ШТАММ ARTHROBACTER SP. ДЛЯ РАЗЛОЖЕНИЯ СЫРОЙ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 1999 года по МПК C12N1/26 C02F3/34 B09C1/10 C12N1/26 C12R1/06 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, разрушающих нефть и нефтепродукты, и которая может быть использована, например, для очистки загрязненных поверхностей.

Известна смесь специально селекционированных штаммов бактерий Rhodococcus erythropolis ВКПМ В-3078 (36а-1), Rhodococcus luteus ВКПМ В-3077(25) и Micrococcus flavus ВКПМ В-3079 (53) /а.с. СССР N 1493666, C 02 F 3/34, 1989 г), используемый для деструкции нефти и нефтепродуктов.

Использование указанных культур микроорганизмов возможно только в аэротенках. Выращивание смеси культур возможно при больших материально- и энергозатратах.

Известен штамм бактерий Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1339Д, используемый для разложения нефти и нефтепродуктов, который применяется для очистки воды и почвы от указанных продуктов. Недостатком известного штамма является недостаточная скорость утилизации нефти и неспособность осуществлять утилизацию нефти и нефтепродуктов при высоком содержании их к объему загрязненного объекта.

Наиболее близким аналогом является штамм Arthrobacter sp., OC-1, выделенный из образца загрязненных нефтью вод, полученных с месторождения Ван-Еган. Штамм депонирован в ВКПМ института "ВНИИГенетики" под номером Ас-1556. /пат. РФ 2128221/.

Целью данного изобретения является получение нового штамма, характеризующегося высокой скоростью утилизации нефти и нефтепродуктов, которые являются единственными источниками углерода и энергии.

Для достижения поставленной цели предложен штамм Arthrobacter sp. МИА-74, выделенный при воздействии космических излучений на штамм Arthrobacter sp., ОС-1, ВКПМ Ас-1575 (справка о депонировании прилагается).

Выделение штамма осуществлялось путем рассевов образцов штамма ОС-1 после экспозиции в условиях космического полета.

Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик в соотношении с описанием, данным в определении бактерий Bergey/Bergey Smanual of Systematic Bacteriology vol. 1. 1984 p./..

Хранится штамм на агаризованных питательных средах при температуре 6-8^oC. в течение месяца. Более длительное хранение штамма осуществляется в герметично запаянных ампулах в лиофильно-высушенном состоянии.

Состав среды для хранения штамма.

Мясопептонный агар, г/л:
Мясная вода - 100,0
Агар - 20,0
NaCl - 5,0
Пептон - 10,0
Глюкоза - 7,0
Вода водопроводная - До 1 литра
Агаризованная среда Раймонда с нефтью, г/л:
Na₂CO₃ - 0,1
CaCl₂ - 0,01
MnSO₄ - 0,02
FeSO₄ - 0,01
MgSO₄ - 0,2
NH₄Cl - 0,2
NaCl - 3,0
Na₂HPO₄ - 1,5
KH₂PO₄ - 1,0
Агар - 20,0
Мясопептонный бульон - 500
Нефть - 0,5 об.%
Вода дистиллированная - До 1 литра
Данный штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными признаками.

Культура представляет собой подвижные, грамвариабельные короткие палочковидные мелкие клетки и клетки округлой формы, расположенные парами или по несколько в строчку, а также и по одиночке, расположенные под углом друг к другу, а также отдельные кокковидные клетки. Клетки подвижные, спор не образуют. Размер клеток в пределах 0,7 - 0,8 - 2,5 мкм.

Штамм растет на многих натуральных и синтетических средах. На МПА через 2-е суток роста при 30^oC культура образует круглые колонии, не очень крупные, чуть выпуклые, с матовой поверхностью и ровными краями, слегка кожистой консистенции, с розовым пигментом. Как правило, при выращивании на плотных средах на 2-3 сутки обнаруживается сплошной рост по штриху в виде образования розового цвета.

Культура не лизогенна, после хранения на плотных питательных средах в течение 2-3 недель негативных пятен не обнаружено (при T = 30 - 35^oC).

На мясопептонном бульоне при 30^oC через 3 суток наблюдается помутнение среды, беловатый осадок, заметно образование тонкого пристеночного кольца, небольшое количество агломератов клеток в толще среды в виде хлопьев, слабая пленка на поверхности среды. Оптимум роста 28 - 30^oC, pH 6,8 - 7,2.

На минеральной среде Раймонда с глюкозой образует беловатый осадок, слегка опалесцирующую муть в толще среды и тонкое пристеночное кольцо.

На минеральной среде Раймонда с нефтью в качестве единственного источника углерода наблюдается слегка опалесцирующая муть в толще среды. Визуально нефть значительно деградирована - при встряхивании образуется взвесь в виде мелкодисперсной фазы коричневого цвета, что совершенно не характерно для нативной нефти.

Размножение культуры осуществляли путем пересева на мясопептонном агаре или агаризованной среде Раймонда, состав которых представлен выше.

Условия культивирования на ферментационной питательной среде: температура 28 - 30^oC, pH 6,8 - 7,2, продолжительность культивирования 22 часа.

Состав ферментационной питательной среды.

Кормовые дрожжи БВК - 2%.

Кукурузный экстракт - 1%.

Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный анаэроб растет в диапазоне температур от 18 до 30^oC.

Крахмал гидролизует слабо, молоко не пептонидирует, желатин не разжижает, казеин не гидролизует, некислотоустойчивый, каталазоположительный. Хорошо растет на МПБ, разбавленном средой Раймонда в отношении 1:1, c NaCl в концентрации 0,5 и 1,0%. При выращивании на средах с 5% NaCl наблюдается очень легкое помутнение среды, образование пристеночного кольца. При концентрации NaCl 10, 15, 20% рост отсутствует.

Отношение к источникам углерода.

Штамм ассимилирует углеводы с образованием кислот: из гексоз - глюкозу, из полисахаридов - слабо крахмал и из спиртов - маннит. При этом наблюдается подкисление среды от pH 7,0 и 5,5. Слабо усваивает сахарозу, мальтозу, рамнозу. На средах с арабинозой и лактозой рост не наблюдался.

Данный штамм проявляет хорошую способность к росту на углеводородных субстратах: парафине (C₁₀ - C₁₃), гексадекане и сырой нефти, причем рост в этом случае наблюдается главным образом на границе раздела фаз. На жидкой среде Раймонда способен усваивать нефть и парафины в концентрации до 20%.

Отношение к источникам азота.

Штамм хорошо растет на средах с аммонийным и нитратным азотом (NaNO₃, NH₄NO₃, NH₄Cl_[C.A.1], когда нефть выступает в качестве единственного источника углерода.

Культура Arthrobacter sp. МИА-74 непатогенна для теплокровных.

На производственной питательной среде продуктивность культуры по биомассе составляет 2 - 3•10⁹ кл/мл, активность на песке с нефтью - на 7-е сутки биодеградации нефти отмечается в разведении 10¹ - 10⁸. Активность определяли на песке с нефтью методами спектрофотометрического и хроматографического анализа по количеству остаточной нефти.

Результаты проведенных исследований заявляемого штамма показывают, что средневирулентная доза штамма при однократном внутрибрюшинном введении белым мышам составила более 10⁹ клеток на животное.

Штамм не обладает способностью к транслокации и диссеминации во внутренние органы и кровь животных после 30-ти дневного наблюдения.

Штамм не обладает токсичными и токсигенными свойствами.

Наблюдение за животными в течение 30-ти суток не выявило каких-либо клинических признаков заболевания, а изучение внутренних органов не выявило патологических изменений, регистрируемых морфологически.

Изучаемые микроорганизмы не обладают раздражающим действием на слизистую оболочку глаза, не проникают через естественные барьеры верхних дыхательных путей, не диссемилируют во внутренние органы при интраназальном поступлении в организм. При многократном интраназальном введении установлено, что микроорганизмы обладают слабым сенсибилизирующим и умеренно выраженным дисбиотическим действием.

В результате проведенной работы было установлено, что культура Arthobacter sp. МИА-74 наиболее активно потребляет тяжелые фракции нефти (C₂₄ - C₃₃). В процессе жизнедеятельности микроорганизмов образуются вторичные метаболиты в виде жирных кислот с длиной цепи C₁₄ - C₂₀, именно они могут вносить свой вклад в количественную оценку фракции.

Примеры конкретного использования.

Применение на практике данного штамма обуславливается его физиолого-биохимическими особенностями, а именно способностью к активному росту на средах с углеводородами (нефть, парафин, гексадекан).

Пример 1.

Культуру выращивали в колбах объемом 250 мл с рабочим объемом заполнения питательной средой 30 мл на качалке при 350 об/мин, что обеспечивает коэффициент массопередачи по кислороду K_1a = 90 час^-1. Продолжительность культивирования составляет 22 - 24 часа, конечная концентрация клеток в культуральной жидкости составляет в среднем 3 • 10⁹ кл/мл.

Пример 2.

Экспериментальная оценка спосбности штамма микроорганизмов биодеградировать нефть проводилась в лабораторных условиях, в пилотных и полевых экспериментах комплексно по следующим показателям: убыли суммы углеводородов, изменению фракционного состава нефти в процессе биодеструкции, изменению площади остаточной нефти по отношению к общей площади загрязненной поверхности.

Культуральную жидкость после выращивания штамма бактерий-деструкторов нефти сгущали сепарированием до концентрации клеток 1 • 10⁹ - 10¹⁰ кл/мл. Для биообработки водных поверхностей культуральную жидкость заявляемого штамма разводили до конечной концентрации клеток 1 • 10⁶ кл/мл в пресной воде, добавляли 0,2% нитроаммофоски. Наносили готовый раствор из расчета 10 л/м² поверхности почвы. Через 10-15 дней проводили повторную биообработку загрязненной поверхности. При необходимости, в случае высокого уровня загрязнения, проводили третью биообработку через 10-15 дней после второй. На почвах при пересыхании обрабатываемой поверхности проводили полив и рыхление, если это было возможно. Обработку почвы и воды в пилотных испытаниях осуществляли из садовых леек, в полевых - с помощью поливальной или пожарной машины вместимостью 5-10 м³.

В лабораторных условиях обработку почвы, искусственно загрязненной нефтью, осуществляли в лабораторной посуде объемом 0,25-0,50 л. Лабораторные эксперименты проводили при комнатной температуре.

Пилотные испытания проводили на поверхности водоемов площадью 1-2 м² и более, или на аварийно загрязненных почвах, где предварительно определяли уровень загрязнения.

Полевые испытания проводили на природных объектах после аварийных разливов нефти на них. И пилотные и полевые испытания проводили в летне-осенний период.

Пробы для анализов изначально и в динамике отбирали по пятиточечной схеме стандартным пробоотборником.

Массовый анализ исходного уровня загрязнения и дальнейший мониторинг процесса очистки почвенных объектов и воды от нефтяных загрязнений проводили гравиметрическим методом. Качественный состав загрязняющего агента проводили методами газожидкостной хроматографии. Количественный состав нефтяных фракций определяли с помощью площади пиков, качественный - по времени удержания. В качестве контроля использовали нативную нефть, не подвергавшуюся биодеградации.

Эффективность биодеградации загрязнения оценивали по убыли углеводородов нефти в процессе проведения биообработок, принимая за 100% исходную концентрацию загрязнения.

Учет численности живых клеток микроорганизмов во всех экспериментах проводили общепринятым методом предельных разведений на элективных средах.

В табл. 1, 2, 3 приведены результаты тестирования биодеградирующей способности штамма в лабораторных условиях, полевых и пилотных экспериментах.

В табл. 1 приведены результаты сравнительного тестирования деградирующей способности штамма Arthrobacter sp МИА-74 и препарат Деворойл на модели почвы в лабораторных условиях. В качестве модели был использован образец загрязненной почвы Павелецкого предприятия по обеспечению нефтепродуктов. Контролем служил загрязненный углеводородами образец почвы с того же участка без внесения каких бы то ни было дополнительных микроорганизмов.

В табл. 2 представлены результаты полевых тестов биодеградирующей способности штамма МИА-74 на природном объекте (река Черная), загрязненном углеводородами (УВ) в результате аварийных разливов нефти
В табл. 3 представлены результаты тестирования штамма МИА-74 в сравнении с отечественным препаратом в пилотных экспериментах, которые были поставлены на засторелом нефтяном загрязнении.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что с помощью штамма Arthobacter sp. МИА-74 может быть достигнута интенсивная деградация при высоком содержании ее в объекте загрязненного субстрата и он может быть использован для удаления нефтяных загрязнений с поверхности почвы и водоемов.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для очистки загрязненных нефтью поверхностей. Штамм Arthrobacter sp. МИА-74 хорошо растет на средах с аммонийным и нитратным азотом, когда нефть является единственным источником углерода, штамм не является патогенным. Он может использоваться для очистки воды, почвы и др. загрязненных поверхностей. Новый штамм Arthrobacter sp. МИА-74, ВКПМ Ас-1575 характеризуется высокой скоростью утилизации нефти и нефтепродуктов. 3 табл.

Штамм Arthrobacter sp. МИА-74 ВКПМ Ас-1575 для разложения нефти и нефтепродуктов.