РЕКОМБИНАНТНЫЙ НОКАУТНЫЙ МУТАНТ ВИРУСА НОДУЛЯРНОГО ДЕРМАТИТА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2019 года по МПК C12N7/04 A61K39/12 

Уровень техники

Данное изобретение относится к живому ослабленному рекомбинантному нокаутному мутанту вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота, где ген интерлейкин-10-подобного белка или функциональная часть указанного гена инактивированы в вирусном геноме. Данное изобретение конкретно относится к рекомбинантному нокаутному мутанту вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота, к фармацевтическим композициям, содержащим этот нокаутный мутант, к способам получения этого нокаутного мутанта и к применению этого нокаутного мутанта.

Нодулярный дерматит (lumpy skin disease, LSD) представляет собой острое или бессимптомное заболевание крупного рогатого скота, вызванное вирусом нодулярного дерматита (lumpy skin disease virus, LSDV), поксвирусом, принадлежащим роду Capripoxvirinae. Это важное инфекционное заболевание крупного рогатого скота, переносимое насекомыми; оно является эндемичным в большинстве африканских стран, а также распространено на Ближнем Востоке и в Турции.

Поквирусы, инфицирующие позвоночных животных, принадлежат семейству Poxviridae, подсемейству Chordopoxvirinae. Это крупные вирусы, содержащие двухцепочечную ДНК, которые реплицируются в цитоплазме. Они содержат центральную кодирующую область, фланкированную областями инвертированного концевого повтора (inverted terminal repeat, ITR), которые представляют собой идентичные, но противоположно ориентированные последовательности на двух концах генома, и найдены во всех исследованных поксвирусах (Esposito and Knight, 1985). Большая консервативная центральная область преимущественно содержит гены, необходимые для структуры и репликации вируса, тогда как терминально расположенные гены имеют тенденцию к более вариабельной экспрессии и участвуют в ограничении диапазона хозяев и иммуномодуляции (Esposito and Knight, 1985).

Известно, что поксвирусы кодируют множество генных продуктов, которые позволяют им избегать, препятствовать или разрушать ключевые компоненты врожденного и приобретенного иммунных ответов хозяина. Тем не менее, не существует одного иммуномодулирующего гена, который присутствовал бы во всех поксвирусах, что указывает на то, что на патогенез вируса могут влиять различные механизмы в зависимости от специфических взаимодействий вируса и хозяина в конкретном случае. Показано, что отдельные нокауты генов частично ослабляют вирусы. Огромный массив этих иммуномодулирующих или вирулентных генов действует сообща, позволяя вирусу уклоняться или подавлять иммунные ответы хозяина после заражения.

Стратегии, используемые поксвирусами при заражении их хозяев, позволяют проникнуть в суть различных возможностей и разработок, которые могут привести к созданию новых вакцин, а также возможных терапевтических инструментов для лечения заболеваний.

Целью данного изобретения было создание улучшенной живой ослабленной LSDV-вакцины с использованием технологии нокаута гена, нацеленной на предполагаемый иммуномодулирующий ген LSDV, такой как ген интерлейкин-10-подобного белка. Этот нокаутный вирус LSDV был бы ценным для использования в качестве вакцины для защиты крупного рогатого скота от заражения LSD, овец от заражения оспой овец и коз от заражения оспой коз.

Вирулентный полевой изолят LSDV Warmbaths (из Уормбатс, ЮАР) был выбран в качестве каркаса для создания этого вируса/вакцины, поскольку он был способен стимулировать иммунные ответы хозяина. Вакцина LSDV OP рассматривалась для использования в качестве каркаса, но из-за того, что она уже является ослабленной, удаление такого гена может снизить ее способность стимулировать релевантные иммунные реакции.

Поскольку каприпоксвирусы, в том числе вирусы оспы овец и оспы коз, имеют общий нейтрализующий сайт основного антигена (Р32), вакцина на основе LSDV потенциально может защитить овец и коз от оспы овец и оспы коз.

Создание нокаутного вируса имеет ряд потенциальных исходов, так что он достаточно ослаблен, чтобы вызывать менее выраженные симптомы, и способен обеспечить защиту животных от инфекции. Оно также может иметь отрицательный результат из-за создания более вирулентного вируса, вызывающего тяжелое заболевание.

LSDV классифицируется как заболевание, регистрируемое МЭБ (Международное эпизоотическое бюро). Данное заболевание, как правило, не вызывает высокую смертность, но имеет экономическое значение, поскольку является причиной снижения производства молока, временного или постоянного бесплодия у коров и быков, абортов и повреждения шкур. Тем не менее, есть случаи, когда заболевание вызывает смерть из-за истощения и вторичных бактериальных инфекций.

Вакцинация ослабленным штаммом вируса нодулярного дерматита (LSDV) является единственным жизнеспособным средством контроля LSD в эндемичных районах, таких как Южная Африка и другие районы Африки.

Существует шесть каприпоксвирусных вакцин, которые используются специально для контроля LSD. Это кенийская оспа овец и коз (KS-1), югославский штамм оспы овец RM 65, румынский штамм оспы овец, вакцинный штамм LSDV Neertling из Ондерстепоорта, Южная Африка (LSDV ОВР), который продается компаниями Onderstepoort Biological products, Lumpyvax™ и Herbivac®LS. Все каприпоксвирусы имеют общий нейтрализующий сайт основного антигена, так что различные штаммы каприпоксвируса, например, вируса овечьей оспы, могут обеспечить перекрестную защиту крупного рогатого скота от LSD.

В Южной Африке в настоящее время используется вакцинный штамм SA LSDV ОВР, разработанный в 1968 году путем пассажа полевого изолята в тканевой культуре и на хориоаллантоических мембранах эмбриональных куриных яиц (van Rooyen et al., 1969). Существуют две другие вакцины LSDV, которые были разработаны в Южной Африке. Это Lumpyvax™, живой ослабленный вирус (тип SIS) и Herbivac®LS, живой ослабленный вирус (модифицированный тип Neethling), продаваемый компаниями Intervet и Deltamune, соответственно. Тем не менее, нет никакой дополнительной информации об этих вакцинах из-за прав на защиту интеллектуальной собственности, поэтому мы ограничены в своем понимании их разработки и эффективности.

Хотя вакцинация против LSD использовалась для обеспечения защиты в течение всей жизни (Weiss, 1968), сообщалось о проблемах "вакцинальной неудачи", например, во время вспышки LSD в 1990-1991 годах, а также во время последующих вспышек (Hunter and Wallace, 2001). Эти проблемы, возможно, были связаны с преобладанием климатических условий, благоприятствующих размножению и распространению насекомых-переносчиков (Hunter and Wallace, 2001). Низкий уровень использования вакцины в этот период и в последующие годы также может способствовать распространению LSD (Hunter and Wallace, 2001). Другие проблемы могут включать более короткий период индуцированного иммунитета и, самое главное, отсутствие образования антител на обнаруживаемом уровне у 10% матерей после вакцинации, что предположительно оставляет телят восприимчивыми к инфекции (Hunter and Wallace, 2001). Поэтому рекомендуется ежегодная вакцинация против LSD.

Молекулярная характериризация нашей группой как штамма вакцины LSDV Neethling (GenBank № AF409138.1), так и полевого изолята LSDV Warmbaths (GenBank № AF409137.1) позволила нам выявить гены, предположительно вовлеченные в определение диапазона хозяина, вирулентности и иммуномодуляции или в ингибирование реакций хозяина на инфекцию (Kara, et al., 2003). Среди них имеются гены интерлейкин-10-подобного белка, интерлейкин-1-рецептор-подобного белка, регулятора апоптоза, интерферона-гамма-рецептор-подобного белка, интерлейкин-18-связывающего белка, рецептора СС-хемокинов, связанного с G-белком, интерферон-альфа/бета-связывающего белка и ОХ-2-подобного белка.

Эти предполагаемые иммуномодулирующие гены были удалены или нокаутированы у некоторых поксвирусов, таких как вирус осповакцины (vaccinia virus, VV), вирус миксомы (myxoma virus, MYX) и орф-вирус (orf virus, ORFV) из группы парапокс-вирусов, а также другие поксвирусы. Нокаутируя их, можно получить инструмент для их функциональной характеризации, позволяющий лучше понять механизмы патогенеза. Ряд этих нокаутных рекомбинантных вирусов был оценен на животных моделях, причем некоторые из них проявляли различную степень ослабления (аттенуации).

Оспа овец (sheep pox, SPP) и оспа коз (goat pox, GTP) также являются первичными вирусными заболеваниями, влияющими на поголовье мелкого скота в некоторых частях Азии и Африки. Вирус оспы овец (sheep pox virus, SPPV) и вирус оспы коз (goat pox virus, GTPV), наряду с вирусом нодулярного дерматита крупного рогатого скота (LSDV), являются членами вирусного рода Capripoxvirinae. У животных, не использовавшихся ранее в опытах, как SPPV, так и GTPV могут вызывать заболеваемость и смертность, достигающую 100% и приближающуюся к 90% в зависимости от изолята, соответственно. Для нодулярного дерматита крупного рогатого скота результаты как полевых вспышек, так и экспериментального инфицирования весьма различны: заболеваемость варьирует от 3% до 85%, а смертность обычно составляет менее 3%. Из-за тяжести всех трех заболеваний, наряду с их потенциальными отрицательными последствиями для местной экономики, Международное эпизоотическое бюро обозначило их в Списке заболеваний (OIE, 2010). Каприпоксвирусы имеют высокую степень гомологии последовательностей, а иммунные ответы, вызванные инфекцией, обычно являются перекрестно-защитными, что подтверждается в одном раннем исследовании, в котором степень перекрестной защиты для всех трех CaPV была продемонстрирована у овец, коз и крупного рогатого скота (Capstick, 1961).

После 4-8-дневного инкубационного периода инфекция SPPV и GTPV характеризуется лихорадкой, повышением внутренней температуры тела и частоты дыхания, а вскоре после этого в коже появляются макулы, которые в конечном итоге развиваются в оспенные поражения (Bhanuprakash et al., 2006, Babiuk et al., 2008a). Эти поражения наряду с усиленными оральными и носовыми секретами содержат высокие вирусные нагрузки и служат первичными путями контактной передачи (Bowden et al., 2008).

В настоящее время имеются коммерческие вакцины для борьбы со вспышками этих заболеваний в эндемичных странах. Хотя они отличаются географическим происхождением, они имеют одну общую черту; т.е. каждая вакцина была получена из ранее вирулентного штамма и серийно пассирована в клеточной культуре до ослабления (Babiuk et al., 2008; Davies and Mbugwa, 1985; Kitching, 2003). Хотя полевые исследования обычно показывали, что эти вакцины обладают высокой степенью эффективности, мало известно о точном механизме ослабления.

Данное изобретение относится к вирулентному штамму LSDV, который ослаблен посредством нарушения его открытой считывающей рамки 005 (ORF005, от англ. - open reading frame), кодирующей предполагаемый фактор вирулентности, обладающий гомологией с интерлейкином-10 (IL-10), с использованием гомологичной рекомбинации. Этот ослабленный штамм оценивали у крупного рогатого скота, овец и коз для обеспечения безопасности и эффективности в отношении вирулентных изолятов каприпоксвируса.

Сущность изобретения

Данное изобретение относится к живому ослабленному рекомбинантному нокаутному мутанту вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота, где ген интерлейкин-10-подобного белка или функциональная часть этого гена инактивированы в вирусном геноме, а также к фармацевтическим композициям, содержащим этот нокаутный мутант, к способам получения этого нокаутного мутанта и к применению этого нокаутного мутанта в лечении заболевания.

В соответствии с первым аспектом данного изобретения предусмотрен нокаутный мутант вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота (LSDV), где ген интерлейкин-10-подобного белка или функциональная часть этого гена инактивированы в вирусном геноме. Специалистам в данной области будет Следует понимать, что гены могут быть инактивированы путем делеции, замещения или какой-либо другой модификации.

В предпочтительном воплощении данного изобретения ген интерлейкин-10-подобного белка или его функциональная часть инактивированы путем делеции из вирусного генома. Более предпочтительно, ген интерлейкин-10-подобного белка или его функциональная часть удалены посредством гомологичной рекомбинации.

Следует понимать, что инактивация гена интерлейкин-10-подобного белка приводит к получению живого ослабленного штамма вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота. Также следует понимать, что ген интерлейкин-10-подобного белка расположен в открытой рамке считывания 005 (ORF005) вирулентных штаммов вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота.

Второй аспект данного изобретения предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую нокаутный мутант вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота, где ген интерлейкин-10-подобного белка или функциональная часть указанного гена были удалены из вирусного генома, вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем и/или эксципиентом. Данная фармацевтическая композиция также может включать адъювант.

Фармацевтическая композиция согласно данному изобретению способна вызывать защитный иммунный ответ у животного против заболевания, вызванного вирусом из вирусного рода Capripoxvirinae. Неограничивающие воплощения данного заболевания включают нодулярный дерматит крупного рогатого скота, оспу овец и оспу коз, тем не менее, специалистам в данной области будет Следует понимать, что фармацевтическая композиция согласно данному изобретению также может быть эффективной в отношении других заболеваний, вызванных вирусами рода Capripoxvirinae, как и еще не открытых/не описанных.

В одном воплощении данного изобретения животное является жвачным. Предпочтительно жвачное животное выбрано из группы, состоящей из крупного рогатого скота, овец, коз и диких копытных, но не ограничиваясь ими.

В другом воплощении данного изобретения фармацевтическая композиция составлена для внутримышечного, внутрикожного, внутривенного, внутрибрюшинного или подкожного, перорального или подъязычного введения. Следует понимать, что фармацевтическая композиция может быть составлена для введения животному в разовой дозе, альтернативно фармацевтическая композиция может быть составлена для введения животному в двух или более дозах.

Еще один аспект данного изобретения предусматривает способ получения живого ослабленного нокаутного мутанта LSDV, где указанный способ включает этапы (i) инфицирования клетки-хозяина родительским штаммом LSDV, (ii) трансфекции клетки-хозяина инсерционным вектором, содержащим селективный маркер, и (iii) селекции рекомбинантных нокаутных мутантов LSDV. Следует понимать, что родительский штамм LSDV может быть штаммом дикого типа, ослабленным, инактивированным штаммом или клоном с искусственной бактериальной хромосомой (bacterial artificial chromosome, ВАС).

Четвертый аспект данного изобретения предусматривает использование нокаутного мутанта LSDV для изготовления лекарственного препарата для использования в способе профилактики заболевания у животного. Предпочтительно, данное заболевание вызвано вирусом из вирусного рода Capripoxvirinae. Более предпочтительно, данное заболевание выбрано среди нодулярного дерматита крупного рогатого скота, оспы овец и оспы коз.

Пятый аспект данного изобретения предусматривает нокаутный мутант LSDV для использования в способе профилактики заболевания у животного. Предпочтительно, указанное заболевание вызвано вирусом из вирусного рода Capripoxvirinae. Более предпочтительно, указанное заболевание выбрано среди нодулярного дерматита крупного рогатого скота, оспы овец и оспы коз. Следует понимать, что указанное животное может быть жвачным. Предпочтительно указанное жвачное животное выбрано из группы, состоящей из крупного рогатого скота, овец, коз и диких копытных, но не ограничиваясь ими.

Шестой аспект данного изобретения предусматривает введение инсерционного вектора для получения или продукции нокаутного мутанта вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота (LSDV), где указанный инсерционный вектор инактивирует ген интерлейкин-10-подобного белка или функциональную часть этого гена, образуя нокаутный мутант.

В одном воплощении ген интерлейкин-10-подобного белка или функциональная часть этого гена родительского штамма LSDV инактивированы путем делеции из вирусного генома при трансфекции клетки инсерционным вектором.

Краткое описание графических материалов

Неограничивающие воплощения данного изобретения далее будут описаны только в качестве примера и со ссылкой на следующие графические материалы:

Фиг. 1: Универсальный клонирующий вектор pUL для использования в конструировании трансферного вектора. Данный вектор состоит из уникальных сайтов рестрикции по обе стороны от репортерного гена усиленного зеленого флуоресцентного белка (enhanced green fluorescent protein, EGFP) (под контролем промотора вируса осповакцины (vaccinia virus, VV) Р11) и доминантного селективного маркерного гена ксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (gpt) Е. coli под контролем промотора VV Р7.5. Дополнительный промотор VV Р7.5 расположен ниже, чтобы обеспечить последующую делецию гена gpt Е. coli. Уникальные сайты рестрикции с обеих сторон генов EGFP и gpt позволяют вставлять последовательности, которые гомологичны последовательности гена (генов), подлежащей удалению или разрушению. Стрелки указывают направление/ориентацию генов и промоторов.

Фиг. 2: Инсерционный вектор LSDV, pTW005, для использования в создании рекомбинантного LSDV WB005KO. Указанный вектор состоит из гена ORF 005 LSDV, нарушенного репортерным геном EGFP (под контролем промотора VVP11), и доминантного селективного маркерного гена gpt Е. coli (под контролем промотора VV Р7.5, с дополнительным промотором VV Р7.5 ниже, чтобы обеспечить последующую делецию гена gpt E.coli). Стрелки указывают направление/ориентацию генов и промоторов.

Фиг. 3: Клинические признаки, наблюдаемые у телят после вакцинации клеточным культуральным материалом (группа 1, отрицательный контроль), вакциной LSDV ОВР (группа 2) и конструкцией LSDV WB005KO (группа 3).

Фиг. 4: Титры нейтрализующих антител в сыворотках телят в различные моменты времени после вакцинации клеточным культуральным материалом (группа 1, отрицательный контроль), вакциной LSDV ОВР (группа 2) и конструкцией LSDV WB005KO (группа 3). Нейтрализующие титры представлены в виде средних логарифмических значений.

Фиг. 5: Пролиферативные ответы одноядерных клеткок периферической крови (РВМС, от англ. peripheral blood mononuclear cells), стимулированных 1×10⁵ БОЕ/мл антигена LSDV WB, от животных, вакцинированных клеточной культуральной средой (группа 1), вакциной LSPV ОВР (группа 2) и конструкцией LSDV WB005KO (группа 3). Результаты были выражены как индекс стимуляции (stimulation index, SI), который определяется как среднее число отсчетов в минуту для антигена LSDV Warmbaths, разделенное на среднее число отсчетов в минуту (counts per minute, cpm) для нестимулированных РВМС. Ответ считали положительным, если результат был в два раза выше, чем SI отрицательного контроля, со значимым р-значением (р-значение меньшее или равное 0,01, определенное t-критерием Стьюдента).

Фиг. 6: Пример коркоподобных повреждений, наблюдаемых как в группе телят 1 (отрицательный контроль), так и в группе телят 2 (LSDV ОВР) после заражения изолятом LSDV Warmbaths (LSDV WB).

Фиг. 7: Титры нейтрализующих антител в сыворотках крови телят из групп 1, 2 и 3 в разное время после заражения изолятом LSDV WB. Нейтрализующие титры представлены в виде средних логарифмических значений.

Фиг. 8: Пролиферативные ответы РВМС, стимулированных 1×10⁵ БОЕ/мл антигена LSDV WB, от телят в группах 1, 2 и 3 после заражения изолятом LSDV WB. Результаты были выражены как индекс стимуляции (stimulation index, SI), который определяется как среднее число отсчетов в минуту для антигена LSDV Warmbaths, разделенное на среднее число отсчетов в минуту (counts per minute, cpm) для нестимулированных РВМС. Ответ считали положительным, если результат был в два раза выше, чем SI отрицательного контроля, со значимым р-значением (р-значение меньшее или равное 0,01, определенное с помощью t-критерия Стьюдента).

Фиг. 9: Ректальные температуры овец и коз после инфицирования/заражения вирулентными каприпоксвирусами. Ректальные температуры вакцинированных/невакцинированных овец и коз измеряли до вирусного заражения и через регулярные ежедневные интервалы после заражения. Результаты представлены как средние температуры для каждой группы со стандартными отклонениями, указанными в каждый момент времени.

Фиг. 10: Клинические признаки и общая патология невакцинированных/вакцинированных овец и коз после заражения каприпоксвирусом на 10-й день после заражения (days post challenge, dpc). (A) Конъюнктивит у невакцинированных овец; (В, С) отсутствие оспенных поражений у вакцинированных овец и коз, соответственно, в отличие от оспенных поражений, наблюдаемых у невакцинированных коз (D) и овец (F) в одно и то же время. Назальные и слизистые выделения наблюдались также у невакцинированных животных (Е).

Фиг. 11: Количественная оценка каприпоксвирусной ДНК в крови, проведенная с помощью ПЦР в режиме реального времени. Цельную кровь получали от вакцинированных и невакцинированных овец и коз в нескольких временных точках на 20-й (козы) или 21-й (овцы) день после вакцинации (days post vaccination, dpv). Вирусные копии в каждый момент времени представлены как средние значения со стандартными отклонениями. Различия между невакцинированными и вакцинированными животными были значимыми (р меньше 0,05), что определяли с помощью t-теста.

Фиг. 12: Сероконверсия вакцинированных/невакцинированных овец и коз. Титры специфических для каприпоксвируса IgG-антител у овец (А) и коз (В) измеряли с использованием непрямого иммуноферментного анализа (ELISA, от англ. - enzyme-linked immunosorbent assay) после вакцинации (дни 0-21) и после вирусного заражения вирулентными каприпоксвирусами (дни 22-42). Результаты представлены как средние значения со стандартными отклонениями в каждый момент времени.

Фиг. 13: Количественная оценка специфических для каприпоксвируса нейтрализующих антител у вакцинированных/невакцинированных овец (А) и коз (В). Тесты нейтрализации вируса (virus neutralisation test, VNT) проводили с использованием сывороток, полученных после вакцинации и заражения каприпоксвирусом в различные моменты времени. Титры VNT представлены в виде средних логарифмических значений со стандартными отклонениями в каждый момент времени.

Фиг. 14: Количественная оценка секреции интерферона-гамма (ИФ-γ) в образцах от вакцинированных и невакцинированных коз на 14-й и 21-й dpv. Измерение уровней ИФ-γ проводили с использованием ИФ-γ ELISA и антител с перекрестной реактивностью в отношении бычьего ИФ-γ и оценивали количественно с использованием стандарта, предоставленного изготовителем. Результаты представляют собой средние значения со стандартными отклонениями. Различия в уровнях ИФ-γ у невакцинированных и вакцинированных коз были значимыми (Р менее 0,05), что определяли с помощью t-теста.

Подробное описание изобретения

Далее данное изобретение далее будет описано более подробно со ссылкой на прилагаемые графические материалы, на которых показаны некоторые, но не все воплощения данного изобретения.

Описанное изобретение не должно ограничиваться раскрытыми конкретными воплощениями, и предполагается, что модификации и другие воплощения включены в объем данного изобретения. Хотя в данном документе используются конкретные термины, они используются только в общем и описательном смысле, а не в целях ограничения.

Используемые в этом описании и в последующих пунктах формулы изобретения слова в единственном числе включают множественную форму, если контекст явно не указывает на иное.

Терминология и фразеологизмы, используемые в данном документе, предназначены для описания и не должны рассматриваться как ограничивающие. Использование терминов "содержащий", "имеющий" и "включающий" и их вариации, используемые в данном документе, предназначено для охвата перечисленных ниже элементов и их эквивалентов, а также дополнительных пунктов.

Под "состоянием, связанным с поксвирусной инфекцией" подразумевается любое состояние, заболевание или нарушение, которое коррелирует с наличием существующей поксвирусной инфекцией, оно включает вторичные эффекты, такие как сокращение производства молока, временное или постоянное бесплодие у коров и быков, аборты и повреждения шкур, потеря веса и нарушение формирования шерсти.

Организм согласно данному изобретению включает, но не ограничиваясь этим, нокаутный мутант вируса нодулярного дерматита, в котором ген интерлейкин-10-подобного белка или функциональная часть указанного гена инактивирована в вирусном геноме.

Данное изобретение нацелено на ген интерлейкин-10-подобного белка, который расположен в открытой рамке считывания 005 (ORF005) полевого изолята LSDV Warmbaths (GenBank № AF409137.1). SEQ ID NO 9 представляет репрезентативную последовательность фланкирующих областей ORF005 вместе с ORF005, содержащей ген интерлейкин-10-подобного белка, в полевом изоляторе LSDV Warmbaths. SEQ ID NO 10 представляет репрезентативную последовательность той же самой области нокаутного мутанта вируса нодулярного дерматита (LSDV), показывающую две фланкирующие области ORF005 вместе с последовательностью маркерного гена EGFP, которая была вставлена в полевой изолят LSDV Warmbaths, заменяя большую часть последовательности гена ORF005, приводя к образованию нокаутного мутанта.

Термин "рекомбинантный" означает, что что-то подверглось рекомбинации. При использовании в отношении нуклеиновокислотной конструкции данный термин относится к молекуле, которая содержит нуклеиновокислотные последовательности, которые соединены вместе или продуцируются с помощью молекулярно-биологических методик. Рекомбинантные нуклеиновокислотные конструкции могут включать нуклеотидную последовательность, которая лигирована или подвергается лигированию с нуклеиновокислотной последовательностью, с которой она не связана в природе или с которой она связана в другом месте в природе. Соответственно, рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция указывает, что нуклеиновокислотной молекулой манипулируют с использованием генной инженерии, т.е. путем человеческого вмешательства. Рекомбинантные нуклеиновокислотные конструкции могут быть введены в клетку-хозяина путем инфицирования или трансфекции. Такие рекомбинантные нуклеиновокислотные конструкции могут включать последовательности, полученные из одних и тех же видов клеток-хозяев или из разных видов клеток-хозяев.

Нокаутные мутанты вируса нодулярного дерматита или композиции согласно данному изобретению могут быть предоставлены либо отдельно, либо в сочетании с другими соединениями (например, нуклеиновокислотными молекулами, малыми молекулами, пептидами или пептидными аналогами), в присутствии липосомы, адъюванта или любого носителя, такого как фармацевтически приемлемый носитель, и в форме, подходящей для введения млекопитающим, например, людям, крупному рогатому скоту, овцам и т.д.

Используемый в данном документе термин "фармацевтически приемлемый носитель" или "эксципиент" включает любые и все антибактериальные и противогрибковые агенты, покрытия, дисперсионные среды, растворители, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты и т.п., которые физиологически совместимы. "Фармацевтически приемлемый носитель" может включать твердый или жидкий наполнитель, разбавитель или инкапсулирующее вещество, которое можно безопасно использовать для введения субъекту композиции, содержащей нокаутный мутант вируса нодулярного дерматита или вакцину. Фармацевтически приемлемый носитель может быть подходящим для внутримышечного, внутрикожного, внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, перорального или сублингвального введения. Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы, дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных растворов. Использование сред и агентов для получения фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. Если любые обычные среды или агенты несовместимы с активным соединением, их использование в фармацевтических композициях согласно данному изобретению не рассматривается. В композиции также могут быть включены дополнительные активные соединения.

Подходящие составы или композиции для введения нокаутных мутантов вируса нодулярного дерматита и композиций субъектам, страдающим от поксвирусной инфекции, или субъектам, которые являются предсимптомными по состоянию, связанному с поксвирусной инфекцией, подпадают под объем данного изобретения. Может быть использован любой подходящий путь введения, такой как парентеральный, внутривенный, подкожный, внутримышечный, внутричерепной, внутриглазничный, глазной, внутрижелудочковый, внутрикапсулярный, внутриспинномозговой, интратекальный, интрацистеральный, внутрибрюшинный, интраназальный, аэрозольный, местный или пероральный.

Используемый в данном документе термин "субъект" включает как диких, так и домашних жвачных животных. Предпочтительно, субъектами являются крупный рогатый скот, овцы и/или козы.

Для вакцинных составов и фармацевтических композиций эффективное количество нокаутных мутантов вируса нодулярного дерматита или композиций может быть предоставлено либо отдельно, либо в сочетании с другими соединениями, с иммунологическими адъювантами, например, алюминия гидроксидом, диметилдиоктадециламмония гидроксидом или неполным адъювантом Фрейнда. Нокаутные мутанты вируса нодулярного дерматита и композиции согласно данному изобретению также могут быть связаны с подходящими носителями и/или другими молекулами, такими как бычий сывороточный альбумин или гемоцианин фиссуреллы, для усиления иммуногенности.

В некоторых воплощениях нокаутные мутанты вируса нодулярного дерматита и композиции согласно данному изобретению могут быть представлены в наборе, возможно, с носителем и/или адъювантом, вместе с инструкциями по применению.

"Эффективное количество" соединения в соответствии с изобретением включает терапевтически эффективное количество, иммунологически эффективное количество или профилактически эффективное количество. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата, такого как лечение инфекции или состояния, связанного с такой инфекцией. Исход лечения может быть, например, измерен уменьшением виремии, ингибированием экспрессии вирусных генов, задержкой развития патологии, связанной с поксвирусной инфекцией, стимуляцией иммунной системы или любым другим способом определения терапевтического эффекта. Терапевтически эффективное количество соединения может варьировать в зависимости от таких факторов как состояние заболевания, возраст, пол и вес индивидуума, а также способность соединения вызывать желаемый ответ у индивидуума. Схемы дозировки могут быть скорректированы для обеспечения оптимального терапевтического ответа. Терапевтически эффективное количество также является таким количеством, в котором любые токсичные или вредные эффекты соединения перевешиваются терапевтически благоприятными эффектами.

Дозировка любого из нокаутных мутантов вируса нодулярного дерматита или композиций согласно данному изобретению варьирует в зависимости от симптомов, возраста и массы тела субъекта, характера и тяжести нарушения, подлежащего лечению или профилактике, пути введения и формы композиции. Любая из композиций согласно данному изобретению может вводиться в виде разовой дозы или множественных доз. Дозировки композиций согласно данному изобретению могут быть легко определены с помощью методик, известных специалистам в данной области или описанных в данном документе.

Под "иммуногенно эффективным количеством" подразумевается количество, эффективное в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого иммунного ответа. Желаемый иммунный ответ может включать стимуляцию или получение иммунного ответа, например, Т-клеточного ответа.

"Профилактически эффективное количество" относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого профилактического результата, такого как предотвращение возникновения состояния, связанного с поксвирусной инфекцией. Как правило, профилактическая доза используется у субъектов до заболевания или на ранней стадии заболевания, так что профилактически эффективное количество может быть меньше терапевтически эффективного количества.

Значения дозировок могут варьировать и корректироваться со временем в соответствии с индивидуальной потребностью и суждением человека, вводящего или контролирующего введение нокаутных мутантов вируса нодулярного дерматита или композиций согласно данному изобретению. Диапазоны дозировок, приведенные в данном документе, являются только иллюстративными и не ограничивают диапазоны дозировок, которые могут быть выбраны. Количество активного соединения (соединений) в композиции может варьировать в зависимости от таких факторов как состояние заболевания, возраст, пол и вес человека. Схемы дозировки могут быть скорректированы для обеспечения оптимального терапевтического ответа. Например, можно вводить единичную дозу, либо в течение некоторого времени можно вводить несколько доз. Может быть выгодным собирать композиции в дозированных единичных формах для удобства введения и единообразия дозировки.

Термин "профилактика", используемый в связи с инфекционным заболеванием или другим медицинским заболеванием или состоянием, хорошо известен в данной области и включает введение композиции, которая уменьшает частоту или задерживает появление симптомов состояния у субъекта по сравнению с субъектом, который не получает данную композицию. Профилактика заболевания включает, например, сокращение числа диагнозов инфекции в леченой популяции по сравнению с нелеченой контрольной популяцией и/или задержку появления симптомов инфекции у леченой популяции по сравнению с нелеченой контрольной популяцией.

Термин "профилактическое или терапевтическое" лечение хорошо известен специалистам в данной области и включает введение субъекту одной или более чем одной из композиций согласно данному изобретению. Если композицию вводят до клинического проявления нежелательного состояния (например, заболевания или другого нежелательного состояния субъекта), то лечение является профилактическим, т.е. оно защищает хозяина от развития нежелательного состояния, тогда как если его вводят после проявления нежелательного состояния, то лечение является терапевтическим (т.е. оно предназначено для уменьшения, ослабления или стабилизации существующего нежелательного состояния или его побочных эффектов).

Токсичность и терапевтическая эффективность композиций согласно данному изобретению могут определяться стандартными фармацевтическими процедурами на клеточной культуре или с использованием экспериментальных животных, такими как определение полулетальной дозы LD₅₀ (англ. - lethal dose) и полуэффективной дозы ED₅₀ (англ. - effective dose). Данные, полученные на клеточных культурах и/или животных, могут быть использованы для определения диапазона дозировки для использования у субъекта. Дозировка любой композиции согласно данному изобретению предпочтительно лежит в пределах диапазона концентраций в кровотоке, которые включают ED₅₀, но которые имеют незначительную токсичность или вообще не имеют токсичности. Дозировка может варьировать в пределах этого диапазона в зависимости от используемой лекарственной формы и используемого способа введения. Для композиций согласно данному изобретению терапевтически эффективную дозу первоначально можно оценить в клеточных культуральных анализах.

Данное изобретение также частично относится к способу профилактического лечения субъекта, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, профилактически эффективного количества нокаутных мутантов вируса нодулярного дерматита или композиций согласно данному изобретению.

Следующие примеры предлагаются в качестве иллюстрации, но не в качестве ограничения.

ПРИМЕР 1

Конструирование универсального клонирующего вектора

Был сконструирован универсальный клонирующий вектор pUL (фиг. 1). Вкратце, в качестве основы для конструирования универсального клонирующего вектора использовали вектор pMOS. Вектор pHGS7-E подвергали расщеплению рестриктазами MluI и XmnI для получения позднего промотора вируса осповакцины (VV) Р11 вместе с геном усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP). Ген EGFP находится под контролем промотора VV Р11. Этот фрагмент вставляли по сайту XhoI в вектор pARO-gpt. Полученную плазмиду назвали pAgE. Плазмиды pHGS7-E и pARO-gpt были получены от D. Wallace. Все рестрикционные ферменты были приобретены у Fermentas.

Плазмиду pAgE подвергали расщеплению рестриктазой BamHI для удаления промотора VV Р11 и EGFP вместе с ранним/поздним промотором Р7.5, который контролирует ген ксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (gpt). Затем этот фрагмент вставляли по сайту BamHI в плазмиду pMOSBlue. Полученную плазмиду назвали pMgE.

Полевой изолят LSDV Warmbaths (GenBank № AF409137.1) использовали в качестве матрицы в ПЦР для амплификации левой фланкирующей последовательности ORF005 с помощью праймеров 005-KOL-F (прямой) (5'-AATAACCCTGCAGGCTTAAGTCATGAATGGAAAACAAACACAAAAATAATAC-3' (SEQ ID NO 1) и 005-KOL-R (обратный) (5'-TAAACTGCAGACGCGTTGATCACTTAAGCAATGTAAAAAATCACACGATATG-3') (SEQ ID NO 2). Последовательности распознавания рестрикционного фермента также были включены в последовательности праймеров для облегчения последующей вставки в pMgE (в 005-KOL-F были добавлены последовательности распознавания рестрикционных ферментов SdaI, BspTI и BspHI, в 005-KOL-R были добавлены последовательности распознавания рестрикционных ферментов MluI, BclI и BspTI).

Фрагмент ПЦР (названный 005KOL) вставляли перед генами EGFP и gpt по сайтам рестриктаз Sse8387I и PstI в плазмиду pMgE, и создавали и отбирали плазмиду pMgE-005-L. Плазмиду pARO-VP7 (полученную от D Wallace), содержащую промотор VV Р7.5 и ген VP7 вируса африканской болезни лошадей (african horse sickness virus, AHSV), расщепляли рестриктазами NdeI и EcoRI для удаления промотора Р7.5 и фрагмента гена VP7, которые затем вставляли после генов EGFP и gpt по сайту NotI в плазмиду pMgE-005-L, получая плазмиду pMgE-005L-VP7. Ген AHSV VP7 удаляли путем расщепления плазмиды рестриктазой BamHI, оставляя впереди промотор VV Р7.5. Фрагмент 005KOL удаляли путем расщепления рестриктазой BspHI, получая окончательный универсальный клонирующий вектор, pUL (фиг. 1). Этот вектор использовали для конструирования инсерционного вектора, pTW005

Конструирование инсерционного вектора (pTW005)

Левый и правый фланкирующие фрагменты ORF005 амплифицировали с использованием изолята LSDV WB в качестве матрицы (фиг. 2). ПЦР проводили с использованием ДНК-полимеразы TaKaRa Ex Taq™ (Takara, Япония) в соответствии с рекомендациями производителя. Пару праймеров LF005FWD (5'-ATACATCTTAAGCAGTTTTAATCGCTCTAAAATTC-3') (SEQ ID NO 3) и LF005REV (5'-TAGTAGACGCGTGTAATCAAAGCTAACGTCGTCAC-3') (SEQ ID NO 4) использовали для амплификации левой фланкирующей последовательности ORF005, а именно 005L. Пара праймеров LF005FWD и LF005REV имеет на своих 5'-концах сайты распознавания рестрикционных ферментов BspTI и MluI, соответственно.

Пару праймеров RT005FWD (5'-TCCTCCCCCGGGGAAAAGTACATAGTTAAAAAGTAATC-3') (SEQ ID NO 5) и RT005REV (5'-ATCGAGCTCTATCGTTTGTAAGAAATTATAACG-3') (SEQ ID NO 6) использовали для амплификации правой фланкирующей последовательности ORF005, а именно 005R. Пара праймеров RT005FWD и RT005REV имеет на своих 5'-концах сайты распознавания рестрикционных ферментов SmaI/AvaI и SacI, соответственно.

ПЦР проводили с начальным этапом денатурации при 98°С в течение 5 минут, последующим 35 циклами при 98°С в течение 1 минуты, 58°С в течение 30 секунд, 72°С в течение 1 минуты, и финальным этапом элонгации при 72°С в течение 10 минут. Затем образцы подвергали электрофорезу в агарозном геле с использованием 1,2% агарозного геля для подтверждения. Остальные продукты амплификации фрагменты гена 005L и 005R подвергали электрофорезу с использованием 0,8% агарозного геля и фрагменты извлекали с использованием стерильного лезвия скальпеля и очищали с использованием набора Qiagen® gel extraction purification kit (Qiagen®, Германия).

Затем очищенные фрагменты вставляли в вектор pGEMT-Easy (Promega, США) в соответствии с инструкциями производителя, получая плазмиды pGTE-005L и pGTE-005R. Плазмиду pGTE-005L подвергали расщеплению рестриктазами BspTI и MluI и вставляли перед генами EGFP и gpt, тогда как pGTE-005R подвергали расщеплению рестриктазами AvaI и SacI и вставляли после генов EGFP и gpt, получая pTW005 (фиг. 2). Окончательный инсерционный вектор pTW005 (фиг. 2) использовали в создании рекомбинантной конструкции LSDV с нокаутом IL-10 (ORF005) с использованием подхода МРА-селекции, в котором трансфекцию выполняли с использованием трансфекционного реагента jetPEI® (Polyplus transfection, Франция).

Получение первичных клеток FBT/FCE

Ткани фетальных бычьих семенников (foetal bovine testes, FBT) и фетального уха теленка (foetal calf ear, FCE) получали со скотобойни Strydfontein вблизи Претория-Норт, Южная Африка. Семенники надрезали, чтобы удалить капсулы, кровеносные сосуды и жир. Затем мягкие ткани семенников удаляли и разрезали на более мелкие куски (кубики размером 0,5 см×0,5 см). Ткань FCE (полученную от плодов менее 30 см в длину) также разрезали на мелкие кусочки, как указано выше. Затем ткань FBT и ткань FCE промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором (phosphate buffered saline, PBS), содержащим 1X раствор антибиотиков (пенициллин, стрептомицин и амфотерицин В) (Lonza, США), чтобы вымыть избыток крови. Измельченные ткани инкубировали по отдельности с 1% раствором диспазы (Roche®) при комнатной температуре в течение 30 минут. К оставшейся ткани добавляли свежий 1% раствор диспазы и процесс повторяли. Затем трипсинизированную смесь объединяли и добавляли 8% раствор фетальной телячьей сыворотки (foetal calf serum, FCS) (Gibco/Lonza). Затем смесь центрифугировали со скоростью 1000 об/мин в течение 10 минут для осаждения клеток. Супернатант декантировали и затем осадок клеток ресуспендировали в среде для замораживания, содержащей питательную среду (комбинация 1:1 среды Игла в модификации Дульбекко и среды Хэма F-12 с Glutamax-I (DMEM/F12) (Gibco, США)), 8% FCS, 1Х антибиотиками (пенициллин, стрептомицин и амфотерицин В) (Lonza, США) и 5% DMSO (Sigma, США) и замораживали в течение ночи при -70°С с последующим хранением в жидком азоте (liquid nitrogen, LN₂).

Замороженные клетки извлекали из жидкого азота, согревали вручную и ресуспендировали в предварительно нагретой (37°С) DMEM/F12 с 10% FCS и 1Х антибиотиками. Смесь центрифугировали со скоростью 1000 об/мин в течение 10 минут для осаждения клеток. Супернатант декантировали и добавляли свежую среду. Затем ресуспендированные клетки высевали в колбы для культивирования клеток объемом 25 см² и инкубировали при 37°С с 5% CO₂ до тех пор, пока они не вырастали до конфлюэнтности. Клетки контролировали на наличие загрязнений перед их дальнейшим использованием.

Полевой изолят вирулентного LSDV Warmbaths (LSDV WB) (GenBank № AF409137.1) из региона Вармбатс (Бела-Бела) в Южной Африке в провинции Лимпопо использовали в качестве исходного вируса в конструировании рекомбинантного вируса и также использовали в качестве тестового вируса в испытаниях на крупном рогатом скоте. Клетки FBT и FCE использовали для конструирования и селекции рекомбинантов и выращивали в культуральной среде DMEM/F12, содержащей 8% FCS с 1Х антибиотиками.

В испытаниях на крупном рогатом скоте в качестве положительного контрольного вируса использовали вакцину против нодулярного дерматита от Onderstepoort Biological Products (ОВР) (штамм LSDV Neethling, GenBank № AF409138.1). Эта вакцина была разработана более 50 лет назад из вирулентного полевого изолята путем 61 последовательного пассажа в монослоях клеток почки ягненка с последующими 20 пассажами в хориоаллантоисных мембранах (chorioallantoic membrane, САМ) эмбриональных куриных яиц и еще тремя пассажами в монослоях клеток почек ягненка, десятью в клетках Мадин-Дарби бычьих почек (Madine-Darby bovine kidney, MDBK) и, наконец, пятью в клетках эмбриональных бычьих семенников (FBT) (van Rooyen et al., 1969).

Исходный вирус, используемый для создания рекомбинантного вируса, а затем и чистой рекомбинантной вакцинной конструкции, титровали на безмикоплазменных клетках MDBK (полученных D. Wallace). Клетки MDBK высевали в 12-луночный планшет для культивирования клеток и инкубировали в течение примерно шести часов при 37°С с 5% CO₂. 100 мкл вирусного стока для титрования обрабатывали ультразвуком в течение 3 минут в ультразвуковом аппарате (Sonorex® TK52, Банделин, Германия) и добавляли к 900 мкл клеточной культуральной среды с 1Х антибиотиками, но без фетальной бычьей сыворотки. Среду в лунках заменяли средой RPMI 1640 (Gibco, США), содержащей 2% FCS и 1Х антибиотики. Затем проводили десятикратное серийное разведение вирусного стока и вносили в лунки по 100 мкл на каждое разведение в четырех повторах. Клетки контролировали на наличие индуцированных вирусом цитопатогенных эффектов (cytopathogenic effect, CPE) через 3-4 дня. Затем титр вирусного стока (N) оценивали количественно путем подсчета бляшек в лунках при максимальном разведении, в котором наблюдались бляшки, и используя следующую формулу:

d - коэффициент разведения

V - объем разведенного вируса, вносимый в лунки (мл)

БОЕ/мл - бляшкообразующие единицы на миллилитр

Создание и селекция рекомбинантного вируса (rLSDV WB005KO)

Первичные клетки FBT высевали в 12-луночные планшеты для культивирования клеток (Nunclon) с плотностью 1×10⁵ клеток на лунку в 1 мл среды для культивирования клеток. Как только они достигали 80% конфлюэнтности, их инфицировали вирусом LSDV WB (GenBank № AF409137.1) с множественностью инфицирования (multiplicity of infection, MOI) в значении 0,1. Трансфекционные комплексы получали с использованием реагента для трансфекции jetPEI® (Polyplus transfection) в соответствии с инструкциями производителя. 1 мкг высокочистой ДНК инсерционного вектора pTW005 (очищенного с использованием набора Qiagen® Midiprep kit) разводили в 150 мМ NaCl (до конечного объема 50 мкл) и 2 мкл реагента jetPEI® в 150 мМ NaCl (до конечного объема 50 мкл на лунку). Растворы jetPEI® и ДНК смешивали, перемешивали на вортексе и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Через один час после инфицирования 100 мкл смеси ДНК и JetPEI® по каплям добавляли к клеткам в 1 мл на лунку содержащей сыворотку среды. Планшеты осторожно покручивали, а затем возвращали в инкубатор (37°С, 5% CO₂) на ночь. Трансфекционную смесь удаляли и заменяли средой DMEM/F12 с антибиотиками и 8% FCS, и клетки инкубировали еще в течение 4 дней или до тех пор, пока не наблюдали полный СРЕ и легко визуализировали его с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа при исследовании в УФ-свете (клетки, содержащие рекомбинантный вирус, продуцировали видимый зеленый свет из-за экспрессии белка маркера селекции EGFP).

Затем клетки замораживали и размораживали три раза и раствор осветляли центрифугированием. Затем делали 10-кратное серийное разведение супернатанта и аликвоту каждого разведения помещали на свежие клетки FBT, предварительно инкубированные в течение 24 часов в присутствии среды для отбора по МХН (10 мкг/мл микофенольной кислоты, 250 мкг/мл ксантина, 15 мкг/мл гипоксантина, DMEM/F12, 2,5% FCS и 1Х антибиотики). Клетки инкубировали в стандартных условиях (37°С, 5% CO₂) с заменой селекционной среды каждые 72 ч до тех пор, пока СРЕ не становилась видимой (обычно через 4-5 дней после инокуляции). Этапы замораживания и размораживания, серийные разведения и инкубацию в стандартных условиях повторяли еще раз.

Через 4-5 дней после того, как появлялся демонстрирующий СРЕ флуоресцирующий вирус, селекционную среду удаляли с клеток, а мертвые клетки осаждали на низкой скорости (200 g, 5 мин) в настольной центрифуге. Надосадочную жидкость (супернатант) подвергали ультразвуковой обработке при 35 кГц в течение 15 минут в ультразвуковом аппарате с водяной баней (Sonorex® TK52, Банделин, Германия), а затем фильтровали через ацетатный фильтр с размером пор 0,45 мкм (Millipore, США). Фильтрат разводили до конечной точки с использованием 10-кратного серийного разведения и помещали на свежие клетки FBT в селективных условиях (как описано выше). Надосадочную жидкость из лунки, демонстрирующую очаги при самом высоком разведении, снова удаляли, отделяли от мертвых клеток, обрабатывали ультразвуком, фильтровали и титровали. Для третьего цикла клетки в лунке, демонстрирующие отдельные флуоресцирующие очаги при самом высоком разведении, промывали в стерильном PBS, и отдельные флуоресцирующие очаги собирали с использованием стерильного 20 мкл наконечника с фильтром. Затем их замораживали и размораживали, как было описано, и половину материала, собранного из каждого очага, инокулировали на свежие клетки в селективных условиях в 6-луночных или 12-луночных культуральных планшетах (Nunclon), а вторую половину хранили при -20°С.

ПЦР использовали на каждом этапе процесса селекции, чтобы определить, приближается ли сток рекомбинантного вируса к гомогенному, свободному от вируса дикого типа/исходного вируса.

ПЦР-скрининг на гомогенность

Использовали два праймера: LF005FWD (5'-ATACATCTTAAGCAGTTTTAATCGCTCTAAAATTC-3') (SEQ ID NO 3), который специфически связывается с последовательностями, расположенными непосредственно перед предполагаемым геном IL-10-подобного белка, и RT005REV (5'-ATCGAGCTCTATCGTTTGTAAGAAATTATAACG-3') (SEQ ID NO 6), который связывается с последовательностями ниже предполагаемого гена интерлейкин-10-подобного белка.

Конфлюэнтный монослой клеток FBT в 6-луночном планшете для культивирования клеток инфицировали очагами rLSDV WB005KO, извлекаемыми из хранилища при -20°С и размороженными при комнатной температуре, при низкой MOI. Затем планшет инкубировали при 37°С в 5% CO₂ в течение 48 часов. Зараженную вирусом область и очаги соскабливали наконечником для микропипетки, аспирируя 10 мкл среды и клеток. Их помещали в новую микроцентрифужную пробирку и добавляли 10 мкл раствора детергента (2Х ПЦР-буфер с 0,9% NP40 и 0,9% Tween-20® или 2Х ПЦР-буфер с 2% Triton Х-100) и 1,2 мкл протеиназы K (5 мг/мл). Пробирку инкубировали в течение 30-60 минут при 37°С или 30 минут при 45°С. Затем протеиназу К подвергали инактивации нагреванием в течение 10 минут при 94°С и затем центрифугировали с высокой скоростью (14000 g) в течение 10 секунд для удаления клеточного дебриса. Затем использовали 10 мкл супернатанта в ПЦР-реакции объемом 100 мкл.

ПЦР проводили на супернатанте с использованием ДНК-полимеразы TaKaRa Ex Taq™ (Takara, Япония) в соответствии с рекомендациями производителя. ПЦР проводили с начальным этапом денатурации при 98°С в течение 5 минут, последующими 35 циклами при 98°С в течение 1 минуты, 58°С в течение 30 секунд, 72°С в течение 5 минут, и финальным этапом элонгации 72°С в течение 10 минут. Затем образцы подвергали электрофорезу в агарозном геле с использованием 1,2% агарозного геля.

После получения очагов, которые продемонстрировали отсутствие вируса дикого типа, селекционное давление снимали и вирус rLSDV WB005KO пассировали на клетках FBT в DMEM/F12 с 8% FCS и антибиотиками. Клетки пассировали несколько раз и проверяли на СРЕ. ПЦР проводили еще раз, чтобы подтвердить отсутствие вируса дикого типа.

Рекомбинация и скрининг рекомбинантного вируса rLSDV WB005KO для удаления маркерного гена устойчивости к антибиотику gpt

Удаление селекционного давления имело вторичную цель, которая заключалась в проведении второго раунда гомологичной рекомбинации для удаления гена gpt. Процесс повторяли, как описано выше. ПЦР использовали на каждом этапе процесса для определения того, был ли ген gpt удален из рекомбинантного вируса. Два праймера: Eco-gpt-F (5'-CAGGCTGGGACACTTCAC-3') (SEQ ID NO 7) и Eco-gpt-R (5'-GATTAGCGACCGGAGATTG-3') (SEQ ID NO 8), которые связываются с 5'- и 3'-областями gpt-гена, соответственно, использовали для подтверждения удаления гена селективного маркера gpt.

Вкратце, конфлюэнтный монослой клеток FBT в 6-луночном планшете для культивирования тканей инфицировали rLSDV WB005KO при низкой MOI. Планшет инкубировали при 37°С, 5% CO₂, в течение 48 ч. Инфицированные вирусом клетки соскребали с помощью стерильного наконечника для микропипетки и извлекали в 10 мкл среды, используя мягкую аспирацию. Вирусно-клеточную смесь помещали в микроцентрифужную пробирку и добавляли 10 мкл раствора детергента (2Х ПЦР-буфер, содержащий 0,9% NP40 и 0,9% Tween-20®) и 1,2 мкл протеиназы K (5 мг/мл). Пробирку инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Затем протеиназу K (Fermentas) подвергали инактивации нагреванием в течение 10 минут при 94°С и затем центрифугировали с высокой скоростью 14000 g в течение 10 секунд для удаления клеточного дебриса.

ПЦР проводили на 10 мкл полученного супернатанта с использованием ДНК-полимеразы TaKaRa Ex Taq™ (Takara, Япония) в соответствии с рекомендациями производителя в реакции объемом 100 мкл. ПЦР проводили с начальным этапом денатурации при 98°С в течение 5 минут, последующими 35 циклами при 98°С в течение 1 минуты, 58°С в течение 30 секунд, 72°С в течение 5 минут, и финальным этапом элонгации 72°С в течение 10 минут. Затем образцы подвергали электрофорезу в агарозном геле с использованием 1,2% агарозного геля для анализа.

Окончательную гомогенную конструкцию LSDV WB005 KO, содержащую маркерный ген EGFP без гена gpt, выращивали до высоких титров в клетках FBT и использовали для оценки ее потенциала в качестве вакцины для защиты крупного рогатого скота от заражения LSD, коз от заражения оспой коз и овец от заражения оспой овец.

ПРИМЕР 2

Вакцинация и экспериментальное заражение крупного рогатого скота

Данный пример был нацелен на оценку рекомбинантной конструкции LSDV (предполагаемо) с нокаутным геном IL-10-подобного белка (LSDV WB005KO) для использования в качестве вакцины для защиты крупного рогатого скота от заражения LSD. В качестве вируса положительного контроля использовали вакцинный штамм ОВР LSDV Neethling, который производится ОВР (GenBank № AF409138.1) и поэтому упоминается как "LSDV ОВР Vac". Тестовый вирус представлял собой вирулентный полевой изолят LSDV Warmbaths (LSDV WB) (GenBank № AF409137.1).

Прививка телят вирусами LSDV ОВР Vac и LSDV WB005KO

В общей сложности тридцать 6-месячных телят голштинской породы предварительно подвергали скринингу на наличие антител к LSDV путем реакции сывороточной нейтрализации. Все проанализированные животные продемонстрировали отрицательный результат. Двадцать телят были отобраны, куплены, доставлены и содержались в помещении, свободном от насекомых. В течение первой недели после прибытия от телят получали образцы сыворотки и повторно тестировали их на наличие антител к LSDV. Телятам давали возможность акклиматизироваться в течение трех недель и ежедневно измеряли ректальные температуры.

Пятнадцать телят разделяли на три группы по пять особей и вакцинировали подкожно (subcutaneously, SC) в области шеи, как указано в таблице 1.

* - группа 1: отрицательный контроль

** - БОЕ - бляшкообразующие единицы

Ректальные температуры измеряли ежедневно после вакцинации и телят наблюдали на наличие клинических признаков заболеваний в соответствии с листом оценки (реакция в месте инокуляции, потеря аппетита, поражения, жар, боль, отеки и лимфаденопатия). После вакцинации оценивали как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ, а также виремию.

Ответы, вызванные конструкцией LSDV WB005KO после вакцинации

В таблице 2 указаны параметры, которые подвергали измерению, и результаты, полученные после вакцинации. Вкратце, у трех телят, вакцинированных LSDV WB005KO, развилась лихорадка по сравнению с группами отрицательного контроля и вакцины ОВР. В двух контрольных группах не отмечалось никаких клинических симптомов. В группе, вакцинированной LSDV WB005KO, были отмечены поствакцинальные реакции, которые, по-видимому, были специфичны для LSDV (фиг. 3). В этой группе также наблюдались ответы в виде обнаруживаемых антител к 10-му дню после вакцинации по сравнению с двумя контрольными группами, которые не обнаруживали ответы в виде обнаруживаемых антител (фиг. 4). Защита от инфекции LSDV считается в основном опосредованной клетками, поэтому важно, что животные в этой группе показали лучший клеточный иммунный ответ по сравнению с группами вакцинирования ОВР и отрицательного контроля после вакцинации (фиг. 5).

Ответы, вызванные конструкцией LSDV WB005KO после заражения вирулентным изолятом LSDV WB

Спустя двадцать восемь дней после вакцинации телятам вводили внутрикожно (intradermally, ID) вирулентный полевой изолят LSDV Warmbaths (GenBank № AF409137.1) путем введения 500 мкл (5×10⁶ БОЕ) в обе стороны шеи.

В таблице 3 указаны измеренные параметры и результаты, полученные после заражения. Один из телят в группе LSDV WB005KO (№3135) умер на 18-й день из-за обстоятельств, не связанных с испытанием. Ректальные температуры телят также измеряли ежедневно после заражения, и телят ежедневно контролировали на наличие клинических признаков заболевания согласно листу оценки. Гуморальный и клеточно-опосредованный иммунитет, а также виремию оценивали после заражения. Было отмечено, что у животных в контрольных группах развивалась лихорадка, в то время как группа LSDV WB005KO не демонстрировала лихорадочной реакции. У животных в двух контрольных группах развивались коркоподобные поражения в местах инокуляции (фиг. 6), в то время как в группе LSDV WB005KO не наблюдалось никаких повреждений. Нейтрализующие антитела были обнаружены у всех животных после заражения с чрезвычайно высокими титрами, зарегистрированными в сыворотках у двух животных в группе KO (фиг. 7). Измеренный клеточный ответ был выше в группах отрицательного контроля и ОВР-вакцинации на 7-й день после заражения (фиг. 9).

Гуморальный иммунитет - Реакция сывороточной нейтрализации

Реакцию сывороточной нейтрализации проводили в соответствии с Beard et al., 2010. Все процедуры проводили в стерильных условиях. Вкратце, разведение анализируемой сыворотки 1:5 проводили в буфере PBS⁺ и инактивировали в водяной бане в течение 30 минут при 56°С. Из разведения анализируемой сыворотки 1:5 в 96-луночных микротитровальных планшетах готовили серию из шести двукратных разведений в минимальной основной среде для культивирования (Minimum Essential Media, MEM) (Gibco, Великобритания), содержащей 5% FCS, в объемах 100 мкл. Стоковый раствор вируса (LSDV WB005KO) разводили в культуральной среде MEM, содержащей 5% фетальной телячьей сыворотки FCS, получая концентрацию 100 TCID₅₀/мл. Затем из этого стока вирусного антигена производили серию четырех десятикратных разведений, которые использовали в качестве вирусного контроля. 50 мкл добавляли во все лунки, содержащие разведенную анализируемую сыворотку. Готовили вирусный контроль, охватывающий три ряда и шесть столбцов, следующим образом:

a. Во все лунки вносили 100 мкл MEM, содержащей 5% FCS.

b. В первые два столбца добавляли 100 мкл TCID₅₀/мл вирусного стока.

c. В остальные четыре столбца добавляли 100 мкл аликвот вирусных разведений, начиная с самого высокого разведения в столбце 3.

Планшеты инкубировали в течение одного часа при 37°С (плюс/минус 2°С) во влажной атмосфере, содержащей 5% CO₂. В течение этого периода клетки FBT (неинфицированные) трипсинизировали, собирали и подсчитывали. Затем клетки разводили до 4,8×10⁵ клеток/мл и в каждую лунку титровального планшета вносили по 80 мкл по меньшей мере в 2 ряда, которые служили в качестве клеточного контроля, получая таким образом только клетки и 200 мкл MEM с 5% FCS.

Затем планшеты инкубировали, как указано выше, до тех пор, пока клетки в лунках, содержащих стоковый вирус с обратным титрованием, не продемонстрировали 50% СРЕ при разведении 10^-2. Наличие нейтрализующих антител в анализируемых сыворотках ингибирует продукцию СРЕ. Таким образом, титр антител в конечной точке рассчитывали как разведение, при котором 50% клеток демонстрировали СРЕ.

Клеточный иммунитет - анализ пролиферации лимфоцитов

Анализы пролиферации лимфоцитов проводили в трех повторах в 96-луночных планшетах, как описано в Van Kleef et al., 2000. Вкратце, РВМС (2×10⁵ РВМС/лунка), извлеченные из крови от испытываемого крупного рогатого скота, стимулировали различными антигенами в трех повторах в общем объеме 100 мкл в полной среде RPMI 1640 (Gibco, Великобритания). Антигены, используемые для стимуляции, представляли собой вирус LSDV WD (который добавляли в количестве 1×10⁵ БОЕ/лунка), отрицательный антиген (нестимулированные РВМС) и конкавалин А (ConA) (5,0 мкг/мл, Sigma). Клетки инкубировали при 37°С в увлажненной атмосфере с 5% CO₂ в течение 3-5 дней. Затем клетки метили 1 мкКи/лунка [³Н]-тимидина и инкубировали в течение дополнительных 18 ч, как указано выше. Клетки собирали и измеряли радиоактивность с помощью сцинтилляционного счетчика Trilux® 1450 Microbeta® (Wallac). Результаты выражали как значения индекса стимуляции (stimulation index, SI), который определяется как среднее число отсчетов в минуту для анализируемого антигена, деленное на среднее число отсчетов в минуту (counts per minute, cpm) для нестимулированных РВМС. Ответ считали положительным, если результат был в два раза выше, чем SI отрицательного контроля, со значимым р-значением (р-значение меньшее или равное 0,01, определенное с помощью t-критерия Стьюдента).

Вывод

Конструкция LSDV с нокаутным геном IL-10-подобного белка индуцировала ответы в виде обнаруживаемых антител через 10 дней после вакцинации по сравнению с отсутствием их в контрольных группах, а также вызывала лучший клеточный ответ по сравнению с вакциной LSDV OP сегодняшнего дня. У животных в группе, получавшей LSDV с нокаутным геном IL-10-подобного белка, также наблюдалось повышение температуры тела после вакцинации и ответ в первичном месте инокуляции. Ответ в первичном месте инокуляции может быть результатом высокого титра вируса, который был введен. После заражения только у некоторых животных в контрольных группах развивалась лихорадка, в то время как у всех развивалось коркоподобное поражение в месте инокуляции по сравнению с группой, получавшей LSDV с нокаутным геном IL-10-подобного белка, в которой ни одно животное его не продемонстрировало. Все животные в контрольных группах продемонстрировали ответы в виде обнаруживаемых антител к 16-му дню после заражения.

Напротив, хорошие гуморальные и клеточные иммунные ответы измерялись у большинства животных, инокулированных конструкцией LSDV WB005 KO в высокой дозе. Кроме того, у большинства животных не развивались тяжелые клинические признаки после вакцинации и заражения. Это говорит о том, что у конструкции есть хороший потенциал в качестве новой вакцины против LSD, ожидающей дальнейших испытаний на безопасность и эффективность.

ПРИМЕР 3

Вакцинация и экспериментальное заражение овец и коз

Двенадцать коз бурской породы и двенадцать овец породы Ридо-Аркотт (все в возрасте 6 месяцев) были получены из местных ферм и размещены в отдельных клетках для животных 3-го уровня биобезопасности согласно Национальном центру иностранных заболеваний животных (Виннипег, Канада). Овец случайным образом делили на две группы по шесть особей для использования в качестве вакцинированных и невакцинированных контролей, как и коз. Все животные получали полноценную сбалансированную диету и воду без ограничения. Эксперименты на животных проводили с одобрения Канадского научного центра по охране здоровья человека и животных, который следует руководящим принципам Канадского совета по уходу за животными. Перед вакцинации овец и коз подвергали скринингу и признавали отрицательными в отношении каприпоксвируса с помощью ПЦР в режиме реального времени и серологического анализа.

Рекомбинантную вирусную конструкцию LSDV WB005KO разводили в DMEM до концентрации 3×10³ TCID₅₀/мл. Шесть овец и шесть коз вакцинировали 0,1 мл, введенными внутрикожно. После вакцинации собирали кровь, сыворотки, мазки из полости рта и носа на 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 21 день после инокуляции (days post inoculation, dpi). Невакцинированным контрольным овцам и козам вводили только DMEM. После наблюдения за животными в течение 21 дня вакцинированную и невакцинированную группу размещали вместе и заражали с использованием вирулентных штаммов каприпоксвируса. Заражение вирусом выполняли как у вакцинированных, так и у невакцинированных животных. Овец заражали с использованием 0,1 мл интрадермального введения нигерийского изолята вируса оспы овец (10⁵ TCID₅₀/мл) (Bowden et al., 2008) и коз с использованием 0,1 мл внутрикожного введения йеменского штамма вируса оспы коз (10⁵ TCID₅₀/мл) (Babiuk et al., 2009). Всех животных наблюдали ежедневно и регистрировали клинические признаки на протяжении всего исследования. Ректальные температуры измеряли ежедневно до 21 dpi. Кровь и сыворотку собирали у овец и коз на 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 21 dpi.

Обнаружение антител к Capripoxvirus путем ELISA

Антитела, полученные путем вакцинации или вирусного заражения, количественно оценивали с использованием протокола ELISA и двух рекомбинантных ядерных белков каприпоксвириона (ORF 095 и ORF 103), экспрессированных в Е. coli, как описано ранее (Bowden et al., 2009). Вкратце, 96-луночные планшеты для ELISA (Nunc, США) покрывали комбинацией бактериально экспрессированных рекомбинантных белков каприпоксвируса, ORF 095 и ORF 103, с 30 нг каждого белка, разведенного в 100 мкл карбонатного буфера (рН 9,6), и инкубировали в течение ночи при 4°С. Затем планшеты инкубировали с блокирующим раствором (5% обезжиренного молока в PBS/0,05% Tween®) в течение 1 часа при 37°С. Затем добавляли серийно разведенные сыворотки овец и коз (начиная с разведения 1:100), инкубировали в течение 1 часа при 37°С, промывали 3 раза и дополнительно инкубировали в течение 1 часа при 37°С с разведением 1:32000 конъюгированного с пероксидазой белка G (Sigma, А). Затем планшеты промывали 3 раза с использованием фосфатазного субстрата Blu Phos™ (KPL, США) и измеряли абсорбцию при длине волны 650 нм. Титры в конечной точке определяли с использованием средней оптической плотности плюс два стандартных отклонения от отрицательных сывороток овец в качестве значения отсечки.

Реакция нейтрализации вируса (virus neutralisation test, VNT)

Антитела, нейтрализующие вирус, которые были получены или путем вакцинации, и/или путем вирусного заражения, оценивали количественно с использованием VNT. Оценивали серийные разведения (от 1:10 до 1:10240) сывороток овец и коз в различные моменты времени после вакцинации и заражения. Кенийский вакцинный штамм вируса оспы овец и коз (KS-1) (100 TCID₅₀ в DMEM) смешивали с сывороткой овец и коз (в двух экземплярах) в объеме 200 мкл и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Клетки Vero, инкубированные в 96-луночных планшетах, инфицировали с помощью 200 мкл смеси вируса и сыворотки (или среды в качестве отрицательного контроля). Затем клетки инкубировали в течение 6-7 дней с ежедневным анализом на СРЕ. Титр, нейтрализующий вирус, определяли как самое высокое разведение, которое демонстрирует снижение СРЕ при сравнении с ранее охарактеризованным отрицательным контролем.

Пир на наличие каприпоксвируса в режиме реального времени

Чтобы количественно оценить наличие вирусной ДНК в крови, мазки из полости рта и носа анализировали у овец и коз после вакцинации и в крови после вирусного заражения. Количественный анализ PCR Taqman® в режиме реального времени проводили с использованием ранее описанного протокола (Bowden et al., 2008). Этот анализ обнаруживает область длиной 89 п.о. ORF 074 каприпоксвируса. Кровь и мазки собирали в 0, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 21 сутки после вакцинации. Кровь собирали через 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 21 сутки после заражения.

Обнаружение овечьего и козлиного интерферона-гамма (ИФ-γ) на основе ELISA

Кровь собирали у овец и коз в течение 21 дня после вакцинации в вакуумные пробирки (Becton Dickinson, США). Очищенные лейкоциты анализировали на их способность секретировать ИФ-γ в присутствии антигена каприпоксвируса с использованием ранее описанного способа (Caro et al., 1998) с модификациями. Сток каприпоксвируса KS-1 (1×10⁵ TCID₅₀) подвергали инактивации нагреванием, и разведение вируса 1/100 инкубировали с 2×10⁵ лейкоцитов анализируемого образца в 96-луночном планшете в течение 48 часов в общем объеме 200 мкл. Затем супернатанты собирали и количественно оценивали с использованием набора для количественной оценки ИФ-γ крупного рогатого скота (AbD Serotec, США), который можно было использовать для измерения ИФ-γ овец и коз на основе способности выбранных бычьих моноклональных антител перекрестно реагировать как с овечьим, так и с козлиным ИФ-γ. Секретируемые уровни ИФ-γ измеряли с использованием количественного ELISA, как описано выше (Tourais-Esteves et al., 2008). Общие концентрации ИФ-γ определяли путем нормализации со стандартом, предоставленным производителем.

Статистика

Статистический анализ проводили с использованием t-теста в Excel (Microsoft, США) для определения различий между овцами и козами на предмет нагрузки вирусной ДНК, серологии и секреции ИФ-γ.

Безопасность LSDV WB 005 KO у овец и коз

Овец и коз размещали в учреждениях по уходу за животными высокого уровня биологической защиты, вакцинированные и контрольные группы в отдельных боксах, позволяя им акклиматизироваться к их окружению в течение как минимум двух недель до вакцинации. В течение этого времени их температуру тела регистрировали ежедневно и их контролировали на предмет общего состояния здоровья и благополучия. Все животные были здоровыми и свободными от заболеваний и имели базальную ректальную температуру в диапазоне от 38,5 до 40,1°C (козы) и от 39,0 до 39,8°С (овцы). После вакцинации появление реакций на месте инъекции варьировалось от невидимого до отдельного, приподнятого, покрасневшего узла диаметром примерно 1 см, который исчезал в течение 2 недель. Чтобы оценить репликацию конструкции LSDV WB 005 KO у вакцинированных животных, кровь, мазки из полости рта и носа оценивали с помощью ПЦР в режиме реального времени на присутствие ДНК каприпоксвируса. У вакцинированных овец или коз в их крови или в мазках из полости рта и носа не было обнаружено вирусной ДНК ни в какой момент после вакцинации, что указывает на то, что вакцина не реплицируется за пределами места введения.

Лихорадка и прогрессирование заболевания у овец и коз

Через двадцать дней после вакцинации как вакцинированных, так и невакцинированных животных размещали вместе и заражали вирулентными каприпоксвирусами. После заражения овец и коз наблюдали на наличие лихорадки. Повышенные ректальные температуры наблюдались у невакцинированных контрольных животных, начиная с 5-го дня после заражения (dpc) для овец (фиг. 9А) и 6-го dpc для коз (фиг. 9В). Повышенные температуры тела у этих животных наблюдали до полного выздоровления от клинического заболевания.

Клинические признаки каприпоксвирусной инфекции наблюдались у невакцинированных овец и коз, тогда как у всех шести вакцинированных овец (фиг. 10В) и у всех шести вакцинированных коз (фиг. 10С) клиническое заболевание не развивалось. У всех шести невакцинированных овец развивались многочисленные оспенные поражения кожи (фиг. 10F), наиболее просто наблюдаемые на коже в областях без шерсти, конъюнктивит (фиг. 10А) и слизисто-гнойные выделения из носа. Все невакцинированные козы также демонстрировали многочисленные оспенные поражения кожи (фиг. 10D), конъюнктивит, слизисто-гнойные выделения из носа (фиг. 10Е) и, кроме того, тяжелую летаргию.

Репликация патогенного каприпоксвируса у овец и коз

Для измерения вирусной репликации как у вакцинированных, так и у невакцинированных животных проводили количественную ПЦР с использованием цельной крови как от овец, так и от коз. У всех вакцинированных животных не было какой-либо измеримой степени виремии (фиг. 11). Напротив, невакцинированные животные выработали уровень ДНК каприпоксвируса, обнаруживаемый с использованием ПЦР в реальном времени, с уровнем вирусной ДНК, достигающим пика к 8-му dpc у овец и 12-му dpc у коз. К 21-му дню ни одно из животных, используемых в этом исследовании, не имело обнаруживаемого уровня виремии.

Серология после вакцинации и заражения

Сыворотки оценивали в нескольких временных точках у овец и коз после вакцинации и заражения каприпоксвирусом. Сыворотки со всех временных точек анализировали на наличие IgG-антител, специфичных для рекомбинантно экспрессированных ядерных белков каприпокс-вириона, с помощью ELISA. Нейтрализующие антитела также измеряли путем оценки ингибирования каприпоксвируса KS-1, инкубированного в присутствии образцов сыворотки, для инфицирования клеток ОА3.Т in vitro.

После вакцинации вакцинной конструкцией LSDV WB 005 KO у овец развивались низкие уровни специфических для каприпоксвируса IgG-антител, начиная с 4-го дня после вакцинации (dpv), что измеряли с использованием ELISA с рекомбинантным антигеном (фиг. 12). Напротив, у коз не развивались обнаруживаемые уровни специфических для каприпоксвируса IgG-антител после вакцинации. После заражения каприпоксвирусом титры у вакцинированных овец значительно не увеличивались, тогда как у невакцинированных овец развивались значительные уровни специфических для каприпоксвируса IgG-антител. У вакцинированных овец развивались статистически значимо более низкие титры (Р равно 0,017), чем у невакцинированных овец, после заражения каприпоксвирусом. У коз после заражения каприпоксвирусом, как у вакцинированных, так и у невакцинированных, развивались специфические к каприпоксвирусу IgG-антитела. У вакцинированных коз были значительно более низкие титры антител по сравнению с невакцинированными козами (Р равно 0,001).

После вакцинации у овец развивались значимо низкие уровни обнаруживаемых нейтрализующих каприпоксвирус антител, что измеряли с использованием VNT, тогда как у коз они не развивались до 21 dpv (фиг. 13). После заражения каприпоксвирусом как у вакцинированных, так и у невакцинированных овец и коз возникало значительное увеличение титров VNT. У невакцинированных контрольных овец и коз имели место более высокие титры VNT по сравнению с вакцинированными овцами (Р равно 0,053) и козами (Р равно 0,041).

Количественная оценка козлиного ИФ-γ после вакцинации LSDV WB005KO

РВМС собирали у всех коз (вакцинированных и невакцинированных) на 14-й и 21-й dpv и анализировали их на способность секретировать ИФ-γ в присутствии каприпоксвирусного антигена. РВМС инкубировали в присутствии инактивированного нагреванием штамма каприпоксвируса KS-1 в течение 2 дней, а затем оценивали на секрецию ИФ-γ. Средние уровни секретируемого ИФ-γ из РВМС вакцинированных коз были выше 800 пг/мл на 14-й dpv и 2400 пг/мл на 21-й dpv (фиг. 14). Никаких значительных уровней ИФ-γ не было обнаружено ни в невакцинированных контрольных РВМС, ни в РВМС, стимулированных без вируса, что указывает на то, что ответы, наблюдаемые в РВМС от вакцинированных коз, были специфическими для каприпоксвирусов ответами.

Вывод

Эффективность конструкции LSDV WB005KO в качестве вакцины оценивали как у овец, так и у коз, поскольку ранее было показано, что иммунитет против LSDV может обеспечить защиту от оспы овец и оспы коз (OIE, 2010; Capstick, 1961; OIE, 2009). Было обнаружено, что вакцинация обеих групп животных с помощью вакцинной конструкции не вызвала каких-либо клинических заболеваний, а кожные реакции в местах инъекций были минимальными.

Кроме того, было обнаружено, что сыворотки, собранные у вакцинированных овец и коз до заражения каприпоксвирусом, обладают значительными уровнями нейтрализующих антител против каприпоксвирусов, что указывает на индуцированную вакциной продукцию каприпоксвирус-специфического антитела. Интересно, что уровни как нейтрализующих, так и специфических антител к ядерным белкам каприпоксвируса увеличивались после заражения каприпоксвирусом овец и коз. Тем не менее, уровни каприпоксвирусных антител у вакцинированных овец и коз были ниже после заражения по сравнению с невакцинированными животными. Одна из возможных причин этого заключается в том, что вакцина индуцировала сильный клеточный иммунитет у вакцинированных животных, что приводило к уменьшению репликации вируса по сравнению с невакцинированными контролями. Это снижение репликации вируса, возможно, было причиной различий в количестве антигена, доступного для стимуляции В-клеток, что позволило невакцинированным контрольным животным образовывать более высокие уровни специфических для каприпоксвируса антител.

В дополнение к ответам в виде антител, вызванных вакциной LSDV WB005KO у овец и коз, известно, что клеточно-опосредованный иммунитет также вызван каприпоксвирусной инфекцией, поскольку убитые вакцины против каприпоксвируса неэффективны в борьбе с этим заболеванием. Клеточно-опосредованный иммунитет подтверждали анализом РВМС, выделенных от вакцинированных и невакцинированных коз, причем значительная продукция ИФ-γ наблюдалась через 14 и 21 день после вакцинации.

Эффективность конструкции LSDV WB005KO оценивали как у овец, так и у коз путем вирусного заражения с использованием вирулентных изолятов каприпоксвируса, которые, как было ранее продемонстрировано, вызывали клиническое заболевание как в полевых, так и в экспериментальных условиях. У вакцинированных овец и коз не было прогрессирования заболевания по сравнению с невакцинированными контролями, которые демонстрировали клиническое каприпоксвирусное заболевание, включая обнаружение вирусной ДНК в крови путем ПЦР в режиме реального времени, лихорадку, поражения кожи и выделения из носа. Наличие вирусной ДНК в крови у всех вакцинированных овец и коз было ниже предела обнаружения, что свидетельствует о том, что может быть достигнут стерильный иммунитет. Эти результаты демонстрируют эффективность вакцинной конструкции LSDV WB005KO, используемой в дозах, которые были бы практичными для массовой вакцинации в полевых условиях. Эффективность этой вакцины, а также ее конструирование позволяют широко ее применять после полевых испытаний и лицензирования либо: а) в ее текущей форме, либо; b) в качестве потенциального рекомбинантного вакцинного вектора, экспрессирующего антигены других патогенов.

Ссылки

Babiuk, S., et al. (2009) J. Gen. Virol. 90: 105-114.

Babiuk, S., et al (2008) Transbound Emerg. Dis. 55: 263-272.

Beard P.M., et al. (2010) Veterinary Microbiology 142: 427-431.

Bhanuprakash, V., et al. (2006) Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 29: 27-60.

Bowden, T.R., et al. (2009) J. Virol. Methods 161:19-29.

Bowden, T.R., et al. (2008) Virology 371, 380-393.

Capstick, P.B. (1961) Veterinary Department Annual Report. Government of Kenya., 45-47.

Caro, M.R., et al. (1998) Res. Vet. Sci. 65, 145-148.

Davies, F.G. and Mbugwa, G., (1985) J. Comp. Pathol. 95, 565-572.

Esposito and Knight. (1985) Virology. 143(1), 230-51.

Hunter and Wallace. (2001) Journal of the South African Vet Ass, 72(2), 68-71.

Kara, et al. (2003) Arch Virol. 148(7), 1335-56.

Kitching, R.P. (2003) Dev. Biol. (Basel) 114, 161-167.

OIE, 2010. Sheep And Goat Pox; OIE Terrestrial Manual, pp. 2.7.14.

OIE, 2009. Sheep and Goat Pox--World Animal Health/OIE bulletin.

Tourais-Esteves, I., et al. (2008) Dev. Comp. Immunol. 32, 1231-1241.

Van Kleef M., et al. (2000) Infection and Immunity. 68(2): 603-614.

Van Rooyen, P.J., et al. (1969) Onderstepoort J. of Vet. Res. 36: 165-174.

Weiss. (1968) Virology Monographs. 3, 112-282.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение относится к живому ослабленному рекомбинантному нокаутному мутанту вируса нодулярного дерматита, где ген интерлейкин-10-подобного белка или функциональная часть указанного гена инактивированы в вирусном геноме. Данное изобретение конкретно относится к рекомбинантному нокаутному мутанту вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота, к фармацевтическим композициям, содержащим этот нокаутный мутант, к способам получения этого нокаутного мутанта и к применению этого нокаутного мутанта. Изобретение позволяет повысить эффективность защиты животных от заболевания, вызванного вирусом из вирусного рода Capripoxvirinae. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 14 ил., 3 табл.

1. Нокаутный мутант вируса нодулярного дерматита (LSDV, от англ. lumpy skin disease virus) по гену интерлейкин-10-подобного белка для вызова защитного иммунного ответа у животного против заболевания, вызванного вирусом из вирусного рода Capripoxvirinae, где ген интерлейкин-10-подобного белка инактивирован путем делеции из вирусного генома.

2. Фармацевтическая композиция для вызова защитного иммунного ответа у животного против заболевания, вызванного вирусом из вирусного рода Capripoxvirinae, содержащая:

i. от 3 x 103 TCID50/мл до 1,4 x 107 TCID50/мл нокаутного мутанта LSDV по гену интерлейкин-10-подобного белка, в котором ген интерлейкин-10-подобного белка удален из вирусного генома; и

ii. фармацевтически приемлемый разбавитель или эксципиент.

3. Фармацевтическая композиция по п. 2, которая также включает адъювант.

4. Фармацевтическая композиция по п. 2, где заболевание выбрано из нодулярного дерматита, оспы овец и оспы коз.

5. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 2-4, где указанное животное является жвачным.

6. Фармацевтическая композиция по п. 5, где жвачное животное выбрано из группы, состоящей из крупного рогатого скота, овец, коз и диких копытных.

7. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 2-6, которая составлена для внутримышечного, внутрикожного, внутривенного или подкожного введения.

8 Фармацевтическая композиция по любому из пп. 2-7, которая составлена для введения животному в разовой дозе.

9. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 2-7, которая составлена для введения животному в двух или более дозах.

10. Инсерционный вектор для получения нокаутного мутанта вируса нодулярного дерматита (LSDV), где указанный инсерционный вектор включает последовательность SEQ ID NO 10.

11. Способ получения нокаутного мутанта LSDV по гену интерлейкин-10-подобного белка, в котором ген интерлейкин-10-подобного белка инактивирован в вирусном геноме, где данный способ включает этапы:

(i) инфицирования клетки-хозяина родительским штаммом LSDV,

(ii) трансфекции клетки-хозяина инсерционным вектором по п. 10, содержащим селективный маркер, и

(iii) селекции рекомбинантных нокаутных мутантов LSDV по гену

интерлейкин-10-подобного белка.

12. Нокаутный мутант LSDV по п. 1 для применения в профилактике заболевания, вызванного вирусом из вирусного рода Capripoxvirinae, у животного.

13. Нокаутный мутант LSDV по п. 12, где указанное заболевание выбрано из нодулярного дерматита, оспы овец и оспы коз.

14. Нокаутный мутант LSDV по п. 12, где указанное животное является жвачным.

15. Нокаутный мутант LSDV по п. 14, где жвачное животное выбрано из группы, состоящей из крупного рогатого скота, овец, коз и диких копытных.