ШТАММ Pseudomonas deceptionensis ARC 44 ВКПМ В-13090 - ДЕСТРУКТОР НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 C12R1/38 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии, экологии, охране окружающей среды и представляет собой новый бактериальный штамм Pseudomonas deceptionensis ARC 44 ВКПМ В-13090, обладающий способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов. Штамм может быть использован для очистки акваторий водоемов, береговой линии, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, при температуре от +20 до -2,5°С и солености 30 г/л.

Уровень техники

Известен штамм Rhodococcus sp. - деструктор нефтяных углеводородов (патент РФ №2518349, приоритет 11.04.2013, опубл. 10.06.2014.), который утилизирует нефть, мазут, керосин, нафталин, пентадекан, тетрадекан, гексадецен, фенилдекан, пристан уже на 5 день при 20-30°С. Данный штамм показал высокую степень деструкции углеводородов при температуре +30°С. Однако данный штамм не способен производить утилизацию углеводородов при низких температурах.

Известен штамм Pseudomonas alcaligenes В-1 (патент РФ 2133770, приоритет 25.03.1998, опубл. 27.07.1999), обладающий способностью быстро утилизировать нефть, дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат. Недостатком данного штамма также является то, что он не утилизирует нефтезагрязнения при низких температурах.

Известен штамм Bacillus subtilis «Колыма-7/2к» (патент РФ 2446900, 2010-07-13, опубл. 10.04.2012), который может быть использован в условиях Крайнего Севера. Применение такого микробного препарата позволяет за 3 месяца летнего периода снизить концентрацию нефти до 0,48%. Недостатком данного штамма является то, что он утилизирует углеводороды в условиях почвы.

Известен штамм Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 (патент РФ №2523584, приоритет 2013-03-27, опубл. 20.07.2014). Штамм может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур от +4 до +37°С. Также исвестен штамм Serratia plymuthica VKM B-2819D (патент РФ №2560272, 2014-09-22, опубл. 2015-08-20), обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур от +4 до +30°С. Недостатком штаммов является то, что они не способны утилизировать нефтезагрязнения при высокой солености воды до 30 г/л.

Наиболее близким аналогом является штамм Rhodococcus erythropolis депонирован под регистрационным номером ВКМ Ac-2613D (патент РФ 2553336 20.08.2013 опул. 10.06.2015). Штамм используется для очистки пресноводных, солоноватоводных и морских объектов и донных отложений. Микроорганизм обеспечивает деструкцию нефти в водных объектах при температуре от +2 до +25°С и солености до 2,7%. Недостатком изобретения является то, что штамм утилизирует углеводороды в условиях богатых по питательным веществам (в состав среды входит пептон 5 г/л и сахароза 15 г/л). В реальных условиях утилизации углеводородных загрязнений количество питательных веществ значительно снижены.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является получение бактериального штамма, способного осуществлять деструкцию нефти и нефтепродуктов при температуре от +20 до -2,5°С и солености 30 г/л в условиях, бедных по питательным веществам.

Поставленная задача решается тем, что получен штамм Pseudomonas deceptionensis ARC 44 ВКПМ В-13090, способный осуществлять деструкцию нефти и нефтепродуктов, который может быть использован для очистки акваторий водоемов, береговой линии, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, при температуре от +20 до -2,5°С и солености 30 г/л в условиях, бедных по питательным веществам.

Штамм выделен из прибрежной зоны западного берега полуострова Ямал в октябре 2015 года. Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика (ВКПМ, Москва, 1-й Дорожный пр., д. 1) под регистрационным номером ВКПМ В-13090.

Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик, а также на основании изучения последовательности гена 16S рРНК.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Колонии бесцветные, блестящие, гладкие, круглые, каплевидные, размером 1-4 мм, с однородной структурой, ровным краем, мягкой консистенции. Клетки представляют собой небольшие подвижные палочки длинной 0,8-2 мкм. Окраска по Граму отрицательная.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм растет при температуре от +20 до -2,5°С, в аэробных условиях. Растет при рН 4,0-8,0. Растет на плотных и жидких питательных средах с содержанием NaCl 30±10 г/л. Способен расти в жидкой среде с углеводородами в качестве единственного источника углерода и энергии.

Штамм поддерживается пересевами 1 раз в 14 дней на плотной питательной среде modPCA следующего состава (г/л): K₂HPO₄ - 1,5; KH₂PO₄ - 0,75; MgSO₄ - 1,0; (NH₄)₂SO₄ - 4,0; NaCl - 30; гидролизат казеина - 5,0; дрожжевой экстракт - 2,5; D-глюкоза - 1,0; агар - 14; рН 7,0 или жидкой питательной среде №1 следующего состава: K₂HPO₄ - 1,5; KH₂PO₄ - 0,75; MgSO₄ - 1,0; (NH₄)₂SO₄ - 4,0; NaCl - 30; гидролизат казеина - 0,5; дрожжевой экстракт - 0,1; рН 7,0. В жидкой питательной среде в качестве углеводородного субстрата использовали смесь товарной нефти Возейского месторождения (плотность 37,9° API, сернистость 0,66%, характеризуется как тяжелая, вязкая, с высоким содержанием смол и асфальтенов) и дизельного топлива в соотношении 1:1 по объему.

Также штамм может храниться при +6±2°С в лиофилизированном состоянии с использованием сухого обезжиренного молока в качестве защитной среды.

Для приготовления препарата к культуре микроорганизмов можно добавить питательный премикс на основе различных органических компонентов в различных соотношениях (таких как сухое обезжиренное молоко, мука различных растительных культур, молочная сыворотка, меласса и т.п.), неорганические вещества, стимулирующие микробный рост - в первую очередь содержащие такие макроэлементы как азот и фосфор, железо и пр. (различные копмлексные минеральные удобрения). Кроме того, в сухой форме препарат содержит защитные среды, использующиеся для увеличения выживаемости микроорганизмов при сушке, например растворы сахаров, сложные среды, такие как раствор сухого обезжиренного молока, сухие протеины и другие.

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение поясняется конкретными примерами выполнения, которые не являются единственно возможным, но наглядно демонстрирует возможность достижения требуемого технического результата.

Пример 1. Выделение и культивирование штамма Pseudomonas deceptionensis ARC 44 ВКПМ В-13090.

Штамм выделен из образцов грунта и морской воды береговой линии западного берега полуострова Ямал в октябре 2015 года. Образец массой 5±2 г вносили в 100 мл питательной среды №1. Культивирование проводили при температуре +4°С, на орбитальном шейкере (130 об/мин). Время культивирования 7 суток. Полученную накопительную культуру вносили в количестве 10 мл в 100 мл питательной среды №1. Было проведено не менее 30 пассажей накопительной культуры. Выделение штамма из накопительной культуры проводили на среде modPCA, полученную чистую культуру далее культивировали на среде №1.

Пример 2. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Pseudomonas deceptionensis ARC 44 ВКПМ В-13090.

Штамм, выращенный на жидкой питательной среде №1, вносили в качестве инокулята в 100 мл питательной среды №1. В качестве контроля была использована питательная среда без добавления культуры. После проведения культивирования при температуре -2,5°С, 130 об./мин в течение 30 суток проводилась экстракция углеводородов гексаном согласно ГОСТ 31953-2012, хроматографическая оценка убыли углеводородов проводилась на на хроматографе Кристалл 2000 м (Хроматэк) с капиллярной колонкой DB-1 (Agilent) [длина - 30 м, диаметр - 0,25 мм, толщина слоя - 0,25 мкм] с пламенно-ионизационным детектором (ПИД). Температура детектора - 350°С; температура испарителя - 300°С; газ-носитель - гелий; поток газа - 1,0 мл/мин; расход газа - 20,0 мл/мин; расход водорода - 20 мл/мин; расход воздуха - 200 мл/мин. Измерения проводят в условиях температурного градиента от 100 до 300°С со скоростью градиента 15,0°С/мин.

Суммарная убыль для среднекипящей и высококипящей фракции составляла не менее 30% за 7 суток культивирования при -2,5°С и солености среды 30 г/л.

Суммарная убыль для среднекипящей и высококипящей фракции составляла не менее 30% за 30 суток культивирования при -2,5°С и солености среды 40 г/л.

Пример 3. Способ производства препарата на основе штамма Pseudomonas deceptionensis ARC 44 ВКПМ В-13090.

Штамм Pseudomonas deceptionensis ARC 44 ВКПМ В-13090, выращенный на среде modPCA при температуре +4°С в течение 7 суток, вносят в жидкую питательную среду следующего состава (г/л): K₂HPO₄ - 1,5; KH₂PO₄ - 0,75; MgSO₄ - 1,0; (NH₄)₂SO₄ - 4,0; NaCl - 30; гидролизат казеина - 5,0; дрожжевой экстракт - 2,5; D-глюкоза - 1,0; рН 7,0. Далее культивируют при температуре +10°С на орбитальном шейкере в течение 3 суток до конечного титра 10⁹ КОЕ/мл. В полученную суспензию клеток в питательной среде вносят защитную среду (сухое обезжиренное молоко в количестве 10%). Далее полученную жидкую биомассу замораживают и обезвоживают методом лиофилизации. Полученную сухую биомассу штамма Pseudomonas deceptionensis ARC 44 ВКПМ В-13090 смешивают с питательным премиксом (сухое обезжиренное молоко) в соотношении 1:10.

Таким образом, получен штамм, способный осуществлять деструкцию нефти и нефтепродуктов при температуре -2,5°С и солености 30±10 г/л в условиях, бедных по питательным веществам.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм бактерий Pseudomonas deceptionensis ARC 44, обладающий способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-13090. Штамм бактерий Pseudomonas deceptionensis ВКПМ В-13090 позволяет повысить степень очистки акваторий водоемов, береговой линии от загрязнений нефтью и нефтепродуктами при температуре от +20 до -2,5°С и солености 30±10 г/л в условиях, бедных по питательным веществам. 3 пр.

Штамм Pseudomonas deceptionensis ARC 44 ВКПМ В-13090 для деструкции нефти и нефтепродуктов в водной среде при температуре от +20 до -2,5°С и солености 30±10 г/л в условиях, бедных по питательным веществам.