Способ прогнозирования клинического течения гемофилии с уровнем активности факторов VIII, IX Российский патент 2019 года по МПК G01N33/50 C12Q1/6827 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к способу прогнозирования клинического течения гемофилии с уровнем активности факторов VIII, IX <1% путем исследования однонуклеотидных полиморфизмов генов фолатного обмена человека. Способ включает в себя комплексное определение полиморфизмов генов MTHFR:677, MTHFR:1298, MTR:2756, MTRR:66. Способ обеспечивает раннюю диагностику особенностей клинического течения гемофилии.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, основанной на генетическом методе выявления критериев, свидетельствующих о тяжести клинического течения гемофилии.

Цель изобретения - разработать способ оценки генетических факторов путем анализа полиморфизмов генов MTHFR:677 С>Т, MTHFR:1298 А>С, MTR:2756 A>G, MTRR:66 A>G у пациентов с тяжелой формой гемофилии А, В.

Гемофилия - это наследственное заболевание, возникающее в результате нарушения синтеза фактора свертывания крови VIII или IX (гемофилия А или В соответственно) [1, 2]. В зависимости от уровня активности фактора выделяют тяжелую форму заболевания (менее 1% от нормы), средней тяжести (1-5%), легкую (более 5% от нормы) [3]. Тяжесть геморрагических проявлений гемофилии определяется уровнем содержания в крови фактора VIII или IX и может варьировать.

Легкая форма без действия провоцирующих факторов протекает бессимптомно, но травма или инвазивные вмешательства сопровождаются геморрагическими проявлениями, требующими применения специфических препаратов. Гемофилия легкой степени тяжести нередко впервые выявляется в зрелом возрасте.

При средней степени тяжести спонтанные кровотечения и кровоизлияния возникают редко, тогда как тяжелая форма манифестирует в раннем детском возрасте спонтанными, часто рецидивными кровотечениями и кровоизлияниями в любые органы и ткани, вызывающими дегенеративные процессы и прогрессирующие изменения в суставах.

Даже при сходном уровне снижения коагуляционного фактора тяжесть клинического течения гемофилии у разных пациентов варьирует [4, 5]. Высказывались предположения, что интенсивность геморрагических проявлений болезни зависит от полиморфизма генов тромбофилии, в том числе генов фолатного обмена [6, 7].

К генам, регулирующим фолатный обмен, относятся мутации, ассоциированные с патологическим синтезом гомоцистеина. Гипергомоцистеинемия оказывает прямое повреждающее действие на эндотелиоциты, ингибирует активацию антитромбина III, экспрессию тромбомодулина и оксида азота, снижает синтез простациклина, повышает агрегационные и адгезивные свойства тромбоцитов и блокирует связывание тканевого активатора плазминогена эндотелиоцитами, что в целом повышает свертываемость крови [8, 9].

Известен способ прогнозирования потребности в концентрате фактора для профилактики кровотечений у больных гемофилией [10], основанный на исследовании носительства мутации фактора V Лейден, предрасполагающей к повышенной свертываемости крови. Недостатком способа является отсутствие информации о роли других мутаций генов тромбофилии, которые чаще встречаются в популяции и могут также воздействовать на течение гемофилии.

Известен способ оценки влияния полиморфизма генов F2, F5, фибриногена, ITGA2, ITGB3, PAI-1 на возраст манифестации гемофилии [11], однако использование только возраста дебюта в качестве критерия недостаточно для установления связи генетических факторов с особенностями клинического течения заболевания.

Наиболее близко к предлагаемому изобретению - изучение генов MTHFR, F2, F5 и их влияния на геморрагические проявления у пациентов с гемофилией [12]. Этот способ охватывает несколько генетических факторов тромбофилии, но не включает в себя оценку аллелей генов MTR, MTRR как других предикторов гипергомоцистеинемии.

Комплексный анализ генов MTHFR, MTR, MTRR позволяет клиницисту прогнозировать особенности течения гемофилии и персонифицировать терапию.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание способа прогнозирования клинического течения гемофилии с уровнем активности факторов VIII, IX <1% при исследовании однонуклеотидных полиморфизмов генов MTHFR, MTR, MTRR человека, что необходимо для назначения пациенту адекватной медикаментозной терапии и установления риска развития геморрагических осложнений у больных гемофилией.

Для достижения указанного результата в соответствии с прототипом исследуют однонуклеотидные полиморфизмы генов MTHFR:677 C>Т, MTHFR:1298 А>С, MTR:2756 A>G, MTRR:66 A>G человека. В отличие от аналога, в котором изучается только несколько полиморфизмов генов (MTHFR, F2, F5) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), в данном способе осуществляется комплексная оценка генов MTHFR:677 C>Т, MTHFR:1298 А>С, MTR:2756 A>G, MTRR:66 A>G и прогнозирование клинического течения гемофилии в соответствии с разработанной балльной шкалой.

В процессе проведения патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предполагаемого изобретения.

Заявляемое изобретение разработано в лаборатории иммуногематологии ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России в соответствии с планом научно-исследовательской работы.

Способ предусматривает следующую последовательность исследований:

Этап 1. Получение препаратов геномной ДНК из образца периферической крови больного гемофилией. Взятие, пробоподготовку, хранение материала и выделение ДНК проводят в соответствии с инструкцией к используемому комплекту для выделения ДНК из биологического материала.

Этап 2. Проведение процедуры типирования больного гемофилией. Анализ заключается в определении однонуклеотидных замен локусов генов MTHFR:677 C>Т, MTHFR:1298 А>С, MTR:2756 A>G, MTRR:66 A>G методом ПЦР с флуориметрической регистрацией продуктов в ходе процесса (ПЦР в реальном времени). Исследование осуществляют в соответствии со способом, описанным в инструкции к набору для ПЦР.

Этап 3. Оценка генотипа пациентов с присвоением выявленным полиморфизмам генов MTHFR:677 C>Т, MTHFR:1298 А>С, MTR:2756 A>G, MTRR:66 A>G определенного балла в зависимости от их корреляции с интенсивностью геморрагических проявлений (таблица 1).

Заключение о том, что клиническая манифестация тяжелой формы гемофилии будет соответствовать легкой форме, делают при суммарном количестве баллов 10 и более, средней форме - 5-9 баллов, тяжелой - 4 балла и менее.

Клинические примеры подтверждают возможность использования и эффективность предлагаемого способа при прогнозировании клинических проявлений тяжелой формы гемофилии.

Пример 1.

Больной С, 1981 г.р.

Диагноз: Гемофилия А, ингибиторная форма.

Первые геморрагические проявления наблюдались в 4 г., когда пациент впервые обратился в КНИИГиПК с посттравматической гематомой левой щеки. Уровень фактора VIII составил менее 1% от нормы (тяжелая форма). В детстве госпитализировался в среднем 2-3 раза/год по поводу посттравматических кровотечений (обычно гематомы мягких тканей, кровоизлияния в голеностопные суставы). Несмотря на то что пациент длительное время не получал адекватной современной терапии (в связи с тем, что концентрат фактора VIII стал доступен в России с 2007 г. для профилактического лечения по программе «7 нозологий»), у больного нет выраженных изменений опорно-двигательного аппарата, деформаций суставов. В 2000 г. выявлено наличие ингибитора в крови более 20БЕ (к 2017 г. снизился до 1-1,5 БЕ). Пациент получает профилактическое лечение 2000ЕД 2 раза/нед концентрат фактора VIII. Жалоб не предъявляет, спонтанные кровотечения беспокоят редко. Таким образом, можно сделать вывод о несоответствии клинической картины тяжести диагноза. Результаты типирования полиморфизмов генов фолатного цикла: MTHFR:677 Т/Т - 5 баллов, MTHFR:1298 А/С - 3 балла, MTR:2756 А/А - 0 баллов, MTRR:66 А/А - 0 баллов. Суммарное количество баллов - 8.

Заключение: Выявленный у больного полиморфизм генов фолатного обмена предрасполагает к течению гемофилии А средней тяжести.

Пример 2.

Больной Ж., 2014 г.р.

Диагноз: Гемофилия В.

Первые геморрагические проявления наблюдались в 1 мес, в виде постинъекционного кровотечения. При обследовании уровень фактора IX составил менее 1% от нормы (тяжелая форма). Находится на стационарном лечении в среднем 3-4 раза/год по поводу посттравматических кровотечений. Беспокоят спонтанные кровотечения на фоне адекватной заместительной терапии. Результаты типирования полиморфизмов генов фолатного цикла: MTHFR:-677 С/С - 0 баллов, MTHFR:1298 А/А - 0 баллов, MTR:2756 A/G - 1 балл, MTRR:66 A/G - 1 балл. Суммарное количество баллов - 2.

Заключение: Выявленный у больного полиморфизм генов фолатного обмена предрасполагает к тяжелому течению гемофилии В.

Список литературы:

1. Данилов И.П., Змачинский В.А., Цвирко Д.Г., и др. Гемофилия // Медицинские новости. - 2008. - №13. - С. 20-23.

2. Oldenburg J. Optimal treatment strategies for hemophilia: achievements and limitations of current prophylactic regimens // Blood. - 2015. - №125. - P. 2038-2044.

3. Triplett D.A. Coagulation and Bleeding Disorders: Review and Update // Clinical Chemistry. - 2000. №46:8(B). P. 1260-1269.

4. Jayandharan G.R., Srivastava A. The phenotypic heterogeneity of severe hemophilia // Semin Thromb Hemost. - 2008. - №34 (1). - P. 128-141.

5. Nogami K., Shima M. Phenotypic heterogeneity of hemostasis in severe hemophilia // Semin Thromb Hemost. - 2015. - №41 (8). - P. 826-831.

6. Franchini M., Montagnana M., Targher G. et al. Interpatient phenotypic inconsistency in severe congenital hemophilia: a systematic review of the role of inherited thrombophilia // Semin Thromb Hemost. - 2009. - №35 (3). - P. 307-312.

7. Момот А.П. Проблема тромбофилии в клинической практике // Российский журнал детской гематологии и онкологии (РЖДГиО). - 2015. - №2(1). - С. 36-48.

8. Лазаренко В.А., Бобровская Е.А., Сорокин А.В. Гипергомоцистеинемия: периферический атеросклероз и реконструктивная хирургия // Человек и его здоровье. - 2014. - №4. - С. 63-66.

9. Williams К.Т., Schalinske К.L. Homocysteine metabolism and its relation to health and disease // Biofactors. - 2010. - Vol. 36, №1. - P. 19-24.

10. Lee D.H., Walker I.R., Teitel J. et al. Effect of the factor V Leiden mutation on the clinical expression of severe hemophilia A // Thromb Haemost. - 2000. - №83 (3). - P. 387-391.

11. Poponina E., Butina E., Roitman E. et al. Correlation of the debut of clinical symptoms in hemophilia with hereditary factors of thrombophilia // Materials of 25^th biennial international congress of thrombosis, Venice, 2018: 168.

12. Ahmed R., Kannan M., Choudhry V.P. et al. Does the MTHFR 677T allele alter the clinical phenotype in severe haemophilia A? // Thrombosis Research. - 2003. - №109(1). - P. 71-72.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, основанной на генетическом методе выявления критериев, свидетельствующих о тяжести клинического течения гемофилии. Раскрыт способ прогнозирования клинического течения гемофилии с уровнем активности факторов VIII, XI < 1% путем исследования однонуклеотидных полиморфизмов генов фолатного обмена человека, включающий в себя комплексное определение полиморфизмов генов MTHFR:677, MTHFR:1298, MTR:2756, MTRR:66. При этом оценку генов в гомозиготном и гетерозиготном состояниях проводят в соответствии с балльной шкалой, присваивая генетическим факторам следующие значения: MTHFR:677 С/Т - 3 балла, MTHFR:677 Т/Т - 5 баллов, MTHFR:1298 А/С - 3 балла, MTHFR:1298 С/С - 5 баллов, MTR:2756 A/G - 1 балл, MTR:2756 G/G - 2 балла, MTRR:66 A/G - 1 балл, MTRR:66 G/G - 2 балла; при суммарном количестве баллов 10 и более дают прогноз легкого клинического течения, 5-9 баллов - средней тяжести, 4 балла и менее - тяжелого. Изобретение обеспечивает возможность назначения пациенту адекватной медикаментозной терапии и установления риска развития геморрагических осложнений у больных гемофилией. 1 табл., 2 пр.

Способ прогнозирования клинического течения гемофилии с уровнем активности факторов VIII, XI <1% путем исследования однонуклеотидных полиморфизмов генов фолатного обмена человека, включающий в себя комплексное определение полиморфизмов генов MTHFR:677, MTHFR:1298, MTR:2756, MTRR:66, отличающийся тем, что оценку генов в гомозиготном и гетерозиготном состояниях проводят в соответствии с разработанной балльной шкалой, присваивая генетическим факторам следующие значения: MTHFR:677 С/Т - 3 балла, MTHFR:677 Т/Т - 5 баллов, MTHFR:1298 А/С - 3 балла, MTHFR:1298 С/С - 5 баллов, MTR:2756 A/G - 1 балл, MTR:2756 G/G - 2 балла, MTRR:66 A/G - 1 балл, MTRR:66 G/G - 2 балла; при суммарном количестве баллов 10 и более дают прогноз легкого клинического течения, 5-9 баллов - средней тяжести, 4 балла и менее - тяжелого.