СТАБИЛЬНЫЙ ЖИДКИЙ СОСТАВ СЛИТОГО БЕЛКА С ДОМЕНОМ FC IgG Российский патент 2019 года по МПК A61K47/68 A61K47/18 A61K47/26 A61K9/00 

Область техники

Настоящее изобретение относится к стабильному жидкому составу слитого белка, имеющего домен Fc иммуноглобулина G человека (IgG). Более конкретно, настоящее изобретение относится к жидкому составу, содержащему стабилизированный белок, в котором домен Fc IgG человека и растворимый внеклеточный домен рецептора фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) являются слитыми, например, афлиберцепту, с композицией для стабилизации белка, в котором домен Fc IgG и растворимый внеклеточный домен рецептора VEGF являются слитыми, и способу для стабилизации белка, в котором домен Fc IgG и растворимый внеклеточный домен рецептора VEGF являются слитыми.

Предшествующий уровень техники

Был идентифицирован тип индуцирующего клетки димерного митогена, обладающего селективностью к эндотелиальным клеткам сосудов, и он обозначен как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). VEGF является важным фактором, который увеличивает ангиогенез и проницаемость сосудов.

Как было известно ранее VEGF активирует рецепторы VEGF (т.е., VEGFR-1, VEGFR-2 и VEGFR-3), которые представляют собой трансмембранные тирозинкиназные рецепторы. Среди рецепторов VEGFVEGFR-1 и VEGFR-2 имеют 7 подобных Ig последовательностей во внеклеточном домене для того, чтобы связаться с VEGF, единственной трансмембранной областью и консенсусной областью тирозинкиназы. Эти особенности применены в качестве последовательности для анти-VEGF агента. Афлиберцепт, который является офтальмологическим терапевтическим агентом, представляет собой растворимый рецептор-ловушку размером приблизительно 115 кДа (включая гликозилирование), имеющий структуру, в которой второй связывающий домен VEGFR-1 и третий связывающий домен VEGFR-2 являются слитыми с областью Fc IgG1 человека (см. [Drug Design Development and Therapy (2013), 3(7), 711-722]).

В механизмах, опосредованных VEGF, аномальный ангиогенез связан с офтальмологическими заболеваниями, такими как влажная форма возрастной макулярной дегенерации, диабетический макулярный отек и макулярный отек вследствие окклюзии вены сетчатки и т.д. (см. [J. Korean Med. Assoc. (2014), 57(7), 614-623]).

Примеры терапевтических агентов от этих офтальмологических заболеваний включают в себя пегаптаниб (торговое название: Macugen), ранибизумаб (торговое название: Lucentis), бевацизумаб (торговое название: Avastin) и афлиберцепт (торговое название: Eylea). Афлиберцепт одобрен для лечения влажной формы возрастной макулярной дегенерации в 2011 (см. [Biol. Ther. (2012), 2(3) 1-22] и [Drug Design Development and Therapy (2013), 3(7), 711-722] и т.д.). Сообщалось, что афлиберцепт обладает лучшим терапевтическим эффектом среди терапевтических агентов для пациентов с диабетическим макулярным отеком с развитой амблиопией (см. [NEJM (2015), 372(13) 1193-1203]. Афлиберцепт распространяется коммерчески в качестве терапевтического агента от метастатического колоректального рака (торговое название: Zaltrap) и терапевтического агента от окклюзии вены сетчатки, диабетического макулярного отека, хориоидальной неоваскуляризации и влажной формы возрастной макулярной дегенерации (торговое название: Eylea).

Физико-химические модификации происходят в белковых лекарственных средствах, включая лекарственные средства на основе антитела в неоптимальном состоянии. В частности, такие факторы, как температура, рН, концентрация соли, контакт с воздухом, концентрация белка и типы буферов, существенно влияют на окисление, дезамидирование, изомеризацию и полимеризацию белка. Эти модификации вызывают агрегацию и генерируют фрагменты, изомеры белка, так что биологическая активность может быть уменьшена. Эти свойства отличаются для разных белков. В частности, для слитого белка Fc из-за проблемы с укладкой выделяют 3 пика в хроматографии гидрофобного взаимодействия (см. [Antibodies (2013), 2,452-500]).

Следующий предшествующий патенту документ 1 (Международная публикация WO 2007/149334) раскрывает ʺофтальмологический состав, включающий 1-100 мг/мл афлиберцепта, 0,01-5% органического совместного растворителя (например, полисорбат, полиэтиленгликоль, пропиленгликоль и т.д.), 30-150 мМ изотонического агента (например, NaCl, KCl и т.д), 5-40 мМ натрий-фосфатного буфера и 1,0-7,5% стабилизатора (например, сахароза, сорбит, глицерин, трегалоза и маннит и т.д.)ʺ и ʺлиофилизуемый состав, включающий 5-50 мг/мл афлиберцепта, 5-25 мМ натрий-фосфатного буфера, 0,01-0,15% органического сорастворителя, 1-10% стабилизатора и 20-150 мМ изотонического агентаʺ. Состав, раскрытый в следующем предшествующем патенту документе 1, может быть применен в предварительно заполненном шприце, подходящем для интравитреального введения.

Сообщалось о том, что для офтальмической композиции и лиофилизуемой композиции, описанной в следующем предшествующем патенту документе 1, имеет место влияние ингибирования продуцирования примесей и побочных продуктов из-за агрегации, фрагментации и изомеризации афилберцепта. Однако состав в предшествующем патентном документе 1 представлял проблему, заключавшуюся в том, что эффект стабилизации афилберцепта заметно снижался в тяжелых условиях, таких как условия высокой температуры 40°C или более или условия встряхивания.

Таким образом, авторы настоящего изобретения совершили настоящее изобретение путем разработки жидкого состава, имеющего повышенную стабильность в тяжелых условиях, а также проявляющего стабильное сохранение слитого белка, имеющего домен Fc IgF, такого как афлиберцепт, в условиях хранения в течение длительного периода времени.

Документ предшествующего уровня техники

Патентный документ

Предшествующий патентный документ 1: Международная публикация WO 2007/149334

Раскрытие

Техническая задача

Настоящее изобретение осуществлено для разрешения задач, описанных выше, и относится к составу, содержащему стабилизированный белок, в котором домен Fc иммуноглобулина G человека (IgG) и растворимый внеклеточный домен рецептора фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) являются слитыми.

Другая задача настоящего изобретения относится к композиции для стабилизации белка, в которой домен Fc IgG и растворимый внеклеточный домен рецептора VEGF являются слитыми.

Еще одна задача настоящего изобретения относится к жидкому составу, содержащему композицию для стабилизации белка, в которой домен Fc IgG и растворимый внеклеточный домен рецептора VEGF являются слитыми; и афлиберцепт.

Техническое решение задачи

Настоящее изобретение относится к жидкому составу, содержащему: белок, в котором растворимый внеклеточный домен рецептора фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и домен Fc иммуноглобулина G человека (IgG) являются слитыми; и буфер, содержащий соль гистидина и имеющий pH, варьирующийся от 5,7 до 6,2.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения растворимый внеклеточный домен рецептора VEGF может включать в себя иммуноглобулиноподобный домен 2 первого рецептора VEGF и иммуноглобулиноподобный домен 3 второго рецептора VEGF.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения слитый белок может быть представлен в количестве от 10 до 40 мг/мл.

В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения соль гистидина может представлять собой гистидин HCl или гистидинацетат.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения при этом концентрация соли гистидина может составлять 10 мМ до 50 мМ.

В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения жидкий состав может дополнительно содержать один или более стабилизаторов, выбранных из группы, состоящей из сахаров и поверхностно-активных веществ.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения сахар может являться по меньшей мере одним, выбранным из группы, состоящей из от 2,5% до 10% из сахарозы, трегалозы, маннита и глюкозы.

В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения сахар может представлять собой от 5% до 10% сахарозы.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения поверхностно-активное вещество может представлять собой от 0% до 0,03% полисорбата 20 или полисорбата 80, например, 0% или от 0,01% до 0,03%.

Дополнительно, настоящее изобретение относится к композиции для стабилизации белка, в которой растворимый внеклеточный домен рецептора VEGF и домен Fc IgG являются слитыми, при этом композиция содержит: буфер, содержащий соль гистидина и имеющий pH, варьирующийся от 5,7 до 6,2; и один или более стабилизаторов, выбранных из группы, состоящей из сахаров и поверхностно-активных веществ, при этом соль гистидина представляет собой от 10 мМ до 50 мМ гистидина HCl или гистидинацетата; сахар представляет собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из от 2,5% до 10% сахарозы, трегалозы, маннита и глюкозы; и поверхностно-активное вещество представляет собой 0% до 0,03% полисорбата 20 или полисорбата 80, например, 0% или от 0,01% до 0,03%.

Также настоящее изобретение относится к способу для стабилизации белка, в котором домен Fc иммуноглобулина G человека (IgG) и растворимый внеклеточный домен рецептора фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) являются слитыми с применением буфера, содержащего соль гистидина и имеющего pH, варьирующийся от 5,7 и 6,2.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения буфер может дополнительно буфер содержать один или более стабилизаторов, выбранных из группы, состоящей из сахаров и поверхностно-активных веществ.

Дополнительно, настоящее изобретение относится к жидкому составу, содержащему буфер, содержащий соль гистидина и имеющий pH, варьирующийся от 5,7 до 6,2; один или более стабилизаторов, выбранных из группы, состоящей из сахаров и поверхностно-активных веществ; и афлиберцепт; при этом соль гистидина представляет собой от 10 мМ до 50 мМ гистидина HCl или гистидинацетата, и сахар представляет собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из от 2,5% до 10% сахарозы, трегалозы, маннита и глюкозы, и поверхностно-активное вещество представляет собой от 0% до 0,03% полисорбата 20 или полисорбата 80, например, 0% или от 0,01% до 0,03%.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения жидкий состав может быть пригодным для интравитреальной инъекции.

Полезные эффекты

В жидком составе, к которому относится настоящее изобретение, значительно снижена выработка примесей и побочных продуктов из-за агрегации, фрагментации и изомеризации слитого белка, имеющего домен Fc иммуноглобулина G человека (IgG) (в частности, белок, в котором домен Fc иммуноглобулина G человека (IgG) и растворимый внеклеточный домен рецептора фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) являются слитыми (напр., афлиберцепт)) в тяжелых условиях, таких как условия высокой температуры 40°C или более или условия встряхивания, а также при обычных условиях хранения, и таким образом стабильность для длительного хранения может быть повышена.

Кроме того, настоящее изобретение улучшает терапевтические эффекты при различных офтальмологических заболеваниях (напр., окклюзия вены сетчатки, диабетический макулярный отек, хориоидальная неоваскуляризация и влажная форма возрастной макулярной дегенерации и т.д.), вызванных аномальным ангиогенезом, в то же время обеспечивая сохранение биоактивности посредством стабилизации жидкого состава, пригодного для интравитреальной инъекции слитого белка анти-VEGF-Fc, включающего афлиберцепт.

Описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой график, демонстрирующий изменения содержания фрагмента и агрегата в образце, хранившемся в течение 7 дней при 40°С, путем изменения рН буфера соли гистидина, содержащего афлиберцепт.

Фиг. 2 представляет собой график, демонстрирующий изменения содержаний (%) в пиках 1, 2 и 3 в высокоэффективной жидкостной хроматографии гидрофобномного взаимодействия (HI-HPLC) образца, содержащего афлиберцепт, хранившегося в течение 7 дней при 40° C, путем изменения рН солевого гистидинового буфера.

На фиг.3 показаны результаты анализа SDS-PAGE для различных буферов (фосфат натрия, сукцинат, гистидин HCl, гистидинацетат и ацетат натрия), содержащих афлиберцепт после хранения в течение 21 дня при 40° C.

На фиг.4 показаны результаты анализа SDS-PAGE состава, включающего различные сахара (трегалоза, сахароза, маннит и глюкоза) в солевом гистидиновом буфере, содержащем афлиберцепт после хранения в течение 8 дней при 50°C.

Фиг. 5 представляет собой график, демонстрирующий изменения содержаний фрагмента и агрегата (%) образца, хранившегося в течение 7 дней при 45°С, путем изменения концентраций сахарозы в солевом гистидиновом буфере, содержащем афлиберцепт.

Фиг. 6 представляет собой график, демонстрирующий изменения содержаний фрагмента и агрегата (%) образца, хранившегося в течение 7 дней при 45°С, при этом образец представляет собой состав, включающий различные соли (хлорид натрия, хлорид аммония, сульфат аммония и хлорид калия) в солевом гистидиновом буфере, содержащем афлиберцепт.

На фиг. 7 показаны результаты SDS-PAGE состава, включающего солевой гистидиновый буфер, содержащего афлиберцепт с или без полисорбата, при этом состав хранили в течение 7 дней при 25°C со встряхиванием при 200 об/мин.

Фиг. 8 представляет собой график, демонстрирующий изменения содержаний фрагмента и агрегата (%) образца, хранившегося в течение 7 дней при 45°С, при этом образец представляет собой состав, включающий различные концентрации полисорбата 20 (0%, 0,01%, 0,03%, 0,05% и 0,1%) в солевом гистидиновом буфере, содержащем афлиберцепт.

Лучший вариант

В дальнейшем, настоящее изобретение будет описано более подробно.

Как описано выше, ранее представленный состав, в котором стабилизирован слитый белок, такой как афлиберцепт, содержащий домен Fc IgG, обладает недостатком, заключающимся в том, что стабильность бывает значительно снижена в тяжелых условиях, так что имеет место потребность в разработке состава, способного сохранять слитый белок в тяжелых условиях в добавление к общим условиям хранения.

Таким образом, в настоящем изобретении обнаружено решение вышеописанных недостатков посредством предоставления жидкого состава, содержащего: белок, в котором домен Fc иммуноглобулина G человека (IgG) и растворимый внеклеточный домен рецептора фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) являются слитыми; и при этом буфер содержит соль гистидина и имеет pH, варьирующийся от 5,7 до 6,2. Поскольку жидкий состав настоящего изобретения стабильно сохраняет слитый белок при обычных условиях хранения в течение длительного периода времени и также значительно снижает образование примесей и побочных продуктов в тяжелых условиях, возможно предоставление состава, имеющего значительно улучшенную стабильность по сравнению с известным составом слитого белка, для которого ранее имела место неотъемлемая особенность, заключавшаяся в том, что оптимальные условия хранения могли не быть обеспечены.

Настоящее изобретение относится к жидкому составу, содержащему белок, в котором домен Fc иммуноглобулина G человека (IgG) и растворимый внеклеточный домен фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) являются слитыми; и при этом буфер содержит соль гистидина и имеет pH, варьирующийся от 5,7 до 6,2.

В слитом белке, который представляет собой активный ингредиент жидкого состава, растворимый внеклеточный домен VEGF может включать в себя иммуноглобулиноподобный домен 2 первого рецептора VEGF и иммуноглобулиноподобный домен 3 второго рецептора VEGF, и домен Fc иммуноглобулина G человека (IgG) может представлять собой домен Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, предпочтительно домен Fc IgG1. Область Fc содержит шарнир-CH1-CH2-CH3, и CH1 может быть удален.

В жидком составе настоящего изобретения слитый белок может быть включен в количестве приблизительно 10-100 мг/мл, предпочтительно приблизительно 10-80 мг/мл и более предпочтительно приблизительно 10-40 мг/мл.

В жидком составе в соответствии с настоящим изобретением "буфер" относится к буферизированному раствору, который выдерживает изменения pH из-за действия ингредиента с кислотно-основным конъюгатом буфера. В варианте осуществления настоящего изобретения применяли буфер, содержащий соль гистидина и имеющий pH, варьирующийся от 5,7 до 6,2, при этом соль гистидина представляет собой предпочтительно гистидин HCl или гистидинацетат, и концентрация соли гистидина может составлять от 10 мМ до 50 мМ.

Как показано на фиг. 1 и 2, для состава, с применением солевого гистидинового буфера, имеющего pH от 5,7 до 6,2, эффект ингибирования образования фрагментов и агрегатов был значительно повышен, больше чем в контрольном составе (2). В частности, стабильность состава при pH 6,0 была совершенно превосходной.

Когда pH буфера был снижен до менее чем 5,7, как показано на фиг. 1 и 2, стабильность состава была значительно снижена. Для pH выше 6,5, может возникнуть проблема возрастания количества примесей, вызванная разрушением или агрегацией целевого белка.

В добавление, как показано на фиг. 3, было обнаружено, что эффект ингибирования образования примесей и агрегатов является совершенно превосходным, когда буфер гистидин HCl или гистидинацетат применяли с различными буферными условиями.

Дополнительно для состава (3) фиг. 5 измеряли стабильность афлиберцепта в 10 мМ солевом гистидиновом буфере, имеющем pH 6,0 и было обнаружено, что стабильность афлиберцепта, подобная стабильности контрольного состава (2), сохранялась в условиях буфера.

Жидкий состав настоящего изобретения может дополнительно содержать один или более стабилизаторов, выбранных из группы, состоящей из сахаров и поверхностно-активных веществ в добавление к слитому белку, который является активным ингредиентом жидкого состава, и солевой гистидиновый буфер.

В жидком составе настоящего изобретения сахар представляет собой любой, выбранный из группы, состоящей из трегалозы, сахарозы, маннита, сорбита, глюкозы, лактозы, ксилита, инозита, глицерина и гидроксипропилциклодекстрина и предпочтительно любого, выбранного из группы, состоящей из трегалозы, сахарозы, маннита и глюкозы. Концентрация сахара может составлять 2,5-10% (масс./об.).

Как показано на фиг. 4, все из составов (3) - (6), которые соответственно включают в себя трегалозу, сахарозу, маннит и глюкозу в солевом гистидиновом буфере, демонстрировали увеличенную стабильность афлиберцепта, большую чем в контрольном составе (2). В частности, в случае, когда сахар представлял собой сахарозу, стабильность афлиберцепта являлась совершенно превосходной.

Дополнительно, как показано на фиг. 5, состав (3) без сахарозы продемонстрировал стабильность состава, подобную стабильности контрольного состава (2). По мере того как концентрация сахарозы возрастала, эффект ингибирования образования агрегатов и примесей возрастал относительно контроля (2).

В жидком составе настоящего изобретения поверхностно-активное вещество может быть применено для доставки офтальмологического лекарственного средства. Типы поверхностно-активных веществ не ограничены и включают в себя анионные поверхностно-активные вещества, катионные поверхностно-активные вещества, неионные поверхностно-активные вещества и цвиттер-ионные поверхностно-активные вещества и т.д. Концентрация поверхностно-активного вещества может составлять приблизительно 0-0,3% (масс./об.), например, 0% или от 0,01% до 0,03%.

Примеры анионного поверхностно-активного вещества могут включать в себя сульфат, сульфонат, фосфат и карбоксилат, но не ограничены ими.

Примеры катионного поверхностно-активного вещества могут включать в себя окценидиндигидрохлорид, бромид цетилтриметиламмония (CTAB), бромид гексадецилтриметиламмония, хлорид цетилтриметиламмония (CTAC), хлорид цетилпиридиния (CPC), хлорид бензалкония (BAC), хлорид бензетония, 5-бром-5-нитро-1,3-диоксан, хлорид диметилдиоктадециламмония, бромид цетримония, бромид диоктадецилдиметиламмония (DODAB) и т.д.

Примеры неионных поверхностно-активных веществ могут включать в себя алкиловый эфир полиоксиэтиленгликоля, алкиловый эфир полиоксипропиленгликоля, октилфеноловый эфир полиоксиэтиленгликоля (напр. Triton X-100 и т.д.), алкилфеноловый эфир полиоксиэтиленгликоля, алкиловый эфир глицерина, сорбитан-алкиловый эфир полиоксиэтиленгликоля (напр. полисорбат 20, полисорбат 80 и т.д.), кокамид MEA, кокамид DEA, додецилдиметиламиноксид, сополимер полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, полиэтоксилированный талловый амин (POEA) и т.д.

Примеры цвиттер-ионных поверхностно-активных веществ могут включать в себя CHAPS (3-[(3-кокамидопропил)диметиламомоний]-1-пропансульфат), кокамидопропилгидроксисультаин и т.д.

Кроме того, в качестве поверхностно-активных веществ могут быть применены алкилсульфаты такие, как лаурилсульфат аммония, лаурилсульфат натрия (SLS), додецилсульфат натрия (SDS), лауриловый эфир сульфата натрия (SLES), миреатсульфат натрия; могут быть использованы докузаты, такие как диоктилсульфосукцинат натрия, перфторооктан сульфонат (PFOS), перфторбутан сульфонат, линейный алкилбензолсульфонат (LAB); фосфолипиды, такие как фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин и сфингомиелины.

В варианте осуществления настоящего изобретения для оценки стабильности составов в зависимости того, добавлен ли или нет дополнительный солевой ингредиент, помимо компонентов, включенных в жидкий состав, описанный выше, были получены составы, соответственно включающие различные соли, и состав без соли. Следовательно, как показано на фиг. 6, наблюдали то, что эффект ингибирования образования примесей и агрегатов являлся совершенно превосходным в составе без дополнительных солевых ингредиентов.

Жидкий состав в соответствии с настоящим изобретением сохраняет стабильность слитого белка при обычных условиях хранения в течение длительного периода времени и имеет превосходный эффект ингибирования образования примесей и побочных продуктов слитого белка в тяжелых условиях и, таким образом, стабильность слитого белка бывает увеличена больше, чем стабильность в типичном жидком составе. В данном описании термин "тяжелые условия" относится к условиям среды, химически и физически неблагоприятным для слитого белка и которые приводят к неприемлемой стабильности белка. Тяжелые условия включают, например, высокую температуру или условия встряхивания.

В данном описании термин "стабильный" указывает на то, что белок по существу сохраняет его физическую, и/или химическую стабильность, и/или биологическую активность во время хранения. Различные аналитические технологии для измерения стабильности белка доступны в данной области. Стабильность может быть измерена при выбранной температуре и в выбранный период.

Белок считается "сохраняющим его физическую стабильность" в составе, когда белок демонстрирует меньшее или отсутствие изменения в агрегации, осаждении и/или модификации во время наблюдения цвета и/или прозрачности при оценке невооруженным глазом, измерением рассеивания ультрафиолетового света (т.е., измерены заметные агрегаты) или измерением с эксклюзионной хроматографией размеров (SEC).

Как показано на фиг. 1-6 и 8, различные условия жидких составов настоящего изобретения продемонстрировали значительное ингибирование образования примесей и агрегатов, в большей степени, чем в контрольном составе (2), таким образом, они были относительно стабильными в течение от 7 до 21 дней при температуре, варьирующейся от 40 до 50°C.

Жидкие составы настоящего изобретения хранили при отличающихся условиях при 25°C со встряхиванием при 200 об/мин в течение 7 дней и затем каждый состав подвергали SE-HPLC и HI-HPLC. Следовательно, независимо от присутствия и отсутствия полисорбата 20 было ингибировано образование агрегатов и модификаций. Подобным образом, по результатам SDS-PAGE ДНС-ПААГ (невосстанавливающий) (фиг. 7) и SE-HPLC, наблюдали, что образование агрегатов и фрагментов белка было ингибировано больше, чем в контроле (1), независимо от присутствия и отсутствия полисорбата при условиях встряхивания при 25°C в течение 7 дней. В частности, эффект ингибирования образования агрегатов и фрагментов белка был несколько более сильным, чем для состава без полисорбата.

Настоящее изобретение относится к способу стабилизации белка, в котором домен Fc иммуноглобулина G человека (IgG) и растворимый внеклеточный домен рецептора фактора роста эндотелия сосудов VEGF являются слитыми с применением буфера, содержащего соль гистидина и имеющего pH от 5,7 до 6,2.

Так как описание особенностей буфера и слитого белка является таким же, как описано выше, дублирующее содержание не приведено во избежание избыточной сложности данного описания.

В способе стабилизации слитого белка настоящего изобретения буфер может дополнительно содержать один или более стабилизаторов, выбранных из группы, состоящей из сахаров и поверхностно-активных веществ.

Так как описание дополнительно добавленного сахара и поверхностно-активного вещества является таким же, как описано выше, эти особенности не приведены.

Настоящее изобретение также относится к композиции для стабилизации слитого белка, в котором домен Fc IgG и растворимый внеклеточный домен рецептора VEGF являются слитыми, при этом композиция включает буфер, содержащий соль гистидина и имеющий pH от 5,7 до 6,2; и один или более стабилизаторов, выбранных из группы, состоящей из сахаров и поверхностно-активных веществ, при этом соль гистидина представляет собой от 10 мМ до 50 мМ гистидина HCl или гистидинацетата; сахар представляет собой любой, выбранный из группы, состоящей из от 2,5% до 10% сахарозы, трегалозы, маннита и глюкозы; и поверхностно-активное вещество представляет собой любое, выбранное из от 0% до 0,03%, полисорбата 20 или полисорбата 80, например, 0% или от 0,01% до 0,03%.

Описание особенностей стабилизированной композиции является таким же, как описано выше и таким образом дублирующее содержимое не приведено во избежание избыточной сложности данного описания.

Настоящее изобретение также относится к жидкому составу, содержащему композицию для стабилизации белка, в которой домен Fc IgG и растворимый внеклеточный домен рецептора VEGF являются слитыми; и афлиберцепт.

Жидкий состав может быть применен для медицинского применения для предотвращения или лечения различных заболеваний без ограничения, при условии, что заболевания могут быть вылечены с применением лечения с афлиберцептом. Предпочтительно, состав может быть применен для лечения или предотвращения различных офтальмологических заболеваний, таких как окклюзия вены сетчатки, диабетический макулярный отек, хориоидальная неоваскуляризация и влажная форма возрастной макулярной дегенерации и т.д.

Жидкий состав в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и вспомогательное вещество и т.д.

Фармацевтически приемлемый носитель, как правило, применен в составе и может включать в себя лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмал, аравийскую камедь, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп, метилцеллюлозу, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло, но не ограничен ими.

В добавление к вышеприведенным ингредиентам, жидкий состав настоящего изобретения может дополнительно содержать смазочные вещества, увлажняющие агенты, подслащивающие агенты, ароматизирующие агенты, эмульгаторы, суспензии, консерванты и т.д. Пригодный фармацевтически приемлемый носитель и состав описаны подробно в Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

Жидкий состав настоящего изобретения может быть введен различными путями в зависимости от целей. Состав предпочтительно введен посредством интравитреальной инъекции для лечения офтальмологических заболеваний. Также, состав может быть применен посредством предварительно наполненного шприца, пригодного для интравитреальной инъекции.

Пригодное количество введения введение жидкого состава настоящего изобретения может варьироваться в зависимости от факторов, таких как способы составления, виды введения, возраст, вес, пол и состояние заболевания пациентов, пища, время введения, путь введения, скорость экскреции и чувствительность реакции. Обычные врачи могут легко определить и прописать количество введения, эффективное для требуемой терапии или в целях профилактики.

Необходимо иметь в виду, что объем настоящего изобретения не ограничен следующими примерами, и все технические и научные термины, примененные в описании, имеют такое же значение, как в большинстве случаев понимаемое рядовым специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение ("специалист в данной области").

Вариант осуществления изобретения

[Пример 1]

Оценка оптимальных условий pH для состава

В примере 1 и следующих примерах 2-5, жидкий состав, раскрытый в документе предшествующего уровня техники, международной публикации WO 2007/149334, хранили при 5±3°C и применяли в качестве контроля (1). Также контроль (1) подвергали тяжелым условиям (температура 40°C или более) и применяли в качестве контроля (2). Затем, стабильность состава сравнивали со стабильностью различных форм жидких составов настоящего изобретения.

В настоящем примере для идентификации оптимального pH жидкого состава, содержащего в качестве активного ингредиента афлиберцепт, который представляет собой слитый белок анти-VEGF-Fc, подготавливали образцы для каждого pH на основании солевого гистидинового буфера следующим образом.

В частности, конечную концентрацию афлиберцепта доводили до 40 мг/мл и (1) состав, содержавший 10 мМ фосфата натрия, рН 6,2, 5% сахарозы, 40 мМ NaCl, 0,03% полисорбата 20 (состав хранили при 5 ± 3 °С); (2) состав, содержавший 10 мМ фосфата натрия, рН 6,2, 5% сахарозы, 40 мМ NaCl, 0,03% полисорбата 20 (состав хранили при 40°С) и состав с 10% трегалозы, 0,01% (мас./об.) полисорбата 20 и буфер 10 мМ гистидин HCl соответственно с pH (3) 5,5; (4) 5,7; (5) 6,0; (6) 6,2; и (7) 6,5, хранили при 40°C в течение 7 дней. Затем, примеси, полученные по прошествии определенного времени, анализировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (SE-HPLC) и HI-HPLC.

В анализе SE-HPLC применяли колонку TSK-gel G3000SWXL (7.8 × 300 мМ) (TOSOH Co., Япония) и использовали 0,2 М фосфат калия (pH 6,2), 0,25 М KCl и буфер 0,05% (мас./об.) NaN₃ при скорости потока 0,5 мл/мин. Пик слитого белка анти-VEGF-Fc анализировали при поглощении 280 нм.

В анализе SE-HPLC для образца, хранившегося при 40°C в течение 7 дней, рассчитывали содержание мономера, и агрегаты, которые представляют собой высокомолекулярные примеси, и фрагменты, которые представляют собой низкомолекулярные примеси, объединяли и подвергали обсчету. Фиг. 1 демонстрирует результат SE-HPLC на 7-й день. Указано, что при сравнении с контролем (2) состав настоящего изобретения демонстрирует значительно сниженное образование агрегатов и фрагментов при рН 5,7, 6,0, 6,2 и 6, 5 и, таким образом, состав является стабильным. Также при различных условиях рН идентифицировали, что стабильность состава является самой высокой при рН 6,0.

В анализе HI-HPLC применяли колонку TSK Phenyl-5PW (7,5 × 300 мМ). В качестве подвижной фазы применяли 50 мМ фосфата натрия (рН 7,0). 2 М NaCl, 50 мМ фосфата натрия (pH 7,0) и 30% (об./об.) ацетонитрильный буферный раствор и позволяли протекать при градиенте концентрации 0% -90%. Затем пик слитого белка анти-VEGF-Fc анализировали при поглощении 220 нм. Во время анализа HI-HPLC наблюдали три основных пика, т.е. пик 1, пик 2 и пик 3. Когда изменение в пике было меньше, его считали стабильным.

Фиг. 2 демонстрирует результат анализа HI-HPLC образца, хранившегося при 40°С, по прошествии определенного времени. Фиг. 2 демонстрирует изменения в пике 1, пике 2 и пике 3 при каждом из условий, и было обнаружено, что, по сравнению с контролем (2), состав настоящего изобретения при значениях рН 5,7, 6,0, 6,2 и 6,5 демонстрировал значительно меньше изменений в пиках. Кроме того, среди других условий рН состав, соответственно, был наиболее стабильным при значении рН 6,0.

[Пример 2]

Оценка оптимальных буферных условий для состава

В настоящем примере для идентификации оптимальных буферных условий для жидкого состава, содержащего в качестве активного ингредиента афлиберцепт, который представляет собой слитый белок анти-VEGF-Fc, подготавливали образцы следующим образом.

В частности, конечную концентрацию афлиберцепта доводили до 40 мг/мл и (1) состав, содержавший 10 мМ фосфата натрия, рН 6,2, 5% сахарозы, 40 мМ NaCl, 0,03% полисорбата 20 (состав хранили при 5 ± 3 °С); (2) состав, содержавший 10 мМ фосфата натрия, рН 6,2, 5% сахарозы, 40 мМ NaCl, 0,03% полисорбата 20 (состав хранили при 40° C) и другой состав, соответственно, включавший 0,01% полисорбата 20 и 2,5% сахарозы в буфере (3) 10 мМ фосфата натрия, рН 6,0; (4) 10 мМ гистидин HCl, pH 6,0; (5) 10 мМ гистидинацетата, pH 6,0; (6) 10 мМ сукцината, рН 6,0; и (7) 10 мМ ацетата натрия, pH 5,6, хранили при 40°C в течение 21 дня. Затем, так же, как в примере 1, мономер, агрегаты и варианты анализировали по прошествии определенного времени посредством SE-HPLC и HI-HPLC.

После этого выполняли анализ SDS-PAGE. К 20,0 мкл аналитического образца, разбавленного до 1 мг/мл, добавляли 5,0 мкл буфера 5X (восстанавливающего или невосстанавливающего), и полученный результат подвергали взаимодействию при 100°С в течение 5 минут и использовали для анализа. Нагружали 12,5 мкл конечного аналитического образца в лунку. В качестве маркера (М) применяли маркер размеров белков DokDo-Mark ™ и нагружали его по 3 мкл на лунку. Проводили 10% SDS-PAGE (восстанавливающий) и 6% SDS-PAGE (невосстанавливающий) гель-электрофорез. Затем проводили окрашивание с синим кумасси. Выполняли обесцвечивание, пока не появлялись отчетливые полосы.

В результате анализа SDS-PAGE (невосстанавливающий) (фиг.3) и SE-HPLC и HI-HPLC было обнаружено, что по сравнению с контролем (2) составы 10 мМ гистидин HCl и 10 мМ гистидинацетат настоящего изобретения значительно ингибировали образование агрегатов и примесей.

Пример 3

Оценка оптимальной концентрации сахара для состава

В настоящем примере для идентификации оптимальной концентрации сахара для жидкого состава, содержавшего в качестве активного ингредиента афлиберцепт, который представляет собой слитый белок анти-VEGF-Fc, подготавливали образцы следующим образом.

В частности, конечную концентрацию афлиберцепта доводили до 40 мг/мл и (1) состав, содержавший 10 мМ фосфата натрия, рН 6,2, 5% сахарозы, 40 мМ NaCl, 0,03% полисорбата 20 (состав хранили при 5 ± 3 °С); (2) состав, содержавший 10 мМ фосфата натрия, рН 6,2, 5% сахарозы, 40 мМ NaCl, 0,03% полисорбата 20 (состав хранили при 50 °С), и составы, соответственно содержавшие в 10 мМ гистидинацетатном буфере (рН 6,0) 0,01% полисорбата 20, (3) 2,5% трегалозы; (4) 2,5% сахарозы; (5) 2,5% маннита; и (6) 2,5% глюкозы, хранили при 50°C в течение 8 дней. Затем, аналогично примерам 1 и 2, мономеры, агрегаты и варианты, полученные по прошествии определенного времени, анализировали с помощью SDS-PAGE (восстанавливающий, невосстанавливающий), SE-HPLC и HI-HPLC.

В результате анализа SDS-PAGE (восстанавливающий, невосстанавливающий) (фиг. 4) и анализа SE-HPLC и HI-HPLC, при сравнении с контролем (2), все составы, соответственно включавшие трегалозу, сахарозу, маннит и глюкозу по настоящему изобретению, значительно ингибировали образование агрегатов и примесей. В частности, эффект ингибирования образования примесей и агрегатов являлся совершенно превосходным в составе, включавшем сахарозу.

[Пример 4]

Оценка оптимальной концентрации сахара для состава

В настоящем примере для идентификации оптимальной концентрации сахара для жидкого состава, содержавшего в качестве активного ингредиента афлиберцепт, представляющий собой слитый белок анти-VEGF-Fc, подготавливали образцы следующим образом.

В частности, конечную концентрацию афлиберцепта доводили до 40 мг/мл и (1) состав, содержавший 10 мМ фосфата натрия, рН 6,2, 5% сахарозы, 40 мМ NaCl, 0,03% полисорбата 20 (состав, хранили при 5 ± 3 °С); (2) состав, содержавший 10 мМ фосфата натрия, рН 6,2, 5% сахарозы, 40 мМ NaCl, 0,03% полисорбата 20 (состав, хранили при 45 °С), и составы, соответственно содержавшие в 10 мМ гистидинацетатном буфере (рН 6,0) с 0,01% полисорбата 20 сахарозу с различными концентрациями (3) 0%, (4) 2,5%; (5) 5%; и (6) 10%, хранили при 45°C в течение 7 дней. Затем аналогично примерам 1 и 2 анализировали мономеры, агрегаты и варианты, полученные по прошествии определенного времени, с помощью SDS-PAGE (восстанавливающий, невосстанавливающий), SE-HPLC и HI-HPLC.

В результате анализа SE-HPLC было обнаружено, что состав без сахарозы по настоящему изобретения (3) продемонстрировал стабильность состава, подобную стабильности контроля (2) и по мере того, как концентрация сахарозы в каждом составе настоящего изобретения возрастала, эффект ингибирования образования агрегатов и примесей возрастал относительно контроля (2) (фиг. 5).

[Пример 5]

Оценка дополнительных солевых условий

В настоящем примере для идентификации дополнительного солевого ингредиента, оптимального для жидкого состава, содержащего в качестве активного ингредиента афлиберцепт, который представляет собой слитый белок анти-VEGF-Fc, подготавливали образцы следующим образом.

В частности, конечную концентрацию афлиберцепта доводили до 40 мг/мл и (1) состав, содержавший 10 мМ фосфата натрия, рН 6,2, 5% сахарозы, 40 мМ NaCl, 0,03% полисорбата 20 (состав, хранили при 5 ± 3°С); (2) состав, содержавший 10 мМ фосфата натрия, рН 6,2, 5% сахарозы, 40 мМ NaCl, 0,03% полисорбата 20 (% состав, хранили при 45°С) и составы, соответственно содержавшие в 10 мМ гистидинацетатном буфере (рН 6,0) 0,01% полисорбата 20, (3) без соли, (4) 40 мМ хлорида натрия; (5) 40 мМ хлорида аммония; (6) 40 мМ сульфата аммония; и (7) 40 мМ хлорида калия, хранили при 45°C в течение 7 дней. Затем, аналогично примерам 1 и 2, анализировали мономеры, агрегаты и варианты, полученные по прошествии определенного времени, с помощью SDS-PAGE (восстанавливающий, невосстанавливающий), анализа SE-HPLC и HI-HPLC.

В результате анализа SDS-PAGE и SE-HPLC (фиг. 6), наблюдали, что при сравнении с контролем (2), состав без дополнительного солевого ингредиента настоящего изобретения (3) продемонстрировал совершенно превосходный эффект ингибирования образование примесей и агрегатов.

[Пример 6]

Оценка стабильности в зависимости от присутствия и отсутствия поверхностно-активного вещества в условиях встряхивания

В настоящем примере подготавливали образцы следующим образом для того, чтобы оценить стабильность состава в зависимости от присутствия и отсутствия полисорбата 20 и концентрации сахарозы во время встряхивания, при этом жидкий состав был основан на буфере гистидин HCl и содержал в качестве активного ингредиента афлиберцепт, который представляет собой слитый белок анти-VEGF-Fc.

В частности, конечную концентрацию афлиберцепта доводили до 40 мг/мл и состав с (1) 10 мМ фосфатом натрия, рН 6,2, 5% сахарозы, 40 мМ NaCl, 0,03% полисорбата 20; (2) 10 мМ гистидинацетата, рН 6,0, 10% сахарозы; (3) 10 мМ гистидин HCl, рН 6,0, 7,5% сахарозы; (4) 10 мМ гистидин HCl, рН 6,0, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата 20; (5) 10 мМ гистидин HCl, рН 6,0, 7,5% сахарозы, 0,01% полисорбата 20; и (6) 10 мМ гистидин HCl, pH 6,0, 10% сахарозы, 0,01% полисорбата 20, соответственно, хранили при 5 ± 3°C или 25°C в течение 7 дней со встряхиванием при 200 об/мин с помощью орбитального встряхивателя.

Состав, описанный в (1), соответствовал составу, раскрытому в предшествующем патентном документе 1, т.е. Международной публикации WO 2007/149334. Описанные в (2) условия применяли в качестве контроля изменений в солевом гистидиновом буфере.

Как продемонстрировано посредством результатов анализа SE-HPLC и HI-HPLC, было обнаружено, что независимо от присутствия и отсутствия полисорбата, состав, хранившийся в течение 7 дней при 25°C со встряхиванием, продемонстрировал ингибирование образования агрегатов и вариантов по сравнению с контролем (1). Результаты SDS-PAGE (невосстанавливающий) (фиг. 7) и SE-HPLC демонстрируют, что независимо от присутствия и отсутствия полисорбата, состав, хранившийся в течение 7 дней при 25°C со встряхиванием, также продемонстрировал ингибирование образования агрегатов и вариантов по сравнению с контролем (1). В частности, эффект ингибирования образования фрагментов белка и агрегатов состава без полисорбата был немного лучше.

Пример 7

Оценка оптимальной концентрации полисорбата 20 для состава

В настоящем примере для идентификации оптимальной концентрации полисорбата 20 для жидкого состава, содержащего в качестве активного ингредиента афлиберцепт, который представляет собой слитый белок анти-VEGF-Fc, подготавливали образцы следующим образом.

В частности, конечную концентрацию афлиберцепта доводили до 40 мг/мл и (1) состав, содержавший 10 мМ фосфата натрия, рН 6,2, 5% сахарозы, 40 мМ NaCl, 0,03% полисорбата 20 (состав, хранили при 5 ± 3°С); (2) состав, содержавший 10 мМ фосфата натрия, рН 6,2, 5% сахарозы, 40 мМ NaCl, 0,03% полисорбата 20 (% состав, хранили при 45 °С), и состав с 10% сахарозы и полисорбатом 20 различной концентрации (3) 0%; (4) 0,01%; (5) 0,03%; (6) 0,05%; и (7) 0,1% в 10 мМ гистидинацетатном буфере (pH 6,0), хранили при 45°C в течение 7 дней. Затем, аналогично примерам 1 и 2, мономеры, агрегаты и варианты, полученные по прошествии определенного времени, анализировали с помощью SDS-PAGE (восстанавливающий, невосстанавливающий), SE-HPLC и HI-HPLC.

В результате анализа SE-HPLC было обнаружено, что состав (3) без полисорбата 20 по настоящему изобретению и составы (4), (5), (6) и (7) без полисорбата 20 имели превосходящий эффект ингибирования образования агрегатов и примесей, по сравнению с эффектом контрольного состава (2) (фиг. 8).

Следовательно, посредством примеров 1-7, было обнаружено, что различные условия жидких составов настоящего изобретения существенно ингибировали фрагментацию и агрегацию, больше чем состав предшествующего уровня техники.

Посредством тестирования стабильности состава, было обнаружено, что жидкий состав настоящего изобретения имеет превосходный эффект ингибирования образования примесей и побочных продуктов, вызванных агрегацией, фрагментацией и изомеризацией слитого белка, имеющего домен Fc IgG, и, таким образом, слитый белок может храниться стабильным образом в течение длительного периода времени, а также может быть обеспечена увеличенная стабильность в тяжелых условиях.

В данном описании выше подробно описаны конкретные особенности настоящего изобретения. Однако, специалисту в данной области будет очевидно, что конкретное описание является только предпочтительным вариантом осуществления, и объем настоящего изобретения не ограничен этим описанием. Таким образом, реальный объем настоящего изобретения будет определен пунктами прилагаемой формулы изобретения и их эквивалентами.

Группа изобретений относится к жидкому составу, который, содержит от 10 до 100 мг/мл белка, в котором растворимый внеклеточный домен рецептора фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и домен Fc иммуноглобулина G человека (IgG) являются слитыми; буфер, содержащий соль гистидина и имеющий pH, варьирующийся от 5,7 до 6,2; сахар, выбранный из группы, состоящей из от 2,5% (масс./об.) до 10% (масс./об.) сахарозы, трегалозы, маннита и глюкозы; и поверхностно-активное вещество, выбранное из группы, состоящей из от 0% (масс./об.) до 0,1% (масс./об.) полисорбата 20 и полисорбата 80, где растворимый внеклеточный домен рецептора VEGF содержит иммуноглобулиноподобный домен 2 первого рецептора VEGF и иммуноглобулиноподобный домен 3 второго рецептора VEGF и соль гистидина представляет собой от 10 мМ до 50 мМ гистидина HCl или гистидинацетата. Также группа изобретений относится к композиции для стабилизации белка, а также к жидкому составу, содержащему композицию для стабилизации белка и афлиберцепт. Группа изобретений улучшает терапевтические эффекты в отношении офтальмологических заболеваний, вызванных аномальным ангиогенезом за счет обеспечения сохранения биоактивности посредством стабилизации жидкого состава, пригодного для интравитреальной инъекции слитого белка анти-VEGF-Fc, включающего афлиберцепт, а также обеспечивает снижение выработки примесей и побочных продуктов из-за агрегации, фрагментации и изомеризации слитого белка, имеющего домен Fc иммуноглобулина G человека (IgG). 3 н. и 3 з.п., 8 ил., 7 пр.

1. Жидкий состав, содержащий:

от 10 до 100 мг/мл белка, в котором растворимый внеклеточный домен рецептора фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и домен Fc иммуноглобулина G человека (IgG) являются слитыми;

буфер, содержащий соль гистидина и имеющий pH, варьирующийся от 5,7 до 6,2;

сахар, выбранный из группы, состоящей из от 2,5% (масс./об.) до 10% (масс./об.) сахарозы, трегалозы, маннита и глюкозы; и

поверхностно-активное вещество, выбранное из группы, состоящей из от 0% (масс./об.) до 0,1% (масс./об.) полисорбата 20 и полисорбата 80,

где растворимый внеклеточный домен рецептора VEGF содержит иммуноглобулиноподобный домен 2 первого рецептора VEGF и иммуноглобулиноподобный домен 3 второго рецептора VEGF и соль гистидина представляет собой от 10 мМ до 50 мМ гистидина HCl или гистидинацетата.

2. Жидкий состав по п.1, где сахар представляет собой от 5% (масс./об.) до 10% (масс./об.) сахарозы.

3. Композиция для стабилизации белка, в которой растворимый внеклеточный домен рецептора VEGF и домен Fc IgG являются слитыми, где растворимый внеклеточный домен рецептора VEGF содержит иммуноглобулиноподобный домен 2 первого рецептора VEGF и иммуноглобулиноподобный домен 3 второго рецептора VEGF, где композиция содержит:

буфер, содержащий соль гистидина и имеющий pH, варьирующийся от 5,7 до 6,2; и

один или более стабилизаторов, выбранных из группы, состоящей из сахаров и поверхностно-активных веществ,

где соль гистидина представляет собой от 10 мМ до 50 мМ гистидина HCl или гистидинацетата; сахар представляет собой любой, выбранный из группы, состоящей из от 2,5% (масс./об.) до 10% (масс./об.) сахарозы, трегалозы, маннита и глюкозы; и поверхностно-активное вещество представляет собой от 0% (масс./об.) до 0,1% (масс./об.) полисорбата 20 или полисорбата 80.

4. Композиция по п.3, где поверхностно-активное вещество представляет собой от 0% (масс./об.) до 0,03% (масс./об.) полисорбата 20 или полисорбата 80.

5. Жидкий состав, содержащий:

композицию по п.3 или 4 для стабилизации белка, в которой растворимый внеклеточный домен рецептора VEGF и домен Fc IgG являются слитыми; и

афлиберцепт.

6. Жидкий состав по п.5, где жидкий состав пригоден для интравитреальной инъекции.