Способ определения длительного темпа наступления смерти Российский патент 2019 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к исследованию физических и химических свойств биологического материала, в частности крови и может быть использовано при проведении судебно-медицинских экспертиз для установления непосредственной причины смерти, типа танатогенеза, а именно длительного темпа наступления смерти, а также для выявления дефектов лечения и ятрогений.

Установление длительности умирания человека, а также связанного с ним темпа наступления смерти являются одной из наиболее старых и сложных проблем судебно-медицинской танатологии, до сих пор не получившей удовлетворительного решения. Темп наступления смерти зависит от ряда субъективных и объективных причин, которые могут ускорить или замедлить его и, тем самым, повлиять не только на длительность процесса умирания, но и на танатогенез в целом. В связи с этим, интерес к проблеме определения особенностей танатогенеза неуклонно возрастает, что обусловлено новыми требованиями к работе судебно-медицинского эксперта и ее результатам. Для полного, объективного, научно-обоснованного судебно-медицинского заключения о причине смерти необходим всесторонний анализ характеристик премортального периода (Mazeikiene et al, 2016). Mazeikiene S., Laima S., Chmieliauskas S., Fomin D., Andriuskeviciute G., Markeviciute M., Matuseviciute A., Jasulaitis A., Stasiuniene J. Deontological examination: Clinical and forensic medical diagnoses discrepancies. Egyptian Journal of Forensic Sciences. 2016;6(4):323-327. https://doi.org/10.1016/j.ejfs.2016.02.003).

За прототип предлагаемого изобретения выбран известный способ определения длительного темпа наступления смерти, включающий проведение комплексных исследований биологического материала, взятого от трупа, в том числе морфологическое, микро- и макроскопического исследования, анализ секционной картины и гистохимическое исследование (Путинцев В.А., Богомолов Д.В., Богомолова И.Н., Денисов О.П. Определение длительности и темпа умирания по морфологическим признакам. Методические рекомендации утверждены и рекомендованы к изданию Ученым советом ФГБУ «РЦСМЭ» Минздрава России (протокол №7 от 27 декабря 2016 года) / Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Москва, 2017.).

Известный способ осуществляют следующим образом.

Проводят комплексное исследование, включающее:

- анализ сведений об обстоятельствах наступления смерти (по материалам дела);

- ретроспективный клинико-анатомический анализ, основной (классический) метод вскрытия трупов людей при секционных исследованиях;

- гистологическое исследование, а также иммуногистохимическое исследование, по данным об экспрессии фибриногена в легких для установления темпа и длительности умирания;

- дополнительный морфометрические, макроскопические и фотографические исследования, и ПЦР исследование при необходимости.

Для точности и надежности полученных результатов исследования используют морфолого-статистический анализ, который включает статистический анализ морфологических признаков и танатогенетический анализ случаев отобранного материала.

После проведения комплексных исследований определят темп наступления смерти:

1) молниеносный темп (атональный период не превышает 15-30 минут);

2) быстрый темп (агональный период более 30 минут и до 2 часов);

3) средний темп (агональный период более 2 часов и до 6 часов);

4) медленный темп (агональный период более 6 часов и до 12 часов);

5) длительный темп (агональный период более 12 часов).

Однако известный способ является достаточно трудоемким и громоздким. Кроме того, авторы известного способа отмечают, что в ходе исследований была выявлена «… некоторая субъективность экспертной оценки признаков по приведенным позициям, которая зависит от навыка эксперта и стажа его работы, что отрицательно сказывается на доказательственном значении выводов или суждений». Таким образом, известный способ недостаточно точен для его применения в судебно-медицинской практики. Для усовершенствования известного способа его авторы разработали таблицу, которая позволяет установить пять вариантов темпа наступления смерти по 5-и морфологическим комплексам с описанием морфологических признаков и указанием диагностического предела их суммарной значимости. Однако таблицу используют те же эксперты, которые обладают теми же навыками и стажем работы, что не уменьшает долю субъективизма.

Задачей предлагаемого изобретения является создание способа определения длительного темпа наступления смерти, которое лишено недостатков прототипа.

Технический результат предлагаемого способа заключается в повышении точности способа за счет исключения факта субъективности исследования и сокращении времени его проведения.

Технический результат достигается тем, что в известном способе определения длительного темпа наступления смерти, включающем проведение комплексных исследований биологического материала, взятого от трупа, в том числе морфологического, микро- и макроскопического исследования, анализ секционной картины, гистохимическое исследование, проводят комплексное исследование образца сыворотки крови, взятого из бедренной вены трупа не более чем через 35 часов с момента наступления смерти, и исследуют параметры окислительной модификации белков, количество общего белка и параметры свободно- радикальной активности сыворотки крови, при этом значения окислительной модификации белков определяют на спектрофотометре на длинах волн 270,370,430,535 нм, параметры свободно радикальной активности определяют по максимальной интенсивности свечения пробы и определяют длительный темп наступления смерти по формуле:

где К - параметр темпа наступления смерти;

Σ ОМБ - суммарное значение окислительной модификации белков;

Б - количество общего белка;

CPA - значение радикальной активности сыворотки крови

и при значении К менее 8×10^-6 условных единиц определяют длительный темп наступления смерти.

Предлагаемое изобретение отвечает критерию изобретения «новизна», так как проведенные патентно-информационные исследования не выявили источников научно-медицинской и патентной документации, которые бы порочили новизну предлагаемого технического решения.

Из анализа литературы известно использование феномена свечения биологических объектов, который был назван «сверхслабым свечением» при проведении судебно-медицинских экспертиз (Пашинян Г.А., Прутовых В.В. «Использование метода хемилюминисценции для определения прижизненности и давности механической травмы скелетных мышц» Судебно-медицинская экспертиза, 1978, №2, с. 15-17). Применяя метод индуцированной ионами двухвалентного железа хемилюминесценции (ХЛ), исследовали гомогенаты мышц бедра животного после его механической травматизации. Определение параметров ХЛ проводили на установке по регистрации сверхслабых свечений. Было установлено, что параметры индуцированной ХЛ гомогенатов травмированных мышц закономерно изменяются по мере увеличения посттравматического периода.

Однако известный способ применяется для определения прижизненности и длительности посттравматического периода при механической травме скелетных мышц.

Таким образом, проведенные патентно-информационные исследования по доступным научно-медицинской информации и патентной документации позволили сделать вывод об отсутствии технических решений с существенными признаками предлагаемого способа, что соответствует критерию «изобретательский уровень».

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в повышении точности и объективности способа, за счет выявленной авторами предлагаемого способа зависимости темпа умирания от соотношения параметров окислительной модификации белков сыворотки крови трупа к количеству общего белка в пробе и к значению свободно-радикальной активности сыворотки крови. Полученные данные являются новыми критериями для установления длительного темпа наступления смерти. Кроме того результаты анализа представляются в цифровой форме, что увеличивает объективность и точность заключения. Предлагаемый способ позволяет значительно сократить время проведения судебно-медицинской экспертизы.

Для подтверждения технического результата были проведены исследования образцов крови, взятых из бедренной вены от 10 трупов лиц, из них 6 мужчин возрастом от 55 до 89 лет и 4 женщин возрастом от 67 до 82 лет, умерших в результате онкологических заболеваний, как пример танатогенеза, характеризующегося длительным агональным периодом (более 12 часов) в соответствии с утвержденными методическими рекомендациями «Определение длительности и темпа умирания по морфологическим признакам»).

Контрольную группу составили случаи с молниеносным темпом наступления смерти (агональный период не превышает 15-30 минут). Из них 25 случаев смерти от сочетанной тупой травмы тела, из них 15 мужчин возрастом от 22 до 71 года и 10 женщин возрастом от 13 до 84 лет, 4 случая смерти от колото-резанных ран, мужчины возрастом от 29 до 62 лет. Статистический анализ был проведен с помощью программного обеспечения Statplus, компании «AnalystSoft», 2018. Для выявления различий между выборками использовали U-критерий Манна-Уитни, различия между выборками использовали U-критерий Манна-Уитни, различия считались статистически достоверными при уровне значимости р<0,05. Для оценки корреляционной связи данных двух выборок применяли корреляцию по Спирмену.

При сравнении окислительной модификации белков сыворотки крови при длительном темпе умирания со случаями с мгновенным темпом наступления смерти, были получены следующие результаты (табл. 1).

Уровень суммарной окислительной модификации белков сыворотки крови в пересчете на белок и свободно радикальную активность при разных темпах умирания. (Таблица 1).

Были выявлены статистически значимые различия между уровнем суммарной ОМБ/белок/радикальная активность сыворотки крови при длительном и молниеносном темпе наступления смерти (р=0,041).

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Забор крови осуществляют при аутопсии из бедренной вены трупа в срок не более 35 часов после наступления смерти в количестве 10,0 мл сухим шприцем в стерильную склянку (параграф VII, главы 88 Приказа №346н Минздравсоцразвития РФ от 12.05.2010 «Об утверждении порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях Российской Федерации»). Определение окислительной модификации белков (ОМБ) проводят по уровню карбонильных производных, выявляемых в реакции с 2,4-динитрофенилгидразином (Дубинина Е.Е., Бурмистров CO., Ходов Д.А., Поротов И.Г. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения. Вопросы медицинской химии; 1995;41(1):24-26).

Метод основан на реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов, которые регистрируют спектрофотометрически. В результате ОМБ наблюдается появление карбонильных производных, которые в присутствии 2,4-ДНФГ образуют 2,4-динитрофенилгидразоны.

Определение окислительной модификации белков сыворотки крови.

Ход определения степени окислительной модификации белков в плазме крови

Оптическую плотность соединений регистрируют на спектрофотометре на длинах волн 230, 270, 370, 430, 530 нм. Суммарную спонтанную ОМБ определяют сложением всех значений на вышеуказанных длинах волн, результат выражают в условных единицах.

Количественное определение общего белка в растворе проводят методом Лоури (Набор реагентов для определения белка в биологических жидкостях, производитель ООО «Фирма Синтакон», Санкт-Петербург, Россия). К 0,4 мл разведенной в 400 раз сыворотки крови добавляют 2 мл раствора В, содержащего цитрат натрия, сульфат меди, карбонат натрия и гидроокись натрия), перемешивают и инкубируют 10 минут на водяной бане при 25°С. Затем добавляют 0,2 мл реактива Фолина-Чокальтеу (1N), перемешивают и инкубируют 30 минут на водяной бане при 25°С. Затем колориметрируют против контрольной пробы, содержащей вместо 0,4 мл разведенной сыворотки крови 0,4 мл физиологического раствора при длине волны 760 нм. Концентрацию общего белка определяют по калибровочному графику и умножают полученный результат на фактор разведения пробы.

Значение свободно радикальной активности определяют методом индуцированной перекисью водорода и сульфатом железа хемилюминесценции. (Кузьмина Е.И., Нелюбин А.С., Щенникова М.К. Применение индуцированной хемилюминесценции для оценки свободно-радикальных реакций в биологических субстратах // Межвузовский сборник биохимии и биофизики микроорганизмов. Горький, 1983. С. 179-183.).

Ход работы:

В измерительную кювету вносят:

- 0,1 мл плазмы крови

- 0,4 мл фосфатного буфера (рН=7,5)

- 0,4 мл раствора сульфата железа (0,05 мМ).

Кювету устанавливают в кюветодержатель биохемилюминометра БХЛ-07, сопряженным с компьютером. В измерительную кювету вносят 0,2 мл 2% раствора перекиси водорода, затем поворачивают ручку кюветного блока на 180 градусов против часовой стрелки до упора. На дисплее появляется окно «Измерение» и начинается регистрация кинетической кривой сигнала ХЛ. По окончании заданного времени (30 сек.), измерение прерывается и происходит обсчет необходимых параметров ХЛ сигнала. Программа переходит в окно обработки, на котором появляется карта опыта, на которой приведен отнормированный график кинетики ХЛ и рассчитанные параметры сигнала (Imax, который выражают в импульсах/секунду).

Длительный темп наступления смерти определяют по формуле:

где К - параметр темпа наступления смерти;

ОМБ - суммарное значение окислительной модификации белков;

Б - количество общего белка;

CPA - значение радикальной активности сыворотки крови

и при значении К менее 8×10^-6 условных единиц определяют длительный темп наступления смерти.

Примеры конкретного исполнения даны в виде выписок из протоколов исследования.

1) Гражданин М 1958 г.р. Смерть от полиорганной недостаточности, которая развилась вследствие имевшегося у него заболевания плеоморфного мелкоклеточного рака правого легкого с очагами распада и метастазами, что подтверждается данными секционного и гистологического исследования. Продолжительность атонального периода более 12 часов, что зафиксировано родственниками и медицинскими работниками, а так же подтверждено секционными данными и гистологическими исследованиями. Проведено исследование по предлагаемому способу.

Соотношение суммарной окислительной модификации белков сыворотки крови к общему содержанию белка и далее к значению свободно радикальной активности сыворотки крови. Получен результат, К=4,82×10^-6 усл.ед., что < 8×10^-6, таким образом определен длительный темп наступления смерти.

2) Гражданин К, 1961 г.р. Смерть наступила от интоксикации вследствие прогрессирования имеющегося заболевания - злокачественной опухоли желудка распространяющейся на внутренние органы грудной клетки, лимфатические узлы брюшной полости. Продолжительность атонального периода более 12 часов, что зафиксировано родственниками и медицинскими работниками, а так же подтверждено секционными данными и гистологическими исследованиями. Результаты исследования по предлагаемому способу - соотношение окислительной модификации белков сыворотки крови/к общему содержанию общего белка и далее к значению свободнорадикальной активности сыворотки крови составил, К=7,17×10^-6 усл.ед., что < 8×10^-6, таким образом, определен длительный темп наступления смерти.

3) Гражданка А, 1956 г.р. Смерть наступила от повреждений, входящих в комплекс имевшейся у нее сочетанной тупой травмы тела, в которую входит открытая тупая черепно-мозговая травма (открытый оскольчатый перелом всех костей свода и основания черепа, костей всех черепных ямок), закрытой тупой травмы грудной клетки (переломы ребер 3-7, разрывы плевры, ушибы и разрывы легких), перелом левой лопатки, разрыв селезенки, разрыв печени. По данным следствия, свидетельств медицинских работников, секционного исследования продолжительность агонального периода составила не более нескольких минут. Результаты гистологического исследования выявили массивные кровоизлияния в мягких тканях в областях повреждений без реактивных клеточных изменений, что свидетельствует о длительности агонального периода от 0-1 часа.

Проведены исследования по предлагаемому способу. Соотношение окислительной модификации белков сыворотки крови/к общему содержания в ней белка и к свободно радикальной активности сыворотки крови 2,63×10^-5 усл.ед., что > 8×10^-6, таким образом, длительный темп наступления смерти не подтвержден.

Изобретение относится к медицине и касается способа определения длительного темпа наступления смерти, включающего проведение комплексных исследований биологического материала, взятого от трупа, в том числе морфологического, микро- и макроскопического исследования, анализ секционной картины, гистохимическое исследование. При этом проводят комплексное исследование образца сыворотки крови, взятого из бедренной вены трупа не более чем через 35 часов с момента наступления смерти, и исследуют параметры окислительной модификации белков, количество общего белка и параметры свободно-радикальной активности сыворотки крови, при этом значения окислительной модификации белков определяют на спектрофотометре на длинах волн 270,370,430,535 нм, параметры свободно радикальной активности определяют по максимальной интенсивности свечения пробы и определяют длительный темп наступления смерти по заявленной формуле. Изобретение обеспечивает повышение точности способа за счет исключения факта субъективности исследования и сокращение времени его проведения. 2 табл., 3 пр.

Способ определения длительного темпа наступления смерти, включающий проведение комплексных исследований биологического материала, взятого от трупа, в том числе морфологического, микро- и макроскопического исследования, анализ секционной картины, гистохимическое исследование, отличающийся тем, что проводят комплексное исследование образца сыворотки крови, взятого из бедренной вены трупа не более чем через 35 часов с момента наступления смерти, и исследуют параметры окислительной модификации белков, количество общего белка и параметры свободно-радикальной активности сыворотки крови, при этом значения окислительной модификации белков определяют на спектрофотометре на длинах волн 270,370,430,535 нм, параметры свободно радикальной активности определяют по максимальной интенсивности свечения пробы и определяют длительный темп наступления смерти по формуле:

где К - параметр темпа наступления смерти;

Σ ОМБ - суммарное значение окислительной модификации белков;

Б - количество общего белка;

CPA - значение свободно радикальной активности сыворотки крови

и при значении К менее 8×10^-6 условных единиц определяют длительный темп наступления смерти.