СПОСОБ СКРИНИНГОВОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЫСОКОЙ ВЕРОЯТНОСТИ НАЛИЧИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ХАРАКТЕРА ВОСПАЛЕНИЯ, АССОЦИИРОВАННОГО С БРОНХООБСТРУКТИВНЫМ СИНДРОМОМ, ПРИ БРОНХОЛЕГОЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ У ДЕТЕЙ Российский патент 2019 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, пульмонологии, клинической лабораторной диагностике. Изобретение может использоваться для оценки характера воспалительного процесса, скрининга хронического характера воспаления при обструктивном синдроме у детей с бронхолегочными заболеваниями.

Известно, что аномалии воспалительного процесса могут приводить к нарушению регенерации и репарации тканей, развитию широкого спектра заболеваний, их тяжелым осложнениям (хронизации болезни, развитию обструктивного синдрома, фиброзу органов и тканей, ателектазам легких и пр.). При клиническом и инструментальном обследовании больного не всегда можно объективно оценить характер воспаления, хотя это необходимо для определения тактики лечения, разработки и применения новых лекарственных средств.

Исследования последних лет внесли вклад в понимание патогенеза тяжелых бронхолегочных заболеваний, их хронизации, развития осложнений [Atamas S., Chapoval S.P., Keegan A.D. Cytokines in chronic respiratory diseases. // Biol. Rep. - 2013. - Vol. 5. - N3. - P. 1-12; Tzouvelekis A., Bonella F., Spagnolo P. Update on therapeutic management of idiopathic pulmonary fibrosis. // Ther. Clin. Risk Manag. - 2015. - Vol. 11. - Р. 359-370].

Однако до настоящего времени не предложено достаточно информативного и объективного способа оценки динамики и характера воспалительного процесса при бронхолегочных заболеваниях - биопсия тканей с последующим морфологическим исследованием является опасным и травмирующим методом, его осуществление часто невозможно ввиду состояния больного, особенно в детском возрасте. Поэтому использование альтернативного, безопасного и малоинвазивного метода диагностики фаз воспаления, каким является метод оценки асептического воспаления in vivo, по-прежнему актуально.

Известен метод оценки асептической воспалительной реакции in vivo, разработанный Rebuch G., Crowley J. (1955) [Rebuck J.W., Crowley J.H. A method of studying leukocytic functions in vivo. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 1955. -Vol. 59. - N 5. - P. 757-805]. Он предполагает получение монослоя лейкоцитов, вышедших в зону асептического воспаления на участке кожи со скарифицированным эпидермисом. При смене предметных стекол, плотно прижатых к участку скарификации, указанный метод позволял оценить таксис лейкоцитов в зону альтерации кожного покрова в динамике локального асептического воспаления.

Модификация данного способа адаптирована к использованию в клинической лабораторной практике для характеристики активности нейтрофилов и моноцитов в процессе воспаления in vivo [Цветкова Е.И., Капелько М.А., Рябинская Т.Ф. и др. Цитологические методы в оценке реактивности детей при острой и хронической пневмонии. /Методические рекомендации. - М., 1982. - С. 16-19]. Данный метод позволял оценить состав клеточных элементов в двух фазах воспаления: I (нейтрофильной) и II (моноцитарной/макрофагальной). К достоинствам методов-прототипов относятся а) возможность оценки клеточных реакций in vivo; б) низкая травматичность; в) полная безопасность при соблюдении асептики.

Известен также способ оценки активности воспаления при бронхиальной астме [RU 2277710, C1]. В указанном способе использован тот же метод постановки реакции асептического воспаления и те же методы его оценки, что и в вышеуказанных известных способах. Дополнительным преимуществом этого метода является включение в оценку динамики реакции дополнительной точки исследования результатов (12 часов от начала реакции).

Известен способ оценки функциональных и цитоморфологических дефектов фагоцитов в экссудате асептического воспаления с элементами статистической обработки данных [RU 2013129534, А]. Было проведено исследование функциональных и цитоморфологических дефектов фагоцитов в экссудате асептического воспаления. К дополнительным достоинствам данного метода можно отнести возможность частичного использования статистических методов оценки результатов.

Однако известные, указанные выше способы предполагают лишь фрагментарную количественную оценку воспаления, не обеспечивают полной объективности при интерпретации данных.

Они позволяют получить только описательный характер заключения, интерпретация результатов проведенного исследования сложна и субъективна.

Кроме того, известные лабораторные методы исследования по уровню техники не позволяют количественно охарактеризовать хронический характер воспаления, ассоциированный с обструктивным синдромом, при бронхолегочных заболеваниях у детей старше 2 лет, что ограничивает их внедрение в клиническую, особенно в педиатрическую практику.

Нами поставлена задача разработать простой, объективный способ скрининга хронического характера воспаления, ассоциированного с обструктивным синдромом, у детей с бронхолегочными заболеваниями, позволяющий отобрать пациентов для последующего углубленного обследования и выбора оптимальной лечебной тактики.

Технический результат заключается в обеспечении доступности и объективности выявления хронического характера воспаления при бронхообструктивном синдроме у детей с бронхолегочными заболеваниями путем анализа количественных показателей кожной асептической воспалительной реакции трех фаз воспаления.

Нами установлен комплекс объективных показателей -скрининговых критериев, указывающих на хронический характер воспаления при обструктивном синдроме у детей с бронхолегочными заболеваниями, основанных на количественной (морфометрической) оценке определенных цитологических и не цитологических признаков, характеризующих кожную асептическую воспалительную реакцию с учетом трех фаз воспаления.

Предлагаемые скрининговые критерии объективны и понятны специалистам. Внедрение в клиническую практику предложенного нами способа позволит повысить уровень диагностики хронического воспаления при бронхообструктивном синдроме у детей.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Для скринингового определения высокой вероятности наличия хронического характера воспаления, ассоциированного с обструктивным синдромом, при бронхолегочных заболеваниях у детей старше 2 лет скарифицируют участок эпидермиса на ладонной стороне предплечья. Получают отпечаток клеток и экссудата кожной асептической воспалительной реакции на предметных стеклах через 6, 24 и 32 часа с момента скарификации. Препараты фиксируют этанолом, окрашивают по Гимзе-Романовскому и микроскопируют при увеличениях х100 и х1000. В препарате, полученном через 6 часов с момента скарификации, определяют количество моноцитов и лимфоцитов в процентах от общего числа лейкоцитов и коэффициент спрединга, который выражается соотношением максимального и минимального диаметра лейкоцитов. В препарате, полученном через 24 часа с момента скарификации, определяют количество лимфоцитов в процентах от общего числа лейкоцитов, количество лейкоцитов с признаками аутолиза в процентах от общего числа лейкоцитов (показатель аутолиза), максимальное количество волокон в поле зрения. В препарате, полученном через 32 часа с момента скарификации, определяют коэффициент спрединга и показатель аутолиза. При наличии количества моноцитов менее 10%, лимфоцитов более 0,9% и коэффициента спрединга более 1,4 через 6 часов с момента скарификации, количества лимфоцитов менее 1,5%, максимального количества волокон менее 0,7 в поле зрения, показателя аутолиза менее 42% через 24 часа с момента скарификации, коэффициента спрединга более 1,7 и показателя аутолиза более 49% через 32 часа с момента скарификации определяют высокую вероятность наличия хронического характера воспаления, ассоциированного с обструктивным синдромом.

Способ осуществляется следующим образом.

На участке кожи внутренней поверхности предплечья у ребенка старше 2 лет с бронхолегочным заболеванием по намеченному трафарету снимают слой эпидермиса. Размеры участка скарифицированного эпидермиса должны составлять 0,003×0,003 м (9×10^-6м²=900×10^-8м²).

На образовавшуюся поверхностную ранку накладывают стерильное предметное стекло размерами 0,025×0,025 м с зашлифованными краями. Плотно прижимают стекло к поверхности кожи и тщательно фиксируют. Через 6 часов (I, нейтрофильная фаза), 24 часа (II, моноцитарная/макро-фагальная) и 32 часа (III, фибробластическая фаза) от начала постановки реакции стекла снимают, маркируют и немедленно заменяют на новые, за исключением III фазы.

Препараты в течение 15 мин фиксируют 96% этанолом и окрашивают по Гимзе-Романовскому. Под световым микроскопом при увеличениях х100, х1000 посредством компьютерной морфометрии оценивают результаты реакции асептического воспаления. Может быть использован микроскоп Axioscop 40 (Zeiss, Германия) с программным обеспечением морфометрического исследования «ВидеоТест Мастер», СПб, Россия.

В каждой из трех фаз нами оценивались следующие количественные параметры воспалительного процесса: площадь зоны выхода элементов воспаления (в м²×10^-8 при увеличении х100); максимальная плотность (число) лейкоцитов в п/зр. (при увеличении х1000); показатель аутолиза (% лейкоцитов с признаками аутолиза при увеличении х1000), диаметр клеток в м х10^-6 при увеличении х1000), средний диаметр клеток в м х10^-6 при увеличении х1000), коэффициент спрединга (соотношение максимального и минимального диаметра лейкоцитов, в единицах при увеличении х1000), площадь, занимаемая экссудатом (в м² х10^-8 при увеличении х100), максимальное количество волокон в п/зр. (при увеличении х1000), количество нейтрофилов (% от всех лейкоцитов), моноцитов (% от всех лейкоцитов), лимфоцитов (% от всех лейкоцитов), эозинофилов (% от всех лейкоцитов, при увеличении х1000), ядер фибробластов (максимальное количество в п/зр. при увеличении х1000).

Поиск зон с высокой плотностью лейкоцитов, волокон и ядер фибробластов осуществляют при увеличении х100. Максимальное число лейкоцитов, волокон и ядер фибробластов в поле зрения регистрируют в результате просмотра всего препарата.

Подсчет количества лейкоцитов, определение показателя аутолиза и коэффициента спрединга осуществляют при увеличении х1000. Относительное количество нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов, эозинофилов в процентах определяют на 100 лейкоцитов.

Полное количественное параметрирование процесса воспаления позволило значительно увеличить объективность и точность оценки результатов, поднять на более высокий уровень методическую и диагностическую ценность метода.

Определяли высокую вероятность наличия хронического характера воспаления, ассоциированного с бронхообструктивным синдромом, при бронхолегочных заболеваниях у детей старше 2 лет при наличии следующего комплекса показателей: количества моноцитов менее 10%, лимфоцитов более 0,9% и коэффициента спрединга более 1,4 через 6 часов с момента скарификации, количества лимфоцитов менее 1,5%, показателя аутолиза менее 42%, максимального количества волокон менее 0,7 в поле зрения через 24 часа с момента скарификации, коэффициента спрединга более 1,7 и показателя аутолиза более 49% через 32 часа с момента скарификации.

С помощью предлагаемого способа высокая вероятность хронического характера воспаления при бронхообструктивном синдроме у детей в возрасте от 2 до 17 лет с болезнями органов дыхания со среднетяжелым и тяжелым течением заболевания была выявлена у 33 больных с бронхообструктивным синдромом. Во всех случаях наличие бронхообструктивного синдрома и хронический характер воспаления были верифицированы данными клинического наблюдения за пациентами и результатами инструментального обследования.

Результаты исследования подтверждают объективность динамической характеристики воспаления, полученной посредством разработанного нами количественного морфометрического способа.

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, пульмонологии, клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для скринингового определения высокой вероятности наличия хронического характера воспаления при бронхообструктивном синдроме у детей старше 2 лет. Для этого скарифицируют участок эпидермиса на ладонной стороне предплечья и получают отпечаток клеток и экссудата кожной асептической воспалительной реакции на предметных стеклах через 6, 24 и 32 часа с момента скарификации. Через 6 часов с момента скарификации определяют количество моноцитов и лимфоцитов в процентах от общего числа лейкоцитов и коэффициент спрединга. Через 24 часа определяют количество лимфоцитов в процентах от общего числа лейкоцитов, количество лейкоцитов с признаками аутолиза в процентах от общего числа лейкоцитов (показатель аутолиза), максимальное количество волокон в поле зрения. Через 32 часа с момента скарификации определяют коэффициент спрединга и показатель аутолиза. При количестве моноцитов менее 10%, лимфоцитов более 0,9% и коэффициенте спрединга более 1,4 через 6 часов с момента скарификации, количестве лимфоцитов менее 1,5%, максимальном количестве волокон менее 0,7 в поле зрения, показателе аутолиза менее 42% через 24 часа с момента скарификации, коэффициенте спрединга более 1,7 и показателе аутолиза более 49% через 32 часа определяют высокую вероятность наличия хронического характера воспаления, ассоциированного с бронхообструктивным синдромом. Способ позволяет выявить хронический характер воспаления при бронхообструктивном синдроме у детей с бронхолегочными заболеваниями за счет объективности выявления хронического характера воспаления при его доступности.

Способ скринингового определения высокой вероятности наличия хронического характера воспаления при бронхолегочных заболеваниях у детей старше 2 лет с бронхообструктивным синдромом, при котором скарифицируют участок эпидермиса на ладонной стороне предплечья, получают отпечаток клеток и экссудата кожной асептической воспалительной реакции на предметных стеклах через 6, 24 и 32 часа с момента скарификации, фиксируют препараты этанолом, окрашивают по Гимзе-Романовскому, микроскопируют при увеличении ×1000; в препарате, полученном через 6 часов, определяют количество моноцитов и лимфоцитов в процентах от общего числа лейкоцитов и соотношение максимального и минимального диаметра лейкоцитов (коэффициент спрединга); в препарате, полученном через 24 часа, определяют количество лимфоцитов в процентах от общего числа лейкоцитов, количество лейкоцитов с признаками аутолиза в процентах от общего числа лейкоцитов (показатель аутолиза), максимальное количество волокон в поле зрения; в препарате, полученном через 32 часа, определяют коэффициент спрединга и показатель аутолиза; и при количестве моноцитов менее 10%, количестве лимфоцитов более 0,9% и коэффициенте спрединга более 1,4 через 6 часов, наибольшем количестве лимфоцитов менее 1,5%, максимальном количестве волокон менее 0,7 в поле зрения, показателе аутолиза менее 42% через 24 часа, коэффициенте спрединга более 1,7 и показателе аутолиза более 49% через 32 часа с момента скарификации определяют высокую вероятность наличия хронического характера воспаления.