ЖИДКИЕ СОСТАВЫ ДЛЯ КОНЪЮГАТА ЭРИТРОПОЭТИНА ДЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ Российский патент 2019 года по МПК A61K9/08 A61K38/17 A61K38/22 A61K47/10 

Область техники

Настоящее изобретение относится к жидкому составу для обеспечения стабильности при длительном хранении конъюгата эритропоэтина длительного действия, в котором эритропоэтин, непептидный полимер, и Fc-фрагмент иммуноглобулина ковалентно связаны, и который обладает увеличенной продолжительностью действия по сравнению с диким типом.

Предпосылки изобретения

Эритропоэтин (EPO) представляет собой гликопротеин, состоящий из 165 аминокислотных остатков, который действует как цитокин для предшественников эритроцитов в костном мозге, таким образом, являясь ответственным за контроль эритропоэза (образования эритроцитов). EPO синтезируется в основном клетками почек, с небольшим количеством, продуцируемом печенью. Как видно при хронической почечной недостаточности, потеря функций почек, как правило, сопровождается уменьшением, например, уровня EPO, с сопутствующим уменьшением продукции эритроцитов. В настоящее время EPO используют для лечения анемии, возникающей в результате хронической почечной недостаточности и в результате других тяжелых заболеваний, а также вводят пациентам, которых планируют подвергнуть хирургической операции (Mijake et al., J. Biol. Chem. 25: 5558-5564, 1977;, Eschbach et al., New Engl. J. Med. 316: 73-78, 1987; Sanford B.K, Blood, 177: 419-434, 1991; PCT WO 85-02610).

EPO из мочи человека впервые выделен у пациентов с апластической анемией Miyake et al. (Miyake et al., J. Biol. Chem., 252: 5558, 1977), но количество EPO из этого источника является недостаточным для использования в лечении анемии. Поскольку в публикации Патента США No. 4703008 описаны идентификация и клонирование гена EPO человека и экспрессия рекомбинантных белков EPO, крупномасштабного производства EPO достигли посредством ряда различных генетических манипуляций.

Поскольку полипептиды проявляют тенденцию к легкой денатурации из-за их низкой стабильности, к деградации протеолитическими ферментами в крови и легкому прохождению через почку или печень, белковые лекарственные средства, включающие полипептиды в качестве фармацевтически эффективных компонентов, необходимо часто вводить пациентам для поддержания желательного уровня концентраций и титров. Однако это частое введение белковых лекарственных средств, особенно посредством инъекции, вызывают боль у пациентов.

Для решения этих проблем множество усилий направлено на улучшение стабильности в сыворотке белковых лекарственных средств и поддержание лекарственных средств в крови на высоких уровнях в течение длительного периода времени и таким образом максимизации фармацевтической эффективности лекарственных средств. Для использования в составах длительного действия белковые лекарственные средства необходимо составлять, чтобы они обладали высокой стабильностью и сохраняли титры на достаточно высоких уровнях без вызова иммунных ответов у пациентов.

Для стабилизации белков и предотвращения ферментативной деградации и выведения почками, полимер, обладающий высокой растворимостью, такой как полиэтиленгликоль (PEG), общепринятым образом используют для химической модификации поверхности белкового лекарственного средства. Посредством связывания со специфическими или различными областями белка-мишени, PEG стабилизирует белок и предотвращает гидролиз, не вызывая тяжелых побочных эффектов (Sada et al., J. Fermentation Bio- engineering 71:137-139, 1991). Однако, несмотря на его способность увеличивать стабильность белка, пэгилирование вызывает такие проблемы, как большое снижение титров физиологически активных белков. Кроме того, выход снижается при увеличении молекулярной массы PEG из-за пониженной реакционной способности белков.

Альтернативным способом улучшения стабильности in vivo физиологически активных белков является соединение гена физиологически активного белка с геном, кодирующим белок, обладающий высокой стабильностью в сыворотке, способом генетической рекомбинации, и культивирование клеток, трансфицированных рекомбинантным геном, для получения слитого белка. Например, слитый белок можно получать конъюгацией альбумина, белка, как известно, наиболее эффективного для увеличения стабильности белка, или его фрагмента, с интересующим физиологически активным белком посредством генетической рекомбинации (Публикации PCT No. WO 93/15199 и WO 93/15200, Публикация Европейского Патента No. 413622).

Другим способом является использование иммуноглобулина. Как описано в Патенте США No. 5045312, гормон роста человека конъюгируют с бычьим сывороточным альбумином или мышиным иммуноглобулином с использованием сшивающего средства. Конъюгаты обладают улучшенной активностью по сравнению с некодифицированным гормоном роста. Карбодиимид или глутаральдегид используют в качестве сшивающего средства. Однако неспецифическое связывание пептидов с такими низкомолекулярными сшивающими средствами не позволяет образования гомогенных конъюгатов, и они даже являются токсичными in vivo. Кроме того, в этом патенте показано улучшение активности только благодаря химическому присоединению гормона роста. Способ согласно этому патенту не может обеспечивать улучшения активности для различных видов полипептидных лекарственных средств, так что в патенте не отмечены даже связанные со стабильностью белка факторы, такие как продолжительность действия, период полувыведения из крови и т.д.

Недавно предложен состав лекарственного средства, представляющий собой состав белкового лекарственного средства длительного действия с улучшением как продолжительности действия, так и стабильности in vivo. Для использования в составе лекарственного средства длительного действия, конъюгат белка получают ковалентным соединением физиологически активного полипептида, неполипептидного полимера и Fc-фрагмента иммуноглобулина (Патент Кореи No. 10-0567902 и 10-0725315).

По этому способу EPO можно использовать в качестве физиологически активного полипептида для получения конъюгата EPO длительного действия. Для применения конъюгатов EPO длительного действия в фармацевтических продуктах необходимо сохранять их фармацевтическую эффективность in vivo при ограничении физико-химических изменений, таких как индуцированные светом, нагреванием или добавками дегенерация, агрегация, адсорбция или гидролиз во время хранения и транспортировки. Конъюгаты EPO длительного действия более трудно стабилизировать, чем сам полипептид EPO, из-за их увеличенных объема и молекулярной массы.

Как правило, белки обладают очень коротким временем полужизни и при воздействии неподходящих температур, границ между водой и воздухом, высокого давления, физического/механического напряжения, органических растворителей, заражения микроорганизмами и т.д., они подвергаются такой дегенерации, как агрегация мономеров, преципитация из-за агрегации и адсорбция на поверхности контейнеров. При дегенерации белки теряют свои физико-химические свойства и физиологическую активность. После дегенерации белки почти не могут восстанавливать их исходные свойства, поскольку дегенерация является необратимой. В частности, в случае белков, которые вводят в следовых количествах сотен микрограмм на инъекцию, таких как EPO, когда они теряют стабильность и таким образом адсорбируются на поверхности контейнера, это приводит к относительно большому количеству повреждений. Кроме того, абсорбированные белки легко агрегируют в ходе процесса дегенерации, и агрегаты дегенерировавших белков, при введении в организм, действуют как антигены, в отличие от белков, синтезированных in vivo. Таким образом, белки необходимо вводить в стабильной форме. Проведено множество исследований для предотвращения дегенерации белков в растворах (John Geigert, J. Parenteral Sci. Tech., 43(5): 220-224, 1989; David Wong, Pharm. Tech., 34-48, 1997; Wei Wang., Int. J. Pharm., 185: 129-188, 1999; Willem Norde, Adv. Colloid Interface Sci., 25: 267-340, 1986; Michelle et. Al., Int. J. Pharm. 120: 179-188, 1995).

Лиофилизацию используют для некоторых белковых лекарственных средств для достижения цели стабильности. Однако, лиофилизированные продукты являются неудобными в том отношении, что их необходимо повторно растворять в воде для инъекций для использования. Кроме того, для них необходимы крупные вложения в лиофильные сушилки большой вместимости, поскольку процесс лиофилизации включен в процессы их получения. Предложено притирание белков с использованием распылительной сушилки. Однако, этот способ является экономически невыгодным из-за низкого выхода продукции. Кроме того, в процессе сушки распылением белки подвергают воздействию высоких температур, таким образом, оказывая отрицательное влияние на стабильность белков.

В качестве альтернативы для преодоления ограничений появились стабилизаторы, которые, при добавлении к белкам в растворе, могут ограничивать физико-химические изменения белковых лекарственных средств и поддерживать фармацевтическую эффективность in vivo даже после хранения в течение длительного периода времени. Среди них присутствуют углеводы, аминокислоты, белки, поверхностно-активные вещества, полимеры и соли. Среди прочих, человеческий сывороточный альбумин широко используют в качестве стабилизатора для различных белковых лекарственных средств, с сертификацией его эффективности (Edward Tarelli et al., Biologicals, 26: 331-346, 1998).

Типичный способ очистки человеческого сывороточного альбумина включает инактивацию биологических загрязнений, таких как микоплазма, прионы, бактерии и вирусы, или скрининг или выявление одного или нескольких биологических загрязнений или патогенов. Однако всегда существует риск, что пациенты подвергаются воздействию биологических загрязнений, поскольку они не полностью удалены или инактивированы. Например, проводят скрининг крови человека от доноров для проверки, содержит ли она конкретные вирусы. Однако этот способ не всегда надежен. В частности, конкретные вирусы, существующие в очень малых количествах, невозможно детектировать.

Недавно предложены альтернативы человеческому сывороточному альбумину, включая рекомбинантный альбумин (Публикация Патента Кореи в открытом доступе No. 10-2004-0111351) и свободный от альбумина эритропоэтин (Патенты Кореи No. 10-0560697 и 10-0596610).

Несмотря на использование стабилизаторов, свободных от альбумина, различные белки могут постепенно инактивироваться из-за их химических различий, поскольку их подвергают различным соотношениям и условиям в ходе хранения. Эффект стабилизатора на время хранения белков отличается от одного белка к другому. То есть, различные стабилизаторы можно использовать в различных соотношениях в зависимости от физико-химических свойств интересующих белков.

Кроме того, различные стабилизаторы, при одновременном использовании, могут оказывать почти обратные эффекты из-за конкуренции и их неправильного действия. Комбинация различных стабилизаторов также оказывает различные эффекты, поскольку они вызывают изменение характеристик или концентрации белков в ходе хранения. Поскольку каждый стабилизатор подходящим образом проявляет свою стабилизирующую активность в конкретном диапазоне концентраций, необходимо прикладывать много усилий для комбинации, с осторожностью, видов и концентраций различных стабилизаторов.

В частности, для конъюгатов EPO длительного действия, обладающих улучшенными продолжительностью действия и стабильностью in vivo, молекулярные массы и объемы достаточно отличаются от масс и объемов общепринятых соединений эритропоэтина, поскольку они состоят из физиологически активного пептида EPO, непептидных полимеров и Fc-фрагмента иммуноглобулина. Соответственно, стабилизаторы специальных составов, отличных от составов стабилизаторов EPO, необходимы для конъюгатов EPO длительного действия.

Приводящее к настоящему изобретению интенсивное и тщательное исследование по разработке стабильного жидкого состава конъюгатов EPO длительного действия, способного сохранять фармацевтическую эффективность в течение длительного периода времени без вирусной инфекции, привело к обнаружению того, что стабилизатор, содержащий буфер и высокую концентрацию маннита, обеспечивает улучшенную стабильность конъюгатов EPO длительного действия и позволяет формирование экономичных и стабильных жидких составов конъюгатов EPO длительного действия.

Описание изобретения

Техническая задача

Таким образом, целью настоящего изобретения является получение жидкого состава, содержащего конъюгат эритропоэтина длительного действия, в котором EPO, непептидный полимер и Fc-фрагмент иммуноглобулина ковалентно соединены, и свободный от альбумина стабилизатор, состоящий из буфера и маннита.

Решение задачи

В соответствии с вариантом его осуществления, настоящее изобретение относится к жидкому составу, содержащему конъюгат эритропоэтина длительного действия, в котором EPO, непептидный полимер и Fc-фрагмент иммуноглобулина соединены ковалентно, и свободный от альбумина стабилизатор, состоящий из буфера и маннита.

Термин «конъюгат эритропоэтина длительного действия» или «конъюгат EPO длительного действия» в рамках изобретения предназначен для обозначения белковой конструкции, в которой физиологически активный EPO, один или несколько непептидных полимеров и один или несколько Fc-фрагментов иммуноглобулинов соединены ковалентно, и который обладает увеличенной продолжительностью действия по сравнению с EPO в его природной форме.

Термин «длительного действия» в рамках изобретения относится к увеличенной продолжительности действия по сравнению с природной формой. Термин «конъюгат» относится к конструкции, в которой EPO, непептидный полимер и Fc-фрагмент иммуноглобулина соединены ковалентно.

Для использования по настоящему изобретению EPO обладает аминокислотной последовательностью эритропоэтина человека или близкородственных аналогов. EPO, пригодный по настоящему изобретению, может представлять собой природный белок или рекомбинантный белок. Также, EPO может представлять собой мутантный EPO, подвергнутый вставке, делеции или вставке аминокислот, при условии, что мутация не оказывает значительного влияния на его исходную биологическую активность.

EPO человека или его аналоги, пригодные по настоящему изобретению, можно выделять из позвоночных или можно химически синтезировать. Альтернативно, EPO или его аналоги можно получать из прокариот или эукариот, трансформированных геном, кодирующим EPO или его аналог, с использованием способа генетической рекомбинации. В этой связи, кишечные бактерии (например, E.coli), клетки дрожжей (например, S. cerevisiae), или клетки млекопитающих (например, клетки яичников китайского хомячка, клетки обезьяны) можно использовать в качестве клеток-хозяев. В зависимости от клеток-хозяев, рекомбинантный EPO или его аналоги могут являться гликозилированными углеводами млекопитающих или эукариот или агликозилированными. При экспрессии рекомбинантный EPO или его аналоги могут содержать начальный остаток метионина (положение -1). Предпочтительно, рекомбинантный EPO человека (HuEPO) получают с использованием клеток CHO в качестве хозяина.

Для использования по настоящему изобретению, Fc-фрагмент иммуноглобулина обладает аминокислотной последовательностью Fc-фрагмента иммуноглобулинов человека или их близкородственных аналогов. Fc-фрагменты можно получать из природных форм, выделенных из животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок. Кроме того, Fc-фрагмент иммуноглобулина может представлять собой Fc-фрагмент, полученный из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM, или Fc-фрагмент, полученный посредством их комбинаций или их гибридов. Предпочтительно, он является полученным из IgG или IgM, которые присутствуют среди наиболее распространенных белков в крови человека, и наиболее предпочтительно, из IgG, который, как известно, увеличивает периоды времени полужизни лиганд-связывающих белков. В настоящем изобретении, Fc иммуноглобулина можно получать из природного иммуноглобулина посредством выделения полноразмерных иммуноглобулинов из организмов человека или животных и их обработки протеолитическим ферментом, или он может представлять собой их рекомбинантные формы или производные, полученные из трансформированных клеток животных или микроорганизмов. Предпочтительным является рекомбинантный Fc иммуноглобулина человека, продуцируемый трансформантами E. coli.

С другой стороны, IgG подразделяют на подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и настоящее изобретение включает в себя их комбинации и гибриды. Предпочтительными являются подклассы IgG2 и IgG4, и наиболее предпочтительным является Fc-фрагмент IgG4, редко обладающий эффекторными функциями, такими как CDC (комплементзависимая цитотоксичность). То есть, в качестве носителя лекарственного средства по настоящему изобретению, наиболее предпочтительным Fc-фрагментом иммуноглобулина является полученный из IgG4 человека агликозилированный Fc-фрагмент. Происходящий из человека Fc-фрагмент является более предпочтительным, чем происходящий не из человека Fc-фрагмент, который может действовать как антиген в организме человека и вызывать нежелательные иммунные ответы, такие как продукция нового антитела против антигена.

Конъюгат EPO длительного действия, пригодный по настоящему изобретению, получают соединением вместе EPO и Fc-фрагмента иммуноглобулина. В этом отношении, EPO и Fc-фрагмент иммуноглобулина можно сшивать посредством непептидного полимера или можно формировать слитый белок с использованием рекомбинантного способа.

Непептидный полимер для использования для пришивки может являться выбранным из группы, состоящей из биоразлагаемых полимеров, жидких полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинаций. Биоразлагаемый полимер можно выбирать из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимеров этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированых полиолов, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, поливинилэтилэфира, PLA (поли(молочной кислоты), PLGA (полимолочной-гликолевой кислоты) и их комбинаций. Наиболее предпочтительным является поли(этиленгликоль) (PEG), с предпочтением для полиэтиленгликоля. Также их производные, хорошо известные в данной области и поддающиеся легкому получению в пределах знаний в данной области, включены в объем настоящего изобретения.

Конъюгаты EPO длительного действия, пригодные по настоящему изобретению, можно получать с использованием способа генной инженерии, как описано в Патенте Кореи No. 10-0725315.

Жидкий состав в соответствии с настоящим изобретением содержит конъюгат EPO длительного действия в терапевтически эффективном количестве. Как правило, терапевтически эффективное количество EPO лежит в диапазоне от 2000 до 10000 международных единиц (IU) на одноразовую ампулу. Концентрация конъюгатов EPO длительного действия, используемых по настоящему изобретению, составляет порядка 1-5000 мкг/мл, и предпочтительно порядка 50-3000 мкг/мл.

В рамках изобретения термин «стабилизатор» предназначен для обозначения вещества, позволяющего безопасное хранение конъюгата EPO длительного действия. Термин «стабилизация» предназначен для обозначения потери активного ингредиента не более предопределенного отношения, как правило, не более 10%, в течение конкретного периода времени в условиях хранения. Когда EPO сохраняет 90% или более от его исходной активности и предпочтительно, 95% или выше от его исходной активности после хранения при 10°C в течение 2 лет, при 25°C в течение 6 месяцев или при 40°C в течение одной – двух недель, его считают стабильным. Что касается таких белков, как EPO, их стабильность при хранении является важной для подавления потенциального образования подобных EPO антигенных материалов, так же как для обеспечения введения точных количеств. Во время хранения приблизительно 10% потери активности EPO можно рассматривать как допустимое для введения, если EPO в составе не агрегирован или не фрагментирован с образованием антигенных материалов.

Стабилизатор, пригодный для использования по настоящему изобретению, содержит забуференный раствор, составленный для обеспечения стабильности конъюгата EPO длительного действия, и маннит.

Кроме того, стабилизатор в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно свободен от альбумина. Из-за того, что он получен из крови человека, человеческий сывороточный альбумин, доступный в качестве стабилизатора для белков, обладает возможностью контаминации полученными от человека патогенными вирусами. Желатин или бычий сывороточный альбумин могут вызывать заболевания или индуцировать аллергическую реакцию у некоторых пациентов. Свободный от сывороточного альбумина человеческого или животного происхождения, или гетерогенных белков, таких как очищенный желатин, стабилизатор в соответствии с настоящим изобретением освобождает от опасений относительно вирусной инфекции.

Маннит, вид сахарного спирта, используют в стабилизаторе по настоящему изобретению, поскольку он действует для увеличения стабильности конъюгата EPO длительного действия. Маннит используют предпочтительно в концентрации от 1 до 20% (масс./об.) на основе общего объема состава, более предпочтительно, в концентрации от 3 до 12% (масс./об.) и наиболее предпочтительно, в концентрации от 5 до 10% (масс./об.).

В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, когда маннит в присутствии забуференного фосфатом раствора использовали в качестве стабилизатора, показали, что стабильность при хранении конъюгата EPO длительного действия увеличивалась более сильно, чем когда использовали общепринятые стабилизаторы, включая сорбит, мальтозу, PEG400 и аминокислоты (см. таблицу 1). При использовании по настоящему изобретению обнаружили, что мальтоза, используемая в качестве стабилизатора в находящейся в открытом доступе Публикации патента Японии No. 2009-249292, уменьшала стабильность конъюгата EPO длительного действия при увеличении времени хранения (см. Таблицу 8).

Эти данные выявили специфичность маннита в качестве стабилизатора для конъюгата EPO длительного действия по сравнению с другими стабилизаторами, указывая на необходимость различных стабилизаторов в соответствии с мишенями, нуждающимися в стабилизации.

Буферный раствор в стабилизаторе играет роль в поддержании pH жидкого состава постоянным для предотвращения колебаний pH, таким образом, стабилизируя конъюгат EPO длительного действия. Буферный раствор, пригодный по настоящему изобретению, может содержать фармацевтически пригодные забуферивающие pH средства, включая щелочные соли (фосфат натрия или калия, их гидро- или дигидро-соли), цитрат натрия/лимонную кислоту, ацетат натрия/уксусную кислоту и их комбинацию. Пригодными для использования по настоящему изобретению являются цитратный буфер, фосфатный буфер, тартратный буфер, карбонатный буфер, сукцинатный буфер, лактатный буфер и ацетатный буфер, с предпочтением для фосфатного буфера и цитратного буфера, с большим предпочтением для фосфатного буфера. В фосфатном буфере концентрация фосфата предпочтительно лежит в диапазоне от 5 до 100 мМ и более предпочтительно, от 10 до 50 мМ. Буфер предпочтительно обладает pH 4,0-8,0 и более предпочтительно, pH 5,0-7,0.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, стабилизатор, пригодный по настоящему изобретению, может дополнительно содержать по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из изотонических средств, полигидроспиртов, сахаров, неионных поверхностно-активных веществ и нейтральных аминокислот, в дополнение к буферному раствору и манниту.

Изотоническое средство действует не только для поддержания пригодного осмотического давления, когда конъюгату EPO длительного действия в жидком составе позволяют проникать в организм, но и для дополнительной стабилизации конъюгата EPO длительного действия в жидком составе. Примеры изотонического средства включают в себя водорастворимые неорганические соли. Среди них присутствуют хлорид натрия, сульфат натрия, цитрат натрия, хлорид кальция и их комбинация. Наиболее предпочтительным является хлорид натрия.

Предпочтительно, концентрация изотонического средства составляет порядка 5-200 мМ. В пределах этого диапазона концентрацию изотонического средства можно регулировать в соответствии с видами и количествами содержащихся компонентов, так чтобы жидкий состав являлся изотоническим.

В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, влияние на стабильность конъюгата EPO длительного действия в присутствии буферного раствора оценивали для различных видов солей. В результате обнаружили, что жидкие составы, содержащие сульфат натрия, хлорид натрия, цитрат натрия или комбинацию сульфата натрия и хлорида натрия, вместе с забуференным фосфатом раствором, увеличивали стабильность конъюгата EPO длительного действия, по сравнению с жидкими составами, свободными от солей (см. таблицу 2). Из данных понятно, что конъюгат EPO длительного действия по настоящему изобретению является стабилизированным до различной степени в зависимости от видов используемых солей и обладает наивысшей стабильностью с некоторыми солями.

Предпочтительные примеры сахара, который может дополнительно содержаться для увеличения стабильности при хранении конъюгата EPO длительного действия, включают в себя моносахариды, такие как манноза, глюкоза, фукоза и ксилоза, и полисахариды, такие как лактоза, мальтоза, сахароза, рафиноза и декстран. В жидком составе сахар предпочтительно используют в количестве от 1 до 20% (масс./об.) и более предпочтительно, используют в количестве от 5 до 20% (масс./об.). Примеры полигидроспирта, пригодного по настоящему изобретению, включают в себя пропиленгликоль, низкомолекулярный полиэтиленгликоль, глицерин и низкомолекулярный полипропиленгликоль. Их можно использовать по отдельности или в комбинации. И их концентрация в жидком составе предпочтительно составляет порядка 1-15% (масс./об.) и более предпочтительно, порядка 5-15% (масс./об.).

Что касается неионного поверхностно-активного вещества, уменьшающего поверхностное натяжение раствора белка для предотвращения адсорбции или агрегации белков на гидрофобных поверхностях, неионные поверхностно-активные вещества на основе полисорбата и неионные поверхностно-активные вещества на основе полоксамера пригодны для использования по настоящему изобретению. Их можно использовать по отдельности или в комбинации. Предпочтительными являются неионные поверхностно-активные вещества на основе полисорбата. Среди них присутствуют полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60 и полисорбат 80, с большим предпочтением для полисорбата 80.

Не рекомендуется использовать неионное поверхностно-активное вещество в высокой концентрации, поскольку неионное поверхностно-активное вещество, если присутствует в высокой концентрации, индуцирует интерференцию при УФ-спектрометрии или изофокусировке, что делает сложной точную оценку концентрации или стабильности белка. Таким образом, жидкий состав по настоящему изобретению может содержать неионное поверхностно-активное вещество, предпочтительно в концентрации 0,1% (масс./об.) или менее, и более предпочтительно, в концентрации от 0,001 до 0,05% (масс./об.).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения неионные поверхностно-активные вещества анализировали по эффекту на стабильность белка в присутствии фосфатного буфера. Обнаружено, что в ходе времени хранения, настолько короткого, как одна неделя, неионные поверхностно-активные вещества оказывают небольшое влияние на стабильность конъюгата EPO длительного действия (см. таблицу 3). Также при использовании неионного поверхностно-активного вещества полисорбата 80 обнаружили, что конъюгат EPO длительного действия являлся более стабилизированным в ходе хранения с помощью стабилизатора, содержащего 0,01% полисорбат 80, а не 0,1% полисорбат 80 (см. таблицу 4).

Аминокислота, также доступная в качестве стабилизатора для жидкого состава, действует для привлечения большего количества молекул воды в раствор вокруг EPO, так что внешние молекулы гидрофильных аминокислот EPO дополнительно стабилизированы (Wang, Int. J. Pharm. 185: 129-188, 1999). В этой связи, заряженные аминокислоты могут индуцировать электростатическое притяжение EPO, чтобы способствовать агрегации EPO. Таким образом, нейтральные аминокислоты, такие как глицин, аланин, лейцин и изолейцин, добавляют в качестве стабилизирующего компонента. В жидком составе нейтральную аминокислоту предпочтительно используют в концентрации от 0,1 до 10% (масс./об.).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мальтоза обеспечивала более высокую стабильность при хранении конъюгатов EPO длительного действия при использовании в сочетании с глицином, чем отдельно. Однако, наблюдали, что обработка маннитом в концентрации, настолько высокой, как 3-12% (масс./об.) обеспечивала более высокую стабильность даже в отсутствие нейтральных аминокислот, чем обработка комбинацией мальтозы и глицина (см. таблицу 10).

Соответственно, жидкий состав для обеспечения высокой стабильности конъюгатов EPO длительного действия можно получать с использованием высокой концентрации маннита даже без добавления нейтральных аминокислот. Однако, концентрация маннита, превышающая 20% (масс./об.) выходит за верхний предел изотоничности. Таким образом, маннит используют в концентрации от 1 до 20% в жидком составе, предпочтительно, в концентрации от 3 до 12% (масс./об.), и более предпочтительно, в концентрации от 5 до 10% (масс./об.).

В дополнение к вышеуказанным компонентам, включая буфер, изотоническое средство, сахарный спирт, нейтральную аминокислоту и неионное поверхностно-активное вещество, жидкий состав по настоящему изобретению может дополнительно избирательно содержать другие компоненты, известные в данной области, пока они не ухудшают эффект по настоящему изобретению.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения жидкий состав не содержит альбумина и может содержать буферный раствор, маннит, изотоническое средство и неионное поверхностно-активное вещество.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к жидкому составу, содержащему конъюгат EPO длительного действия и стабилизатор, где стабилизатор содержит фосфатный или цитратный буфер, маннит, изотоническое средство и полисорбат 80, где изотоническое средство выбрано из группы, состоящей из хлорида натрия, сульфата натрия, цитрата натрия и их комбинации. Предпочтительно, жидкий состав содержит фосфатный или цитратный буферный раствор в концентрации от 5 до 100 мМ, маннит в концентрации от 1 до 20% (масс./об.), изотоническое средство в концентрации от 5 до 200 мМ, изотоническое средство, выбранное из группы, состоящей из хлорида натрия, сульфата натрия и цитрата натрия, и полисорбат 80 в концентрации от 0,001 до 0,05% (масс./об.). Более предпочтительно, жидкий состав содержит фосфатный буферный раствор в концентрации от 5 до 100 мМ, маннит в концентрации от 3 до 12% (масс./об.), хлорид натрия в концентрации от 100 до 200 мМ и полисорбат 80 в концентрации от 0,001 до 0,05% (масс./об.). Наиболее предпочтительно, жидкий состав содержит буфер фосфат натрия (pH 6,5) в концентрации 10 мМ, маннит в концентрации от 5 до 10% (масс./об.), натрий в концентрации от 100 до 200 мМ и полисорбат 80 в концентрации от 0,001 до 0,05% (масс./об.), и не содержит нейтральных аминокислот.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения жидкий состав для конъюгатов EPO длительного действия, содержащий натрий-фосфатный буферный раствор в концентрации 10 мМ (pH 6,5), маннит в концентрации от 5 до 10% (масс./об.), хлорид натрия в концентрации от 100 до 200 мМ и полисорбат 80 в концентрации от 0,001 до 0,05% (масс./об.), сравнивали с известным составом EPO Рекормон, Roche, по стабильности EPO при хранении. Обнаружили, что EPO являлся более стабильным в жидком составе по настоящему изобретению, чем в коммерчески доступном составе (см. таблицы 6 и 14).

Также жидкий состав для EPO в соответствии с настоящим изобретением сравнивали с другими составами, такими как Аранесп, лекарственное средство против анемии, производимое Amgen, Энбрел (TNFR-Fc), лекарственное средство против ревматоидного артрита, производимое Amgen, и PBS отдельно, по стабильности EPO при хранении. В результате, для жидкого состава для конъюгатов EPO длительного действия в соответствии с настоящим изобретением показали более высокую стабильность, чем для любого другого жидкого состава (см. таблицу 17).

В другом варианте осуществления жидкий состав для конъюгатов EPO длительного действия в соответствии с настоящим изобретением анализировали по долговременной стабильности и обнаружили, что он сохранял конъюгаты EPO длительного действия стабильными в течение 12 месяцев и обеспечивал по меньшей мере 92,5% активности даже после 6 месяцев хранения в условиях ускоренных испытаний (см. таблицы 19-21).

Из этих данных понятно, что жидкий состав, содержащий буфер и маннит в концентрации от 1 до 20% (масс./об.), может сохранять в нем конъюгат EPO длительного действия стабильным в течение 12 месяцев или дольше даже в отсутствие нейтральных аминокислот.

Полезные эффекты изобретения

Являясь свободным от человеческого сывороточного альбумина и других потенциально опасных для организма факторов, жидкий состав для конъюгатов эритропоэтина длительного действия в соответствии с настоящим изобретением освобождает от опасений относительно вирусных инфекций и обеспечивает отличную стабильность при хранении конъюгатов EPO длительного действия, в которых EPO и Fc-фрагмент иммуноглобулина связаны, и которые обладают большей молекулярной массой и большей продолжительностью действия, чем природные формы EPO. Даже без содержания нейтральных аминокислот, жидкий состав по настоящему изобретению может обеспечивать отличную стабильность при хранении EPO, таким образом, являясь экономически более преимущественным, чем другие стабилизаторы и лиофилизирующие средства.

Краткое описание фигур

ФИГ. 1 представляет собой график, показывающий стабильность EPO в различных жидких составах для конъюгата EPO длительного действия и в коммерчески доступном составе EPO Рекормон, при их анализе с использованием обращеннофазовой хроматографии каждую неделю для продолжительности хранения при 40°C в течение четырех недель.

ФИГ. 2 представляет собой график, показывающий стабильность конъюгата EPO длительного действия в жидком составе, содержащем фосфатный буфер pH 6,5, хлорид натрия, маннит и полисорбат 80 при его анализе с использованием обращеннофазовой хроматографии и эксклюзионной хроматографии каждые два месяца для продолжительности хранения при 4°C в течение 12 месяцев.

ФИГ. 3 представляет собой график, показывающий стабильность конъюгата EPO длительного действия в жидком составе, содержащем фосфатный буфер pH 6,5, хлорид натрия, маннит и полисорбат 80 при его анализе с использованием анализа in vitro каждые два месяца для продолжительности хранения при 4°C в течение 12 месяцев.

Способ осуществления изобретения

Лучшее понимание настоящего изобретения можно получить посредством следующих примеров, которые приведены для иллюстрации, но которые не следует рассматривать как ограничивающие настоящее изобретение.

ПРИМЕР 1: Конструирование конъюгата EPO длительного действия

<1-1> Получение Fc-фрагмента иммуноглобулина с использованием иммуноглобулина

Fc-фрагмент иммуноглобулина, пригодный по настоящему изобретению, представлял собой агликозилированный Fc-фрагмент IgG4 человека, который можно экспрессировать в трансформанте E. coli, как описано в Патенте Кореи No. 725314.

<1-2> Получение рекомбинантного эритропоэтина человека

EPO человека, использованный в этом примере, получали, как описано в Патенте Кореи No. 880509. Для этого линию клеток животных, трансформированную вектором, способным к сильному увеличению эффективности амплификации гена посредством искусственного ослабления промотора гена дигидрофолатредуктазы, который представляет собой последовательность контроля транскрипции гена, культивировали для экспрессии белков EPO человека. Только высокогликозилированные белки очищали для использования.

<1-3> Получение конъюгата EPO длительного действия с использованием Fc-фрагмента иммуноглобулина

Конъюгат EPO длительного действия в этом примере представлял собой конструкцию, в которой эритропоэтин и Fc-фрагмент иммуноглобулина человека ковалентно связаны посредством непептидного полимера. И его получали, как описано в Патентах Кореи No. 725315 и 775343.

ПРИМЕР 2: Анализ конъюгатов EPO длительного действия по стабильности в зависимости от различных стабилизаторов

В присутствии фосфатного буфера различные стабилизаторы, включая сахара, сахарные спирты, полигидроспирты и аминокислоты, анализировали по их способности стабилизировать конъюгат EPO длительного действия.

Для анализа Na-фосфатный буфер использовали в качестве фосфатного буфера, маннит или сорбит - в качестве сахарного спирта, гистидин или метионин - в качестве сахарного спирта, мальтозу – в качестве сахара и PEG 400 – в качестве полигидроспирта.

После хранения при 40°C в течение одной недели в композициях, перечисленных в таблице 1, для проведения анализа проводили обращеннофазовую хроматографию. Результаты обобщены в таблице 1, ниже. Степень удержания конъюгата EPO длительного действия по сравнению с исходным значением выражена как RPC (%) (площадь, % / исходная площадь, %).

Таблица 1 № EPO Буфер Стабилизатор RPC (%) 1 200 мкг/мл 10 мМ Na-фосфат, pH 6,5 1% маннит 95,2 2 200 мкг/мл 10 мМ Na-фосфат, pH 6,5 1 мМ гистидин 86,2 3 200 мкг/мл 10 мМ Na-фосфат, pH 6,5 1 мМ Метионин 76,1 4 200 мкг/мл 10 мМ Na-фосфат, pH 6,5 10% мальтоза 93,5 5 200 мкг/мл 10 мМ Na-фосфат, pH 6,5 1% PEG 400 92,8 6 200 мкг/мл 10 мМ Na-фосфат, pH 6,5 1% сорбит 92,7

Как очевидно из данных таблицы 1, использование маннита в качестве стабилизатора сохраняло конъюгат EPO длительного действия наиболее стабильным.

ПРИМЕР 3: Анализ конъюгатов EPO длительного действия по стабильности в зависимости от солей

В присутствии фосфатного буфера различные соли анализировали по способности стабилизировать конъюгат EPO длительного действия, следующим образом. Соли, такие как щелочные соли и неорганические соли, служат не только забуферивающими pH средствами для обеспечения конъюгата длительного действия дополнительной стабильностью pH, но и в качестве изотонических средств для поддержания соответствующего осмотического давления.

После хранения при 40°C в течение одной недели в композициях, перечисленных в таблице 2, для проведения анализа проводили обращеннофазовую хроматографию. Для анализа буфер фосфат натрия (pH 6,5) использовали в качестве буфера, в то время как хлорид меди (II), сульфат натрия, цитрат натрия и карбонат натрия использовали в качестве солей. Результаты обобщены в таблице 2, ниже. Степень удержания конъюгата EPO длительного действия по сравнению с исходным значением выражена как RP-HPLC (%).

Таблица 2 № EPO Буфер Соль RP-HPLC (%) 1 200 мкг/мл 10 мМ Na-фосфат, pH 6,5 - 94,6 2 200 мкг/мл 10 мМ Na-фосфат, pH 6,5 30 мМ CuCl₂ 81,6 3 200 мкг/мл 10 мМ Na-фосфат, pH 6,5 40 мМ Na₂SO₄ 98,1 4 200 мкг/мл 10 мМ Na-фосфат, pH 6,5 200 мМ NaCl 97,0 5 200 мкг/мл 10 мМ Na-фосфат, pH 6,5 10 мМ Na-цитрат 97,5 6 200 мкг/мл 10 мМ Na-фосфат, pH 6,5 10 мМ Na₂CO₃ 83,2 7 200 мкг/мл 10 мМ Na-фосфат, pH 6,5 20 мМ Na₂SO₄/
100 мМ NaCl 97,7

Как очевидно из данных таблицы 2, стабильность конъюгата EPO длительного действия увеличивалась, когда сульфат натрия, хлорид натрия, цитрат натрия или комбинацию сульфата натрия и хлорида натрия использовали в присутствии фосфатного буфера, по сравнению с контролем, к которому ни один из них не добавляли. В отличие от этого, стабильность конъюгата EPO длительного действия уменьшалась в присутствии хлорида меди (II) по сравнению с контролем.

Из данных понятно, что конъюгат EPO длительного действия по настоящему изобретению является стабилизированным до различной степени в зависимости от видов используемых солей и обладает большей стабильностью с некоторыми солями.

ПРИМЕР 4: Анализ конъюгатов EPO длительного действия по стабильности в зависимости от неионного поверхностно-активного вещества

В присутствии фосфатного буфера различные неионные поверхностно-активные вещества анализировали по способности стабилизировать конъюгат EPO длительного действия, следующим образом.

Для анализа полисорбат 80 использовали в качестве поверхностно-активного вещества, и другие средства, как показано, придающие стабильность конъюгату EPO длительного действия, включая соли, сахарные спирты и сахара, использовали в нужной комбинации.

Для простоты, хлорид натрия был выбран из подтвержденных солей, включающих хлорид натрия, сульфат натрия и цитрат натрия. Также использовали маннит, как доказано в примере 1, обеспечивающий наибольшую стабильность. В тех же условиях, когда EPO доводили до 200 мкг/мл в 10 мМ буфере фосфате натрия (pH 6,5), конъюгат EPO длительного действия по настоящему изобретению хранили при 40°C в течение одной недели в композициях, перечисленных в таблице 3, с последующим анализом обращеннофазовой хроматографией. Результаты обобщены в таблице 3, ниже. Степень удержания конъюгата EPO длительного действия по сравнению с исходным значением выражена как RP-HPLC (%).

Таблица 3 № Поверхностно-активное вещество Соль Стабилизатор RP-HPLC (%) 1 - 10 мМ NaCl 10% маннит 96,5 2 0,005% полисорбат 80 10 мМ NaCl 10% маннит 97,8

В условиях фосфатного буфера, как видно в таблице 3, стабильность EPO немного колебалась вне зависимости от присутствия неионного поверхностно-активного вещества, что указывает на то, что неионное поверхностно-активное вещество действительно оказывает значительные эффекты на стабильность EPO на протяжении настолько короткого времени, как одна неделя.

Также проводили проверку эффекта концентрации неионного поверхностно-активного вещества на стабильность конъюгата EPO длительного действия. В тех же условиях, когда EPO доводили до 200 мкг/мл в 10 мМ буфере фосфате натрия (pH 6,5), конъюгат EPO длительного действия по настоящему изобретению хранили при 40°C в течение двух недель в композициях, перечисленных в таблице 4, с последующим анализом обращеннофазовой хроматографией. Результаты обобщены в таблице 4, ниже. Степень удержания конъюгата EPO длительного действия по сравнению с исходным значением выражена как RP-HPLC (%).

Таблица 4

№ Поверхностно-активное вещество Соль Стабилизатор 1 неделя (%) 2 недели (%) 1 0,1% полисорбат 80- 150 мМ NaCl 5% маннит 95,9 91,8 2 0,01% полисорбат 80 150 мМ NaCl 5% маннит 98,4 93,7

Обнаружили, что для продолжительности хранения две недели, как показано в таблице 4, конъюгат EPO длительного действия являлся более стабильным в жидком составе, содержащем 5% маннит и 150 мМ хлорид натрия в буфере 10 мМ фосфате натрия (pH 6,5), когда его дополняли 0,01% полисорбатом 80, по сравнению с 0,1% полисорбатом 80.

ПРИМЕР 5: Сравнение жидких составов для конъюгатов EPO длительного действия (I)

В отношении стабильности при хранении, коммерчески доступный жидкий состав EPO Рекормон (Roche) сравнивали с жидким составом для конъюгата EPO длительного действия по настоящему изобретению. Состав Рекормона, хотя и остается нуждающимся в подтверждении, включает в себя фосфат натрия в качестве буфера, полисорбат 20 в качестве поверхностно-активного вещества, хлорид натрия в качестве соли и мочевину, CaCl, глицин, лейцин, изолейцин, треонин, глутаминовую кислоту и фенилаланин в качестве стабилизаторов.

Для жидких составов конъюгатов EPO длительного действия по настоящему изобретению полисорбат 80 использовали в качестве поверхностно-активного вещества в различных концентрациях от 0,1 до 0,005%, хлорид натрия в качестве соли в концентрациях 150 и 200 мМ, и маннит или мочевину в качестве стабилизатора в различных концентрациях от 1 до 10% (масс./об.). Конъюгат EPO длительного действия по настоящему изобретению хранили при 40°C в течение двух недель в композициях, перечисленных в таблице 5, с последующим анализом обращеннофазовой хроматографией и эксклюзионной хроматографией (SE-HPLC). Результаты обобщены в таблице 6, ниже. Степень удержания конъюгата EPO длительного действия по сравнению с исходным значением выражена как RP-HPLC (%) и SE-HPLC (%).

Таблица 5 No Наименование Конц. Буфер Поверхностно-активное вещество Стабилизатор Соль 1 Рекормон 138 мкг/мл Na-фосфат P.S 20 Мочевина, CaCl, Gly, Leu, Ile, Thr, Glu, Phe NaCl 2 Конъюгат EPO длительного действия 200 мкг/мл 10 мМ Na-фосфат, pH 6,5 0,005% P.S80 10% маннит 200 мМ NaCl 3 Конъюгат EPO длительного действия 200 мкг/мл 10 мМ Na-фосфат, pH 6,5 0,005% P.S80 1% маннит 150 мМ NaCl 4 Конъюгат EPO длительного действия 200 мкг/мл 10 мМ Na-фосфат, pH 6,5 0,01% P.S80 5% маннит 150 мМ NaCl 5 Конъюгат EPO длительного действия 200 мкг/мл 10 мМ Na-фосфат, pH 6,5 0,1% P.S80 5% маннит 150 мМ NaCl 6 Конъюгат EPO длительного действия 200 мкг/мл 10 мМ Na-цитрат, pH 6,5 0,01% P.S80 5% маннит 150 мМ NaCl 7 Конъюгат EPO длительного действия 200 мкг/мл 10 мМ Na-фосфат, pH 6,5 0,01% P.S80 25 мМ мочевина, 5% маннит 150 мМ NaCl

Таблица 6 RP-HPLC (%) SE-HPLC (%) Старт Неделя 1 Неделя 2 Старт Неделя 1 Неделя 2 1 100 95,7 92,7 100 99,5 98,3 2 100 98,7 100 99,3 3 100 98,3 93,3 100 99,8 99,0 4 100 98,4 93,7 100 100,7 100,0 5 100 95,9 91,8 100 97,4
(расширение пика) 91,5 6 100 98,8 93,9 100 100,7 100,1 7 100 98,6 79,0 100 100,4 99,5

Для продолжительности хранения две недели, как показано в таблице 6, все из жидких составов по настоящему изобретению обеспечивали более высокую стабильность EPO, чем Рекормон, за исключением состава No. 5 с 0,1% полисорбатом 80 в качестве поверхностно-активного вещества и состава No. 7 с мочевиной в качестве стабилизатора.

ПРИМЕР 6: Поиск стабилизаторов, способных придавать стабильность при хранении конъюгату EPO длительного действия

Для поиска стабилизаторов, которые могут стабилизировать конъюгаты EPO длительного действия для продолжительности хранения в течение длительного времени, жидкие составы для конъюгата EPO длительного действия получали с составами из таблицы 7, ниже. В этой связи, глицин и метионин по отдельности добавляли к композиции поверхностно-активное вещество-хлорид натрия-мальтоза для проверки эффекта аминокислот на стабильность при длительном хранении. В жидких составах концентрацию EPO доводили до 200 мкг/мл в буфере 10 мМ фосфате натрия (pH 6,5).

При хранении при 40°C в течение четырех недель жидкие составы для конъюгата EPO длительного действия анализировали каждую неделю с использованием обращеннофазовой хроматографии. Результаты обобщены в таблице 8, ниже. Степень удержания конъюгата EPO длительного действия по сравнению с исходным значением выражена как RP-HPLC (%).

Таблица 7 No. Поверхностно-активное вещество Соль Стабилизатор 1 0,005% полисорбат 80 200 мМ NaCl 10% мальтоза 2 0,005% полисорбат 80 200 мМ NaCl 10% мальтоза + 1% глицин 3 0,005% полисорбат 80 200 мМ NaCl 10% мальтоза + 1 мМ метионин

Таблица 8 RP-HPCL (%) Неделя 1 Неделя 2 Неделя 3 Неделя 4 1 99,12 94,26 94,27 70,66 2 97,81 9660 95,29 92,43 3 70,14 57,46 28,34 15,40

Для продолжительности хранения четыре недели, как показано в таблице 8, обнаружили, что конъюгат EPO длительного действия являлся наиболее стабильным в жидком составе, содержащем хлорид натрия в сочетании с мальтозой и глицином в качестве стабилизаторов. После двух недель хранения детектировали сходную стабильность при хранении между жидкими составами, в которых 10% мальтозу использовали отдельно и в сочетании с 1% глицином, соответственно. Однако, использование одной 10% мальтозы значительно уменьшало стабильность после хранения в течение четырех недель. В отличие от этого, обнаружили, что использование 10% мальтозы в сочетании с 1% глицином поддерживало высокую стабильность после хранения в течение четырех недель.

Что касается сравнения между жидкими составами No. 2 и 3, метионин значительно снижал стабильность конъюгата EPO длительного действия, указывая на то, что нейтральные аминокислоты, особенно глицин, могут вносить большой вклад в стабильность конъюгата EPO длительного действия при длительном хранении.

ПРИМЕР 7: Анализ маннита и мальтозы для стабильности при длительном хранении конъюгата EPO длительного действия

Получали три жидких состава, как приведено в таблице 9, ниже: жидкий состав, содержащий мальтозу-глицин, для которого показали наивысшую стабильность конъюгата EPO длительного действия в примере 6; такой же жидкий состав, за исключением того, что маннит использовали вместо мальтозы; и жидкий состав, содержащий только маннит. Их анализировали по стабильности при длительном хранении. В жидких составах концентрацию EPO доводили до 200 мкг/мл в буфере 10 мМ фосфате натрия (pH 6,5).

Во время хранения при 40°C в течение четырех недель, жидкие составы для конъюгата EPO длительного действия анализировали каждую неделю с использованием обращеннофазовой хроматографии. Результаты обобщены в таблице 10, ниже. Степень удержания конъюгата EPO длительного действия по сравнению с исходным значением выражена как RP-HPLC (%). Также, данные таблицы 10 изображены на графике на ФИГ. 1, где экстраполированы значения для коммерчески доступного состава EPO Рекормон.

Таблица 9 Поверхностно-активное вещество Соль Стабилизатор 1 0,005% полисорбат 80 200 мМ NaCl 10% мальтоза, 1% глицин 2 0,005% полисорбат 80 200 мМ NaCl 10% маннит, 1% глицин 3 0,005% полисорбат 80 200 мМ NaCl 10% маннит

Таблица 10 RP-HPCL (%) Старт Неделя 1 Неделя 2 Неделя 3 Неделя 5 1 100 96,6 94,7 93,9 92,0 2 100 97,8 95,5 95,8 93,5 3 100 97,8 96,0 95,1 93,4

Для продолжительности хранения пять недель, как показано в таблице 10, обнаружено, что конъюгат EPO длительного действия являлся более стабильным в жидком составе, содержащем маннит-глицин, по сравнению с мальтозой-глицином в качестве стабилизаторов. Сравнимую стабильность при хранении детектировали в жидком составе, содержащем только маннит.

Эти результаты составляют разительный контраст с тем фактом, что у жидкого состава, содержащего только мальтозу, значительно уменьшена стабильность при хранении по сравнению с жидким составом, содержащим мальтозу и глицин, что указывает на то, что маннит может обеспечивать стабильность при длительном хранении конъюгата EPO длительного действия даже без помощи нейтральных аминокислот. Также, обнаружили, что использование маннита в концентрации настолько высокой, как 5-15% (масс./об.), позволяет хранение конъюгата EPO и сохранение его высокой стабильности даже в отсутствие нейтральных аминокислот.

ПРИМЕР 8: Анализ буфера по стабильности при длительном

хранении конъюгата EPO длительного действия

Буферы анализировали по способности стабилизировать конъюгат EPO длительного действия. Также, проводили проверку связи между стабильностью конъюгатов EPO длительного действия и дозами солей и сахарных спиртов, следующим образом.

Сначала исследовали эффекты буферов на стабильность конъюгатов EPO длительного действия с использованием жидких составов, которые составляли с 0,01% полисорбатом, 150 мМ хлоридом натрия и фосфатным или цитратным буфером, как показано в таблице 11 (No. 1 и 2). Жидкие составы содержали высокую концентрацию (5%) маннита в качестве стабилизатора, но никаких аминокислот, и конъюгат EPO длительного действия добавляли в концентрации 200 мкг/мл. Составы хранили при 40°C в течение четырех недель, на протяжении этого времени жидкие составы для конъюгата EPO длительного действия анализировали на неделе 1 и неделе 4 с использованием обращеннофазовой хроматографии. Результаты обобщены в таблице 12 (No.1 и 2), ниже. Степень удержания конъюгата EPO длительного действия по сравнению с исходным значением выражена как RP-HPLC (%).

Такой же жидкий состав, содержащий маннит, как в примере 7, такой же жидкий состав, но содержащий цитратный буфер вместо фосфатного буфера, и такой же жидкий состав, но содержащий половину количеств соли и сахарного спирта, проверяли по их эффекту на стабильность конъюгата EPO длительного действия.

В жидких составах концентрацию конъюгата EPO длительного действия доводили до 200 мкг/мл, и стабилизаторы использовали, как показано в таблице 11, ниже. Жидкие составы для конъюгата EPO длительного действия хранили при 40°C и анализировали на неделе 1 и неделе 4 с использованием обращеннофазовой хроматографии. Результаты обобщены в таблице 12, ниже. Степень удержания конъюгата EPO длительного действия по сравнению с исходным значением выражена как RP-HPLC (%).

Таблица 11 No Буфер Поверхностно-активное вещество Соль Стабилизатор 1 10 мМ Na-фосфат, pH 6,5 0,01% полисорбат 80 150 мМ NaCl 5% маннит 2 10 мМ Na-цитрат, pH 6,5 0,01% полисорбат 80 150 мМ NaCl 5% маннит 3 10 мМ Na-фосфат, pH 6,5 0,005% полисорбат 80 200 мМ NaCl 10% маннит 4 10 мМ Na-цитрат, pH 6,0 0,01% полисорбат 80 100 мМ NaCl 5% маннит

Таблица 12 RP-HPLC (%) Старт Неделя 1 Неделя 4 1 100 98,4 93,7 2 100 98,8 93,9 3 100 98,7 94,3 4 100 99,5 95,0

Как очевидно из данных таблицы 12, жидкие составы, если они содержат маннит, обеспечивали стабильность при хранении конъюгата длительного действия на желательных уровнях вне зависимости от видов используемых в них буферов. Эти результаты указывают на то, что типичные буферы, отличные от фосфатного буфера, можно использовать для получения жидких составов, в которых конъюгат EPO длительного действия можно сохранять стабильным в течение длительного периода времени.

ПРИМЕР 9: Сравнение стабильности при хранении конъюгатов EPO длительного действия между жидкими составами (II)

В отношении стабильности при хранении, жидкий состав, полученный с фосфатным буфером (pH 6,5), хлоридом натрия, маннитом и полисорбатом 80, всеми с доказанной стабилизирующей способностью в примерах 2-8, сравнивали с коммерчески доступным жидким составом EPO Рекормон, Roche. Композиции жидкого состава по настоящему изобретению и Рекормона показаны в таблице 13, ниже. При хранении при 40°C в течение четырех недель, жидкие составы для конъюгата EPO длительного действия анализировали на неделе 2 и неделе 4 с использованием обращеннофазовой хроматографии и эксклюзионной хроматографии. Результаты обобщены в таблице 14, ниже. Степень удержания конъюгата EPO длительного действия по сравнению с исходным значением выражена как RP-HPLC (%) и SE-HPLC (%).

Таблица 13 Наимено-вание Конц. Буфер Поверхностно-активное вещество Соль Стабилизатор Рекормон EPO Na-фосфат Полисорбат 20 NaCl Мочевина,

138 мкг/мл CaCl, Gly, Leu, Ile, Thr, Glu, Phe EPO длитель-ного действия EPO
200
мкг/мл 10 мМ Na-фосфат (pH6,5) 0,005% полисорбат 80 200 мМ NaCl 10% маннит

Таблица 14 Наимено-вание RP-HPLC (%) SE-HPLC (%) Старт Неделя 2 Неделя 4 Старт Неделя 2 Неделя 4 Рекормон 100 96,1 91,6 100 98,4 93,1 EPO длительного действия 100 95,5 93,3 100 98,1 96,4

Как очевидно из данных таблицы 14, жидкий состав, содержащий высокую концентрацию маннита в качестве стабилизатора, обеспечивал более высокую стабильность при хранении EPO, чем Рекормон, содержащий различные виды нейтральных аминокислот. Из этих результатов понятно, что жидкие составы по настоящему изобретению способны обеспечивать отличную стабильность при хранении, конкретно, конъюгата EPO длительного действия.

ПРИМЕР 10: Сравнение стабильности при хранении

между различными жидкими составами

В отношении стабильности при хранении, жидкий состав, полученный с фосфатным буфером (pH 6,5), хлоридом натрия, маннитом и полисорбатом 80, всеми с доказанной стабилизирующей способностью, показанной в примерах 2-8, сравнивали с жидкими составами, полученными с применением композиций различных коммерчески доступных составов для конъюгата EPO длительного действия.

Жидкие составы, использованные в этом примере, обобщены в таблице 15, ниже. В таблице 15 No. 1 представляет собой Аранесп, производимый Amgen, который в настоящее время используют в качестве лекарственного средства против анемии; No. 2 представляет собой жидкий состав, полученный со стабилизирующей композицией, содержащей фосфатный буфер (pH 6,5), хлорид натрия, маннит и полисорбат 80; No. 3 представляет собой такой же жидкий состав, как в Аранесп, за исключением того, что конъюгат EPO длительного действия использовали вместо лекарственного средства; No. 4 представляет собой такой же жидкий состав, как в Энбрел (TNFR-Fc), лекарственном средстве против ревматоидного артрита, производимом Amgen, за исключением того, что конъюгат EPO длительного действия использовали вместо лекарственного средства; и No. 5 представляет собой жидкий состав, содержащий только PBS.

При хранении при 40°C в течение трех недель, жидкие составы для конъюгата EPO длительного действия анализировали каждую неделю с использованием обращеннофазовой хроматографии и эксклюзионной хроматографии. Результаты обобщены в таблице 17, ниже. Степень удержания конъюгата EPO длительного действия по сравнению с исходным значением выражена как RP-HPLC (%) и SE-HPLC (%).

Таблица 15 Белок Конц. Буфер Поверх- Стабили- Соль

ностно-активное вещество затор 1 Аранесп 200 мкг/ мл 20 мМ Na-фосфат (pH 6,2) 0,005% P.S 80 - 140 мМ NaCl 2 Конъюгат EPO длитель-ного действия 0,526 мг/мл 10 мМ Na-фосфат (pH 6,5) 0,005% P.S 80 10% маннит 200 мМ NaCl 3 Конъюгат EPO длитель-ного действия 0,526 мг/мл 20 мМ Na-фосфат (pH 6,2) 0,005% P.S 80 - 140 мМ NaCl 4 Конъюгат EPO длитель-ного действия 0,526 мг/мл 25 мМ Na-фосфат (pH 6,3) - 1% сахароза 25 мМ гидрохло-рид L-аргинина 100 мМ NaCl 5 Конъюгат EPO длитель-ного действия 0,526 мг/мл PBS

Таблица 16 Номер партии HM10760A В10098 LGL211 (партия Исследовательского центра) Температура Условия хранения Стеклянный шприц, 500 мкл Способ анализа SEC, RPC Частота отбора Старт, 1 неделя, 2 неделя, 3 неделя

образцов

Таблица 17 Старт 1 неделя 2 неделя 3 неделя 1 Аранесп SEC (площадь, %) 99,7 99,4 98,6 Агреги-рованный SEC (площадь %/исходная площадь%) % 100,0 99,7 98,9 SEC (площадь/
исходная площадь) % 100,0 100,1 99,8 RPC (площадь, %) 94,0 92,5 91,6 RPC (площадь %/исходная площадь%) % 100,0 98,4 97,4 RPC (площадь/
исходная площадь) % 100,0 99,9 98,7 2 Конъюгат EPO длительного действия SEC (площадь, %) 98,8 97,8 96,6 91,6 SEC (площадь %/исходная площадь%) % 100,0 99,0 97,8 92,7 SEC (площадь/
исходная площадь) % 100,0 97,3 92,1 88,9 RPC (площадь, %) 96,0 92,6 87,9 83,9 RPC (площадь %/исходная площадь%) % 100,0 96,5 91,6 87,4 RPC (площадь/
исходная площадь) % 100,0 94,4 89,9 85,4 3 Конъюгат SEC (площадь, 98,8 98,0 96,7 Агреги-

EPO длительного действия %) рованный SEC (площадь %/исходная площадь%) % 100,0 99,2 97,9 SEC (площадь/
исходная площадь) % 100,0 96,3 91,2 RPC (площадь, %) 95,0 92,3 87,5 RPC (площадь %/исходная площадь%) % 100,0 97,2 92,1 RPC (площадь/
исходная площадь) % 100,0 95,3 91,4 4 Конъюгат EPO длительного действия SEC (площадь, %) 98,9 96,5 Агреги-рованный Агреги-рованный SEC (площадь %/исходная площадь%) % 100,0 97,6 SEC (площадь/
исходная площадь) % 100,0 94,2 RPC (площадь, %) 94,4 90,8 RPC (площадь %/исходная площадь%) % 100,0 96,2 RPC (площадь/
исходная площадь) % 100,0 93,3 5 Конъюгат EPO длительного действия SEC (площадь, %) 98,8 97,4 Агреги-рованный Агреги-рованный SEC (площадь %/исходная площадь%) % 100,0 98,6 SEC (площадь/
исходная 100,0 96,5

площадь) % RPC (площадь, %) 94,6 91,6 RPC (площадь %/исходная площадь%) % 100,0 96,8 RPC (площадь/
исходная площадь) % 100,0 95,5

Как очевидно из данных таблицы 17, для всех жидких составов, кроме жидкого состава, содержащего буфер 10 мМ фосфат натрия (pH 6,5), 0,005% полисорбат 80, 10% маннит и 200 нМ хлорид натрия в соответствии с настоящим изобретением, наблюдали агрегацию при хранении в течение трех недель. Следовательно, жидкий состав, содержащий 10 мМ буфер фосфат натрия (pH 6,5), 0,005% полисорбат 80, 10% маннит и 200 нМ хлорид натрия в соответствии с настоящим изобретением, является наиболее многообещающим средством для хранения конъюгата EPO длительного действия в стабильном состоянии в течение длительного периода времени.

ПРИМЕР 11: Анализ жидких составов для конъюгата EPO длительного действия по стабильности при длительном хранении и стабильности при ускоренных испытаниях

Для проверки его стабильности при длительном хранении и стабильности при ускоренных испытаниях, жидкий состав для конъюгата EPO длительного действия, полученный из стабилизатора, содержащего фосфатный буфер (pH 6,5), хлорид натрия, маннит и полисорбат 80, который, как доказано, обеспечивал наибольшую стабильность при хранении, хранили при 4°C в течение 12 месяцев, в течение которых анализировали стабильность конъюгата EPO длительного действия. Подробные условия хранения обобщены в таблице 18, ниже. Результаты анализа приведены в таблице 19 и на ФИГ. 2. В таблице 19 степень удержания конъюгата EPO длительного действия по сравнению с исходным значением выражена как RP-HPLC (%) и SE-HPLC (%).

Кроме того, жидкий состав для конъюгата EPO длительного действия анализировали in vitro по стабильности при хранении для продолжительности хранения при 4°C в течение 12 месяцев (ФИГ. 3).

Для конъюгата EPO длительного действия, используемого в этом примере, in vitro измеряли титр в линии клеток TF-1 (клетки эритролейкоза, ATCC CRL 2003). После оттаивания из резервуара с азотом для хранения клетки TF-1 культивировали до предопределенного уровня и подсчитывали. Смесь BRP-EPO и конъюгата EPO длительного действия в предопределенном соотношении рассевали в количестве 50 мкл/лунку в 96-луночные планшеты. Клетки разводили в концентрации 40000 клеток/мл в среде для анализа и затем рассевали в количестве 50 мкл/лунку в 96-луночные планшеты. После инкубации при 37°C в течение 72 час в CO₂–инкубаторе, 15 мкл реагента CellTiter 96 Aqueous One Solution (PROMEGA, G358B) добавляли в каждую лунку 96-луночных планшетов. Их снова инкубировали при 37°C в течение 4 час в CO₂–инкубаторе. Окрашивающий реагент удаляли осторожным пипетированием с последующим измерением оптической плотности при 490 нм для расчета EC50. Специфическую активность получали из рассчитанных значений EC50.

Таблица 18 Номер партии HM10760A В10098 LGL071 Концентрация 0,352 мг/мл белка Температура Условия хранения Стеклянный шприц 500 мл Способ анализа SEC, RPC Состав 10 мМ Na-P (pH 6,5) / 0,005% Полисорбат 80 / 10% Маннит / 200 мМ NaCl Частота отбора образцов Старт, 1 месяц, 3 месяца, 6 месяцев, 9 месяцев, 12 месяцев

Таблица 19 Старт 1 месяц 3 месяца 6 месяцев 9 месяцев 12 месяцев Хранение конъюгата EPO длитель-ного действия при 4°C SEC (площадь, %) 98,1 97,8 97,9 98,2 98,0 97,9 SEC (площадь %/
исходная площадь%) % 100,0 99,7 99,8 100,1 99,9 99,8 SEC (площадь/
исходная площадь) % 100,0 97,5 89,7 91,8 92,2 92,6 RPC (площадь, %) 97,1 97,1 97,1 97,1 97,1 97,0 RPC (площадь %/исходная площадь%) % 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 99,9

RPC (площадь/
исходная площадь) % 100,0 100,4 98,3 99,2 99,3 99,7 Специфи-ческая активность (Ед./мг) 5,97Е+04 - 6,31Е+04 5,90Е+04 5,88Е+04 По сравнению со стартом (%) 100,0 - 105,8 98,8 98,5

Как показано в таблице 19, обнаружили, что конъюгат EPO длительного действия является очень стабильным в течение 12 месяцев в жидком составе, содержащем композицию стабилизатора по настоящему изобретению.

Кроме того, как упомянуто выше, жидкий состав для конъюгата EPO длительного действия, содержащий такую же композицию стабилизатора, хранили при 4°C в течение 12 месяцев и затем при 25°C в течение 6 месяцев, на протяжении которых образцы анализировали по стабильности при хранении. Результаты обобщены в таблицах 20 и 21, ниже. В таблицах 20 и 21 степень удержания конъюгата EPO длительного действия по сравнению с исходным значением выражена как RP-HPLC (%), SE-HPLC (%), содержание белка (%) и биологическая инертная активность (%).

Таблица 20 Анализ стабильности при длительном хранении (Хранение при 4°C) Время хранения Свойства pH Идентификационный тест Тест чистоты Тест содержания белка (%) Биологически инертная активность (%) HPLC Вестерн-блот SDS-PAGE RP-HPLC (%) SE-HPLC (%) Старт Бесцветный прозрачный 6,3 Согласуется Пригодный Пригодный 100,0 100,0 100,0 100,0 3 месяца Бесцветный прозрачный 6,5 Согласуется Пригодный Пригодный 100,0 101,0 100,0 122,7 6 месяцев Бесцветный прозрачный 6,4 Согласуется Пригодный Пригодный 99,5 101,0 98,3 121,2 9 месяцев Бесцветный прозрачный 6,4 Согласуется Пригодный Пригодный 99,3 101,0 103,9 131,1 12 месяцев Бесцветный прозрачный 6,5 Согласуется Пригодный Пригодный 99,1 100,1 99,2 124,4

Таблица 21 Анализ стабильности при длительном хранении (Хранение при 4°C) Время хранения Свойства pH Идентификационный тест Тест чистоты Тест содержания белка (%) Биологически инертная активность (%) HPLC Вестерн-блот SDS-PAGE RP-HPLC (%) SE-HPLC (%) Старт Бесцветный прозрачный 6,3 Согласуется Пригодный Пригодный 100,0 100,0 100,0 100,0 2 месяца Бесцветный прозрачный N.A Согласуется Пригодный Пригодный 97,6 99,7 N.A 91,3 4 месяцев Бесцветный прозрачный N.A Согласуется Пригодный Пригодный 96,2 99,7 N.A 106,4 6 месяцев Бесцветный прозрачный 6,5 Согласуется Пригодный Пригодный 92,5 94,0 100,0 101,5

Как очевидно из данных таблиц 20 и 21, конъюгат EPO длительного действия сохраняли стабильным в течение 12 месяцев в жидком составе, содержащем композицию стабилизатора в соответствии с настоящим изобретением, и обнаружили, что он обладает 92,5% исходной активности даже после хранения в течение 6 месяцев в жидком составе в условиях ускоренных испытаний. Таким образом, жидкий состав для конъюгата EPO длительного действия в соответствии с настоящим изобретением обладает эффективной стабильностью при хранении.

Хотя предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения описаны с целью иллюстрации, специалистам в данной области понятно, что возможны различные модификации, дополнения и замены, без отклонения от объема и содержания изобретению, как описано в прилагаемой формуле изобретения.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

Являясь свободным от человеческого сывороточного альбумина, жидкий состав для обеспечения стабильности при хранении, конкретно, конъюгатов эритропоэтина длительного действия в соответствии с настоящим изобретением, освобождает от опасений относительно вирусных инфекций. Он содержит простую композицию, таким образом, обладая экономическим преимуществом над другими стабилизаторами или составами для лиофилизации. Кроме того, поскольку он содержит конъюгат EPO длительного действия, который обладает более длительной продолжительностью действия, чем природная форма, а также сохраняет высокую активность белка в течение более длительного периода времени, жидкий состав можно использовать в качестве эффективной системы лекарственного средства.

Изобретение относится к медицине и касается жидкого фармацевтического состава конъюгата эритропоэтина (ЕРО) длительного действия, содержащего терапевтически эффективное количество конъюгата эритропоэтина длительного действия, в котором ЕРО ковалентно соединен с Fc-фрагментом иммуноглобулина посредством непептидного полимера или пептидного линкера, маннит, буфер, соль и неионное поверхностно-активное вещество. Где маннит включен в концентрации от 3 до 12% масс./об., причем жидкий состав не содержит нейтральных аминокислот и альбумина, и где буфер представляет собой буфер на основе фосфата натрия или буфер на основе цитрата натрия. Изобретение обеспечивает стабильность хранения конъюгатов EPO длительного действия даже без использования нейтральных аминокислот. 17 з.п. ф-лы, 11 пр., 3 ил., 21 табл.

1. Жидкий фармацевтический состав конъюгата эритропоэтина (ЕРО) длительного действия, содержащий терапевтически эффективное количество конъюгата эритропоэтина длительного действия, в котором ЕРО ковалентно соединен с Fc-фрагментом иммуноглобулина посредством непептидного полимера или пептидного линкера, маннит, буфер, соль и неионное поверхностно-активное вещество, где маннит включен в концентрации от 3 до 12% масс./об., причем жидкий состав не содержит нейтральных аминокислот и альбумина, и где буфер представляет собой буфер на основе фосфата натрия или буфер на основе цитрата натрия.

2. Жидкий состав по п.1, где концентрация буфера лежит в диапазоне от 5 до 100 мМ.

3. Жидкий состав по п.1, где pH буфера лежит в диапазоне от 4 до 8.

4. Жидкий состав по п.1, где соль выбрана из группы, состоящей из хлорида натрия, сульфата натрия, цитрата натрия и их комбинации.

5. Жидкий состав по п.1, где концентрация соли лежит в диапазоне от 5 до 200 мМ.

6. Жидкий состав по п.1, где неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионное поверхностно-активное вещество на основе полисорбата или полоксамера.

7. Жидкий состав по п.6, где неионное поверхностноактивное вещество на основе полисорбата выбрано из группы, состоящей из полисорбата 20, полисорбата 40, полисорбата 60 и полисорбата 80.

8. Жидкий состав по п.1, где концентрация неионного поверхностно-активного вещества лежит в диапазоне от 0,001 до 0,05% (масс./об.) на основании общего объема жидкого состава.

9. Жидкий состав по п.1, где буфер представляет собой буфер на основе фосфата натрия в концентрации от 5 до 100 мМ, соль представляет собой хлорид натрия в концентрации от 5 до 200 мМ и неионное поверхностноактивное вещество представляет собой полисорбат 80 в концентрации от 0,001 до 0,05% масс./об.

10. Жидкий состав по п.1, где ЕРО представляет собой мутантный белок ЕРО, модифицированный из ЕРО дикого типа посредством замены, делеции или вставки аминокислоты или аминокислот, или аналог пептида, обладающий активностью, сходной с активностью ЕРО дикого типа.

11. Жидкий состав по п.1, где концентрация ЕРО лежит в диапазоне от 1 до 500 мкг/мл.

12. Жидкий состав по п.1, где Fc-фрагмент иммуноглобулина выбран из группы, состоящей из IgG, IgA, IgD, IgE, IgM и их комбинации.

13. Жидкий состав по п.12, где Fc-фрагмент иммуноглобулина представляет собой гибридный фрагмент, составленный из доменов различного происхождения из группы, состоящей из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM.

14. Жидкий состав по п.12, где Fc-фрагмент иммуноглобулина находится в форме димера или мультимера одноцепочечных иммуноглобулинов, составленных из доменов одинакового происхождения.

15. Жидкий состав по п.12, где Fc-фрагмент иммуноглобулина представляет собой Fc-фрагмент IgG4.

16. Жидкий состав по п.15, где Fc-фрагмент иммуноглобулина представляет собой агликозилированный Fc-фрагмент IgG4 человека.

17. Жидкий состав по п.1, где непептидный полимер выбран из группы, состоящей из биоразлагаемого полимера, липидного полимера, хитина, гиалуроновой кислоты и их комбинации.

18. Жидкий состав по п.17, где биоразлагаемый полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированных полиолов, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, поливинилэтилэфира, PLA (полимолочной кислоты) и PLGA (полимолочной-гликолевой кислоты).