Способ доставки наночастиц, предназначенных для транспортировки лекарственных веществ, в головной мозг млекопитающих через гематоэнцефалический барьер Российский патент 2018 года по МПК A61K9/51 A61K47/00 B82B1/00 

Способ доставки наночастиц, предназначенных для транспортировки лекарственных веществ, в головной мозг млекопитающих через гематоэнцефалический барьер

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, способам направленной доставки наночастиц, предназначенных для транспортировки лекарственных веществ, в головной мозг. Оно может быть также использовано в других областях: нанобиотехнологии, экспериментальная фармакология, нанофармакология.

Проблема доставки лекарственных веществ (ЛВ) в головной мозг, является актуальной для лечения ряда социально значимых заболеваний, например: цереброваскулярных, нейродегенеративных поражений головного мозга, онкологических, нейроинфекционных заболеваний и т.д.

Известно, что для достижения необходимого эффекта от введенного лекарственного вещества необходимо обеспечить его доставку в оптимальной концентрации в целевой участок организма, что достигается применением различных путей введения в организм.

Однако существует проблема введения ЛВ в организм и доставки их в головной мозг (ГМ). Внутренняя среда ГМ отделена от кровеносной системы гематоэнцефалическим барьером (ГЭБ), осуществляющим защитную функцию и препятствующим проникновению в мозг некоторых попадающих в кровь чужеродных веществ.

Таким образом, эффективность воздействия на ЛВ на ГМ может быть повышена за счет поиска новых путей и методов их адресной (направленной) доставки, позволяющих проникать через ГЭБ.

Известны некоторые способы доставки ЛВ в головной мозг.

Известен способ лечения метастатических поражений головного мозга (RU 2238731, 14.04.2000), включающем интратекальное введение метотрексата в количестве 1,2-2,5 мг на кг веса больного в сочетании с цитозаром в количестве 3-5 мг на кг веса и гидрокортизоном в количестве 125 мг с предварительной дегидратацией головного мозга и внутривенным введением церебролизина. Со второго дня после введения химиопрепаратов проводят 1-2 сеанса плазмафереза. Препараты вводят трехкратно с интервалом в 7 дней, в дальнейшем 1 раз в месяц трехкратно.

Известный метод интратекального введения ЛВ имеет существенные недостатки:

- травматичность, которая может приводить к повреждениям спинного мозга;

- опасность инфицирования ликвора, что чревато серьезными осложнениями

- при использовании указанного метода введения и доставки ЛВ не могут преодолеть гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) или преодолевают его в недостаточной степени для обеспечения терапевтического эффекта. Это обусловлено свойствами барьера, препятствующего проникновению в мозг некоторых чужеродных веществ, попадающих в кровь, что можно отнести к подавляющему большинству сложных соединений, не имеющих механизма активного транспорта, выработанного в процессе филогенеза.

Известен способ лечения онкологических больных с метастатическим поражением головного мозга (RU 2290974, 11.04.2005), включающий проведение эндоликворной терапии. После оперативного удаления опухоли головного мозга, в раннем послеоперационном периоде, производят катетеризацию субарахноидального пространства спинного мозга на уровне L4-L5, устанавливают эндолюмбальный катетер. Производят забор 5 мл спинномозговой жидкости. Смешивают ее с метотрексатом в дозе 5 мг и суспензией гидрокортизона в дозе 50 мг. Смесь инкубируют 30 мин при температуре 37°C. Затем струйно через эндолюмбальный катетер вводят в субарахноидальное пространство. В рамках одного курса лечения производят 5 таких инфузий с интервалом в 3 дня. Суммарно проводят 3 описанных курса в сочетании с 5 циклами адъювантной системной полихимиотерапии с введением цитостатиков на аутокрови.

Недостатками способа являются травматичность, которая может приводить к повреждениям головного мозга, а также вероятность инфицирования ликвора, что чревато серьезными осложнениями.

Известен способ внутривенного введения препаратов для лечения онкологических заболеваний, в т.ч. головного мозга, путем комбинированной терапии, которая обеспечивает противораковый эффект при введении человеку, пораженному раком, эффективных количеств (SP-4-3)-(цис-амминдихлор-[2-метилпиридин]платины (II) (ZD0473) или его пролекарства и противоракового средства не на основе платины, выбранного из группы, состоящей из таксана, камптотецина, гемцитабина, капецитабина, 5-фторурацила, винорелбина, топотекана, антрациклина, иринотекана, этопозида, винбластина, пеметрекседа, виндезина, циклофосфамида, ифосфамида и метотрексата (RU 2429838, 2011 г.).

Однако данный способ является инвазивным и травматичным, имеется риск инфицирования организма. В сосудистое русло вместе с ЛВ могут попадать пузырьки воздуха и вызвать эмболию. Способ не достаточно эффективен, что связано с низкой биодоступностью лекарственных веществ из-за необходимости преодоления ГЭБ.

Известны способы перорального введения препаратов для лечения заболеваний или расстройств ЦНС, например, «Фармацевтическая композиция, обладающая ноотропной активностью, и способ ее получения» (RU 2240783, 17.07.2003).

Недостатками перорального способа введения являются:

- первичные и косвенные воздействия ЛВ на слизистые ротовой полости и пищевода, например, прямое раздражающее воздействие на слизистые оболочки;

- прямые и побочные воздействия на слизистую оболочку желудочно - кишечного тракта (ЖКТ), например: стимуляция выделения соляной кислоты, что может быть осложняющим фактором для больных гиперацидной формой гастрита; торможение выработки защитной слизи; замедление процесса физиологической регенерации эпителия слизистой оболочки;

- инактивация ЛВ ферментами желудочно-кишечного тракта;

- медленное и неполное всасывание ЛВ в пищеварительном тракте;

- влияние пищи и других веществ на всасывание;

- частичная инактивация ЛВ в печени;

- депонирование ЛВ в печени, что, вследствие повышения их концентрации в ткани печени выше предельно допустимых концентраций может приводить к гепатотоксическим эффектам;

- возможна гибель макрофагов в подслизистой ЖКТ приводящая к снижению иммунитета;

- ЛВ под влиянием ферментов плазмы крови могут образовывать новые соединения и оказывать нежелательные побочные эффекты на другие органы.

Перечисленные выше факторы снижают биодоступность ЛВ, повышают риск возникновения побочных эффектов и, как следствие, снижают эффективность его применения.

Известен способ доставки лекарственных или диагностических средств в ЦНС через гематоэнцефалический барьер млекопитающих [патент US 6117454]. Лекарственные средства включают в полученные и покрытые соответствующим поверхностно - активным веществом полибутилцианакрилатные наночастицы (НЧ) или адсорбируют на их поверхность и доставляют к головному мозгу без необходимости изменения структуры лекарства. Поверхностно-активные вещества позволяют комплексам с наполненными лекарством полибутилцианакрилатными НЧ преодолевать гематоэнцефалический барьер и направленно доставлять ЛВ в ЦНС.

Недостатком предложенного способа является высокая вероятность побочных токсичных эффектов, вызываемых поверхностно-активными веществами, используемыми для покрытия полибутилцианакрилатных НЧ.

В качестве ближайшего аналога принят «Способ получения системы направленной доставки лекарства для введения фармакологически активного вещества в центральную нервную систему млекопитающих через гематоэнцефалический барьер» (патент RU 2423104; 2011 г)

Система направленной доставки лекарств содержит наночастицы (НЧ) на основе поли(DL-лактида) и/или поли(DL-лактид-согликолида), фармакологически активное вещество, адсорбируемое и/или включаемое в наночастицы, и содержит TPGS (D- -токоферолполиэтиленгликоль 1000 сукцинат) или имеет покрытие из поверхностно-активного вещества плуроник 188, которое осаждают на наполненные лекарственным веществом наночастицы.

Систему, содержащую наночастицы с лекарственным веществом, вводят перорально или путем внутривенной инъекции, чтобы она могла попасть в кровоток, за счет чего ЛВ достигает гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), преодолевает его и попадает в ЦНС.

Недостатками метода при внутривенном введении наночастиц с ЛВ являются:

- инвазивность, т.к. способ введения травматичен;

- возможность инфицирования организма; в сосудистое русло вместе с лекарством могут попадать пузырьки воздуха, которые могут вызвать эмболию.

Недостатки перорального способа введения комплекса наночастиц и ЛВ обусловлены особенностями наноразмерных объектов, которые, легко всасываясь и перемещаясь через тканевые и клеточные барьеры барьерных систем организма, вызывают изменение распределения НЧ, заключающееся в повышении концентрации НЧ как в биологических мишенях, так и в органах, которые не являются такими мишенями, что обусловливает их поражение и, как следствие, развитие побочных эффектов.

Важное значение имеет группа фармакокинетических факторов определяемых физико - химическими процессами взаимодействия НЧ с барьерными системами организма. При пероральном введении НЧ и ЛВ суммарная толщина барьерных структур составляет несколько десятков микрон, в т.ч.: кишечный эпителий в ЖКТ - 22-26 мкм, барьерные системы печени 30-40 мкм, гематоэнцефалический барьер 0,5-0,7 мкм. На всем пути транслокации НЧ через барьерные системы возможны прямые и косвенные побочные эффекты.

Специфика барьерных систем печени состоит в строении синусоидальных капилляров. Базальная мембрана сосудов, на которых находятся эндотелиоциты, является не сплошной, а прерывистой и, следовательно, НЧ и ЛВ попавшие в кровь могут непосредственно контактировать с клетками печени, проникать и накапливаться в клетках печени, вызывая цитотоксические эффекты.

Важным фактором, влияющим на взаимодействие НЧ и организма, является локализация НЧ в геноме. Авторами обнаружено, что степень выраженности генотоксического эффекта определяется локализацией НЧ относительно определенных участков интерфазного хроматина и ядерной мембраны эукариотической клетки. Так, например, локализация НЧ в межмембранном промежутке ядерной мембраны может вызывать некроз, сопровождающийся разрушением ядерной оболочки. В случае локализации металлсодержащих нанообъектов в интерфазном хроматине вблизи ядрышка эффект их воздействия сопровождается активацией генома.

Вероятность побочных воздействий на другие органы, не являющиеся мишенью, зависит также от протяженности маршрута переноса НЧ по кровеносной системе. При пероральном способе ведения после прохождения через печень НЧ попадают в кровеносную систему и под воздействием гематодинамических сил движутся по системе кровообращения: полая вена, большой круг кровообращения, легкие, малый круг кровообращения, сонная артерия. Протяженность маршрута гематодинамического переноса НЧ от ЖКТ до ЦНС составляет примерно 70 см.

Исследования авторов показали и другие возможные побочные эффекты воздействия НЧ, например, незапланированные реакции веществ, выделяемых под слизистой, с НЧ. Продукты этих реакций могут оказаться токсическими.

Задачей изобретения является создание неинвазивного, простого в выполнении и эффективного способа доставки наночастиц, предназначенных для транспортировки лекарственных веществ в головной мозг млекопитающих через ГЭБ, позволяющего снизить вероятность осложнений и обеспечить высокую степень целевой доставки ЛВ.

Сущность изобретения состоит в том, что предлагается способ неинвазивной доставки наночастиц в головной мозг млекопитающих, включающий следующие этапы:

приготовление порошка монокарбида вольфрама или монокарбида ванадия в виде наночастиц с размером от 15 до 60 нм,

приготовление смеси указанного порошка в виде наночастиц с жидким носителем, например, физиологическим раствором, из расчета 5 мг наночастиц на 0,5 мл носителя,

эндотрахеальное введение полученной смеси в количестве от 20 до 32 мг на килограмм веса млекопитающего.

При этом наночастицы предназначены в том числе и для транспортировки лекарственного вещества.

Техническими результатами изобретения являются:

- обеспечение высокой степени целевой доставки в головной мозг лекарственных веществ через гематоэнцефалический барьер и получение выраженного и стойкого клинического эффекта за счет разработанной авторами новой технологии, которая предусматривает введение НЧ в организм через аэрогематический барьер легких, в котором они захватываются эритроцитами, переносятся по кровеносной системе и преодолевают гематоэнцефалический барьер.

- направленная доставка наночастиц в головной мозг по предлагаемому способу значительно снижает осложнения, возможные при их инвазивных или малоинвазивных способах введения в организм, при которых возможны осложнения: кровотечения, развитие инфекционно-воспалительного процесса и т.п., что может негативно сказаться на результатах лечения

- способ позволяет избежать побочных эффектов, свойственных, например, пероральному способу введения, значительно снизив нагрузку на печень и другие органы ЖКТ

Ключевым моментом способа является прохождение НЧ через аэрогематичекий барьер (АГБ) легких за счет эндотрахеального способа введения.

Авторы при этом исходили из морфологического строения легких. Аэрогематичекий барьер (АГБ) представляет собой тканевую структуру сравнительно небольшой толщины. Размер альвеолоцита в тонкой части 0,5-1,5 мкм, две непрерывные базальные мембраны общей толщиной 1-2 мкм и толщина эпителия сосуда 1-2 мкм (фиг. 1). Таким образом, суммарная толщина барьера около 3-6 мкм, что существенно меньше, чем суммарная толщина барьерных систем (около 70 мкм) при пероральном введении.

Авторы подсчитали, что суммарная протяженность маршрута переноса НЧ по кровеносной системе от АГБ до ткани головного мозга составляет примерно 25 см, что существенно короче, чем при пероральном введении (70 см).

За счет сокращения маршрута гемодинамического переноса сокращается время взаимодействия ЛВ и НЧ с кровью и, соответственно, уменьшается риск попадания НЧ в другие органы.

Авторами установлено, что НЧ, преодолев АГБ, депонируются в эритоцитах и переносятся в них по кровеносной системе. После этого, НЧ могут выходить за пределы биомембран эритроцитов и транслоцироваться через ГЭБ в цитоплазму клеток головного мозга и их ядра (фиг. 2).

При этом, суммарное сечение сосудов на маршруте гематодинамического переноса НЧ по кровеносной системе при эндотрахеальном введении больше, чем суммарное сечение сосудов на маршруте переноса при пероральном введении, что соответственно уменьшает суммарную концентрацию НЧ в кровеносной системе и, тем самым, уменьшается риск побочных осложнений

Кроме того, площадь барьерного слоя эпителия в легких существенно выше, чем в ЖКТ и печени и, следовательно, удельная концентрация НЧ при одинаковых дозах будет ниже и вероятность побочных эффектов при взаимодействии с НЧ также уменьшается.

Способ осуществляется следующим образом:

Готовят порошки монокарбида вольфрама (WC) или монокарбида ванадия (VC) в виде наночастиц при термообработке в среде водорода многокомпонентной композиции, полученной в плазменном реакторе на экспериментальной плазмохимической установке ИМЕТ РАН.

Для определения размера наночастиц используется лазерный дифракционный анализатор размера частиц «Malvern Mastersizer 2000». Для приготовления проб проводилось предварительное разделение на фракции, включавшее диспергирование порошка наночастиц в жидкости (этиловый спирт) ультразвуком с последующим осаждением частиц в центрифуге. Выбирают металлсодержащие наночастицы размером от 15 до 60 нм.

Готовят смесь из расчета 5 мг наночастиц на 0.5 мл физиологического раствора в объеме 2-3 мл. Смесь перемешивают в магнитной мешалке.

Готовую смесь с количеством наночастиц от 20 до 32 мг на килограмм веса животного помещают в устройство для эндотрахеального введения, например в шприц без иглы, соединенный с эндотрахеальной трубкой. Животное находится под общим наркозом, ему в трахею вводят эндотрахеальную трубку. Осуществляют введение смеси плавным однократным нажатием на шток шприца в течение 2-3 сек.

После введения наночастицы преодолевают аэрогематический барьер, попадают в кровоток и переносятся по кровеносной системе, достигают гематоэнцефалического барьера, преодолевают его и попадают в ГМ.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Исследовали возможность неинвазивного введения для доставки в головной мозг через АГБ и ГЭБ наночастиц (НЧ) монокарбида вольфрама (WC) размером 40 нм.

НЧ вводили по предлагаемому способу белым беспородным крысам - самцам с исходным весом 200-220 г. эндотрахеально в количестве 20 мг на килограмм веса и устанавливали за ними наблюдение в течение 4-х месяцев.

Контрольную группу составили интактные крысы. Животные содержались в одинаковых условиях вивария. Количество животных 3.

Через 1, 3, 8, 30, 60, 90, 120 суток после эндотрахеального введения НЧ проводили исследования биоптатов тканей головного мозга, форменных элементов крови. У наркотизированных животных проводили биопсию ствола головного мозга, биоптаты фиксировали в буферном растворе четырехокиси осмия, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и в абсолютном ацетоне, заливали в смесь эпона и аралдита. Полутонкие и ультратонкие срезы готовили на ультратоме "LKB - 4800". Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим (для обзора и выявления жира), реактивом Шиффа по методу Мак-Мануса (для выявления гликогена) и просматривали под световым микроскопом.

Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, после чего просматривали под световым микроскопом «МИКМЕД-5» и электронным микроскопом «JEM-7A». Для количественной оценки воздействия НЧ и их агрегатов на клетки и тканевые структуры Mammalia применен метод компьютерной морфоденситометрии для определения диаметра эквивалентного круга агрегатов НЧ и его модификация для прижизненного исследования форменных элементов крови - эритроцитов.

Пример 2

Исследовали возможность неинвазивного введения через АГБ и ГЭБ наночастиц монокарбида ванадия (VC) размером 15, 60, 1200 нм для доставки их в головной мозг.

НЧ вводили по предлагаемому способу белым беспородным крысам - самцам с исходным весом 200-220 г. эндотрахеально в количестве 20 мг на килограмм веса и устанавливали за ними наблюдение в течение 4-х месяцев.

Контрольную группу составили интактные крысы. Животные содержались в одинаковых условиях вивария. Количество животных -14.

В интервалах времени 1, 3, 8, 30, 60, 90 и 120 суток животные вскрывались под наркозом и у них забирали головной мозг для определения содержания НЧ в пересчете на массу V/1 г органа. Проводили исследования биоптатов тканей альвеолярного отдела легкого, головного мозга, форменных элементов крови.

Биоптаты фиксировали в буферном растворе четырехокиси осмия, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и в абсолютном ацетоне, заливали в смесь эпона и аралдита. Полутонкие и ультратонкие срезы готовили на ультратоме "LKB - 4800". Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим (для обзора и выявления жира), реактивом Шиффа по методу Мак-Мануса (для выявления гликогена) и просматривали под световым микроскопом.

Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, после чего просматривали под электронным микроскопом «JEM-7A» (Япония) и световым микроскопом (МИКМЕД-5). Для количественной оценки воздействия НЧ и их агрегатов на клетки и тканевые структуры Mammalia применен метод компьютерной морфоденситометрии для определения диаметра эквивалентного круга агрегатов НЧ и его модификация для прижизненных исследований форменных элементов крови эритроцитов.

Показано, что НЧ размером 15 нм проникают через АЭГ и ГЭБ, накапливаются в мозгу в концентрации 2,9 мкг/мл на 3 сутки после введения, а время их 50% выведения составляет 36 суток (фиг. 3а).

НЧ размером 60 нм накапливаются в мозгу в концентрации 2,75 мкг/мл на 3 сутки после введения, а время их 50% выведения составляет 34 сутки (фиг. 3б).

НЧ размером 1200 нм накапливаются в мозгу в концентрации менее 0,1 мкг/мл, что близко к фоновым значениям (фиг. 3в)

Таким образом, проведенные исследования предлагаемого способа введения НЧ показали, что:

- неинвазивность метода достигается введением НЧ эндотрахеально через аэрогематический барьер (АГБ) легких;

- перенос НЧ от АГБ до ГЭБ осуществляется эритроцитами по кровеносной системе;

- оптимальным размером НЧ для их транслокации в головной мозг при эндотрахеальном введении через АГБ является диапазон от 15 до 60 нм в количестве НЧ от 20 до 32 мг на килограмм веса.

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, а именно к способу неинвазивной доставки наночастиц в головной мозг млекопитающих, включающему следующие этапы: приготовление порошка монокарбида вольфрама или монокарбида ванадия в виде наночастиц с размером от 15 до 60 нм, приготовление смеси указанного порошка в виде наночастиц с жидким носителем, эндотрахеальное введение полученной смеси в количестве от 20 до 32 мг на килограмм веса млекопитающего. Изобретение обеспечивает высокую степень целевой доставки в головной мозг лекарственных веществ через гематоэнцефалический барьер и получение выраженного и стойкого клинического эффекта за счет разработанной авторами новой технологии, которая предусматривает введение наночастиц в организм через аэрогематический барьер легких, в котором они захватываются эритроцитами, переносятся по кровеносной системе и преодолевают гематоэнцефалический барьер. 3 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 пр.

1. Способ неинвазивной доставки наночастиц в головной мозг млекопитающих, включающий следующие этапы:

приготовление порошка монокарбида вольфрама или монокарбида ванадия в виде наночастиц с размером от 15 до 60 нм,

приготовление смеси указанного порошка в виде наночастиц с жидким носителем,

эндотрахеальное введение полученной смеси в количестве от 20 до 32 мг на килограмм веса млекопитающего.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что наночастицы предназначены для транспортировки лекарственного вещества.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что смесь указанного порошка в виде наночастиц с жидким носителем готовится из расчета 5 мг наночастиц на 0,5 мл носителя.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что жидким носителем является физиологический раствор.