СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ УРОВНЯ ТРЕВОЖНОСТИ Российский патент 2019 года по МПК G01N33/53 

Предлагаемое изобретение относится к генетике поведения и психогенетике, и может быть использовано для прогнозирования уровня тревожности с целью предупреждения развития острых психических нарушений.

В современном мире патологическая тревожность является одним из наиболее распространенных нарушений психического здоровья, о чем говорят данные исследований Всемирной организации здравоохранения [Kessler R.C., Aguilar-Gaxiola S., Alonso J., Chatterji S., Lee S., Ormel J., Wang P.S. The global burden of mental disorders: an update from the WHO World Mental Health (WMH) surveys // Epidemiologia e psichiatria sociale, 2009. - P. 23-33]. Это оказывает негативное влияние на качество жизни индивидов, и может поспособствовать развитию более сложных психических расстройств. Вместе с тем, эффективная диагностика и прогнозирование уровня тревожности позволит своевременно провести медико-психологическую консультацию и, при необходимости, адекватную терапию, что позволит значительно облегчить жизнь индивида в постоянно изменяющихся условиях социальной среды.

Существует несколько методик по определению уровня тревожности. Коротковым К.Г. был разработан способ определения уровня тревожности человека, основанный на фиксации структур газоразрядного свечения вокруг исследуемой части одного и того же участка кожного покрова человека через полимерную пленку и без нее, и на основании полученной совокупности параметров каждой структуры в виде точек в многомерном пространстве параметров можно было судить об уровне тревожности индивида. Согласно этой методике, чем меньше расстояние между точками для структур, тем ниже уровень тревожности и, следовательно, чем больше это расстояние - тем выше показатели [Способ определения уровня тревожности человека // Патент РФ №2210982, 2003. / Коротков К.Г.]. Однако работа с газоразрядным свечением подразумевает использование токсичных компонентов и, как следствие, может оказать влияние на испытуемого, а также возникает необходимость в разработке соответствующей инфраструктуры по их сбору и утилизации.

Известен способ психодиагностической оценки тревожности у детей, основанный на психологическом тестировании детей, родителей и учителей, где образуется три блока результатов, определяющих взаимоотношение ребенка с родителями, с одноклассниками и учителями, и полученные усредненные данные с учетом несовпадений оцениваются по четырехбалльной шкале. При общем среднем числе несовпадений менее 30% судят о низком уровне тревожности, при числе несовпадений от 30 до 60% говорят о повышенной тревожности, а значение больше 60% свидетельствуют о высоком уровне тревожности [Способ психодиагностической оценки тревожности у детей // Патент РФ №2160047, 2000. / Крупенин Б.Л.]. Недостатками метода являются его использование только в детской возрастной группе и вовлечение большого числа респондентов для оценки тревожности одного индивида.

Более целесообразным представляет применение методик для диагностики уровня тревожности, отличающихся компактностью и возможностью их применения в разных возрастных группах. К этой группе относится способ определения уровня тревожности Ч.Д. Спилбергера в адаптации Ю.Л. Ханина [Барканова О.В. Методики диагностики эмоциональной сферы: психологический практикум // Красноярск: Литера-принт, 2009. - с. 215-222].

Прототипом изобретения является способ диагностики уровня тревожности, основанный на анкетировании респондентов по шкале Спилбергера-Ханина с определением уровня реактивной и личностной тревожности, с учетом такого физиологического показателя организма, как частота пульса [Способ диагностики уровня тревожности // Патент РФ №2402268, 2010. / Воронова О.А., Герасимова Н.М., Фарленкова Е.Ю.]. На основании полученных данных рассчитывают уровень тревожности и при значениях от 6,0 до 8,0 диагностируют низкий уровень тревожности, от 8,01 до 11,0 - средний уровень, более 11,01 - высокий уровень тревожности.

Недостатком прототипа является возможное влияние эмоциональных, социальных и физиологических факторов на индивида в момент тестирования, что может отразиться на точности и достоверности полученных результатов. Кроме того, частота сердечных сокращений - это физиологический признак, отличающийся большой вариабельностью в популяции, что усложняет выделение групп на его основе и существенно влияет на достоверность результатов диагностики.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение точности и достоверности способа прогнозирования уровня тревожности ввиду применения молекулярно-генетических методов, которые позволяют избежать влияния побочных факторов на индивида в момент тестирования.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе прогнозирования уровня тревожности, согласно изобретению, выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, проводят генотипирование полиморфных локусов А218С гена фермента биосинтеза серотонина триптофангидроксилазы-1 (ТРН1) и G-703T гена фермента биосинтеза серотонина триптофангидроксилазы-2 (ТРН2) методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с последующей рестрикцией, и при выявлении сочетания генотипов ТРН1 А/А и TPH2 T/G прогнозируют высокий уровень тревожности, а при выявлении сочетания генотипов ТРН1 С/С и TPH2 G/G - низкий уровень тревожности.

Изобретение иллюстрируется фигурой, на которой изображены сочетания генотипов полиморфных локусов генов ТРН1 (А218С) и ТРН2 (G-703T) в выборке лиц с различными показателями ситуативной тревожности.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

ДНК выделяют из лимфоцитов периферической крови. Для получения ДНК необходимой степени чистоты используют метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Мэтью [Mathew С.С. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology. / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press.; - 1984. - V. 2. - P. 31-34].

1. Смешивают 4 мл крови с 10 мл холодного лизирующего буфера (для приготовления буфера использовали 109,4 г сахарозы, 25 мл (2М) MgCl₂, 10 мл тритона, 10 мл Трис-HCl).

2. Смесь центрифугируют в течение 30 минут при 1500 об./мин.

3. Надосадочную жидкость сливают до 7 мл; к образовавшемуся осадку приливают 7 мл лизирующего буфера, промывают осадок и охлаждают в холодильнике в течение 10 минут.

4. Охлажденную смесь центрифугируют в течение 30 минут при 1500 об./мин.

5. Надосадочную жидкость сливают полностью; к осадку приливают 14 мл лизирующего буфера и смесь центрифугируют в течение 20 минут при 1500 об./мин.

6. Надосадочную жидкость сливают полностью. Образовавшийся ядерный осадок ресуспензируют в 400 мкл буфера для протеинкиназы К (Solin EDTA).

7. Осадок с Solin EDTA переносят в эппендорф на 1,5 мл, приливают 40 мкл 10% SDS и 30 мкл протеинкиназы К (10 мг/мл). Смесь перемешивают на шейкере.

8. Смесь инкубируют при 37°С в течение 12 часов. Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке:

1. К смеси приливают 500 мкл забуференного фенола (для получения 500 мкл тщательно смешивают 100 мкл фенол-Трис-HCl и 400 мкл меркаптоэтанола). Смесь центрифугируют в течение 8 минут при 10000 об./мин.

2. Надосадочную жидкость переносят в новый эппендорф; приливают добавляли 250 мкл забуференного фенола и 250 мкл хлороформа - изоамилового спирта (24 мл хлороформа к 1 мл изоамилового спирта). Смесь центрифугировали в течение 8 минут при 10000 об./мин.

3. Надосадочную жидкость переносят в новый эппендорф и приливают 500 мкл хлороформа - изоамилового спирта. Смесь центрифугируют в течение 30 минут при 12000 об./мин.

4. Надосадочную жидкость переносят в новый эппендорф, добавляют 800-1000 мкл охлажденного (при -20°С) 96% этанола (2 объема). Перемешивают, наблюдая преципитацию ДНК.

5. Центрифугируют в течение 10 минут при 10000 об./мин. Осадок промывают 1 мл 70% спирта для удаления солей (2 раза). Вновь центрифугируют в течение 10 минут при 10000 об./мин.

6. Спирт сливают и высушивают ДНК при комнатной температуре. Затем ДНК растворяют в воде для инъекций.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) полиморфных локусов генов серотониновой нейромедиаторной системы. Специфические последовательности олигонуклеотидных праймеров и условия ПЦР-анализа полиморфного локуса триптофангидроксилазы-1 (ТРН1, А218С) приведены в работе Rujescu D. с соавт. [Rujescu D. Association of anger-related traits with SNPs in the TPH gene / Rujescu D., Giegling I., Bondy В., Gietl A., Zill P., // Mol. Psychiatry, 2002. - V. 7(9). - P. 1023-1029]. Состав реакционной смеси для ПЦР был следующим: 1,2 мкл геномной ДНК, 3,5 мкл Screen-mix, 1,5 мкл H₂O, 4 мкл праймеров, 20-30 мкл минерального масла. Амплификация включала в себя 35 циклов, каждый из которых состоял из денатурации, отжига праймеров и синтеза ДНК. Смесь прогревают 4 минуты при 95°С, Режим амплификации: 30 циклов со следующими параметрами: 92°С - 1 минута, 56°С - 30 секунд, 72°С - 1 минута. После 35-го цикла проводили инкубацию при 72°С в течение 5 минут.

Нуклеотидную замену аденина на цитозин в положении 218 гена ТРН1 выявляют при помощи рестрикционного анализа. Для этого 10 мкл амплификата смешивают с 0,1 ед. эндонуклеазы рестрикции NheI и 1 ед. буфера White, смесь выдерживают при 30°С в течение 16 часов в термостате. Затем проводят электрофорез в вертикальном 7% полиакриламидном геле. В качестве электролита для электрофореза применяют трис-боратный буфер.

Электрофорез проводят при постоянном напряжении 10 вольт/см после 20-минутного преэлектрофореза. Детекцию результатов проводят путем окрашивания полиакриламидного геля бромистым этидием в течение 3 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете. Генотипы типируются по критерию присутствия или отсутствия сайта рестрикции и соответствующего фрагмента на электрофорезе так, что при наличии фрагмента размером 918 пар нуклеотидов (пн) идентифицируется аллель А и гомозиготный генотип А/А; при наличии четырех фрагментов размером 918, 615, 245 и 58 пн идентифицируется гетерозиготный генотип А/С; при наличии фрагментов размером 615, 245 и 58 пн идентифицируется гомозиготный генотип С/С.

Специфические последовательности олигонуклеотидных праймеров и условия ПЦР-анализа полиморфного локуса триптофангидроксилазы-2 (ТРН2, G-703T) приведены в работе Чукановой А.С. с соавт. [Чуканова А.С.Анализ связи полиморфизмов генов SERT и ТРН2 с побочными эффектами на фоне терапии топираматом с учетом тендерных особенностей / А.С. Чуканова, М.А. Тушканов, В.И. Барский, И.К. Граждан, Е.В. Крикова, М.Г. Аксенова, С.Г. Бурд, Е.И. Гусев // Эпилепсия и пароксизмальные состояния, 2011. - Том 3, №2. - стр. 45-54]. Состав реакционной смеси для ПЦР был следующим: 1,2 мкл геномной ДНК, 3,5 мкл Screen-mix, 1,5 мкл Н20, 4 мкл праймеров, 20-30 мкл минерального масла. Амплификация включала в себя 35 циклов, каждый из которых состоял из денатурации, отжига праймеров и синтеза ДНК. Смесь прогревают 5 минут при 94°С. Режим амплификации: 35 циклов со следующими параметрами: 94°С - 20 секунд, 58°С - 20 секунд, 72°С - 10 секунд. После 35-го цикла проводили инкубацию при 72°С в течение 30 секунд.

Нуклеотидную замену гуанина на тимин в положении 703 гена ТРН2 выявляют при помощи рестрикционного анализа. Для этого 10 мкл амплификата смешивают с 0,1 ед. эндонуклеазы рестрикции Acsl, 0,1 ед. BSA и 1 ед. буфера Tango, смесь выдерживают при 50°С в течение 16 часов в термостате. Затем проводят электрофорез в вертикальном 7% полиакриламидном геле. В качестве электролита для электрофореза применяют трис-боратный буфер.

Электрофорез проводят при постоянном напряжении 10 вольт/см после 20-минутного преэлектрофореза. Детекцию результатов проводят путем окрашивания полиакриламидного геля бромистым этидием в течение 3 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на транс-иллюминаторе. Генотипы типируются по критерию присутствия или отсутствия сайта рестрикции и соответствующего фрагмента на электрофорезе так, что при наличии фрагмента размером 113 пар нуклеотидов (пн) идентифируется аллель Т и гомозиготный генотип Т/Т; при наличии трех фрагментов размером 113, 91 и 22 пн идентифицируется гетерозиготный генотип T/G; при наличии фрагментов размером 91 и 22 пн идентифицируется гомозиготный генотип G/G.

Для подтверждения полученных генетических критериев было проведено психологическое тестирование по определению уровня тревожности согласно методике Спилбергера-Ханина. Основой теста является шкала STAI (State Trait Anxiety Inventory), которая разделена на два блока и на 20 заданий в каждом. Первый блок (STAI: Х-1) определяет то, как человек чувствует себя в момент тестирования (шкала ситуативной тревожности), а задания второго блока (STAI: Х-2) определяют то, как человек чувствует себя в обычной обстановке (шкала личностной тревожности). После обработки результатов подсчитывается сумма баллов по каждой шкале. Данная сумма позволяет судить об уровне тревожности: до 30 баллов - низкий уровень, 31-44 баллов - умеренный уровень, 45 и более баллов - высокий уровень тревожности [Барканова О.В. Методики диагностики эмоциональной сферы: психологический практикум // Красноярск: Литера-принт, 2009. - с. 215-222].

Было обследовано 207 студентов в возрасте от 17 до 24 лет, проходивших обучение на Естественно-географическом факультете Башкирского государственного педагогического университета им. М. Акмуллы г. Уфы. Из общей группы студентов были выделены индивиды с высоким уровнем ситуативной (40 чел.) и личностной (70 чел.) тревожности, со средним уровнем ситуативной (143 чел.) и личностной (124 чел.) тревожности и с низким уровнем ситуативной (24 чел.) и личностной (13 чел.) тревожности. Результаты молекулярно-генетического анализа полиморфных локусов А218С гена ТРН1 и G-703T гена ТРН2 у студентов представлены в таблицах 1 и 2.

Исследование полиморфного локуса А218С гена ТРН1 выявило существенные различия в частотах аллелей у студентов с высокими и низкими показателями ситуативной тревожности. Достоверно чаще в группе студентов с высокими показателями ситуативной тревожности встречался аллель А (54,55%), по сравнению с группой студентов с низкими показателями ситуативной тревожности, где его частота составила - 26,92% (χ2=3,9968; р=0,0457). На основании полученных результатов можно сделать вывод об ассоциации аллеля А полиморфного локуса А218С гена ТРН1 с высокими показателями тревожности (см. табл. 1).

Исследование полиморфного локуса G-703T гена ТРН2 выявило существенные различия в частотах генотипов у студентов с низкими и средними показателями ситуативной тревожности. Достоверно чаще в группе студентов с низкими показателями ситуативной тревожности встречался генотип G/G (61,54%), по сравнению с группой студентов со средними показателями ситуативной тревожности, где его частота составила - 23,73% (χ2=5,5061; р=0,0195). Также в группе студентов со средними показателями ситуативной тревожности достоверно чаще встречался генотип G/T (72,88%), нежели в группе с низкими показателями (23,08%; χ2=9,3968; р=0,0031). На основании полученных результатов можно сделать вывод об ассоциации аллеля G и генотипа G/G полиморфного локуса G-703T гена ТРН2 с низкими показателями тревожности (см. табл. 2).

При исследовании межгенных взаимодействий полиморфных локусов генов триптофангидроксилазы ТРН1 (А218С) и ТРН2 (G-703T) с помощью программы GMDR была определена двухфакторная модель взаимодействия ДНК-локусов, приводящая к формированию фенотипических различий по признаку «ситуативная тревожность». Тестируемая сбалансированная точность (Bal. Acc.) данной модели составила 0,7413; чувствительность (Se) - 0,8529; специфичность (Sp) - 0,6296; повторяемость результата (CV Consistency) - 10/10, р=0,0107. Полученная модель свидетельствовала о том, что сочетание генотипов ТРН1 А/А и TPH2 T/G определяет высокий уровень тревожности, а сочетание ТРН1 С/С и TPH2 G/G - низкий уровень ситуативной тревожности (см. фигуру). На основании полученных данных можно сделать вывод о возможности использования данных сочетаний генотипов для диагностики и прогнозирования уровня тревожности.

В доступной научно-медицинской и патентной литературе отсутствуют сведения о способе прогнозирования уровня тревожности у студентов, заключающегося в выделении ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, генотипировании полиморфных локусов А218С гена фермента биосинтеза серотонина триптофангидроксилазы-1 (ТРН1) и G-703T гена фермента биосинтеза серотонина триптофангидроксилазы-2 (ТРН2) методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с последующей рестрикцией, и при выявлении сочетания генотипов ТРН1 А/А и TPH2 T/G прогнозируется высокий уровень тревожности, а при выявлении сочетания генотипов ТРН1 С/С и TPH2 G/G - низкий уровень тревожности. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «новизна».

Исследованиями авторов доказано, что выявление сочетания генотипов ТРН1 А/А и TPH2 T/G позволяет осуществить достоверный прогноз высокого уровня тревожности, и выявление сочетания генотипов ТРН1 С/С и TPH2 G/G - низкий уровень тревожности, при отсутствии у индивидов яркой клинической симптоматики и тревожных тенденций. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Студент в возрасте 22-х лет, 1994 года рождения (г. Уфа, Республика Башкортостан), не страдающий выраженными психическими расстройствами и отрицающий у себя отягощенную наследственность психическими заболеваниями.

При молекулярно-генетическом исследовании полиморфных локусов А218С гена фермента биосинтеза серотонина триптофангидроксилазы-1 (ТРН1) и G-703T гена фермента биосинтеза серотонина триптофангидроксилазы-2 (ТРН2) у индивида было выявлено сочетание генотипов ТРН1 А/А и TPH2 T/G. Наличие данного сочетания генотипов позволило прогнозировать предрасположенность к высокому уровню тревожности.

В ходе психологического тестирования для определения уровня тревожности по методике Спилбергера-Ханина у индивида был выявлен высокий уровень ситуативной (52 балла по шкале СТ) и личностной (51 балл по шкале ЛТ) тревожности.

Таким образом, на основании генотипирования полиморфных локусов А218С гена ТРН1 и G-703T гена ТРН2 и выявления у индивида сочетания генотипов ТРН1 А/А и TPH2 T/G дан прогноз о повышенном уровне тревожности, что было подтверждено результатами психологического тестирования.

Пример 2.

Студент в возрасте 20-ти лет, 1996 года рождения (г. Уфа, Республика Башкортостан), не страдающий выраженными психическими расстройствами и отрицающий у себя отягощенную наследственность психическими заболеваниями.

При молекулярно-генетическом исследовании полиморфных локусов А218С гена фермента биосинтеза серотонина триптофангидроксилазы-1 (ТРН1) и G-703T гена фермента биосинтеза серотонина триптофангидроксилазы-2 (ТРН2) у индивида было выявлено сочетание генотипов ТРН1 А/С и TPH2 T/G. Наличие данного сочетания генотипов позволило предположить, что у индивида может наблюдаться средний уровень тревожности.

В ходе психологического тестирования для определения уровня тревожности по методике Спилбергера-Ханина у индивида был выявлен средний уровень ситуативной (34 балла по шкале СТ) и личностной (36 баллов по шкале ЛТ) тревожности.

Таким образом, на основании генотипирования полиморфных локусов А218С гена ТРН1 и G-703T гена ТРН2 и выявления у индивида сочетания генотипов ТРН1 А/С и TPH2 T/G дан прогноз о среднем уровне тревожности, что было подтверждено результатами психологического тестирования.

Пример 3.

Студент в возрасте 22-х лет, 1994 года рождения (г. Уфа, Республика Башкортостан), не страдающий выраженными психическими расстройствами и отрицающий у себя отягощенную наследственность психическими заболеваниями.

При молекулярно-генетическом исследовании полиморфных локусов А218С гена фермента биосинтеза серотонина триптофангидроксилазы-1 (ТРН1) и G-703T гена фермента биосинтеза серотонина триптофангидроксилазы-2 (ТРН2) у индивида было выявлено сочетание генотипов ТРН1 С/С и TPH2 G/G. Наличие данного сочетания генотипов позволило предположить, что у индивида может наблюдаться низкий уровень тревожности.

В ходе психологического тестирования для определения уровня тревожности по методике Спилбергера-Ханина у индивида был выявлен низкий уровень ситуативной (24 балла по шкале СТ) и личностной (27 баллов по шкале ЛТ) тревожности.

Таким образом, на основании генотипирования полиморфных локусов А218С гена ТРН1 и G-703T гена ТРН2 и выявления у индивида сочетания генотипов ТРН1 С/С и TPH 2G/G дан прогноз о низком уровне тревожности, что было подтверждено результатами психологического тестирования.

Предлагаемый способ легко воспроизводим и при его использовании достигается указанный технический результат. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «промышленная применимость».

Таблица 1

Распределение частот генотипов и аллелей маркера A218C гена TPH1 в группах с низкими и высокими показателями тревожности

* где СТ - ситуативная тревожность, ЛТ - личностная тревожность, m - ошибка среднего арифметического значения, χ² - критерий значимости различий популяций по распределениям частот генотипов и аллелей, р - вероятность ошибки при отклонении нулевой гипотезы.

Таблица 2

Распределение частот генотипов и аллелей маркера G-703T гена ТРН2 в группах с низкими и средними показателями тревожности

* где СТ - ситуативная тревожность, ЛТ - личностная тревожность, m - ошибка среднего арифметического значения, χ² - критерий значимости различий популяций по распределениям частот генотипов и аллелей, р - вероятность ошибки при отклонении нулевой гипотезы.

Изобретение относится к медицине, а именно к генетике, и может быть использовано для прогнозирования уровня тревожности. Для этого проводят выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, генотипирование полиморфных локусов А218С гена фермента биосинтеза серотонина триптофангидроксилазы-1 (ТРН1) и G-703T гена фермента биосинтеза серотонина триптофангидроксилазы-2 (ТРН2) методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с последующей рестрикцией. При выявлении сочетания генотипов ТРН1 А/А и TPH2 T/G прогнозируют высокий уровень тревожности, а при выявлении сочетания генотипов ТРН1 С/С и TPH2 G/G - низкий уровень тревожности. Способ позволяет повысить точность прогнозирования уровня тревожности за счет нивелирования влияния факторов среды на индивида в момент тестирования. 1 ил., 2 табл., 3 пр.

Способ прогнозирования уровня тревожности, отличающийся тем, что проводят выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, генотипирование полиморфных локусов А218С гена фермента биосинтеза серотонина триптофангидроксилазы-1 (TPH1) и G-703T гена фермента биосинтеза серотонина триптофангидроксилазы-2 (ТРН2) методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с последующей рестрикцией, и при выявлении сочетания генотипов TPH1 А/А и ТРН2 T/G прогнозируют высокий уровень тревожности, а при выявлении сочетания генотипов TPH1 С/С и ТРН2 G/G - низкий уровень тревожности.