Рекомбинантный штамм бактерии Escherichia coli - продуцент L-треонина Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 C12N1/21 C12P13/08 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается рекомбинантного штамма бактерии Escherichia coli - продуцента L-треонина.

L-треонин является незаменимой аминокислотой, которую широко используют в качестве фуражной, кормовой добавки и стимулятора роста животного, а также в качестве компонента в лекарственных водных растворах и дополнительного сырья в медицинских продуктах. В настоящее время в развитых странах L-треонин производят всего пять компаний.

Традиционно L-треонин в промышленном масштабе получают методом ферментации с использованием, как правило, селекционных или рекомбинантных штаммов.

Известные высокопродуктивные рекомбинантные штаммы Е. coli - продуценты L-треонина условно можно разделить на две группы: содержащие треониновый оперон с мутантным геном thrA в составе репликативной плазмиды или в составе хромосомы.

Ниже приведены данные для каждой из них при культивировании в ферментере.

К первой группе относятся, например, штамм Е. coli ВКПМ В-3996, содержащий плазмиду pVIC, который продуцирует 85 г/л L-треонина за 36 ч культивирования (US 5175107 и US 5705371), рекомбинантный штамм Е. coli 29-4, содержащий треониновый оперон с мутантным геном thrA на плазмиде, синтезирующий 65 г/л L-треонина за 72 ч, конверсия 48% (Biosci. Biotech. Biochem. 59: 1095-1098. 1995). Известен также штамм ТН28С (pBRThrABCR3), который продуцирует 82,4 г/л L-треонина за 50 ч культивирования, конверсия 39,3% (Molecular Systems Biology 3: article number 149, p. 8. 2007).

Штаммы-продуценты, содержащие репликативную плазмиду, имеют ограничения для промышленного получения L-треонина. Основная проблема связана с нестабильностью плазмиды во время ферментации. Для поддержания плазмиды, несущей ген устойчивости к антибиотику, в среду культивирования необходимо добавлять антибиотик, что коммерчески невыгодно и недопустимо, так как L-треонина используют в качестве кормовой добавки и в лекарственных водных растворах медицинского назначения.

С точки зрения промышленного использования более перспективными являются штаммы, относящиеся ко второй группе - бесплазмидные штаммы Е. coli.

Известен штамм Е. coli Н-8460, полученный в результате мутагенеза и последовательной селекции на резистентность к нескольким аналогам, который продуцирует 75 г/л L-треонина за 70 ч (US 5474918). Другой штамм Е. coli KYI0935, отобранный селективно, является ауксотрофом по метионину и продуцирует 100 г/л L-треонина через 77 ч культивирования при наличии метионина (0,9 г/л) в ферментационной среде (Biosci. Biotech. Biochem., 61 (11): 1877-1882. 1997).

Рекомбинантный штамм Е. coli MDS-205, содержащий модификации генов треонинового оперона, генов, ответственных за деградацию и транспорт L-треонина, а также геном редуцированный за счет удаления несущественных участков генома, продуцирует 40,1 г/л L-треонина (Microb. Cell Fact. 8,2. 2009).

Описан устойчивый к боррелидину рекомбинантный штамм Е. coli, ADM kat-13, в котором мутантный треониновый оперон в составе хромосомы находится под контролем сильного промотора ptac, функционирующего конститутивно за счет инактивации гена-репрессора lacI. Штамм продуцирует 102 г/л L-треонина за 48 ч культивирования, конверсия 33,1% (US 5939307). Другой штамм ADM ТН25.79 TRF-R, полученный также в компании ADM, продуцирует 117,3 г/л L-треонина за 48 ч, конверсия 37,4% (US 7767431).

Ближайший аналог заявляемого штамма - рекомбинантный штамм Escherichia coli ВКПМ В-11820 - продуцент L-тренина (RU 2 546 237), который при культивировании в пробирках продуцирует 7,1 г/л L-треонина.

Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих незаменимую аминокислоту L-треонин.

Задача решена путем получения рекомбинантного штамма бактерии Escherichia coli ВКПМ В-12204 - продуцента L-треонина.

Штамм Е. coli ВКПМ В-12204 получают из штамма Е. coli ВКПМ В-2307 за счет последовательного введения множественных изменений, как методами генной инженерии, так и путем селекции в ферментере.

Штамм Е. coli ВКПМ В-2307, является ауксотрофом по L-треонину (мутация в гене thrC) и по изо лейцину (мутация в гене ilvA) и не продуцирует L-треонин.

Получение штамма Escherichia coli ВКПМ В-12204 из штамма Е. coli ВКПМ В-2307 осуществляют в несколько этапов:

1. В исходном штамме Е. coli ВКПМ В-2307 осуществляют замену природного промотора гена galP на промотор Ptac3. Отбирают трансформанты способные к росту на среде LB (мас. %: NaCl - 0,5; дрожжевой экстракт - 0,5; триптон - 1; остальное - вода) с агаром (1,5%) и сахарозой (10%) и чувствительные к хлорамфениколу. Корректность последовательности ДНК в районе модификации здесь и далее на каждом этапе подтверждают методом секвенирования по Сэнгеру (Ргос.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (12): 5463-5467, 1977). Полученный штамм Е. coli, содержащий промотор Ptac3 перед геном galP назван T23-Ptac3-galP.

2. В исходном штамме Е. coli ВКПМ В-2307- инактивируют ген sstT путем замещения его ORF кассетой att-Cm-SacB-att. На полученном трансформанте выращивают фаг Р1, осуществляют транедукцию штамма T23-Ptac3-galP данным фагом и отбирают содержащий модификацию ΔsstT::att-Cm-SacB-att транедуктант, устойчивый к хлорамфениколу (0,001%). Затем кассету, содержащую гены cat и sacB, фланкированные att-последовательностями, удаляют. Отбор трансформантов проводят на среде LB с сахарозой и по потере устойчивости к хлорамфениколу. Полученный штамм с инактивированным геном sstT назван T23-Ptac3-galP-ΔsstT.

3. В исходном штамме Е. coli ВКПМ В-2307- инактивируют ген poxl путем замены его ORF кассетой att-Cm-SacB-att, На полученном трансформанте выращивают фаг Р1, осуществляют транедукцию штамма T23-Ptac3-galP-ΔsstT данным фагом и отбирают транедуктант, устойчивый к хлорамфениколу (0,01 г/л) и содержащий модификацию Δpox1::att-Cm-SacB-att. Затем кассету, содержащую гены cat и sacB, а также прилегающий к гену poxl несущественный для жизнедеятельности Е. coli участок геномной ДНК размером около 20 т.п.о. удаляют и отбирают трансформанты способные к росту на среде LB с сахарозой и чувствительные к хлорамфениколу. Полученный штамм Е. coli, содержащий делению ΔpoxB-ltaE (MGF016) размером около 20 т.п.о., называют T23-Ptac3-galP-ΔsstT-ΔpoxB-ltaE.

4. В штамме T23-Ptac3-galP-ΔsstT-ΔpoxB-ltaE инактивируют ген tdh путем замены его ORF кассетой att-Cm-SacB-att. Отбирают трансформант Δtdh::att-Cm-SacB-att, способный расти на среде LB с хлорамфениколом и с «эффектом лизиса» на среде LB с сахарозой. В полученном трансформанте удаляют кассету, содержащую гены cat и sacB. Отбирают трансформанты способные к росту на среде LB с сахарозой (10%) и чувствительные к хлорамфениколу. Полученный штамм с делецией Δtdh назван T23-Ptac3-galP-ΔsstT-ΔpoxB-ltaE-Δtdh.

5. В исходный штамм Е. coli ВКПМ В-2307 вводят треониновый оперон thrABC с мутантным геном thrA (замена Gly433Arg в ферменте ThrA) и генами thrB и thrC дикого типа под контролем индуцибельного промотора Ptac, терминатора TrrnB, а также селективные маркеры Cm и sacB, обеспечивающие устойчивость к хлорамфениколу и лизис клеток на среде LB с сахарозой, соответственно. Кассету, содержащую гены cat и sacB и промотор Ptac, удаляют путем замещения на фрагмент ДНК, содержащий последовательность промотора рН207 фага Т5. На полученном штамме выращивают фаг Р1 и осуществляют транедукцию штамма T23-Ptac3-galP-ΔsstT-ΔpoxB-ltaE-Δtdh данным фагом. После проведения транедукции отбирают транедуктант, способный расти на среде М9 (мас. %: КН₂РО₄ - 0,3; Na₂HPO₄ - 0,6; NaCl - 0,05; NH₄Cl - 0,1; MgSO₄ - 0,05; CaCl₂ - 0,001; тиамин - 0,0001; рН 7,0 вода - остальное) с глюкозой (0,2%) и изолейцином (20 мг/л), но без добавления L-треонина. Полученный штамм Е. coli, содержащий модификации Ptac3-galP, ΔsstT, ΔpoxB-ltaE (MGF016), Δtdh, десенсибилизирующую мутацию в ключевом для биосинтеза L-треонина гене thrA (замена Gly433Arg приводит к снятию эффекта ретроингибирования треонином продукта гена thrA - аспартокиназы I-гомосериндегидрогеназы I) и треониновый оперон под контролем промотора рН207 фага Т5 и терминатора транскрипции rrnB, назван N197.

6. Штамм N 197 культивируют в ферментере на среде ФС (мас. %: (NH₄)₂SO₄ - 1; КН₂РО₄ - 0,1; MgSO₄×7H₂O - 0,15; NaCl - 0,06; FeSO₄ - 0,002; MnSO₄×5H₂O - 0,002; дрожжевой автолизат (сухой) - 0,2; глюкоза - 3; вода - остальное) с L-изолейцином (0,005%); культуру рассевают до отдельных колоний и отбирают колонии, способные расти и продуцировать треонин в ФС среде с мелом (СаСО₃; 2%) в пробирках. В результате отбирают штамм N217, продуцирующий до 10 г/л L-треонина за 24 ч.

Осуществляют культивирование полученного штамма N217 в ферментере в питательной среде ФС в сравнении с ближайшим аналогом - штаммом Escherichia coli ВКПМ В-11820.

Основную ферментацию проводят в литровом ферментере Applicon в питательной среде ФС. Для предотвращения пенообразования в ферментер вносят пеногаситель (0,1% по объему). Исходный объем жидкости в ферментере составляет 0,4 л. В рабочий ферментер вносят 40 мл инокулята из посевного ферментера. Основную ферментацию проводят в течение 48 ч при следующих условиях культивирования: температура - 37°С, обороты мешалки - 1000 об/мин., расход воздуха - 0,5 л/мин., рН 6,9 (рН статирование проводится раствором аммиака (12,5%). Во время ферментации проводят подпитку глюкозо-аммиачной смесью (2,8:1), для приготовления которой используют раствор глюкозы с концентрацией 700 г/л и аммиак. Концентрацию треонина в культуральной жидкости определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Штамм N217 продуцирует 92 г/л L-треонина, а штамм В-11820 - 58 г/л L-треонина за 48 ч.

Штамм N 217 используют для дальнейшего усовершенствования.

7. В штамм N217 вводят прототрофность по изолейцину (Ile^-→Ile⁺). Фаг Р1 выращивают на штамме Е. coli S5 (rhtA+) и проводят транедукцию штамма N217. Отбирают колонии, способные расти на агаризованной среде М9 с цитратом натрия (0,06%), и проверяют их способность расти на среде ФС с изолейцином и без него в пробирках. Отбирают штамм N237 одинаково растущий на среде ФС с изолейцином и без добавления изолейцина и продуцирующий в пробирках до 10 г/л L-треонина.

8. Штамм N 237 культивируют в ферментере в ФК среде. Среда ФК имеет тот же состав, что и ФС среда, но вместо дрожжевого автолизата добавляют жидкий кукурузный экстракт в количестве 2%. Культуру из ферментера рассевают до отдельных колоний и анализируют на способность продуцировать треонин в ФС среде без изолейцина с мелом в пробирках. Ферментацию и отбор проводят последовательно 4 раза, при этом для каждой следующей ферментации посевную культуру готовят из колонии, способной продуцировать L-треонин в пробирках. После 4-х последовательных ферментаций и анализа отдельных колоний получают стабильный штамм N335.

Полученный штамм Escherichia coli N335 депонирован в БРЦ «Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов» (ВКПМ) по адресу 117545 Москва, 1-ый Дорожный проезд, д.1 и имеет регистрационный номер ВКПМ В-12204.

Штамм Escherichia coli ВКПМ В-12204 характеризуется следующими признаками:

Культурально-морфологические признаки.

Грамотрицательные слабо подвижные тонкие палочки средней длины 1,0-1,5 мкм.

Штамм хорошо растет на простых питательных средах. На среде LB с агаром (1,5%) через 24 ч роста при 37°С образует плоские, круглые, с небольшим кремовым оттенком, полупрозрачные на свет колонии, диаметром 2-3 мм, поверхность колоний гладкая, края неровные, слегка волнистые, структура однородная, консистенция пастообразная.

На минимальной среде М9 с глюкозой (0,2%) и агаром (1,5%) через 2-е суток роста при 37°С образует колонии диаметром 1-1,5 мм, серовато-белые, круглые, слегка выпуклые, внутренняя структура однородная, поверхность блестящая, через 4-5 суток колонии приобретают слизистую (мукоидную) консистенцию.

Физиолого-биохимические признаки. Грамотрицательная бактерия, факультативный анаэроб, не образует эндоспор. Сахара не сбраживает. Ассимилирует глюкозу, лактозу, маннозу, галактозу, ксилозу, фруктозу, глицерол и маннитол с образованием кислоты и газа. После 24 ч роста при 37°С в жидкой среде LB наблюдается сильное помутнение, небольшой осадок, запах характерный. Хороший рост по всему уколу на среде LB с агаром.

Оптимальное значение рН для роста 5,5-7,0. Оптимальная температура 37°С. Желатин не разжижает. Индол не образует. На среде с молоком хороший рост с коагуляцией молока Потребностей в факторах роста (аминокислоты, нуклеотиды) не имеет. Устойчивости к антибиотикам не имеет. Штамм не патогенен.

Пример 1. Продукция L-треонина заявляемым штаммом.

Из суточной биомассы штамма Е. coli ВКПМ В-12204 с чашки Петри с LB средой готовят суспензию клеток в 1 мл 0,9% раствора NaCl, определяют оптическую плотность суспензии (OD₆₀₀) и засевают 20 мл среды А (мас. %: дрожжевой экстракт - 3,5; К₂НРО₄×3Н₂О - 0,33; NaCl - 0,25; глюкоза - 0,3; остальное - вода) в колбе на 0,75 л суспензией клеток в таком объеме, чтобы исходная оптическая плотность культуры в колбе равнялась 0,2. Колбу инкубируют на качалке (250 об./мин.) при 37°С в течение не менее 6 ч до OD₆₀₀ равной 5,0.

Подготовку посевной культуры проводят в ферментере КФ-103/4 на питательной среде П, имеющей следующий состав (мас. %): кукурузный экстракт (жидкий) - 3,0; (NH₄)₂SO₄ - 0,1; KH₂PO₄ - 0,2; MgSO₄×7H₂O - 0,08; FeSO₄ - 0,002; MnSO₄×H₂O - 0,002; глюкоза - 4,0. На каждые 1000 мл среды П добавляют 1,0 мл пеногасителя. В посевной ферментер вносят 0,6 мл инокулята из колбы на 1 л среды П. Культивирование проводят при рН-статировании 25% водным раствором аммиака при рН 6,9 и контроле концентрации растворенного кислорода pO₂ равной 20% от насыщения воздуха. Посевную культуру выращивают в течение 16,5 ч до OD₆₀₀ равной 25.

Основную ферментацию проводят в ферментере КФ-103/4 на питательной среде Ф, имеющей следующий состав (мас. %): кукурузный экстракт (жидкий) - 2; (NH₄)₂SO₄ - 0,05; KH₂PO₄ - 0,2; MgSO₄×7H₂O - 0,15; FeSO₄ - 0,002; MnSO₄×H₂O - 0,002; глюкоза - 1,5, вода - остальное. На каждые 1000 мл среды Ф добавляют 2,0 мл пеногасителя. Исходный объем жидкости в ферментере составляет 1000 мл. В рабочий ферментер вносят 80 мл посевной культуры. Культивирование проводят при 33°С, рН-статировании 25% водным раствором аммиака при рН6,9, подпитке 52% (вес/вес) раствором глюкозы и контроле концентрации растворенного кислорода pO₂ равной 20% от насыщения воздуха в течение 36 ч.

Концентрацию L-треонина в культуральной жидкости определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Штамм Escherichia coli ВКПМ В-12204 продуцирует 105,4 г/л L-треонина за 36 ч культивирования в Ф среде, конверсия 43%, скорость синтеза 2,91 г/л/ч.

Штамм Escherichia coli ВКПМ В-12204 по своим биотехнологическим показателям сравним с лучшими зарубежными штаммами Е. coli - продуцентами L-треонина и превосходит ближайший аналог - штамм Escherichia coli ВКПМ fill 820. Полученный штамм является прототрофом и не содержит генов, обеспечивающих устойчивость к антибиотикам.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм Escherichia coli ВКПМ В-12204 - продуцент L-треонина. Изобретение позволяет расширить арсенал бактерий вида Escherichia coli, способных к продукции L-треонина, и продуцировать при ферментации в ферментере с использованием данного штамма в культуральной жидкости более 100 г/л L-треонина за 36 ч культивирования. 1 пр.

Рекомбинантный штамм Escherichia coli ВКПМ В-12204 - продуцент L-треонина.