Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота Российский патент 2019 года по МПК C12Q1/00 

Описание патента на изобретение RU2694558C1

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики коронавирусной инфекции у животных, как в практике ветеринарной службы, так и для научных исследований.

Известно техническое решение, в котором коронавирусную инфекцию определяют методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени (патент РФ №2504585, C12Q 1/68, 2014 г.), включающий выделение РНК из биологического материала, синтез кДНК на матрице РНК путем постановки реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции - с проведением циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома вирусного возбудителя олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и контрольных образцов, измерение накопления флуоресцентного сигнала по каналам соответствующих флуоресцентных красителей и интерпретацию результатов на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией.

Также известен способ выявления коронавирусных инфекций методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени (патент РФ №2460803, C12Q 1/68, 2014 г. - прототип), включающий выделение РНК из биологического материала по выбору: мазки из носа, горла, носоглотки, носоглоточные аспираты, назальные смывы, мокроту, бронхоальвеолярный лаваж, секционный материал, образцы культуральной жидкости от инфицированных особей сорбционным методом, синтез кДНК на матрице РНК путем постановки одноэтапной с добавлением внутреннего положительного контроля мультиплексной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции - с проведением 45 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома вирусного возбудителя олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и контрольных образцов, измерение накопления флуоресцентного сигнала по каналам соответствующих флуоресцентных красителей и интерпретацию результатов на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией Threshold.

Недостатком прототипа является отсутствие возможности получения достоверной диагностики короновирусной инфекции КРС.

Техническим результатом является получение достоверной диагностики коронавирусной инфекции КРС с помощью ОТ - ПЦР в реальном времени.

Технический результат достигается тем, что в способе выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота, включающем выделение РНК из биологического материала по выбору: мазки из носа, горла, носоглотки, носоглоточные аспираты, назальные смывы, мокроту, бронхоальвеолярный лаваж, секционный материал, образцы культуральной жидкости сорбционным методом, синтез кДНК на матрице РНК путем постановки одноэтапной с добавлением внутреннего и положительного контрольных образцов мультиплексной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции - с проведением 45 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома вирусного возбудителя олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и контрольных образцов, измерение накопления флуоресцентного сигнала по каналам соответствующих флуоресцентных красителей и интерпретацию результатов на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией Threshold, согласно изобретению для выделения РНК используют дополнительный биологический материал в виде экстракта фекалий или фрагментов органов брюшной полости, взятый от животных инфицированных возбудителем коронавирусной инфекции, а для внутреннего контрольного образца - суспензию бактериофага MS2 с концентрацией 5×103, и для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя коронавирусной инфекции и фрагмент генома бактериофага MS2, взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:

BCoVF 5'-GATCAAATTGCTAGT-3' - прямой праймер

BCoVR 5'-CAGTCTGCTTAGTTA-3' - обратный праймер

BCoVP 5'-FAM-GGATGCCACTAAGCCA-3' - BHQ1 - зонд

MS2F, 5'-TGGCACTACCCCTCTCCGTATTCAC-3' - прямой праймер

MS2R, 5'-GTACGGGCGACCCCACGATGAC-3' - обратный праймер

MS2P, Су5 5'-CACATCGATAGATCAAGGTGCCTACAAGC-3' - зонд, при этом накопление флуоресцентного сигнала измеряют по каналам: FAM/Green для специфического сигнала; Су5/Red для сигнала внутреннего контроля, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считают положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции -отрицательный.

Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что для получения достоверной диагностики коронавирусной инфекции животных используют две последовательные реакции: обратной транскрипции вирусной РНК для получения кДНК и полимеразной цепной реакции для амплификации фрагмента полученной кДНК матрицы. Обе реакции проводятся последовательно в одной ПЦР-пробирке (one-tube) с использованием специфичных для участка генома коронавируса олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и разных видов контроля для которых используют различные формы материала бактериофага MS2: суспензия и фрагмент генома со специфическими к нему праймерами и зондом. Такая постановка ОТ-ПЦР в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации и возможность ошибки при переносе кДНК в другую пробирку для ПЦР. Кроме того, детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Заявляемый способ рекомендовано использовать в ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики коронавирусной инфекции у животных что соответствует критерию «промышленная применимость».

Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота осуществляется следующим образом.

Для исследования респираторной коронавирусной инфекции используют мазки из носа, горла, носоглотки, носоглоточные аспираты, назальные смывы, мокроту, бронхоальвеолярный лаваж, секционный материал, образцы культуральной жидкости. Для исследования на коронавирусный энтерит и носительство коронавирусов используют предварительно выделяют РНК из экстракта фекалий или фрагментов органов от инфицированных животных сорбционным методом. Проводят синтез кДНК на матрице РНК путем постановки одноэтапной мультиплексной реакции обратной транскрипции с использованием внутреннего контрольного образца - суспензию бактериофага MS2 с концентрацией 5×103/мл и положительного контрольного образца в качестве, которого используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома коронавируса BCoV и фрагмент генома бактериофага MS2, взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеитидными последовательностями:

BCoVF 5'-GATCAAATTGCTAGT-3' - прямой праймер

BCoVR 5'-CAGTCTGCTTAGTTA-3' - обратный праймер

BCoVP 5'-FAM-GGATGCCACTAAGCCA-3' - BHQ1 - зонд

MS2F, 5'-TGGCACTACCCCTCTCCGTATTCAC-3' - прямой праймер

MS2R, 5'-GTACGGGCGACCCCACGATGAC-3' - обратный праймер

MS2P, Су5 5'-CACATCGATAGATCAAGGTGCCTACAAGC-3' - зонд

и полимеразной цепной реакции - с проведением 40 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома возбудителя коронавирусной инфекции олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда.

Затем измеряют накопление флуоресцентного сигнала по каналам: FAM/Green для специфического сигнала; Су5/Red для сигнала внутреннего контроля и интерпретируют результаты на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией (Threshold). Если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции -отрицательный.

Использование следующих олигонуклеотидных праймеров BCoVF, и BCoVR флуоресцентно-меченного зонда BCoVP обеспечивает специфическое выявление РНК коронавируса у животных.

Использование для разных видов контроля различные формы материала бактериофага MS2: суспензии и фрагмента генома со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения РНК из образцов.

Выбор последовательности и расчет первичной структуры олигонуклеотидных праймеров и зондов.

Проведен сравнительный анализ доступных в базе данных GenBank нуклеотидных последовательностей N гена BCoV, кодирующего один из пяти главных структурных белков вириона (nucleocapsid protein (N) gene) коронавирусов, входящих в семейство Coronaviridae. Как и другие представители этого семейства, коронавирусы представлены однонитевой нефрагментированной РНК позитивной полярности, размером порядка 26-30 тысяч оснований. N белок является фосфопротеином с молекулярным весом 50-60 кДа, который взаимодействуя с геномной РНК образует вирусный нуклеокапсид и играет определенную роль в репликации вирусной РНК.

С помощью программы "BioEdit 7.0" выравнены нуклеотидные последовательности N гена BCoV - представителей родов коронавирусов (альфа, бета и гамма подсемейств) нуклеотидной последовательностью гена N генома коронавируса изолята BCoV/FRA/EPI/Caen/2004/14 (Bovine corona-virus isolate BCoV/FRA/EPI/Caen/2004/14 nucleocapsid protein (N) gene, complete cds. (код доступа KT318096). В результате анализа построенного элайнмента внутри гена капсидного белка N выбран участок между 700 и 800 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности.

С помощью программы "Oligo 6.0" рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд BCoVP, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров BCoVF, и BCoVR. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.

С помощью программы "Oligo 6.0" проанализирована нуклеотидная последовательность бактериофага MS2 (Enterobacteria phage MS2 isolate ST4, complete genome. ACCESSION EF204940). Бактериофаг MS2 содержит однонитевую позитивно ориентрованную РНК размером 3569 оснований. В результате анализа внутри гена белка 'созревания' (maturation protein) выбран участок между 200 и 350 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд MS2P, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров MS2F и MS2R. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.

Пример конкретного осуществления способа выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции у животных

Для исследования используют следующий материал:

Для исследования на коронавирусный энтерит и носительство коронавирусов используют:

- фекалии, которые берут весом 5 г. в стерильный пластиковый контейнер;

- из тканей кишечника вырезают кусочки размером 1 см3 и помещают в стерильный контейнер. Далее обрабатывают исследуемый материал.

Пробы тканей кишечника с содержимым (до 1 г) гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, затем готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 9000 об/мин в течение 1 мин. Аликвоту надосадочной жидкости (0,1 мл) используют для экстракции РЖ. Из фекалий (1-5 г) готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе. Взвесь фекалий декантируют в течение 5-10 минут. Отбирают 1 мл надосадочной жидкости и переносят в чистую пробирку 1,5 мл, центрифугируют при 5000 об/мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, в течение 5 мин. Экстракцию РНК из осветленного экстракта фекалий проводят по возможности, сразу. При необходимости хранения замораживают.

Для исследования респираторной коронавирусной инфекции используют по выбору: мазки из носа, горла, носоглотки, носоглоточные аспираты, назальные смывы, мокроту, бронхоальвеолярный лаваж, секционный материал, образцы культуральной жидкости.

• Выделения из носоглотки и трахеи, мазки со слизистой носовой полости, снимают с помощью стерильного зонда, зонд помещают в пластиковую микропробирку объемом 1,5 мл с 0,5 мл стерильного физиологического раствора/фосфатного буфера/транспортной среды.

• Фарингеальные смывы помещают в стерильный контейнер. Смывы, мазки берут на исследование без предварительной подготовки.

Вязкую по консистенции мокроту обрабатывают реагентами типа муколизин, с целью снижения вязкости.

Анализ проводят с помощью набора реагентов «ПЦР-КОРОНОВИРУС-ФАКТОР» http://www.vetfaktor.ru/ (см. таблицу 1 и 2), который состоит из трех этапов: http://www.vetfaktor.ru/ экстракция НК;

• проведение ОТ-ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени;

• учет результатов анализа.

Реакцию ОТ-ПЦР РВ проводят в одной пробирке.

Подготовка образцов к проведению ПЦР

Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем РНК-пробы - 10 мкл. Успешное прохождение реакции контролируют использованием ПКО BCoV, ВКО BCoV и РНК буфера.

Буфер для проведения ОТ-ПЦР, ПЦР буфер BCoV; состав: 2,5х ПЦР-буфер (хлорид калия, 100 мМ, Трис-HCl, рН 8,8 100 мМ, глицерол 1%, Tween-20 0.02%); хлорид магния, 5 мМ; деионизированная вода.

Смесь для проведения ПЦР, ПЦР-смесь BCoV состав: эквимолярная смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ) в концентрации 0,25 мМ; деионизированная вода, смесь праймеров и флуоресцентного зонда на корона-вирус (прямой и обратный праймеры BCoV F и BCoVR в концентрации 0,2 мкМ, зонд BCoVP-FAM в концентрации 0,1 мкМ, взятых в соотношении 1:1:0,5), смесь праймеров и флуоресцентного зонда на ПКО (прямой и обратный праймеры MS2F и MS2R в концентрации 0,2 мкМ, зонд MS2P-Су5 в концентрации 0,1 мкМ, взятых в соотношении 1:1:0,5).

Смесь ферментов, RT PCR ENZ, состав: ДНК полимераза с антителами, ингибирующими активность фермента, TAQ POLYMERASE (5 ед/мкл), обратная транскриптаза MMLV REVERSE TRANSCRIPTASE (100 ед/мкл).

Буфер для разведения РНК, РНК буфер, состав: деионизованная вода.

Внутренний контрольный образец, ВКО BCoV; состав: суспензия бактериофага MS2 (5×103/мл)

- Отрицательный контрольный образец, ОКО (ТЕ буфер); состав: ТЕ буфер (10 мМ Tris-HCl, 0,5 мМ EDTA, рН 8,0)

- Положительный контрольный образец, ПКО BCoV; состав: смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома вируса BCoV и фрагмент генома бактериофага MS2, взяты в соотношении 1:1.

В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:

10 мкл ПЦР БУФЕР BCoV

5 мкл ПЦР СМЕСЬ BCoV

0,75 мкл RT PCR ENZ.

Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации НК исследуемых и контрольных проб. В них вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.

Используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки внести:

а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл РНК буфера;

б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую внести по 10 мкл НК соответствующей пробы, включая пробу ВК-);

в) в пробирку с положительным контролем ПЦР (К+) 10 мкл ПКО BCoV.

Проведение реакции ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией

Параметры температурно-временного режима амплификации на приборах «Rotor-Gene Q», «ДТ-96» и «CFX96» указаны в таблице 3.

Поместить подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора.

Интерпретация результатов анализа

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией производителя к прибору.

Учет результатов ОТ-ПЦР проводился по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).

Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции НК в соответствии с таблицей 4.

Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- на канале FAM/Green и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

Образцы, для которых по каналу Су5/Red значение Ct отсутствует или превышает 35 цикл (при этом по каналу FAM/ Green значение Ct также отсутствует) требуют повторного проведения исследования с этапа ПЦР. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов на канале Су5/Red указывает на присутствие ингибиторов в пробах или на ошибки при постановке реакции ОТ-ПЦР. Требуется провести исследование, начиная с этапа экстракции НК.

Образец считается положительным, РНК коронавируса КРС присутствует, если наблюдается рост специфического сигнала на канале FAM/Green, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (см. Табл. 4). Если для исследуемого образца по каналу FAM/ Green значение Ct определяется позднее 35 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей - он считается спорным и исследуется повторно с этапа выделения НК. Если при повторной постановке наблюдается схожий результат (наблюдается рост специфического сигнала на канале FAM/Green) - образец считается положительным.

Образец считается отрицательным (РНК коронавируса КР отсутствует) если не определяется значение Ct (не наблюдается рост специфического сигнала) на канале FAM/ Green, при этом значения Ct по каналу Су5/Red и Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл.4).

Похожие патенты RU2694558C1

название год авторы номер документа
Тест-система для обнаружения генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени 2018
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Дробин Юрий Дмитриевич
  • Донник Ирина Михайловна
  • Уша Борис Вениаминович
  • Племяшов Кирилл Владимирович
  • Лысенко Александр Анатольевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Мищенко Алексей Владимирович
  • Кулакова Анна Леонидовна
RU2694499C1
Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции нового типа (nCov19) у приматов 2020
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Лысенко Александр Анатольевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Чернов Альберт Николаевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Гулюкин Михаил Иванович
RU2740097C1
Способ выявления генома возбудителя ротовирусной инфекции у сельскохозяйственных животных 2018
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Дробин Юрий Дмитриевич
  • Донник Ирина Михайловна
  • Василевич Федор Иванович
  • Стекольников Анатолий Александрович
  • Лысенко Александр Анатольевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Морозов Виталий Юрьевич
  • Забашта Сергей Николаевич
  • Кулакова Анна Леонидовна
RU2689718C1
Тест-система для выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции нового типа (nCov19) у приматов 2020
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Лысенко Александр Анатольевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Чернов Альберт Николаевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Донник Ирина Михайловна
RU2741887C1
Тест-система для обнаружения генома возбудителя ротовируса типа А у сельскохозяйственных животных с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени 2018
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Донник Ирина Михайловна
  • Джавадов Эдуард Джавадович
  • Макаров Юрий Анатольевич
  • Лысенко Александр Анатольевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Морозов Виталий Юрьевич
  • Солдатенко Николай Александрович
  • Кулакова Анна Леонидовна
RU2694501C1
Тест-система для выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей 2018
  • Малышев Денис Владиславович
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Дробин Юрий Дмитриевич
  • Донник Ирина Михайловна
  • Шахов Алексей Гаврилович
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Кривоногова Анна Сергеевна
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Гулюкин Михаил Иванович
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Калашникова Татьяна Валерьевна
  • Тюрин Владимир Григорьевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Бахарев Алексей Александрович
  • Дайбова Любовь Анатольевна
RU2698662C1
Способ выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей 2018
  • Баннов Василий Александрович
  • Черных Олег Юрьевич
  • Малышев Денис Владиславович
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Дробин Юрий Дмитриевич
  • Донник Ирина Михайловна
  • Стекольников Анатолий Александрович
  • Уша Борис Вениаминович
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Иванов Аркадий Васильевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Калашникова Татьяна Валерьевна
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Барашкин Михаил Иванович
  • Дайбова Любовь Анатольевна
  • Кузьминова Елена Васильевна
RU2700481C1
Тест-система для обнаружения генома вируса парагриппа 3 типа у крупного рогатого скота с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени 2018
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Дробин Юрий Дмитриевич
  • Донник Ирина Михайловна
  • Клименко Александр Иванович
  • Девришов Давудай Абдулсемедович
  • Лысенко Александр Анатольевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Калошкина Инна Муратовна
  • Забашта Сергей Николаевич
  • Кулакова Анна Леонидовна
RU2681473C1
Способ выявления генома возбудителя вируса парагриппа 3 типа у крупного рогатого скота 2018
  • Черных Олег Юрьевич
  • Сочнев Василий Васильевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Дробин Юрий Дмитриевич
  • Донник Ирина Михайловна
  • Иванов Аркадий Васильевич
  • Лысенко Александр Анатольевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Калошкина Инна Муратовна
  • Кулакова Анна Леонидовна
RU2696069C2
Способ выявления и генотипирования РНК вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней 2018
  • Баннов Василий Александрович
  • Черных Олег Юрьевич
  • Малышев Денис Владиславович
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Дунин Иван Михайлович
  • Дробин Юрий Дмитриевич
  • Амерханов Харон Адиевич
  • Донник Ирина Михайловна
  • Дорожкин Василий Иванович
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Племяшов Кирилл Владимирович
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Бахарев Алексей Александрович
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Коломиец Сергей Николаевич
  • Дайбова Любовь Анатольевна
  • Кривоногова Анна Сергеевна
RU2703394C1

Реферат патента 2019 года Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота. Способ включает в себя выделение РНК из биологического материала в виде экстракта фекалий или фрагментов органов брюшной полости сорбционным методом, синтез кДНК на матрице РНК путем постановки одноэтапной с добавлением внутреннего и положительного контрольных образцов мультиплексной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции - с проведением 45 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома вирусного возбудителя олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда. Фрагмент генома возбудителя короновирусной инфекции имеет следующие нуклеотидные последовательности: BCoVF 5'-GATCAAATTGCTAGT-3' - прямой праймер; BCoVR 5'-CAGTCTGCTTAGTTA-3' - обратный праймер; BCoVP 5'-FAM-GGATGCCACTAAGCCA-3'-BHQ1 – зонд. Изобретение расширяет арсенал способов диагностики короновирусной инфекции у крупного рогатого скота. 4 табл., 1 пр.

Формула изобретения RU 2 694 558 C1

Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота, включающий выделение РНК из биологического материала по выбору: мазки из носа, горла, носоглотки, носоглоточные аспираты, назальные смывы, мокроту, бронхоальвеолярный лаваж, секционный материал, образцы культуральной жидкости от инфицированных особей сорбционным методом, синтез кДНК на матрице РНК путем постановки одноэтапной с добавлением внутреннего и положительного контролей образцов мультиплексной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции - с проведением 45 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома вирусного возбудителя олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентно-меченного зонда и контрольных образцов, измерение накопления флуоресцентного сигнала по каналам соответствующих флуоресцентных красителей и интерпретацию результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией - Threshold, отличающийся тем, что для выделения РНК используют дополнительный биологический материал в виде экстракта фекалий или фрагментов органов брюшной полости, взятый от животных, инфицированных возбудителем коронавирусной инфекции, для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага MS2 с концентрацией 5×103 мл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя коронавирусной инфекции и фрагмент генома бактериофага MS2, взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:

BCoVF 5`-GATCAAATTGCTAGT-3` - прямой праймер,

BCoVR 5`-CAGTCTGCТTАGТТА-3` - обратный праймер,

BCoVP 5`-FAM-GGATGCCACTAAGCCА-3` - BHQ1 - зонд,

MS2F, 5`-TGGCACTACCCCTCTCCGTATTCAC-3` - прямой праймер,

MS2R, 5`-GTACGGGCGACCCCACGATGAC-3` - обратный праймер,

MS2P, Су5 5`-СACATCGATAGATCAAGGTGCCTACAAGC-3` - зонд,

при этом накопление флуоресцентного сигнала измеряют по каналам: FAM/Green для специфического сигнала; Cy5/Red для сигнала внутреннего контроля, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считают положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2019 года RU2694558C1

ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ Streptococcus agalactiae В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ 2010
  • Кафарская Людмила Ивановна
  • Ефимов Борис Алексеевич
  • Шкопоров Андрей Николаевич
  • Хохлова Екатерина Викторовна
RU2435853C1
ВЫГРУЗНОЕ УСТРОЙСТВО СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ УБОРОЧНОЙ МАШИНЫ 2021
  • Лёффлер, Никлас
  • Баукнехт, Бенджамин
  • Дойфель, Тобиас
RU2780477C1
WO 2016034610 A1, 10.03.2016.

RU 2 694 558 C1

Авторы

Черных Олег Юрьевич

Баннов Василий Александрович

Малышев Денис Владиславович

Мищенко Алексей Владимирович

Донник Ирина Михайловна

Лайшев Касим Анверович

Сисягин Павел Николаевич

Лысенко Александр Анатольевич

Кривонос Роман Анатольевич

Шевкопляс Владимир Николаевич

Кощаев Андрей Георгиевич

Чернов Альберт Николаевич

Кулакова Анна Леонидовна

Даты

2019-07-16Публикация

2018-01-16Подача