген грудной клетки, слишком малы для возникновения ОЛБ),

- радиация была проникающей (то есть была способна достигнуть внутренних органов),

- все тело человека, или большая его часть, получили дозу облучения, и

- облучение было получено за короткое время, обычно в течение нескольких минут.

Облучение индуцирует пропорциональное его дозе повреждение клеток и тканей млекопитающих. В случае малых доз повреждение может быть ограничено точечными мутациями в ДНК соматических клеток и/или клеток зародышевого пути, которые могут быть связаны с долгосрочными эффектами, такими как повышенный риск возникновения рака или врожденных пороков развития. В случае средних доз облучение индуцирует хромосомные нарушения, такие как разрывы и транслокации, что опять-таки увеличивает риск возникновения рака и врожденных дефектов, и, если они достаточно серьезные, приводит к гибели быстро делящихся клеток в течение нескольких часов после воздействия. В случае очень высоких доз облучение может вызывать денатурацию белков, приводящую к практически немедленной гибели клеток и тканей. Ткани с быстро делящимися клетками, которые наиболее часто бывают поражены умеренными дозами облучения, включают костный мозг, ткани желудочно-кишечного тракта и семенников. Воздействие радиации связано с тяжелыми последствиями, включая кожную сыпь и ожоги, недостаточность костного мозга, включая анемию, снижение количества лейкоцитов и тромбоцитопению, а также гастроинтестинальную токсичность, такую как диарея, и хроническими эффектами, такими как развитие опухолей, особенно сарком и лейкозов, а также врожденные пороки развития.

Первыми симптомами ОЛБ, как правило, являются тошнота, рвота и диарея. Эти симптомы возникают в период от нескольких минут до нескольких дней после облучения и будут сохраняться в течение периода от нескольких минут до нескольких дней, а также могут появляться и пропадать. Затем человек, как правило, выглядит и чувствует себя здоровым в течение короткого промежутка времени, после чего к нему или к ней возвращается болезнь снова с потерей аппетита, слабостью, лихорадкой, тошнотой, рвотой, диареей, а также, возможно, даже судорогами и комой. Эта стадия тяжелого нездоровья может длиться от нескольких часов до нескольких месяцев.

У людей с ОЛБ, как правило, также имеются некоторые повреждения кожи. Эти повреждения могут начинать проявляться в течение нескольких часов после воздействия и могут включать отек, зуд, покраснение кожи и потерю волос. Как и в случае с другими симптомами, кожа может зажить за короткий промежуток времени с последующим возобновлением отека, зуда и покраснения несколько дней или недель спустя. Полное излечение кожи может занимать от нескольких недель до нескольких лет в зависимости от дозы облучения, полученной кожей данного человека.

Проявления ОЛБ со стороны желудочно-кишечного тракта называют острой лучевой болезнью желудочно-кишечного тракта или ЖКТ-ОЛБ. ЖКТ-ОЛБ включает диарею, обезвоживание, энтеробактериальную инфекцию и, в тяжелых случаях, септический шок и смерть (Potten 1990). Как полагают, сопутствующая облучению ЖКТ-ОЛБ вызвана непосредственным повреждением стволовых клеток крипт Либеркюна, результатом которого становится прекращение митоза и смерть посредством механизмов апоптоза (Potten 1997а, Potten 1997b). Целостность слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта зависит от быстрой пролиферации пула плюрипотентных стволовых клеток на дне крипт (Brittan 2002, Gordon 1994, Potten 1997b). Таким образом, считают, что гибель стволовых клеток представляет собой критическое звено этого процесса, так как выживание стволовых клеток представляется достаточным для восстановления комплекса крипта-ворсинка (Potten 1990). Обновление кишечного эпителиального барьера зависит от активного компартмента стволовых клеток, аналогично системе кроветворения. Клоногенные клетки-предшественники кишечного комплекса крипта-ворсинка особенно чувствительны к воздействию ионизирующего облучения, в результате чего с увеличением дозы облучения клоногенные клетки крипты-ворсинки не могут воспроизводить достаточное количество клеток для восстановления ворсинок. Это приводит к притуплению и укорочению ворсинок и, в конечном итоге, их функциональной недееспособности, приводящей к снижению поглощения питательных веществ и барьерной функции, потере жидкости и электролитов, а также проникновению бактерий через кишечный барьер (Monti 2005, Zhao 2009). При дозе облучения свыше 8 грей (Гр) дозозависимая гибель стволовых клеток приводит к снижению регенерации крипт до уровня регенерации недостаточного для восстановления слизистой оболочки ЖКТ. По результатам исследований на мышах прогрессирующая денудация эпителия приводит на 6-7 день после облучения к смерти от гастроинтестинального синдрома. Когда митотическая активность возобновляется, резкое истощение крипт наступает, по-видимому, в результате наступления репродуктивной смерти клоногенных клеток крипт (Withers 1971). В случае более низкого уровня доз (8-13 ГР) выжившие клоногенные клетки полностью обновляют систему крипт, что приводит к полному восстановлению поврежденной слизистой оболочки. В случае доз, превышающих 14 Гр, массовая гибель клоногенных клеток вызывает коллапс системы крипта-ворсинка, денудацию слизистой оболочки и смерть животного от гастроинтестинального синдрома (Paris 2001; Potten 1990; Withers 1971; Withers 1969).

Компартмент стволовых клеток кишечника не является единственным компартментом, чувствительным к ионизирующему облучению. Другим критическим фактором, подразумевающим ответ желудочно-кишечного тракта на крупное физическое повреждение, является гипоперфузия кишечника. Персистирующая гипоперфузия кишечника является важным провоцирующим фактором развития синдрома системного иммунного ответа и полиорганной недостаточности (ПОН) (Moore 1999). В ранний период после облучения наблюдают увеличение проницаемости сосудов кишечника и капиллярную утечку (Cockerham 1984; Eddy 1968, Willoughby 1960). Другие изменения после облучения включают умеренное расширение и скрученность малых артериальных сосудов, сокращение численности и/или длины сосудов с последующим возникновением геморрагических паттернов (Eddy 1968). До настоящего времени существует противоречие относительно того, представляет ли собой первичное поражение после облучения гибель стволовых клеток эпителия кишечника или результат гибели клеток эндотелия (Kirsch 2010). Вне зависимости от первичного поражения, ясно, что результатом облучения является комплексный ответ на повреждение, включающий гибель клеток эпителия кишечника, клеток эндотелия и гипоперфузия кишечника (Williams 2010).

Такие способы лечения, как введение гемопоэтических ростовых факторов, например, гранулоцитарного и/или гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (Г-КСФ или ГМ-КСФ) и эритропоэтина (ЭПО), а также трансплантация гемопоэтических стволовых клеток/костного мозга, доступны для снижения смертности от недостаточности кроветворной системы.

Шанс на выживание у людей с ОЛБ снижается с увеличением дозы облучения. Причиной смерти в течение 15 дней с момента облучения, как правило, является повреждение желудочно-кишечного тракта, в то время как после 15 дней смерть обычно является последствием повреждения костного мозга. Для оставшихся в живых процесс восстановления может длиться от нескольких недель до 2 лет (CDC 2013).

Существует острая необходимость в разработке агентов, смягчающих влияние облучения, поскольку в настоящее время не существует таких агентов, одобренных для лечения острой лучевой болезни. RIVPA (SEQ ID NO. 5) обладает потенциалом для снижения высокого уровня смертности при ОЛБ, обеспечивая условия для проведения поддерживающей терапии, а также для содействия восстановлению повреждений кожи.

Инфекция

Множество микроорганизмов, в том числе вирусы, бактерии, грибы и паразиты, могут вызывать заболевания. Микробные клетки отличаются от клеток животных и растений, не способных жить в природе самостоятельно, а существующих только как части многоклеточных организмов. Микробные клетки могут быть патогенными или непатогенными в зависимости, в частности, от конкретного микроорганизма и статуса организма-хозяина. Например, в иммунокомпрометированном организме-хозяине безвредная в норме бактерия может стать патогеном. Попадание в клетки хозяина является решающим для выживания бактериальных патогенов, которые самовоспроизводятся во внутриклеточной среде. Для организмов, которые самовоспроизводятся во внеклеточной среде значение попадания бактерии в клетки хозяина определено хуже.

Устойчивость к лекарственным средствам остается препятствием для непрекращающихся усилий по борьбе с инфекцией. Например, пенициллин был эффективен при лечении Staphylococcus aureus до тех пор, пока бактерии не приобрели устойчивость к нему. На протяжении второй половины 20-го века были разработаны новые антибиотики, такие как ванкомицин и метициллин; ими успешно лечили инфекции, вызванные S. aureus. Тем не менее, устойчивый к метициллину штамм S. aureus появился в 1970-х и до сих пор является настоящим бедствием в больницах по всему миру. Совсем недавно стали известны устойчивые к ванкомицину штаммы S. aureus.

В связи с ростом угрозы развития устойчивости к противомикробным препаратам и появления новых инфекционных заболеваний существует постоянная потребность в новых терапевтических соединениях. Желательными являются терапевтические средства, которые действуют на организм-хозяин, а не на патоген, так как они не способствуют резистентности патогенов. В частности, лекарственные средства, действующие на организм-хозяин посредством врожденной иммунной системы, являются многообещающим источником терапевтических средств. Существуют данные, указывающие на то, что врожденный иммунный ответ играет важную роль в борьбе с большинством инфекций, а также способствует воспалительному ответу. Воспалительный ответ, запускаемый инфекцией, как известно, является центральным компонентом патогенеза заболеваний. Способность повышать резистентность организма-хозяина, контролируя при этом воспаление, была бы очень полезна в продолжающейся борьбе против инфекции, включая инфекции, вызванные резистентными организмами.

IDR и система врожденного иммунитета

Регуляторы врожденного иммунитета (IDR) взаимодействуют с явлениями внутриклеточной передачи сигнала и модулируют врожденный иммунный ответ. В то время как большая часть работ по IDR была сфокусирована на их роли в борьбе с инфекцией в процессе управления воспалением, недавние результаты, полученные на моделях индуцированного химиотерапией или облучением мукозита и заживления ран у животных, позволяют предположить, что IDR могут оказывать благоприятное воздействие в ходе ответов на широкий спектр индуцирующих повреждения агентов помимо патогенов. IDR лечат и предотвращают инфекции посредством селективной модификации ответов врожденной иммунной системы тела при их активации РАМР или DAMP, без инициации ассоциированных воспалительных ответов (Matzinger 2002). Те же механизмы лежат в основе положительных эффектов, наблюдаемых в моделях мукозита и заживления ран, в которых затронута передача сигнала, находящаяся под контролем распознавания DAMP. Для RIVPA (SEQ ID NO. 5) была продемонстрирована его безопасность для людей и эффективность в моделях индуцированного фракционированным облучением или индуцированного химиотерапией мукозита полости рта у животных, в моделях индуцированного химиотерапией повреждения желудочно-кишечного тракта, а также в моделях местной и системной грамположительной и грамотрицательной инфекций у иммунокомпетентных и иммунокомпрометированных организмов-хозяев.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1. RIVPA (SEQ ID NO. 5) снижает продолжительность тяжелого мукозита полости рта в модели фракционированного облучения.

Фигура 2. RIVPA (SEQ ID NO. 5) снижает продолжительность тяжелого мукозита полости рта в модели фракционированного облучения с применением оптимального режима дозирования.

Фигура 3. RIVPA (SEQ ID NO. 5) снижает тяжесть индуцированного декстрансульфатом натрия (DSS) колита по результатам измерений посредством эндоскопии на 7-й, 14-й и 21-й дни (А) и гистопатологии на 21-й день (B, C, D).

Фигура 4. RIVPA (SEQ ID NO. 5) снижает продолжительность тяжелого мукозита полости рта (А), тяжесть колита (В) и потерю массы тела (С) в модели химиотерапии (Первое исследование).

Фигура 5. RIVPA (SEQ ID NO. 5) снижает продолжительность тяжелого мукозита полости рта (А), тяжесть колита (В) и потерю массы тела (С) в модели химиотерапии (Второе исследование).

Фигура 6. RIVPA (SEQ ID NO. 5) дозозависимым образом снижает продолжительность тяжелого мукозита полости рта (А), тяжесть колита (В) и потерю массы тела (С) в модели химиотерапии.

Фигура 7. Комбинация лечения RIVPA (SEQ ID NO. 5) и ванкомицином в модели внутрибрюшинного инфицирования метициллин-резистентным золотистым стафилококком (MRSA).

Фигура 8. Действие RIVPA (SEQ ID NO. 5) в модели абсцесса бедра при заражении MRSA у мышей с нейтропенией.

Фигура 9. Влияние дозы RIVPA (SEQ ID NO. 5) на ответ в модели вызванной MRSA бактеремии у иммунокомпетентных мышей.

Фигура 10. Влияние дозы RIVPA (SEQ ID NO. 5) на ответ в модели вызванной MRSA бактеремии у мышей, лишенных Т-клеток.

Фигура 11. Терапевтическая эффективность RIVPA (SEQ ID NO. 5) в модели острой перитонеальной инфекции, вызванной S. aureus.

Фигура 12. Действие RIVPA (SEQ ID NO. 5) в модели абсцесса бедра при заражении S. aureus мышей с нейтропенией.

Фигура 13. Эффективность RTVPA (SEQ ID NO. 5) в модели перитонеальной инфекции, вызванной Klebsiella, с высокой (А) и низкой (В) степенью бактериального заражения. * Отсутствие столбца на диаграмме (А) указывает на гибель всех мышей (0% выживших).

Фигура 14. RIVPA (SEQ ID NO. 5) повышает разрешение повреждения тканей кожи, местно инфицированной MRSA. Бактериальная нагрузка в течение 48 ч (А), диаграмма рассеяния за 96 ч (В), слепая оценка изображений через 48 ч (С), слепая оценка изображений через 96 ч (D). * Отсутствие столбца на диаграммах (С) и (D) указывает на то, что у всех мышей была нулевая оценка, то есть среднее значение и стандартная ошибка среднего (SEM) составляли 0±0.

Фигура 15. Отсутствие RIVPA (SEQ ID NO. 5) во время восстановления циркулирующих клеток крови: лейкоцитов (А) или нейтрофилов (В) после индукции лейкопении у мышей линии CD-I.

Фигура 16. R(tBg)V1KAR(tBg)V2 (SEQ ID NO. 91) снижает тяжесть мукозита полости рта в модели химиотерапии.

Фигура 17. RIV(mp2)A-NH2 (SEQ ID NO. 92) снижает тяжесть мукозита полости рта в модели химиотерапии.

Фигура 18. R(tBg)V1KAR(tBg)V2 (SEQ ID NO. 91) повышает выживаемость в модели вызванной MRS А бактеремии.

Фигура 19. RIV(mp2)A-NH2 (SEQ ID NO. 92) повышает выживаемость в модели вызванной MRS А бактеремии.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей настоящего изобретения является обеспечение выделенного пептида, состоящего из аминокислотной последовательности R(tBg)V1KR(tBg)V2, в которой tBg=трет-бутилглицин и при этом R(tBg)V2 присоединен посредством амидной связи между V1 и K.

Задачей настоящего изобретения является обеспечение выделенного пептида, состоящего из аминокислотной последовательности RIV(mp2)A-NH2,

в котором mp2=4-амино-1-метил-1Н-пиррол-2-карбоновая кислота

Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение способа лечения мукозита полости рта у субъекта, подвергнутого воздействию повреждающей дозы облучения или химиотерапевтических агентов, включающего введение указанному пациенту эффективного количества:

a) пептида, содержащего аминокислотную последовательность из таблицы 1; или

b) пептида, содержащего любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 5, 7, 10, 14, 17, 18, 22, 23, 24, 27, 28, 31, 34, 35, 63, 64, 66-69, 72, 76, 77, 90, 91 и 92, или его фармацевтической соли, сложного эфира или амида и фармацевтически приемлемого носителя, разбавителя или вспомогательного вещества.

Задачей настоящего изобретения является обеспечение способа лечения мукозита полости рта у субъекта, подвергнутого воздействию повреждающей дозы облучения или химиотерапевтических агентов, включающего введение указанному пациенту эффективного количества:

а) пептида, содержащего аминокислотную последовательность длиной до 7 аминокислот, причем указанный пептид содержит аминокислотную последовательность Х₁Х₂Х₃Р (SEQ ID NO: 56), в которой:

X1 представляет собой R;

Х2 представляет собой I или V, причем Х2 может быть N-метилированным;

Х3 представляет собой I или V, причем Х3 может быть N-метилированным;

Р представляет собой пролин или аналог пролина;

при этом SEQ ID NO: 56 представляет собой первые четыре аминокислоты на N-конце указанного пептида, или его фармацевтической соли, сложного эфира или амида, и фармацевтически приемлемого носителя, разбавителя или вспомогательного вещества; или

b) пептида, содержащего любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 5, 7, 10, 14, 17, 18, 22, 23, 24, 27, 28, 31, 34, 35, 63, 64, 66-69, 72, 76, 77, 90 и 92, или его фармацевтической соли, сложного эфира или амида и фармацевтически приемлемого носителя, разбавителя или вспомогательного вещества.

Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение способа лечения мукозита полости рта у субъекта, подвергнутого воздействию повреждающей дозы облучения или химиотерапевтических агентов, в котором указанный пептид представляет собой SEQ ID NO: 5 или ее фармацевтическую соль, сложный эфир или амид и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.

Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение способа лечения мукозита полости рта у субъекта, подвергнутого воздействию повреждающей дозы облучения или химиотерапевтических агентов, в котором указанный пептид вводят перорально, парентерально, трансдермально, интраназально.

Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение способа лечения мукозита полости рта у субъекта, подвергнутого воздействию повреждающей дозы облучения или химиотерапевтических агентов, в котором указанное эффективное количество пептида, вводимое субъекту, составляет по меньшей мере 1 мг/кг. В предпочтительном варианте реализации указанное эффективное количество пептида, вводимое субъекту, составляет примерно от 1,5 мг/кг до 6 мг/кг.

Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение способа лечения мукозита полости рта у субъекта, подвергнутого воздействию повреждающей дозы облучения или химиотерапевтических агентов, в котором указанный пептид вводят указанному субъекту раз в три дня в течение облучения или введения химиотерапевтического агента.

Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение способа лечения мукозита полости рта у субъекта, подвергнутого воздействию повреждающей дозы облучения или химиотерапевтических агентов, в котором указанный пептид вводят субъекту в комбинации с лекарственной формой для перорального введения местно активного кортикостероида или его метаболита, причем лекарственная форма для перорального введения является эффективной при местном или локальном лечении желудочно-кишечного тракта и полости рта указанного субъекта и, кроме того, указанный субъект демонстрирует симптомы воспаления в результате повреждения тканей, возникшего вследствие воздействия облучения или химиотерапевтического лечения. Примеры местно активных кортикостероидов включают, но не ограничены ими, беклометазона 17,21-дипропионат, алклометазона дипропионат, будесонид, 22S будесонид, 22R будесонид, беклометазон-17-монопропионат, клобетазола пропионат, дифлоразона диацетат, флунизолид, флурандренолид, флутиказона пропионат, галобетазола пропионат, галцинонид, мометазона фуорат и триамцинолона ацетонид. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения местно активный кортикостероид представляет собой беклометазона дипропионат. Указанное эффективное количество местно активного кортикостероида в каждой лекарственной форме может варьировать от пациента к пациенту и может быть легко определено специалистом в данной области с помощью хорошо известных исследований доза-ответ. Такие эффективные количества, как правило, находятся в диапазоне от примерно 0,1 мг/сутки до примерно 8 мг/сутки, и, чаще, находятся в диапазоне от примерно 2 мг/сутки до примерно 4 мг/сутки.

Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение способа снижения воздействия острой лучевой болезни на желудочно-кишечный тракт, кроветворные ткани и кожу у субъекта, получившего высокую дозу проникающей радиации значительной частью своего тела за короткий период времени.

Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение способа лечения острой лучевой болезни у субъекта, получившего высокую дозу проникающей радиации значительной частью своего тела за короткий период времени, в котором указанный пептид вводят в комбинации с лекарственной формой для перорального введения кортикостероида или его метаболита указанному субъекту, причем указанная лекарственная форма для перорального введения является эффективной при местном или локальном лечении желудочно-кишечного тракта и полости рта указанного субъекта, и, кроме того, указанный субъект демонстрирует симптомы воспаления в результате повреждения тканей, появившихся вследствие воздействия облучения или химиотерапевтического лечения. Примеры местно активных кортикостероидов включают, но не ограничены ими, беклометазона 17,21-дипропионат, алклометазона дипропионат, будесонид, 22 S будесонид, 22R будесонид, беклометазон-17-монопропионат, клобетазола пропионат, дифлоразона диацетат, флунизолид, флурандренолид, флутиказона пропионат, галобетазола пропионат, галцинонид, мометазона фуорат и триамцинолона ацетонид. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения местно активный кортикостероид представляет собой беклометозона дипропионат. Указанное эффективное количество местно активного кортикостероида в каждой лекарственной форме может варьировать от пациента к пациенту и может быть легко определено специалистом в данной области с помощью хорошо известных исследований доза-ответ. Такие эффективные количества, как правило, находятся в диапазоне от примерно 0,1 мг/сутки до примерно 8 мг/сутки, и, чаще, находятся в диапазоне от примерно 2 мг/сутки до примерно 4 мг/сутки.

Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение способа лечения и/или предотвращения инфекции (в том числе микробной инфекции) у субъекта посредством введения указанному субъекту пептида, имеющего или содержащего аминокислотную последовательность из таблицы 1 или ее аналога, производного или варианта, или их очевидного химического эквивалента. В качестве примера, указанный субъект может быть инфицирован или иметь риск инфицирования. В одном варианте реализации указанный пептид модулирует врожденный иммунитет у указанного субъекта, таким образом, обеспечивая лечение и/или предотвращение инфекции у субъекта.

Примеры инфекций, которые можно лечить и/или предотвращать с помощью способа согласно настоящему изобретению включают инфекции, вызванные бактериями (например, грамположительными или грамотрицательными бактериями), инфекции, вызванные грибами, инфекции, вызванные паразитами и инфекции, вызванные вирусами. В одном варианте реализации настоящего изобретения указанная инфекция представляет собой бактериальную инфекцию (например, инфекцию, вызванную Е. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp. или устойчивыми к ванкомицину энтерококками). В другом варианте реализации указанная инфекция представляет собой грибковую инфекцию (например, инфекцию, вызванную плесневым, дрожжевым или высшим грибом) Еще в одном варианте реализации настоящего изобретения указанная инфекция представляет собой паразитарную инфекцию (например, инфекцию, вызванную одноклеточным или многоклеточным паразитом, включая Giardia duodenalis, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis и Toxoplasma gondii). Еще в одном варианте реализации указанная инфекция представляет собой вирусную инфекцию (например, инфекцию, вызванную вирусом, ассоциированным со СПИДом, птичьим гриппом, ветряной оспой, герпесом, простудой, гастроэнтеритом, инфекционным мононуклеозом, гриппом, корью, эпидемическим паротитом, фарингитом, пневмонией, краснухой, ТОРСом и инфекцией верхних или нижних дыхательных путей (например, респираторно-синцитиальным вирусом)).

Состав лекарственной формы

Лекарственная форма RIVPA (SEQ ID NO. 5) представляет собой водный асептически обработанный стерильный раствор для инъекций. Каждый флакон содержит 5 мл раствора с концентрацией 60 мг/мл (300 мг RIVPA (SEQ ID NO. 5)). RIVPA (SEQ ID NO. 5) представлен в виде состава с водой для инъекций, рН доводят до заданного значения, составляющего 6,0. Состав не содержит каких-либо вспомогательных веществ и его осмоляльность составляет ~300 мосм/кг.

Способ введения

Лекарственный продукт RIVPA (SEQ ID NO. 5) разбавляют стерильным физиологическим раствором до надлежащей концентрации для инъекции, определенной на основе соотношения мг/кг из расчета на массу пациента и размер назначенной дозы. Разбавленный RIVPA (SEQ ID NO. 5) вводят в виде внутривенной (IV) инфузии в объеме 25 мл в течение 4 минут один раз в три дня.

Примеры

Синтез пептидов

Указанные в таблице 1 пептиды были синтезированы с применением метода твердофазного синтеза пептидов.

Все необходимые Fmoc-защищенные аминокислоты взвешивали в трехкратном мольном избытке по отношению к 1 ммоль пептида, который необходимо было получить. Затем указанные аминокислоты растворяли в диметилформамиде (ДМФА) (7,5) мл для получения раствора с концентрацией 3 мМ. Надлежащее количество смолы Rink amide МВНА взвешивали с учетом замещений в смоле. Указанную смолу затем переносили в реакционный сосуд автоматического синтезатора и предварительно замачивали в дихлорметане (ДХМ) в течение 15 минут.

С указанной смолы снимали защиту путем добавления к смоле 25% пиперидина в ДМФА (30 мл) и перемешивания в течение 20 минут. После снятия защиты с указанной смолы первое присоединение осуществляли путем смешивания 3 мМ раствора аминокислоты (АК) с 4 мМ 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфата (HBTU) и 8 мМ N,N-диизопропилэтиламина (DIEPA). Раствор оставляли на 5 минут для предварительной активации перед добавлением к смоле. Указанную аминокислоту оставляли для присоединения на 45 минут.

После связывания смолу тщательно промывали ДМФА и диметилацетамидом (DMA). С присоединенной Fmoc-защищенной аминокислоты снимали защиту тем же способом, что описан выше, и присоединяли новую аминокислоту, применяя ту же самую схему присоединения AК:HBTU:DIEPA.

После завершения синтеза указанный пептид отщепляли от смолы, применяя отщепляющий коктейль, содержащий 97,5% трифторуксусной кислоты (TFA) и 2,5% воды. Смолу оставляли для отмывки в отщепляющем коктейле на 1 часа. Затем указанный раствор фильтровали под действием силы тяжести с помощью воронки Бюхнера и собирали фильтрат в центрифужную пробирку объемом 50 мл. Указанный пептид выделяли путем осаждения охлажденным диэтиловым эфиром. После центрифугирования и декантации диэтилового эфира неочищенный пептид еще раз промывали диэтиловым эфиром перед высушиванием в вакуумном эксикаторе в течение 2 часов. Указанный пептид затем растворяли в деионизированной воде (10 мл), замораживали при -80°С и лиофилизировали. После этого сухой пептид был готов к очистке методом ВЭЖХ.

Вследствие гидрофильной природы этих пептидов, выделение пептидов диэтиловым эфиром не удалось. Поэтому потребовалась экстракция хлороформом. TFA испаряли и получившийся пептидный осадок растворяли в 10% уксусной кислоте (15 мл). Примеси и скавенджеры удаляли из раствора пептида в уксусной кислоте путем двукратной отмывки раствора хлороформом (30 мл). Водный раствор пептида затем замораживали при -80°С и лиофилизировали с получением порошкообразного пептида, готового для очистки методом ВЭЖХ.

Каждый из пептидов +RIxVPA (SEQ ID NO. 33) и +RIVPAx (SEQ ID NO. 34) содержали по одной N-метил аминокислоте. Это присоединение осуществляли путем объединения растворов N-метиламинокислоты, PyBroP и N-гидроксибензотриазола*H2O (HOBt) и DIEPA в реакционном сосуде, содержащем смолу. По истечении 45 минут, выделенных для присоединения аминокислоты, N-метиламинокислоту присоединяли повторно для того, чтобы соединение точно произошло. Было отмечено, что присоединение, следующее за присоединением N-аминокислоты, не было полностью завершено. Поэтому это присоединение проводили с применением N,N,N',N'-тетраметил-O-(7-азабензотриазол-1-ил)урония гексафлуорофосфата (HATU) вместо HBTU. Результатом, по-прежнему, был неочищенный пептид, который, как правило, содержал две примеси, доля которых составляет 30-40% всей пробы. Затем указанный пептид очищали в модифицированных условиях ВЭЖХ для выделения чистого пептидного пика вдали от близкородственных примесей.

R(tBg)V1KAR(tBg)V2 (SEQ ID NO. 91) представляет собой дендримерный пептид из 8 остатков с симметричными ветвями, отходящими от четвертой аминокислоты, лизина, содержащей две функциональные аминогруппы. Указанный пептид был синтезирован методом твердофазного синтеза пептидов с применением ди-Fmos-защищенной четвертой аминокислоты для облегчения присоединения ветвей в соответствии с общими методами синтеза, описанными выше.

Кроме того, эти пептиды также могут быть синтезированы методом жидкофазного синтеза пептидов (Tsuda et al. 2010) и другими методами, хорошо известными специалистам в данной области техники.

Эффективность при мукозите полости рта

RIVPA (SEQ ID NO. 5) и другие IDR модулируют врожденный иммунный ответ на повреждение тканей, снижает тяжесть повреждений, вызванных воспалительным каскадом, и благоприятствует разрешению болезни. Это свойство IDR было продемонстрировано в моделях индуцированного химиотерапией мукозита полости рта и желудочно-кишечного тракта у мышей, вызванного облучением мукозита полости рта у хомяков и DSS-индуцированного колита у мышей. Полагают, что в каждой из этих моделей первоначальное повреждение запускает каскад передачи сигналов врожденного иммунитета, который увеличивает тяжесть повреждения (Marks 2011; Sonis 2010). RIVPA (SEQ ID NO. 5) и другие IDR ослабляют действие каскада, уменьшая достигнутую в результате тяжесть повреждения и сокращая продолжительность тяжелого повреждения тканей.

Оптимальный режим дозирования для RIVPA (SEQ ID NO. 5) и других IDR, определенный в модели вызванной MRSA бактеремии, был дополнительно подтвержден в моделях повреждений, в которых большая продолжительность болезни делает повторяющееся введение препарата более информативным. Было обнаружено, что введение 25 мг/кг раз в три дня является оптимальным, отражая долгосрочное фармакодинамическое воздействие RIVPA и других IDR (SEQ ID NO. 5), несмотря на его быстрый фармакокинетический клиренс (в течение нескольких минут) из кровотока мышей.

RIVPA (SEQ ID NO. 5) в значительной степени снижал тяжесть и продолжительность мукозита в модели индуцированного облучением мукозита полости рта у хомяков, в частности, при введении раз в три дня в течение лечения фракционированным облучением. Эти исследования подтвердили, что оптимальное дозирование RIVPA (SEQ ID NO. 5) предполагает введение раз в три дня, и что доза величиной 25 мг/кг является эффективной. В этой модели канюлированных самцов золотистого сирийского хомяка подвергали облучению в 7,5 Гр, направленному на вывернутые левые защечные мешки, в дни 0, 1,2, 3, 6, 7, 8 и 9. Мукозит оценивали раз в два дня между днями 7 и 35, пика тяжести мукозит достигал, как правило, на 19-й день. В первом исследовании RIVPA (SEQ ID NO. 5) (25 мг/кг внутривенно) вводили раз в три дня, с 0-го по 33-й день (схема Q3d d0-33), или в дни лучевой терапии (0, 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9 дни), или раз в три дня с 6 по 24 день (схема Q3d d6-24). В дни, когда вводили RIVPA (SEQ ID NO. 5) и проводили облучение, RIVPA (SEQ ID NO. 5) вводили через 2 часа после облучения. Результаты этого исследования представлены на фигуре 1. Лечение RIVPA (SEQ ID NO. 5) было наиболее эффективным при введении раз в три дня в течение всего периода или в дни облучения, причем лечение, начатое через 6 дней после начала облучения, не оказывало благоприятного воздействия (т.е. Q3d d6-24). Катамнестическое исследование проводили для оценки внутривенного введения RIVPA (SEQ ID NO. 5) в дозе 25 мг/кг по схеме Q3d d0-33, в дни облучения или раз в три дня в течение облучения (т.е. в дни 0, 3, 6 и 9). Результаты этого исследования представлены на фигуре 2. Было обнаружено, что введение препарата раз в три дня является оптимальным, что вероятно отражает длительность фармакодинамического эффекта RIVPA (SEQ ID NO. 5), а также снижало инъекционный стресс, вызванный меньшим количеством внутривенных инъекций у этих мелких грызунов.

Также была показана эффективность RIVPA (SEQ ID NO. 5) в моделях индуцированного химиотерапией мукозита полости рта и желудочно-кишечного тракта, согласующаяся с ответом системы врожденного иммунитета на повреждения в результате химиотерапии и/или облучения. В этих исследованиях введение RIVPA (SEQ ID NO. 5) было связано со значимым уменьшением длительности тяжелого мукозита полости рта в модели индуцированного химиотерапией мукозита у мышей. Была также отмечена тенденция к уменьшению колита, однако наличие умеренных повреждений ЖКТ в контрольной группе не позволяет интерпретировать указанный результат как статистически значимый. В каждом исследовании самцам мышей линии С3Н/HeN вводили 5-фторурацил (60 мг/кг внутрибрюшинно) в дни -4 и -2. В 0 день на нижней поверхности языка мыши вызывали химический ожог, индуцирующий мукозит, который обычно достигал пика на 2-й день. Языки мышей оценивали на предмет мукозита ежедневно с 1-го по 14-й день, где оценки ≥3 указывали на тяжелый мукозит. Также ежедневно измеряли массу тела и определяли тяжесть колита с помощью видеоэндоскопии на 4-й и 7-й дни. В первом исследовании RIVPA (SEQ ID NO. 5) (25 мг/кг внутривенно) вводили либо однократно в -4 день непосредственно перед химиотерапией, либо дважды, в дни -4 и -2, непосредственно после химиотерапии, либо 3 раза, в дни -1, 2 и 5. Многократное введение RIVPA (SEQ ID NO. 5) с захватом пикового периода мукозита оказалось наиболее эффективным (т.е. в -2, 2 и 5 дни). Результаты этого исследования представлены на фигуре 4. Во втором исследовании RIVPA (SEQ ID NO. 5) (25 мг/кг внутривенно) вводили либо в дни -1, 2 и 5, либо в дни -1, 1 и 3, либо в дни 0, 2 и 4. Результаты этого исследования представлены на фигуре 5. Статистически значимые изменения продолжительности тяжелого мукозита (фигура 5 - панель А), тяжести колита на 4 день (фигура 5 - панель В) и средняя потеря массы тела (фигура 5 - панель С) коррелировали между группами. В третьем исследовании RIVPA (SEQ ID NO. 5) (25 или 5 мг/кг внутривенно, как указано) вводили либо в -1, 2 или 5 дни, либо в 1 и 3 дни. И снова режим дозирования с применением RIVPA (SEQ ID NO. 5) раз в три дня оказался наиболее эффективным, причем при снижении величины дозы наблюдалось уменьшение эффективности. Результаты этого исследования относительно мукозита, колита и потери массы тела представлены на фигуре 6, панелях А, В и С, соответственно. Статистическую значимость оценивали для мукозита полости рта с помощью критерия хи-квадрат и показателя площади под кривой массы тела (AUC), англ.: area under the curve) с помощью рангового дисперсионного анализа (ANOVA). R(tBg)V1KAR(tBg)V2 (SEQ ID NO. 91) и 92 также оказались эффективны в модели индуцированного химиотерапией мукозита у мышей, в которой значения оценки мукозита определяли в течение 4 дней после индукции мукозита (фигура 16, фигура 17). Лечение введением R(tBg)V1KAR(tBg)V2 (SEQ ID NO. 91) и RIV(mp2)A-NH2 (SEQ ID NO. 92) проводили в -1 и 2 дни в дозе 25 мг/кг внутривенно.

Эффективность при ответе на повреждение, вызванное облучением RIVPA (SEQ ID NO. 5) и другие IDR модулируют ответ врожденного иммунитета на повреждение тканей, снижает тяжесть повреждений, вызванных воспалительным каскадом, и благоприятствует разрешению болезни. Как описано выше, IDR способны уменьшать ответ на повреждение облучением в модели мукозита полости рта (фигура 1, фигура 2). В другой модели, оценивающей предотвращение индуцированного облучением мукозита (в 0 день нос мыши облучали дозой в 25 Гр), RIVPA (SEQ ID NO. 5) (5 доз по 25 мг/кг вводили внутривенно каждый второй день) не обладал каким-либо значимым эффектом на прогрессирование болезни. Прогрессирующее истончение языка мыши оценивали в дни 0, 2, 4, 6, 8 и 10 с помощью гистопатологического анализа числа базальных и супрабазальных апоптотических, митотических и общего количества эпителиальных клеток на единицу площади и единицу длины. Следует отметить, что примененная доза облучения (25 Гр) была выбрана таким образом, чтобы прогрессировало истончение языка, но не возникало явного мукозита. Эти результаты демонстрируют отсутствие пролиферативного потенциала RIVPA (SEQ ID NO. 5) и предполагают, что эффекты RIVPA (SEQ ID NO. 5) наблюдаются только при стимуляции соответствующих сигнальных путей явным повреждением ткани или патогенной инвазией.

Эффективность в желудочно-кишечном тракте

Способность превентивного или терапевтического внутривенного введения RIVPA (SEQ ID NO. 5) непосредственно защищать поверхность слизистой оболочки ЖКТ, была подтверждена в модели DSS-индуцированного колита. В этой модели DSS вводили в виде 3% раствора DSS в питьевой воде самцам мышей линии C57BL/6 с 0-го по 5-й день исследования. Мониторинг колита проводили с помощью видеоэндоскопии в дни 7, 14 и 21. RIVPA (SEQ ID NO. 5) (25 мг/кг внутривенно) вводили раз в три дня с 0-го по 18-й дни (схема Q3d d0-18), с 3-го по 18-й дни (схема Q3d d3-18) или с 6-го по 18-й дни (схема Q3d d6-18). Результаты данного исследования представлены на фигуре 3. К 14-му дню во всех схемах лечения наблюдали статистически значимое снижение эндоскопического индекса тяжести колита. Тем не менее, на 7-й день снижение индекса на 7-й день наблюдали только в группах, которые получили по меньшей мере 2 дозы RIVPA (SEQ ID NO. 5) к тому времени (т.е. в схемах Q3d d0-18 и Q3d d3-18, но не в Q3d d6-18). К 21-му дню все 3 экспериментальные группы, как представляется, реагируют аналогичным образом. Гистопатологическое исследование толстой кишки на 21-й день указывает на то, что в некоторых группах, получавших RIVPA (SEQ ID NO. 5) статистически значимо снижен отек и некроз, в то время как в других группах, получавших RIVPA (SEQ ID NO. 5) имели место аналогичные реакции, не достигшие статистической значимости. Статистический анализ проводили с помощью t-теста, и звездочки указывают на статистически значимые отличия от контрольных значений (p<0,05).

Как описано выше, IDR также способны к уменьшению продолжительности и/или тяжести мукозита желудочно-кишечного тракта в модели индуцированного химиотерапией мукозита (фигура 4, фигура 5, фигура 6).

Эффективность у инфицированных животных

RIVPA (SEQ ID NO. 5) снижает бактериальную нагрузку и повышает выживаемость в присутствии или при отсутствии лечения антибиотиками в различных моделях инфекций у мышей с сопоставимой эффективностью при величине дозы от 25 мг/кг внутривенно и выше и с устойчивым фармакодинамическим эффектом до 5 дней. Эффективность RIVPA (SEQ ID NO. 5) комплементарна лечению антибиотиками и у нормальных, и у иммунокомпрометированных мышей. Была продемонстрирована эффективность RIVPA (SEQ ID NO. 5) в отношении заболеваний, вызванных грамположительными (S. aureus и MRSA) и грамотрицательными (Klebsiella, Е. coli и В. pseudomallei) инфекциями.

S. aureus

RIVPA (SEQ ID NO. 5) протестировали как в сочетании с лечением ванкомицином, так и в качестве монотерапии.

Лечение RIVPA (SEQ ID NO. 5) увеличивало выживаемость в модели перитонеальной инфекции, вызванной MRSA, при введении в комбинации с субоптимальной дозой антибиотика ванкомицина (Исследование №: D-7-E-11). RIVPA (SEQ ID NO. 5) (50 мг/кг) или физиологический раствор вводили внутривенно либо за 48, либо за 72 часа до инокуляции MRSA (UC6685; 8,2×10⁷ колониеобразующих единиц [КОЕ]) самкам мышей линии CF-1 (N=10/группа). Ванкомицин (3 мг/кг) вводили подкожно (SC), через 1 и 5 ч после инфицирования. Мониторинг выживаемости проводили один раз в день в течение 5 дней. Результаты этого исследования представлены на фигуре 7.

RIVPA (SEQ ID NO. 5) также был эффективен при одиночном введении. Многочисленные исследования с внутривенным введением RIVPA (SEQ ID NO. 5) были проведены в модели вызванной MRSA бактериемии. Введение RIVPA (SEQ ID NO. 5) в данной модели либо иммунокомпетентным мышам линии Balb/c либо мышам линии nu/nu без Т-клеток демонстрировало дозозависимый ответ, причем введение единичной дозы величиной 50 мг/кг статистически значимо увеличивало выживаемость в сравнении с физиологическим раствором в качестве контроля. В первом исследовании MRSA (USA300, 7,31og10 КОЕ) вводили путем внутривенной инъекции в хвостовую вену самкам мышей линии Balb/c в нулевой момент времени. За четыре часа до инфицирования единичную дозу физиологического раствора или RIVPA (SEQ ID NO. 5) указанной величины вводили внутривенно в хвостовую вену. Субоптимальную дозу антибиотика (линезолид, 6,25 мг/кг) вводили однократно перорально непосредственно после инфицирования. Мониторинг выживаемости проводили в течение 21 дня после инфицирования. Результаты данного исследования представлены на фигуре 9. Во втором исследовании RIVPA (SEQ ID NO. 5) (внутривенно) или физиологический раствор (внутривенно) вводили однократно за 4 часа до инфицирования MRSA (штамм USA300, 7,0 log₁₀ КОЕ) в хвостовую вену самкам мышей линии nu/nu. Мониторинг выживаемости проводили в течение 14 дней, как показано на фигуре 10. Статистически значимые отличия (т.е., р≤0,05) в выживаемости были обнаружены при величине дозы 50 мг/кг с помощью анализа Каплана-Майера в каждой опытной группе по сравнению с физиологическим раствором в качестве контроля.

Таким образом, оценка применения монотерапии посредством внутривенного введения RIVPA (SEQ ID NO. 5) в исследованиях относительно различных инфекций, вызванных S. aureus, показала, что:

Влияние RIVPA (SEQ ID NO. 5) является дозозависимым в диапазоне доз от 1 до 50 мг/кг у мышей, соответственно демонстрируя эффективность при величине дозы от 25 мг/кг и выше (таблица 2; фигура 9 и фигура 10). Такая величина дозы также была эффективна в контексте более хронических заболеваний, имеющих место в моделях повреждений (фигуры с 1 по 6).

(i) При успешном исходе лечения было продемонстрировано увеличение выживаемости по меньшей мере 20% по сравнению с соответствующей контрольной группой, получавшей физиологический раствор.

(ii) №исследования: TPS-8-B-100, TPS-8-B-150, TPS-8-B-116, D-7-E-9

(iii) №исследования: TPS-8-B-100, TPS-8-B-150, TPS-8-B-120, TPS-8-B-112

(iv) №исследования: TPS-8-B-100, TPS-8-B-150, TPS-8-B-116, TPS-8-B-114, TPS-8-B-120, TPS-8-B-101

(v) №исследования: TPS-8-B-100, TPS-8-B-150

Ежедневное введение RTVPA (SEQ ID NO. 5) не требуется, введение каждый 2-й или 3-й день является достаточным. В контексте более хронических заболеваний, имеющих место в моделях повреждений, было также подтверждено, что введение каждый 3-й день, как представляется, является оптимальным (данные не представлены).

RIVPA (SEQ ID NO. 5) может быть введен в течение периода длиной вплоть до 24 ч после инициации инфекции в модели вызванной MRSA бактеремии и все равно оказывать благоприятное действие на выживаемость (данные не представлены). Следовательно, он является быстродействующим.

В зависимости от величины дозы единичная доза RIVPA (SEQ ID NO. 5) может быть введена в течение периода длиной вплоть до 5 дней инициации инфекции и все равно оказывать благоприятное влияние на выживаемость (данные не представлены), что отражает долгосрочный фармакодинамический эффект RIVPA (SEQ ID NO. 5), не смотря на его быстрый фармакокинетический (PK) клиренс (в течение нескольких минут) из кровотока мышей.

Благоприятное воздействие на выживаемость, оказываемое лечением RTVPA (SEQ ID NO. 5), можно поддерживать по меньшей мере в течение 21 дня (фигура 9).

RTVPAY* (SEQ ID NO. 90) и R(tBg)V1KAR(tBg)V2 (SEQ ID NO. 91) (5 мг/кг, введенный за 4 часа до инфицирования) также улучшает выживаемость в модели вызванной MRSA бактериемии (фигура 18; фигура 19).

Также было показано, что локальное введение RTVPA (SEQ ID NO. 5) является эффективным, если введение осуществляют локально в месте инфекции. В модели грамположительной перитонеальной инфекции мыши RIVPA (SEQ ID NO. 5) в значительной степени снижает бактериальную нагрузку более чем на 7 порядков (Исследование №: D-7-E-14). Внутрибрюшинное введение S. aureus (номер по каталогу АТСС 25923, 6×10⁷ КОЕ) с 5% муцина внутрибрюшинно вводили самкам мышей линии CD-1 (N=8/группа), и RIVPA (SEQ ID NO. 5) (9,5 мг/кг) вводили путем инъекции внутрибрюшинно на 4 ч позже. Мышей выводили из эксперимента через 24 ч после инфицирования, и жидкость перитонеального лаважа оценивали для подсчета бактерий. Результаты данного исследования представлены на фигуре 11 (каждая точка представляет собой результат по отдельной мыши - умершим мышам присваивали самое высокое значение количества бактерий, полученное у любой из мышей в указанном исследовании, и на графике они представлены незакрашенными значками).

Также RIVPA (SEQ ID NO. 5) в значительной степени снижал бактериальную нагрузку у мышей с нейтропенией в модели абсцесса бедра, вызванного инфицирование, при введении в качестве локальной внутримышечной (IM) инъекции. Самки швейцарских мышей-альбиносов (N=8/группа) были приведены в состояние нейтропении воздействием Ср (100 мг/кг) в 3 и 1 дни до внутримышечной инъекции S. aureus (№ по каталогу АТСС 29213, ~9,5×10⁵ КОЕ). RIVPA (SEQ ID NO. 5) (50 мг/кг) вводили внутримышечно за 24 ч до инфицирования, а также подкожно вводили ванкомицин (100 мг/кг) в 1, 6 и 18 ч до инфицирования. Количество КОЕ бактерий, присутствующее в инфицированном бедре оценивали через 24 часа после инициации инфекции в каждой из групп. Результаты данного исследования представлены на фигуре 12.

Klebsiella

RIVPA (SEQ ID NO. 5) увеличивает выживаемость в модели грамотрицательной перитонеальной инфекции либо при локальном (внутрибрюшинно), либо при системном (внутривенно) введении. Следует отметить, что системное введение проявило себя так же хорошо или лучше, чем локальное введение. Введение RIVPA (SEQ ID NO. 5) (24 мг/кг) осуществляли либо внутрибрюшинно (за 24 ч до или через 4 часа после инфицирования), либо внутривенно (через 4 ч после инфицирования) самкам мышей линии Balb/c (N=8/группа), инокулированным бактерией Klebsiella pneumoniae (№ по каталогу 43816 АТСС) в количестве 2,8×10⁵ КОЕ (фигура 13 - панель А), либо в количестве 5,3×10² КОЕ (фигура 13 - панель В), и мониторинг выживаемости проводили в течение 24 ч. Протективный эффект RIVPA (SEQ ID NO. 5) в данном контексте представлен на фигуре 13. Конечная точка выживаемости указана для животных, получивших большее число бактерий (панель А). Все животные, получившие меньшее число бактерий, выжили во всех группах (панель В), и их оценивали по клиническим признакам (например, пилоэрекция, сниженная двигательная активность кишечника, выпяченный живот и т.д.) через 24 часа после инфицирования все это суммировали в виде клинических показателей.

Эффективность при повреждении кожи

Системное введение RIVPA (SEQ ID NO. 5) также является эффективным в случае повреждения кожи и инфекции, ускоряя заживление кожи в модели инфекции кожи, вызванной MRSA. Инфекция была инициирована через 1 день после того, как у каждой мыши удалили волосы с дорсальной поверхности тела. RIVPA (SEQ ID NO. 5) (25 мг/кг внутривенно или 100 мг/кг подкожно) вводили за 4 часа до инфицирования и в различное время после заражения, как указано. Линезолид для перорального введения применяли в качестве компаратора и вводили ежедневно по 12,5 мг/кг. В 0 день (в -1 ч) каждую мышь наркотизировали с помощью изофлурана, и выбритую кожу спины повреждали путем 7 последовательных наложений и снятий хирургической ленты. Затем это повреждение немедленно инфицировали местным введением 10 мкм бактериальной суспензии, обеспечивая общее введение в количестве 7,6 log₁₀ КОЕ на мышь. Эффективность оценивали посредством измерения бактериальной нагрузки в перфорационных биоптатах кожи через 48 ч (фигура 14 - панель А) и 96 ч (фигура 14 - панель В) после введения бактерий и с помощью слепой макроскопической оценки цифровых изображений врачом-патологом, сертифицированным министерством здравоохранения, через 46 ч (фигура 14 - панель С) и 96 ч (фигура 14 - панель D) после инфицирования. Следует отметить, что ни линезолид, ни RIVPA (SEQ ID NO. 5) не снижали бактериальную нагрузку в биоптатах через 48 или 96 ч по сравнению с контролем, хотя локализация какой-либо выделенной бактерии (например, на поверхности кожи или в ткани) не была определена. Тем не менее, очевидно происходило заживление ран. Среднее значение бактериальной нагрузки для каждой терапевтической группы статистически сравнивали со средним значением бактериальной нагрузки контрольной группы, получавшей физиологический раствор, в той же точке времени, с помощью t-теста, считая дисперсии неравными, выполненного в Excel. Сравнения, в которых получалось значение р≤0,05, считали статистически отличающимися.

Исследования фармакологической безопасности на здоровых животных:

Было проведено два пилотных и два окончательных исследования токсичности многократных доз RIVPA (SEQ ID NO. 5) на мышах и яванских макаках с применением внутривенного (медленного болюсного) способа введения. Все исследования были проведены компанией LAB Research Inc., Канада.

Не предусматривающие применение Правил проведения лабораторных работ (GLP) пилотные токсикологические исследования показали, что максимальная переносимая доза (maximum tolerated dose (MTD)) однократного введения RIVPA (SEQ ID NO. 5), которую вводят в виде внутривенной инъекции в течение периода от 30 до 60 секунд, составляет 88 мг/кг (фактическая доза) для мышей. В не предусматривающих применение Правил проведения лабораторных работ исследованиях на нечеловекообразных обезьянах (NHP) мягкие клинические проявления (поверхностное/затрудненное дыхание, сниженная активность, частично закрытые глаза и подергивания мышц) были отмечены у одного или обоих животных после введения 90 (1 животное), 180 (оба животных) и 220 (1 животное) мг/кг RIVPA (SEQ ID NO. 5) в течение или вскоре после введения дозы. Их разрешение произошло в течение нескольких минут без обнаруживаемых остаточных эффектов.

Безопасность многократных ежедневных инъекций RIVPA (SEQ ID NO. 5) также была оценена в исследованиях с соблюдением правил GLP на мышах и яванских макаках. Мышам в течение 14 дней внутривенно вводили дозы величиной 20, 60 или 90 мг/кг/сутки. При высоких дозах наблюдалась смертность, которой, главным образом, предшествовало затрудненное дыхание и лежачее положение. Также летальность наблюдали у одного животного, получавшего дозу величиной 60 мг/кг, но больше ни одно животное, получавшее такую дозу, не проявляло клинических признаков. Никакой смертности или клинических проявлений, связанных с исследуемым препаратом, при величине дозы 20 мг/кг не наблюдали. У выживших животных во всех группах не было никаких признаков токсичности в каком-либо органе, никакой аномальной биохимии или гематологии. Никаких побочных эффектов в течение 14 дней при величине дозы 20 мг/кг 14 не наблюдали.

RIVPA (SEQ ID NO. 5) в дозах 20, 80, 160 мг/кг/сутки внутривенно вводили ямайским макакам в течение 14 дней. Преходящее снижение активности и частично закрытые глаза продолжали наблюдаться в течение и вскоре после введения дозы величиной 160 мг/кг на протяжении первых 3 дней у большинства животных, а затем спорадически в течение всего оставшегося периода. Во всех случаях разрешение этих клинических проявлений происходило в течение нескольких минут. Не было выявлено никаких побочных эффектов в отношении какого-либо другого измеренного параметра или с помощью микроскопии в какой-либо ткани. Введение RIVPA (SEQ ID NO. 5) в дозах величиной 20 и 80 мг/кг/сутки не к появлению каких-либо доказательств токсичности. Доза величиной 80 мг/кг/сутки была признана максимальной дозой, не приводящей к развитию наблюдаемых нежелательных эффектов (No-Observed-Adverse-Effect-Level (NOAEL)) для этого исследования.

Не было обнаружено никакого воздействия RIVPA (SEQ ID NO. 5) на центральную нервную систему (ЦНС) в каком-либо исследовании при любой величине доз, а также обнаруживали совсем немного или вообще не обнаруживали радиоактивно меченный RIVPA (SEQ ID NO. 5) в ЦНС мышей при величине доз либо 20, либо 90 мг/кг. Не было выявлено никаких взаимодействий между RIVPA (SEQ ID NO. 5) и набором рецепторов и ионных каналов ЦНС in vitro.

В исследованиях на яванских макаках в отношении сердечно-сосудистой системы/легких с применением разовых доз величиной 20 или 80 мг/кг не выявило никакого влияния на сердечно-сосудистую систему или изменений в параметрах электрокардиограммы (ЭКГ). Не было замечено никакого воздействия на респираторную систему при величине доз 20 или 80 мг/кг. При величине дозы 80 мг/кг в данном исследовании RIVPA (SEQ ID NO. 5) был связан с преходящим опусканием век и прострацией в течение введения. При 220 мг/кг введение RIVPA (SEQ ID NO. 5) было связано с преходящими тяжелыми клиническими проявлениями, такими как опускание век, тремор, прострация, бледность, конвульсии и коллапс. У одного животного высокая доза вызвала заметное снижение частоты дыхания с последующей брадикардией, гипотонией и смертью.

В целом, считается, что NOAEL составляет 80 мг/кг/сутки для яванских макаков, так как преходящие клинические проявления ограничились одним исследованием и проявились только в 2 случаях из 98 введений доз препарата такой величины.

В отношении RIVPA (SEQ ID NO. 5) не проводили каких-либо исследований канцерогенности, мутагенности или репродуктивной токсичности.

Воздействие RIVPA (SEQ ID NO. 5) на систему врожденного иммунитета является высокоселективным. В соответствии с этими наблюдениями не было обнаружено каких-либо изменений массы связанных с иммунитетом органов, гистопатологии, гематологии и клинической химии на протяжении 14-дневных исследований токсичности на мышах и нечеловекообразных обезьянах. В более позднем исследовании не было обнаружено никакого влияния на подсчитанное количество Т-клеток, В-клеток или клеток натуральных киллеров (NK) после 14 дней внутривенного введения RIVPA (SEQ ID NO. 5) нечеловекообразным обезьянам в течение 14 дней. RIVPA (SEQ ID NO. 5) не способствует пролиферации ни клеток мыши или человека in vitro, ни первичных лейкозных клеток человека in vitro. В общей сложности, нет никаких признаков того, что RIVPA (SEQ ID NO. 5) обладает потенциалом вызывать иммунотоксичность или неспецифические иммунные ответы. Не было обнаружено никакой гиперактивации или супрессии адаптивных иммунных ответов или иного влияния на фенотипы клеток, связанных с адаптивным иммунитетом, вследствие введения RIVPA (SEQ ID NO. 5).

Таким образом, основными установленными данными о токсическом действии является резкое возникновение угнетения дыхания, сопровождающееся затрудненным дыханием, лежачим положением и преходящим снижением активности. При наибольшей тяжести острая токсичность приводит к смерти. Все клинические проявления оказывались обратимы при прекращении введения, и было отмечено, что животные восстанавливались в течение нескольких минут, без последующих неблагоприятных последствий клинических проявлений или данных о токсичности. Фармакологическое исследование безопасности для сердечно-сосудистой системы/легких на нечеловекообразных обезьянах подтвердило отсутствие токсичности в отношении сердца или удлинения сегмента QT.

Наблюдаемое угнетение дыхания возникало при разной величине доз у разных видов, а не было предсказано в результате аллометрического масштабирования. В частности, мыши оказались наиболее чувствительным видом: у них острая токсичность возникала редко при величине дозы 60 мг/кг (ЭДЧ: ~5 мг/кг) и часто при 90 мг/кг (ЭДЧ: ~7 мг/кг). В отличие от них, у нечеловекообразных обезьян (яванских макак) острая токсичность иногда возникала при 160 мг/кг (ЭДЧ: ~50 мг/кг) и стабильно возникала при 240 мг/кг (ЭДЧ: ~78 мг/кг). Дополнительные исследования аналогов RIVPA (SEQ ID NO. 5) при изучении острой токсичности у мышей показали, что токсичность связана с зарядом, но не со специфической структурой (аминокислотной последовательностью) или статусом связывания молекулы целевого белка, что предполагает, что острая токсичность обусловлена высокой мгновенной концентрацией заряженной молекулы, которая сопоставима с объемом крови, в отличие от аллометрического масштабирования. Кроме того, механистические исследования на мышах показали, что угнетение дыхания обусловлено изменением активности диафрагмального нерва.

Исследования фармакологической безопасности при лейкопении и/или инфекции:

В фармакологическом исследовании, не предусматривающем применение Правил проведения лабораторных работ, RIVPA (SEQ ID NO. 5) не влиял на восстановление циркулирующих популяций клеток крови после индукции лейкопении у мышей линии CD-I. Лейкопению индуцировали двумя внутрибрюшинными инъекциями Ср (150 мг/кг в 1-й день и 100 мг/кг в 4-й день), что приводило к хорошо сформировавшейся лейкопении на 4-й день, которая сохранялась до 10-го дня. Физиологический раствор или RIVPA (SEQ ID NO. 5) (20 или 50 мг/кг) вводили внутривенно в дни 5, 7, 9 и 11. По шесть животных из каждой группы выводили из эксперимента на дни 6, 8, 10, 12 и 14 и оценивали по полному анализу крови и лейкоцитарной формуле. Ни уровни, ни динамика общего числа лейкоцитов и лейкоцитарной формулы не были изменены во время восстановления по сравнению с контрольной группой (фигура 15).

Исследования инфекций на животных с лейкопенией не выявили никакого влияния RIVPA (SEQ ID NO. 5) на действие антибиотиков.

Отсутствие процессинга или ингибирования RIVPA (SEQ ID NO. 5) ферментами CYP450, первичный метаболизм RIVPA (SEQ ID NO. 5) протеазами во всех тканях организма и очень незначительная роль мочи, кала и экскреции желчи в клиренсе RIVPA (SEQ ID NO. 5) позволяют предположить, что фармакокинетическое межлекарственное взаимодействие будет минимальным.

iv. Клинический опыт

Клинический опыт применения RIVPA (SEQ ID NO. 5) был получен в ходе Фазы 1 испытаний. Основной целью указанного исследования являлось определение максимальной переносимой дозы (МПД) однократных и повторяющихся нарастающих доз раствора RIVPA (SEQ ID NO. 5) для последующего внутривенного введения здоровым добровольцам путем инъекций. Вторичные цели настоящего исследования включали оценку ограничивающей дозу токсичности (ОДТ), безопасности, фармакокинетических и фармакодинамических профилей RIVPA (SEQ ID NO. 5) после внутривенного введения однократных и повторяющихся нарастающих доз RIVPA (SEQ ID NO. 5). Указанное исследование было поделено на 2 фазы: фазу однократных нарастающих доз (single-ascending dose (SAD)) и фазу многократных нарастающих доз (multiple-ascending dose (MAD)).

Безопасность для человека

Однократное внутривенное введение доз RIVPA (SEQ ID NO. 5) являлось хорошо переносимым вплоть до максимально тестируемой величины (8 мг/кг), и ежедневное внутривенное введение доз являлось хорошо переносимым вплоть до максимальной тестируемой величины (6,5 мг/кг в течение 7 дней). Не была выявлена ограничивающая дозу токсичность (ОДТ) и ПМД не была достигнута на каждом этапе испытаний. В ходе испытаний не было отмечено ни одного случая смерти, клинически значимых, тяжелых или серьезных нежелательных явлений (НЯ). Не было выявлено каких-либо опасений по поводу безопасности или значимых различий средних значений или сдвигов относительно базового уровня измерений показателей жизненно важных функций организма, клинических лабораторных результатов или результатов электрокардиограммы (ЭКГ) между субъектами, получавшими препарат, и субъектами, контрольной группы, получавшими плацебо.

Фаза однократных нарастающих доз:

Частота возникновения НЯФЛ у субъектов, получавших RIVPA (SEQ ID NO. 5) не являлась дозозависимой, и явления не происходили на клинически значимом высоком уровне у субъектов, получавших RIVPA (SEQ ID NO. 5), в сравнении с субъектами, получавшими плацебо. Наиболее часто возникающими НЯФЛ (наблюдаемыми у одного или более субъектов, получавших RIVPA (SEQ ID NO. 5), а также в большей степени (%), чем у получавших плацебо субъектов) являлись связанные с процессом лечения в рамках исследования явления (Общие расстройства и нарушения в месте введения), такие как гематома в месте прокола сосуда, реакция в месте прокола сосуда и боль в месте прокола сосуда. Все явления, связанные с местом прокола сосуда, являлись незначительными и были определены как не связанные с лечением в рамках исследования посредством QI. Вторыми наиболее часто регистрируемыми НЯФЛ были нарушения со стороны нервной системы, особенно головные боли и головокружения; эти нарушения были от незначительных до умеренных. Всех остальные НЯФЛ были зарегистрированы только у 1 субъекта при любой величине полученной дозы (максимально составляющей 3 величины дозы). Не было показано каких-либо клинически значимых тенденций в характере и продолжительности НЯФЛ в какой-либо исследуемой группе.

Фаза многократных нарастающих доз:

Наибольшую частоту возникновения НЯФЛ наблюдали при 2 наивысших величинах доз (4,5 и 6,5 мг/кг/сутки). Частота возникновения «возможно связанных» явлений также была выше при 2 наивысших величинах доз. Тем не менее, вследствие малого размера образцов (активное лечение в каждой группе получали 4 субъекта) было невозможно заключить, действительно ли результаты представляют собой дозозависимый ответ. Большинство НЯФЛ не были связаны с лечением в рамках исследования и были незначительными по степени тяжести, только одно явление было описано как умеренное по степени тяжести. Наиболее часто регистрируемыми НЯФЛ у субъектов, получавших RIVPA (SEQ ID NO. 5) являлись Общие расстройства и нарушения в месте введения (т.е. связанные с манипуляциями явления), такие как гематома в месте прокола сосуда, реакция в месте прокола сосуда и боль в месте прокола сосуда. Все связанные с проколом сосуда явления были незначительными и были расценены как не связанные с лечением. Повышение уровня аланинаминотрансферазы (ALT) и боль в спине была зарегистрирована у 3 (15,0%) субъектов, получавших RIVPA (SEQ ID NO. 5), и эти явления были зарегистрированы только у одного (10,0%) субъекта, получавшего плацебо.

Фармакокинетика в организме человека

После внутривенного введения субъекту-человеку и в соответствии с данными, полученными в исследованиях на животных, RIVPA (SEQ ID NO. 5) выводится из кровеносного русла в течение нескольких минут. В ходе фазы однократных нарастающих доз Фазы 1 испытаний на здоровых добровольцах RIVPA (SEQ ID NO. 5) быстро подвергался элиминации со снижением содержания в плазме крови до уровня менее 10 процентов от максимальной концентрации (Cmax) в течение 9 минут с момента начала 4-минутной внутривенной инфузии. После быстрого снижения наблюдают фазу медленной элиминации. Среднее время достижения максимальной концентрации находится в диапазоне от ~4 мин до ~4,8 мин от начала инфузии для диапазона доз от 0,15 мг/кг до 8 мг/кг. Максимальная концентрация в плазме и общий уровень воздействия являлись дозозависимыми, и клиренс RIVPA (SEQ ID NO. 5) из кровеносного русла был быстрым, что согласуется с опытом работы с мышами и нечеловекообразными обезьянами.

В свете высокого клиренса и короткого времени полувыведения не ожидается возникновения накопления вследствие ежедневных инъекций. В ходе Фазы 1 исследования многократных возрастающих доз RIVPA (SEQ ID NO. 5) вводили ежедневно в течение 7 дней, и концентрации перед введением, измеренные в дни 5, 6, 7, а также 8 (через 24 ч после начала инфузии в 7-й день), были ниже нижнего предела количественного определения (lower limit of quantitation (LLOQ)) у всех субъектов.

Фармакодинамика в организме человека

В исследованиях ex vivo образцов крови, полученных в ходе в ходе Фазы 1 испытаний на здоровых добровольцах, было проведено количественное определение ряда цитокинов и хемокинов через 4 часа после стимуляции цельной крови in vitro с помощью LPS. Межиндивидуальная вариабельность уровней анализируемых веществ была больше, чем любое изменение с течением времени или в ответ на введение RIVPA (SEQ ID NO. 5) или плацебо, поэтому данные были самонормированы с использованием уровня анализируемого вещества у индивидуума до введения дозы для стандартизации всех ответов для каждого отдельного субъекта (коэффициент активности). Влияние RIVPA (SEQ ID NO. 5) на коэффициенты активности анализируемых веществ не были ни постоянными на протяжении времени, ни линейно дозозависимыми. Тем не менее в диапазоне доз 0,15-2 мг/кг имеет место доказательство повышения «противовоспалительного статуса» (т.е. повышенные уровни противовоспалительных TNF RII и IL-1ra в сочетании с пониженными уровнями TNFα и IL-1β после стимуляции LPS крови каждого индивидуума).

b. Научное обоснование введения пептидов IDR путем инъекций

Мукозит

Мукозит связан с нарушением регуляцией системы врожденного иммунитета, результатом которого является каскад воспалительных реакций, которые дополнительно повреждают слизистую оболочку и приводят к явному мукозиту (Sonis, 2004). В частности, в то время, как химиотерапия или лучевая терапия вызывают повреждения подлежащего эпителия и эндотелия, ответ врожденной иммунной системы на появившиеся в результате "DAMP" приводит к запуску воспалительного каскада, который усугубляет эти повреждения. Недавние исследования по оценке экспрессии генов у животных и человека, предрасположенных к сильному мукозиту полости рта, подтвердили роль системы врожденного иммунитета в данном заболевании (Sonis, 2010). Кроме того, мукозит нижних отделов желудочно-кишечного тракта также связывают с аналогичными механизмами (Bowen, 2008).

Острая лучевая болезнь

Острое воздействие облучения связано с повреждением эпителия (кожи), костного мозга (гемопоэтический синдром) и желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Кроме того, смертность становится все более высокой при возрастающем воздействии облучения, что ограничивает потенциал терапевтического вмешательства. Ранняя смертность (<2 недель) после острого облучения связана с повреждениями желудочно-кишечного тракта. Тяжелое облучение вызывает непосредственные повреждения стволовых клеток в основании крипт Либеркюна, что приводит к прекращению митоза и их гибели посредством механизмов апоптоза (Potten 1997а, Potten 1997b). Было продемонстрировано, что восстановление и/или долгосрочные последствия этого повреждения связаны с восстановительным ответом как микробиоты ЖКТ, так и врожденного иммунитета (Crawford 2005; Garg, 2010). В текущих исследованиях в области радиобиологии нормальной и онкогенной ткани была продемонстрирована значимая роль ответа системы врожденного иммунитета на облучение (Schaue and McBride, 2010; Lauber 2012; Burnette 2012). Кроме того, было показано, что агонисты, мишенью которых является система врожденного иммунитета (например, агонист TLR-9) оказывают радиопротективное действие при регуляции ЖКТ-ОЛБ (Saha, 2012).

Мукозит полости рта и желудочно-кишечного тракта, как следствие лучевой противоопухолевой терапии выступает в роли релевантного индикатора желудочно-кишечного компонента ОЛБ. В соответствии с функцией IDR и ролью врожденного иммунитета в развитии мукозита эффективность применения IDR была продемонстрирована на широком спектре моделей повреждений слизистой оболочки. В частности, в исследованиях индуцированного как химиотерапией, так и лучевой терапией, мукозита ЖКТ было показано, что IDR могут снижать пиковую интенсивность и продолжительность мукозита, что приносит ~50% снижение продолжительности тяжелого мукозита (фигура 1, фигура 2, фигура 4, фигура 5, фигура 6, фигура 7, фигура 8, фигура 16, фигура 17).

Кроме того, в соответствии с воздействием IDR на врожденный иммунитет организма-хозяина, эффективность в моделях инфекций была продемонстрирована и против грамположительных, и против грамотрицательных (фигура 9, фигура 10, фигура 18, фигура 19) бактериальных патогенов, как у иммунокомпетентных (например, фигура 9) так и у иммунокомпрометированных (с лейкопенией или без Т-клеток) мышей.

IDR вводят системно, и они воздействуют на поверхности слизистых оболочек (например, слизистой оболочки полости рта, толстой кишки [фигура 3]), а также на кожу и являются эффективными как при системных (фигура 7, фигура 8, фигура 9 и фигура 10), так и при местных инфекциях.

Таким образом, IDR модулируют ответ врожденного иммунитета на повреждения (фигуры с 1 по 8, фигура 16, фигура 17). В частности, RIVPA (SEQ ID NO. 5) смягчает ущерб, причиненный облучением (фигура 1, фигура 2) и является системно-активным, отмечено значительное протективное действие в желудочно-кишечном тракте в ответ на химиотерапию (фигура 3, фигура 4, фигура 5 и фигура 6). Кроме того, IDR являются эффективными как у иммунокомпетентных, так и у животных с лейкопенией, что позволяет предположить, что воздействие на систему кроветворения, возникающее одновременно с желудочно-кишечным компонентом ОЛБ, не приведет к ухудшению эффективности RIVPA (SEQ ID NO. 5). Учитывая его роль в борьбе с инфекциями, RIVPA (SEQ ID NO. 5) также может быть эффективен при гемопоэтическом синдроме ОЛБ, но при единственном случае непосредственной оценки этого факта применяли субоптимальное внутрибрюшинное дозирование. RIVPA (SEQ ID NO. 5) не является фармакокинетическим препятствием для сопутствующего лечения и демонстрирует отсутствие интерферирующего влияния на основные классы антибиотиков (данные не представлены). RIVPA (SEQ ID NO. 5) не препятствует восстановлению после лейкопении (фигура 15). В сочетании с доказанной безопасностью RIVPA (SEQ ID NO. 5) в исследованиях на людях-добровольцах (См. выше 4.a.iv), все эти исследования активно поддерживают применение RIVPA (SEQ ID NO. 5) и лечение другими IDR в качестве ответной меры на воздействие острого облучения для снижения высокого уровня смертности.

Использованная литература

Athman R, Philpott D. Innate immunity via Toll-like receptors and Nod proteins. Curr Opin Microbiol. 2004; 7, 25-32.

Beutler B. Innate immunity: an overview. Mol Immunol. 2004; 40, 845-59.

Beutler B, Hoebe K, Du X, Ulevitch RJ. How we detect microbes and respond to them: the Toll-like receptors and their transducers. JLeukoc Biol. 2003; 74, 479-85.

Bowen J, Keefe D. New Pathways for Alimentary Mucositis. J Oncology. 2008; 1-7.

Burnette B, Fu Y, Weichselbaum R. The confluence of radiotherapy and immunotherapy. Fontiers in Oncology. 2012; 2, article 143.

Crawford P, Gordon J. Microbial Regulation of Intestinal Radiosensitivity. PNAS. 2005; 102 (37), 13254-13259.

Doyle SL, O'Neill LA. Toll-like receptors: from the discovery of NFkappaB to new insights into transcriptional regulations in innate immunity. Biochem Pharmacol. 2006; 72, 1102-13.

Elting et al. Cancer. 2008; 113 (10) 2704-2713.

Foster SL, Hargreaves DC, Medzhitov R. Gene-specific control of inflammation by TLR-induced chromatin modifications. Nature. 2007; 447, 972-8.

Garg S, Boerma M, Wang J, Fu Q, Loose D, Kumar K, Hauer-Jensen M. Influence of a Sublethaal Total-Body Irradiation on Immune Cell Populations in the Intestinal Mucosa. Radiat. Res. 2010; 173 (4), 469-78.

Janeway CA, Jr., Medzhitov R. Innate immune recognition. Annu Rev Immunol. 2002; 20, 197-216.

Lauber K, Ernst A, Orth M, Herrmann M, Belka C. Dying cell clearance and its impact on the outcome of tumor radiotherapy. Frontiers in Oncology. 2012; 2, Article 116.

Mateus et al. Br. J. Dermatol. 2009; 161 (3), 515-521.

Matzinger, P. The Danger Model: A renewed sense of self. Science. 2002; 296 (5566), 301-305.

Molloy M, Bouladoux N, Belkaid Y. Intestinal Microbiota: shaping local and systemic immune responses. Semin Immunol. 2012; 24(1), 58-66.

Murphy. J Supportive Oncology. 2007; 5(9) supplement 4, 13-21.

Nonzee NJ, Dandade NA, Markossian T, Agulnik M, Argiris A, Patel JD, Kern RC, Munshi HG, Calhoun EA, Bennett CL. Evaluating the supportive care costs of severe radiochemotherapy-induced mucositis and pharyngitis. Cancer. 2008; 113: 1446-52.

Paris F, et al. Endothelial apoptosis as the primary lesion initiating intestinal radiation damage in mice. Science. 2001; 293 (5528): 293-297.

Potten CS. A comprehensive study of the radiobiological response of the murine (BDF1) small intestine. Int J Radiat Biol. 1990; 58 (6): 925-973.

Potten CS and Booth C. The role of radiation-induced and spontaneous apoptosis in the homeostasis of the gastrointestinal epithelium: a brief review. Comp Biochem Physiol В. 1997a; 118(3): 473-478.

Potten CS, Booth С and Pritchard DM. The intestinal epithelial stem cell: the mucosal governor. Int J Exp Pathol. 1997b; 78 (4): 219-243.

Saha S, Bhanja P, Liu L, Alfieri A, Yu D, Kandimalla E, Agrawal E, Guha C. TLR9 Agonist Protects Mice from Radiation-Induced Gastrointestinal Syndrome. PLOS one. 2012; 7 (1), e29357.

Sankhala et al. Target Oncol. 2009; 4 (2), 135-142.

Santaolalla R, Fukata M, Abreu M. Innate immunity in the small intestine. Curr Opin Gastroenterol. 2011; 27 (2), 125-31.

Schaue D, McBride W. Links between Innate Immunity and Normal Tissue Radiobiology. Radiat Res. 2010; 173 (4),406-17.

Scott MG, Dullaghan E, Mookherjee N, Glavas N, Waldbrook M, Thompson A, Wang A, Lee K, Doria S, Hamill P, Yu JJ, Li Y, Donini O, Guarna MM, Finlay BF, North JR, Hancock REW. An anti-infective peptide that selectively modulates the innate immune response. Nat Biotechnol 2007; 25: 465-72.

Seibenhener ML, Geetha T, Wooten MW. Sequestosome l/p62--more than just a scaffold. FEBS Lett. 2007; 581, 175-9

Sonis ST. A Biological Approach to Mucositis. JSupp Onc. 2004; 2(1), 21-36.

Sonis. Oral Diseases in press & personal communication. 2010.

Sonis. Current Opinions in Supportive and palliative care. 2010; 4, 29-34.

Tosi MF. Innate immune responses to infection. J Allergy Clin Immunol. 2005; 116,241-9; quiz 50.

Tsuda, Y. and Okada, Y. Solution-Phase Peptide Synthesis, in Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry: Building Blocks, Catalysis and Coupling Chemistry, Volume 3 (ed A.B. Hughes) 2010, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, Germany.

Williams JP, et al. Animal models for medical countermeasures to radiation exposure. Radiat Res, 2010. 173 (4): 557-78.

Withers HR. Regeneration of intestinal mucosa after irradiation. Cancer. 1971; 28 (1): 75-81. Withers HR and Elkind MM. Radiosensitivity and fractionation response of crypt cells of mouse jejunum. Radiat Res. 1969; 38 (3): 598-613.

Wurthwein G, Rohdewald P. Activation of beclomethasone dipropionate by hydrolysis to beclomethasone-17-monopropionate. Biopharm Drug Dispos. 1990; 11:381-394.

Yu HB, Kielczewska A, Rozek A, Takenaka S, Li Y, Thorson L, et al. Sequestosome-l/p62 is the key intracellular target of innate defense regulator peptide. J Biol Chem. 2009; 284, 36007-11.

**** ОН означает свободную кислоту пептида. Ас означает ацетилирование, О означает орнитин, Cit означает цитруллин;

tBG=трет-бутилглицин, mp2=4-амино-1-метил-1Н-пиррол-2-карбоновая кислота × означает основную цепь NMe (вместо амидной основной цепи).

Изобретение относится к способу уменьшения частоты возникновения, тяжести и/или длительности мукозита полости рта у субъекта, подвернутого воздействию повреждающей дозы облучения или химиотерапевтических агентов, включающему введение указанному субъекту эффективного количества пептида, содержащего аминокислотную последовательность длиной до 7 аминокислот, причем указанный пептид содержит аминокислотную последовательность Х₁Х₂Х₃Р (SEQ ID NO: 56), в которой: Х1 представляет собой R; Х2 представляет собой I или V, причем Х2 может быть N-метилированным; Х3 представляет собой I или V, причем Х3 может быть N-метилированным; Р представляет собой пролин; при этом SEQ ID NO: 56 представляет собой первые четыре аминокислоты на N-конце указанного пептида, или его фармацевтической соли, сложного эфира или амида, и фармацевтически приемлемого носителя, разбавителя или вспомогательного вещества; или пептида, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 7, 10, 14, 17, 18, 22, 23, 24, 27, 28, 31, 34, 35, 63, 64, 66-69, 72, 76, 77, 90 и 92, или его фармацевтической соли, сложного эфира или амида, и фармацевтически приемлемого носителя, разбавителя или вспомогательного вещества. Данные доклинических исследований, полученные в моделях индуцированного химиотерапией мукозита, индуцированного облучением мукозита, нейтропенической инфекции и колита, свидетельствуют о том, что мукозит полости рта является показанием, для которого перспективно применение пептидов-регуляторов врожденного иммунитета (IDR). Результаты оценки эффективности, полученные для IDR в ходе доклинических исследований на моделях мукозита у мышей и хомяков, свидетельствуют о том, что введение данного лекарственного средства раз в три дня должно обеспечивать перекрытие «окна» мукозита количеством доз от семи до четырнадцати в зависимости от длительности воздействия химиотерапии или облучения. Также была показана эффективность IDR на моделях вызванного химиотерапией мукозита полости рта или мукозита желудочно-кишечного тракта у мышей, согласующаяся с врожденным иммунным ответом на повреждение в результате химиотерапии и/или облучения. IDR также являются эффективными для снижения бактериальной нагрузки и повышения выживаемости в присутствии или в отсутствие лечения антибиотиками в различных моделях инфекций у мышей. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 19 ил., 2 табл., 1 пр.

1. Способ уменьшения частоты возникновения, тяжести и/или длительности мукозита полости рта у субъекта, подвергнутого воздействию повреждающей дозы облучения или химиотерапевтических агентов, включающий введение указанному субъекту эффективного количества:

a) пептида, содержащего аминокислотную последовательность длиной до 7 аминокислот, причем указанный пептид содержит аминокислотную последовательность Х₁Х₂Х₃Р (SEQ ID NO: 56), в которой:

Х1 представляет собой R;

Х2 представляет собой I или V, причем Х2 может быть N-метилированным;

Х3 представляет собой I или V, причем Х3 может быть N-метилированным;

Р представляет собой пролин;

при этом SEQ ID NO: 56 представляет собой первые четыре аминокислоты на N-конце указанного пептида,

или его фармацевтической соли, сложного эфира или амида, и фармацевтически приемлемого носителя, разбавителя или вспомогательного вещества; или

b) пептида, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 7, 10, 14, 17, 18, 22, 23, 24, 27, 28, 31, 34, 35, 63, 64, 66-69, 72, 76, 77, 90 и 92, или его фармацевтической соли, сложного эфира или амида, и фармацевтически приемлемого носителя, разбавителя или вспомогательного вещества.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный пептид представляет собой SEQ ID NO: 5 или ее фармацевтическую соль, сложный эфир или амид.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный пептид вводят перорально, подкожно, внутримышечно, внутривенно, трансдермально, интраназально, путем введения в легкие или посредством осмотической помпы.

4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанное эффективное количество пептида составляет по меньшей мере 1,5 мг/кг.

5. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанный пептид вводят указанному пациенту раз в три дня в течение воздействия облучения или введения химиотерапевтического агента.

6. Выделенный пептид, состоящий из аминокислотной последовательности

R(tBg)V1KAR(tBg)V2,

в которой tBg=трет-бутилглицин

при этом R(tBg)V2 присоединен посредством амидной связи между V2 и аминогруппой лизина в боковой цепи (SEQ ID NO. 91).

7. Выделенный пептид, состоящий из аминокислотной последовательности

RIV(mp2)A-NH2,

в которой mp2=4-амино-1-метил-1Н-пиррол-2-карбоновая кислота

(SEQ ID NO. 92).

8. Способ лечения индивидуума, страдающего от заболевания, выбранного из группы, состоящей из мукозита и колита, или подвергнутого тяжелому облучению, включающий введение указанному индивидууму пептида, состоящего из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 7, 10, 14, 17, 18, 22, 23, 24, 27, 28, 31, 34, 35, 63, 64, 66-69, 72, 76, 77, 90 и 92.