Способ диагностики вторичных нефропатий при ревматических заболеваниях у детей Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 C12Q1/6858 G01N33/564 G01N33/573 

Способ относится к медицине и применим в клинической нефрологии.

В последние десятилетия во всех странах мира отмечается стремительный рост числа пациентов, нуждающихся в заместительной почечной терапии - гемодиализе и последующей трансплантации почек. Одна из причин этого явления связана с увеличением распространенности заболеваний, приводящих к развитию вторичных нефропатий, формирующихся на фоне ревматических заболеваний (РЗ). Почки закономерно вовлекаются в патологический процесс при ряде РЗ ввиду своих анатомо-физиологических особенностей: развитой системы кровоснабжения, способности задерживать иммунные комплексы, а также образовывать их местно (Е.А. Панков, К.А. Папаян, С.И. Капустин, Н.Д. Савенкова, 2020).

Нередко нефропатии при ревматических заболеваниях протекают со скудной клинической симптоматикой или с незначительными изменениями в анализах мочи. Однако, даже минимальный мочевой синдром является проявлением необратимых структурных изменений почек, приводящих к снижению их функционального потенциала, формированию хронической болезни почек (ХБП), что приводит к снижению продолжительности и качества жизни, требует проведения заместительной почечной терапии и последующей трансплантации почек (И.Л. Давыдкин, В.А. Кондурцев, Т.Ю. Степанова, С.А. Бобылев, 2009).

Выявление факторов риска развития поражения почек при таких распространенных ревматических заболеваниях как системная красная волчанка, ревматоидный артрит, геморрагический васкулит имеет большое значение для ранней диагностики поражения почек, своевременного назначения терапии, которая очень важна для профилактики прогрессирования ХБП и способствует улучшению качества и продолжительности жизни пациентов.

Несмотря на современные достижения нефрологии, раннее выявление и замедление прогрессирования заболеваний почек разной этиологии, отдаление формирования хронической почечной недостаточности (ХПН), снижение риска осложнений, обусловленных почечной дисфункцией, по-прежнему представляет трудности и остается нерешенной медико-социальной проблемой (Игнатова М.С., 2013).

В связи с этим, особое внимание уделяется проблеме ранней диагностики прогрессирующих заболеваний почек, выявлению латентно протекающих нефрологических заболеваний. Раннее выявление заболеваний почек позволяет замедлить прогрессирование нефропатии, а в ряде случаев даже предотвратить утрату функции почек. В то же время, поздняя диагностика нефропатий непосредственно ассоциирована с более высокой смертностью, более тяжелым течением сопутствующих состояний (Макарова Т.П., .Мельникова Ю.С., 2017).

В настоящее время рассматривается роль дисфункции эндотелия (ДЭ) при ревматических заболеваниях (Макарова Т.П. и соавт.). Доказано, что нарушение функции эндотелия развивается задолго до формирования структурных изменений в почках (Сивцева Е.А., 2013). Для выявления нарушения функции эндотелия необходимо определять в крови и моче уровень циркулирующих факторов, регулирующих вазодилятацию, вазоконстрикцию, пролиферацию, процессы коагуляции (Кочуева М.Н. с соавт., 2014).

В генезе ДЭ при ревматических заболеваниях основную роль играет прямое поражение сосудов, в основе которого лежит иммунное воспаление. К развитию эндотелиальной дисфункции при ревматических заболеваниях приводят: депозиция иммунных комплексов в стенке сосудов, нарушение равновесия между воспалительными цитокинами и антивоспалительными в пользу провоспалительных, выработка антиэндокардиальных, антинуклеарных цитоплазматических, антифосфолипидных антител. Все это приводит к повреждению эндотелиальных клеток, повышению выработки вазоконстрикторов, пролиферации, ангиогенезу при хроническом воспалении, увеличению образования факторов, вызывающих развитие гиперкоагуляции на фоне сосудистого воспаления, стимуляции синтеза эндотелием фактора активации тромбоцитов, повреждению сосудистой стенки и изменению реологических свойств крови (Э.М. Мингазова, 2015; Н.А. Мухин, И.Е. Тареева, 2011). Что приводит к гиперпродукции профиброгенных и провоспалительных медиаторов, в том числе эндотелина-1, с одновременным усилением процессов агрегации тромбоцитов, окислительного стресса и пролиферацией гладкомышечных клеток.

Эндотелин-1 (ЭТ-1) за счет мощного вазоконстрикторного действия повышает периферическое сопротивление сосудов, что приводит к обеднению внутрипочечного кровотока. ЭТ-1 способствует прогрессированию повреждения почек за счет усиления процессов пролиферации мезангиоцитов и клеток почечных канальцев (Zh.D. Semidotskaya, L. A. Pererva, 2004). Выявлено влияние эндотелина-1 на развитие и прогрессированию почечного интерстициального фиброза (Iturbe, B.R. et al., 2005). Эндотелин-1, наряду с выраженными сосудосуживающим и митогенным действиями, потенцирует эффекты трансформирующего фактора роста β (ТФРβ) (Вельков В.В., 2014).

ТФР- β1 является ключевым провоспалительным медиатором, наиболее значимым на индукционном этапе тубулоинтерстициального повреждения, обеспечивающего условия для последующего формирования фиброза почечной ткани (Н.А. Арзиманова, В.В. Марасаев, Т О. Абиссова, 2009).

По данным современной литературы, гомоцистеин является одним из чувствительных маркеров дисфункции эндотелия. Гомоцистеин (ГЦ) - это аминокислота, которая может рассматриваться как предиктор развития множества сосудистых заболеваний. Повышение уровня гомоцистеина крови приводит к повреждению эндотелиальной выстилки сосудов с развитием системной дисфункции эндотелия за счет подавления активности антитромбина III и гепарина, повышая активность тромбина и риски развития тромбозов. Так же известно, что ГЦ снижает биологические эффекты оксида азота, усиливает пролиферацию гладкомышечных клеток сосудистой стенки и может рассматриваться как фактор, способствующий прогрессированию сосудистых осложнений (Шмелева В.М. с соавт., 2010).

В современной литературе широко обсуждается роль идентифицированных генов-кандидатов, мутации которых ответственны за развитие вторичных нефропатий у детей. Актуальным представляется оценка взаимосвязи потенциальных ассоциаций мутаций и аллельного полиморфизма генов с клинико-параклиническими вариантами патологии почек у детей с ревматическими заболеваниями (Л.С. Приходина, 2022; Mohan C., Putterman C., 2015; И.А. Козыро, А.В. Сукало, Е.С. Синявская, Р.И. Гончарова, 2019).

Изучение генетических и патогенетических факторов формирования нефропатии у детей с ревматическими заболеваниями необходимо для выделения группы пациентов высокого риска по развитию вторичных нефропатий.

При изучении влияния мутаций генов, кодирующих ферменты фолатного цикла, на метаболизм гомоцистеина, доказано, что наиболее выраженное повышение уровня гомоцистеина в крови наблюдается у пациентов, имеющих генетические аномалии двух ферментов одновременно - метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR C677T) и метионинредуктазсинтазы (MTRR Ile22Met) (Ю.О. Берман, И.Л. Давыдкин, С.П. Кривова, 2014).

Полиморфизм в гене MTHFR С677Т приводит к увеличению концентрации гомоцистеина, что существенно влияет на прогрессирование нефропатий, которые проявляются быстрее у пациентов с генотипом ТТ или СТ и при наличии ген-генных ассоциаций генов системы гемостаза и фолатного цикла (А.А. Степанова, 2013). Повышение уровня гомоцистеина в крови закономерно приводит к развитию гиперкоагуляционных сдвигов в функционировании системы гемостаза за счет увеличения активности прокоагулянтного звена и угнетения ряда антикоагулянтных механизмов (О.В. Комарова, И.Е. Смирнов, А.Г. Кучеренко, 2012г.). Доказано, что развивающаяся гипергомоцистеинемия (ГГЦ) способствует формированию и усилению нефросклероза (Y. Xuan, L. Wang, H. Zhi, 2016).

По данным Ж.В. Шуцкой, Н.Д. Савенковой, при наблюдении в динамике детей и подростков с сахарным диабетом установлена более высокая частота развития диабетической нефропатии у лиц с ТТ генотипом гена MTHFR по сравнению с пациентами, имеющими СТ и СС генотипы. Полученные данные показывают влияние гомозиготного носительства С677Т полиморфизма гена MTHFR (ТТ генотип) в формировании предрасположенности к диабетической нефропатии при сахарном диабете 1-го типа.

По данным Е.Н. Борисова и соавт. (2019), у пациентов с волчаночным нефритом (ВН), у которых статистически значимо чаще встречались мутации в гене MTHFR (C677T), имел место высокий уровень протеинурии при нефротическом синдроме (НС) по сравнению с таковым у пациентов без мутантного аллеля данного гена. Пятилетняя и десятилетняя «почечная» выживаемость у носителей мутантного аллеля гена MTHFR (C677T) статистически значимо меньше, чем у пациентов без данной мутации.

По данным Л.В. Ждановой и соавт., носительство полиморфизма генов, ответственных за тромбофилию в гомозиготном варианте, сопровождается вовлечением в воспалительный процесс капилляров клубочков почек с развитием постваскулитного нефрита. Установлено, что наличие мочевого синдрома коррелирует с сочетанием гомозиготных вариантов полиморфизма генов MTHFR и гена ингибитора плазминогена-1 (PAI-1), а также с гомозиготным вариантом полиморфизма С677Т гена MTHFR.

Таким образом, патология почек при ревматических заболеваниях у детей формируется при воздействии комплекса факторов таких, как нарушение внутрипочечной гемодинамики, депозиция иммунных комплексов в стенке сосудов, нарушение равновесия между воспалительными цитокинами и антивоспалительными в пользу провоспалительных, выработка антиэндокардиальных, антинуклеарных цитоплазматических, антифосфолипидных антител, которые вызывают повреждение эндотелия, продукцию медиаторов эндотелиальной дисфункции и прогрессирование повреждения почек. Следовательно, дисфункция эндотелия является интегральным маркером поражения органов-мишеней при ревматических заболеваниях, и в первую очередь, почек (Кочуева М.Н., Гаврилюк В.А, 2014; Sharma K., 2016), поэтому оценка уровня показателей эндотелиальной дисфункции позволит диагностировать поражение почек при РЗ на доклинической стадии, что будет способствовать своевременному назначению превентивных мероприятий с целью предотвращения формирования и прогрессирования почечной патологии. Кроме этого, выявление генетических факторов формирования нефропатий у детей с ревматическими заболеваниями позволит повысить эффективность диагностики патологии почек, так как носительство значимых генов или полиморфных аллелей влияет на формирование и течение заболевания, что имеет высокую теоретическую и практическую значимость.

Таким образом, учитывая патогенетические механизмы изменения показателей эндотелиальной дисфункции (эндотелина-1, трансформирующего фактора роста β, гомоцистеина) с учетом генетического профиля (полиморфизма генов фолатного цикла метилентетрагидрофолатредуктазы - MTHFR (A1298C), метионин-синтазы - MTR (2756A/G), метионин-синтазы редуктазы - MTRR (A66G) позволяет разработать способ диагностики патологии почек у детей с ревматическими заболеваниями.

Уровень техники

Современные методы скрининга позволяют выявить патологию почек на ранней стадии, задолго до того, как появится повышенное содержание альбумина в моче (МАУ). Это особенно важно, потому что начальные структурные и функциональные нарушения почек могут возникать задолго до появления увеличения экскреции альбумина (Дедов И.И., Шестакова М.В., 2009).

Диагностика поражения почек при ревматических заболеваниях проводится на основании комплекса параметров: нарушение скорости клубочковой фильтрации (СКФ), нарастание микроальбуминурии, повышение мочевины и креатинина в плазме крови, изменение внутрипочечной гемодинамики по данным допплерографии почечных сосудов и цветового допплеровского картирования, изменение структурного состояния почечной паренхимы по данным эхографических показателей.

В настоящее время для расчета СКФ педиатрами в основном используется формула Шварца, однако она не всегда корректно отражает почечную фильтрацию, поскольку концентрация креатинина в жидкости организма напрямую зависит от процентного содержания мышечной массы (Лойманн Э. с соавт., 2010; Schwartz G.J. et al. 1976).

Микроальбуминурия - это экскреция альбумина с мочой в количестве, превышающим физиологическую норму: за 24 часа более 30 мг (>20 мкг/мин) и до 300 мг альбумина (200 мкг/мин.) (Шишкин А.Н., 2008).

По современным данным уровень экскреции альбумина с мочой в пределах 10-29 мг/сут повышает риск общей и сердечно - сосудистой смертности. Поэтому в настоящее время нижней границей нормы экскреции альбумина принято считать уровень 10 мг/сут (или 10 мг альбумина на 1 г креатинина) (Kidney disease: Improving Global outcomes (KdIGo) cKd Work Group. KdIGo 2012 clinical Practice Guideline for the Evaluation and Management of chronic Kidney disease, 2013).

Измерение скорости клубочковой фильтрации (СКФ) и процента рабочей ткани почек также может быть осуществлено при помощи методов радионуклидной диагностики почечных заболеваний. Однако этот метод является достаточно сложным, и может вызвать нежелательные реакции со стороны пациента (Смирнов И.Е., соавт. 2011).

В литературе широко рассматривается важность канальцевых повреждений в развитии вторичных нарушений функции почек при разнообразных заболеваниях. Эти повреждения проявляются как нарушение обмена оксалатов и уратов, увеличенная экскреция фосфатов, повышенное выведение кальция с мочой, а также нарушение выведения титруемых кислот и аммиака, наряду с повышением скорости клубочковой фильтрации. Определения функционального состояния канальцев при нефропатиях проводится различными способами: исследование титруемых кислот, аммиака, концентрационной способности почек (по пробе Зимницкого), микроальбуминурии, β2-микроглобулина, лизоцима мочи и скрининг метода на наличие фосфатурии, гипераминоацидурии. Однако у данных методов имеются недостатки в виде отсутствия подхода к прогнозированию, так как данные способы малочувствительны и становятся диагностически значимы при длительно текущем патологическом процессе, когда перестают функционировать 60-70% нефронов (Валеева Ф.В., 2005).

Дополнительным критерием при постановке диагноза вторичных нефропатий является измерение внутрипочечной гемодинамики на основе значений систолической и диастолической скорости кровотока. С применением режима цветового допплеровского картирования (ЦДК) (Бегун И.В., Папкевич И.И. 2009). Однако, у данного метода доказана низкая информативность расчета относительных показателей (индекса резистентности, пульсационного индекса) (Егорочкина М.В., 2013). Таким образом, этот подход позволяет оценить уровень сохранения функциональной активности почечной паренхимы косвенно путем анализа данных о внутрипочечном кровотоке.

Представляет интерес способ, разработанный Пленкиной Л.В. с соавторами (патент РФ № 2725850 от 06.07.2020), который предлагает раннюю доклиническую диагностику хронического тубулоинтерстициального повреждения почек у пациентов с анкилозирующим спондилитом, заключающуюся в том, что в предварительно собранной разовой порции мочи методом иммуноферментного анализа производят измерение FABP-1 (англ. fatty acid binding protein 1), полученные значения приводят к уровню креатинина, измеренного в той же порции мочи методом Поппера, основанном на реакции Яффе, затем сопоставляют результат с референтным интервалом, при уровне FABP-1 более 0,12 нг/ммоль креатинина выносится решение о наличии у пациента повреждения почек.

Недостатком способа является:

1) Не позволяет выявлять вторичное поражение почек при ревматических заболеваниях на доклинической стадии, что является важным для своевременного назначения превентивных мероприятий.

2) Возможны погрешности при математических расчетах.

3) Способ применим только у взрослой группы пациентов терапевтического профиля.

Известен также способ прогнозирования хронической почечной недостаточности у больных с посткапилляротоксическим гломерулонефритом (патент РФ № 2333497 от 10.09.2008 г.), разработанный Егоровой Т.В. с соавторами. Данный способ заключается в том, что в анамнезе выявляют клинические признаки артериальной гипертонии и суточной протеинурии более 1 г. Определяют сочетание дебюта геморрагического васкулита с возрастом пациента, содержанием креатинина в сыворотке крови в начале гломерулонефрита, показателей плазменного звена гемостаза, а также проводят анализ терапевтического лечения в дебюте заболевания. При выявлении дебюта геморрагического васкулита в возрасте 31-45 лет, содержания в сыворотке крови креатинина выше 130 мкмоль/л, гиперкоагуляции крови в плазменном звене гемостаза и отсутствия антикоагулянтной терапии в дебюте заболевания, прогноз развития хронической почечной недостаточности считают неблагоприятным, в остальных случаях прогноз благоприятный. Данный способ диагностики позволяет по сравнению с известными технологиями обеспечить более объективное и раннее прогнозирование развития хронической почечной недостаточности у больных с посткапилляротоксическим гломерулонефритом.

Недостатком способа является:

1) Не позволяет диагностировать вторичное поражение почек на доклинической стадии

2) Необходимость наблюдения за пациентом в течение года, трудность забора мочи в течении суток, что не позволяет провести данный метод в амбулаторных условиях.

3) Способ применим только у взрослой группы пациентов терапевтического профиля.

Наиболее близким к предлагаемому способу (прототипом) является способ диагностики доклинической стадии вторичных нефропатий у детей (А.А. Вялкова, Л.В. Куценко, И.В. Зорин, С.В. Плотникова, С.А. Чеснокова, В.И. Ким патент РФ № 2753588 от 18.08.2021), который заключается в том, что для диагностики вторичного поражения почек при эндокринопатиях применяют метод иммуноферментного анализа с определением маркеров эндотелиальной дисфункции и факторов роста. При повышении концентрации уровня нейтрофильного желатиназо-ассоциированного липокалина (NGAL) в моче и эндотелина (ЭТ-1) в крови при эндокринопатиях в указанных диапазонах диагностируют доклиническую стадию вторичных нефропатий у детей. При NGAL 14,38-25,95 нг/мл (20,03±5,92 нг/мл), эндотелине-1 100,64-118,1 пг/мл (109,37±8,73 пг/мл) у детей с сахарным диабетом 1 типа диагностируют вторичные нефропатии. При NGAL 2,32-4,72 нг/мл (3,52±1,20 нг/мл), эндотелине-1 99,3-126,26 пг/мл (112,78±13,48 пг/мл) - при ожирении диагностируют вторичные нефропатии у детей. При NGAL 6,55-14,33 нг/мл (10,44±3,89 нг/мл), эндотелине-1 - 93,08-109,76 пг/мл - при аутоиммунном тиреоидите диагностируют вторичные нефропатий у детей. Способ обеспечивает возможность осуществления ранней неинвазивной диагностики доклинической стадии вторичных нефропатий у детей с эндокринопатиями: с сахарным диабетом 1 типа, при ожирении, при аутоиммунном тиреоидите, за счет оценки показателей функции эндотелия, нарастание которых происходит задолго до манифестации почечного повреждения и изменения общепринятых диагностических критериев.

Недостатком способа является:

1) Способ применим только для диагностики вторичных нефропатий у детей с эндокринопатиями, что ограничивает применение данного способа в диагностике вторичных нефропатий у детей с ревматическими заболеваниями.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка информативного способа прогнозирования формирования вторичных нефропатий у детей с ревматическими заболеваниями на основе оценки комплекса показателей эндотелиальной дисфункции [эндотелина-1 (ЭТ-1), гомоцистеина, трансформирующего фактора роста β) с учетом полиморфизма генов фолатного цикла MTR A2756G, MTHFR A1298C, MTRR A66G.

Новизна предлагаемого способа заключается в том, разработан способ прогнозирования вторичных нефропатий при ревматических заболеваниях у детей на основе оценки показателей дисфункции эндотелия (эндотелина-1 (ЭТ-1), гомоцистеина, трансформирующего фактора роста β) с учетом генетической предрасположенности (полиморфизма генов фолатного цикла MTR A2756G, MTHFR A1298C, MTRR A66G).

Раскрытие изобретения

Значимым отличием данного способа прогнозирования вторичных нефропатий при ревматических заболеваниях у детей является то, что помимо общепринятых показателей диагностики вторичных нефропатий проводят исследование уровня ЭТ-1, ТФРβ в крови и моче и гомоцистеина в моче, в совокупности с определением у пациента патологического гена MTR A2756G, MTHFR A1298C, MTRR A66G и по уровню изменений указанных показателей в определенных диапазонах осуществляется прогнозирование вторичных нефропатий при ревматических заболеваниях у детей.

Способ основан на различиях патогенетических механизмов изменения показателей эндотелиальной дисфункции (эндотелина-1 (ЭТ-1), гомоцистеина, трансформирующего фактора роста β) при ревматических заболеваниях у детей с учетом генетической предрасположенности (определения полиморфизма генов фолатного цикла MTR A2756G, MTHFR A1298C rs1801131, MTRR A66G).

Для выявления предикторов развития вторичных нефропатий при ревматических заболеваниях у детей был выполнен регрессионный анализ. Получена статистически значимая модель (скрорректированный R²=0,89, р-значение<0,001) (Табл.1).

Таблица 1. Предикторы поражения почек у детей при ДБСТ

R= 0,957 R2= 0,91 Скоррект. R²=0,895; F(5,20)=44,311, p<0,001 Коэффициенты [95%ДИ] Статистика Вальда ОШ p-знач. уровень эндотелина-1 в крови -0,70 [-0,61;-0,79] -3,00 1,42 <0,001 уровень эндотелина-1 в моче 0,41 [0,40;0,42] 6,45 1,60 <0,001 уровень ТФРβ в моче -0,18 [-0,11;-0,25] -0,61 1,23 0,01 уровень ТФРβ в крови 0,22 [0,29; 0,29] 1,21 0,41 0,008 уровень гомоцистеина в моче 0,16 [0,11;0,23] 0,06 1,03 0,03

В результате проведенного регрессионного анализа получено наиболее информативное уравнение линейной регрессии, описывающее вероятность формирования вторичных нефропатий при ревматических заболеваниях у детей и включающее в себя уровень эндотелина-1 в сыворотке и моче, ТФРβ в сыворотке и моче и уровня гомоцистеина в моче.

Р=1/(1+еz)*100%

Z= 873,6 - 3,00 * Х эндотелин сыв.+ 6,45 * X эндотелин мочи - 0,61*X ТФРβ мочи + 1,2 * X ТФРβ сыв. + 0,06*X гомоцистеин в моче

где P - вероятность развития вторичных нефропатий у детей с ревматическими заболеваниями.

Пороговое значение полученной регрессионной модели было определено при помощи метода ROC-анализ. Площадь (AUC) ROC-кривой составила 0,85, что свидетельствует о высокой прогностической ценности полученной модели (р<0,05).

Так, у детей с РЗ при показаниях уровня:

ЭТ-1 крови 264,5-322,49 пг/мл;

ЭТ-1 мочи 20,5-36,2 пг/мл;

ТФРβ крови 53,7-97,57 пг/мл;

ТФРβ мочи 69,9-143,17 пг/мл;

гомоцистеин мочи 399,8-1500,6 нг/мл, диагностируют вторичные нефропатии.

Нами проведен анализ распределения частот генотипов MTR A2756G, MTHFR A1298C, MTRR A66G генов с помощью таблицы сопряженности 2х2. Рассчитано отношение шансов с 95% доверительным интервалом. Отношение шансов позволило оценить связь между развитием вторичных нефропатий при ревматических заболеваниях у детей и наследственной отягощенностью (Табл. 2).

Таблица 2. Распределения частот генотипов фолатного цикла у детей с ревматическими заболеваниями

Ген Генотип Дети с РЗ с ПП^** Дети с РЗ без ПП^** ОШ (95%ДИ) р MTR A2756G AA 10 19,35% 20 45,45% 1,0 AG 16 32,26% 17 39,39% 1,9 0,5-6,7 p>0,05 GG 25 48,39%^* 6 15,15%* 7,5 1,8-29,9 p<0,05 MTHFR A1298C rs1801131 AA 8 16,13% 16 36,36% 1,00 AС 15 29,03% 22 51,52% 1,2 0,3-4,7 p>0,05. СС 28 54,84%* 5 12,12% 10,2* 2,2-46,09 p<0,05 MTRR A66G AA 6 12,90% 18 42,42% 1,0 AG 23 45,16% 20 45,45% 3,2 0,8-12,3 p>0,05 GG 22 41,94%* 5 12,12%* 11,37 2,3-55,12 p<0,05 * - различия показателей статистически значимы (p<0,05);
**-ПП - поражение почек.

Способ осуществляется следующим образом

Для определения уровня эндотелина-1, ТФРβ, гомоцистеина в крови и моче проводился забор биологических жидкостей в утренние часы.

Забор крови осуществлялся из вен локтевого сгиба с использованием системы Vacutainer. Сбор мочи проводили после гигиенического туалета наружных половых органов в стерильные контейнеры для сбора биологического материала. Далее, полученные образцы центрифугировали в течение 15 минут при 3000 оборотов на центрифуге ЦЛМН-Р10-01-«Элекон». Полученную сыворотку крови и надосадочную жидкость мочи разливали в полипропиленовые пробирки типа «Эппендорф» (Китай) с последующей глубокой заморозкой при -18°С до проведения исследования не более трех месяцев.

Для количественного исследования указанных биомаркеров в крови и моче применялся метод иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием многофункционального анализатора «Clima» (Финляндия) с применением коммерческих наборов для иммуноферментного анализа (Cloud-Clone Corp. (США)) по принципу метода ELISA. Методика основывается на качественном и количественном определении исследуемого антигена с помощью моноклональных антител, фиксированных на поверхности лунок 96-местной планшетки. Данные антитела способны послойно связываться с антигеном. При этом не связавшиеся протеины удаляли методом отмывания. Далее добавление поликлональных антител, связанных с энзимом, приводило к их наслоению по принципу «сэндвича» на антиген, который был иммобилизирован в ходе первой инкубации. Методом отмывания удалялись излишки образцов. На следующем этапе, после добавления в лунки раствора хромогенного субстрата, наступала реакция с энзимом с окрашиванием в характерный цвет. По интенсивности данного окрашивания проводили оценку уровня исследуемого агента в пробе.

Всем детям проводились специальные методы для оценки полиморфизма генов при вторичных поражениях почек у детей с ревматическими заболеваниями: определение генов компонентов, вовлеченных в патогенез эндотелиальной дисфункции и нарушений цитокинового статуса: метилентетрагидрофолатредуктазы - MTHFR (A1298C), метионин-синтазы - MTR (2756A/G), метионин-синтазы редуктазы - MTRR (A66G) методом аллель-специфической гибридизации в формате полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ТaqMan). Материалом для молекулярно-генетического исследования явились образцы буккального эпителия. Забор биоматериала осуществлялся не ранее 20-30 минут после еды, ротовая полость не должна была содержать остатков пищи. Тампон предварительно был промаркирован (имя, номер). Тампоном с нажимом протирали внуреннюю поверхность обеих щек (слизистую со стороны ротовой полости) в течение 15-30 секунд, вращая его вокруг оси. После забора биоматериала тампон аккуратно помещался обратно в упаковку. Генотипирование проводилось методом аллель-специфической гибридизации в формате полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ТaqMan). Выделение ДНК из лейкоцитов крови проводилось с использованием комплекта реагентов для выделения ДНК «Проба ГС» (ООО «НПО ДНК-Технология»). ПЦР-амплификация ДНК выполнена для определения указанных выше полиморфизмов генов с использованием наборов, разработанных и произведенных научно-производственной компанией «Синтол». Молекулярно-генетическое исследование выполнено на детектирующем амплификаторе DTlite (ООО «НПО ДНК-Технология»).

У всех пациентов с вторичными нефропатиями при ревматических заболеваниях имело место повышение уровня эндотелина-1 и ТФРβ в крови и моче, гомоцистеина в моче и наличие хотя бы одного из патологических генотипов MTHFR A1298C, MTR A2756G, MTRR A66G. Полученные данные позволяют использовать данные показатели эндотелиальной дисфункции и полиморфизма генов в качестве диагностических критериев вторичных нефропатий при ревматических заболеваниях.

Технический результат достигается тем, что у детей с ревматическими заболеваниями в сыворотке крови и в моче определяют концентрацию эндотелина-1, ТФРβ; в моче - уровень гомоцистеина и при повышении данных показателей в диапазонах ЭТ-1 крови и моче (264,5-322,49 пг/мл; 20,5-36,2 пг/мл), ТФРβ в крови и моче (53,7-97,57 пг/мл; 69,9-143,17 пг/мл); уровня гомоцистеина в моче 399,8-1500,6 нг/мл определяют риск формирования вторичных нефропатий при ревматических заболеваниях у детей.

Кроме этого, у детей с ревматическими заболеваниями определяют методом аллель-специфической гибридизации в формате полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени полиморфизм патологического генотипа фолатного цикла СС метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) A1298C, GG - метионин-синтазы (MTR) A2756G, GG - метионин-синтазы редуктазы (MTRR) A66G и наличие хотя бы одного из патологических генотипов свидетельствует о риске формирования вторичных нефропатий при ревматических заболеваниях у детей.

Преимуществами данного способа являются:

- ранняя неинвазивная диагностика вторичных нефропатий при ревматических заболеваниях у детей;

- отсутствие противопоказаний к назначению данного способа диагностики;

- возможность применения на амбулаторно-поликлиническом уровне.

Представляются существенными следующие возможности клинического применения способа:

1. Этот метод предоставляет возможность выявления вторичных нефропатий при ревматических заболеваниях у детей на доклинической стадии, что способствует своевременному назначению профилактических мероприятий и предотвращению дальнейшего ухудшения состояния почек.

2. Возможность применения данного метода на амбулаторно-поликлиническом уровне у детей из диспансерной группы, находящихся под наблюдением педиатров, ревматологов и педиатров-нефрологов, способствует эффективному и динамичному контролю за детьми, находящимися в группе риска развития вторичных нефропатий как на амбулаторно-поликлиническом, так и на стационарном уровне. Это в свою очередь приводит к сокращению финансовых затрат на лечение пациентов с вторичными нефропатиями, за счет ранней диагностики вторичных нефропатий при ревматических заболеваниях и своевременного назначения профилактических мероприятий, что способствует снижению инвалидизации пациентов за счет предотвращения прогрессирования нефросклероза.

Примеры применения

Клинический пример 1

Даниил Ш., 10 лет, находился на диспансерном учете у участкового врача педиатра, нефролога и ревматолога. Из анамнеза заболевания известно: ребенок госпитализирован в специализированное нефрологическое отделение ГАУЗ «ГКБ № 6» г. Оренбурга. Проведен нефрологический консилиум, установлен диагноз «системный микротромбоваскулит, тяжелая форма (кожнопочечная), осложненная постваскулитным нефритом». Функция почек сохранена. В динамике болезни: патологический мочевой синдром: протеинурия нефротического типа до 3 г/сут, в разовой моче 2,8 г/л, гематурия - эритроцитов большое количество. Ребенку назначена базисная терапия: преднизолон - 60 мг/сут, проведено 5 пульсов метилпреднизолона - 20 мг/кг (900 мг), 2 пульса циклофосфаном 15 мг/кг (600 мг), каждые 14 дней из расчета 15 мг/кг - 600 мг, затем 4 пульса циклофосфана ежемесячно, 20 мг/кг (900-1000 мг). С нефропротективной целью назначен эналаприл 2,5 мг/сут, сопроводительная терапия. На фоне проводимой терапии состояние с положительной динамикой, суточная протеинурия стабильно отрицательная, СКФ - 112 мл/мин. (гиперфильтрация). На СМАД лабильная систолическая артериальная гипертензия. После выписки наблюдался участковым педиатром и педиатром-нефрологом. Ребенок неоднократно поступал в стационар для контроля, проведения коррекции терапии. Проведено лечение: преднизолон 25 мг / 48 час по четным дням, эналаприл. В связи с тяжестью заболевания и признаками прогрессирования почечной патологии ребенку было показано проведение биопсии, генетических исследований. Учитывая лабильную систолическую артериальную гипертензию, нарастание суточной протеинурии пренефротического типа до 0,7 г/л на фоне иммуносупрессивной терапии, ребенок госпитализирован для оказания высокотехнологичной помощи в педиатрическое отделение № 1 (нефрология) клиники ФГБОУ ВО «СанктПетербургский ГПМУ» Минздрава России. В отделении нефрологии ФГБОУ ВО СПбГПМУ МЗ РФ проведена морфобиопсия. Установлен морфологический вариант нефрита: мезангиопролиферативный гломерулонефрит с сегментарным гломерулосклерозом отдельных капиллярных петель, в структуре IgA-нефропатии. Рекомендовано: продолжить терапию преднизолоном с последующим снижением до 10 мг / 48 час, в терапию подключен майфортик по 360 мг 2 раза в день, утро и вечер, в течение 6 месяцев. Продолжить сопроводительную терапию при стероидной терапии (омепразол, препараты кальция, калия, вит. Д3). С нефропротективной целью получал эналаприл 5 мг/сут. При последующем стационарном обследовании: функция почек сохранена, на фоне эналаприла - артериальной гипертензии нет. При амбулаторном наблюдении в ОАМ патологических изменений не выявлено, суточная протеинурия - 0,2 г/л, отмечалось однократное повышение уровня креатинина до 117 мкмоль/л. При последующем стационарном обследовании через 3 месяца: функция почек сохранена, СКФ 112 мл/мин. Преднизолон отменен полностью. При последующем стационарном обследовании через 6 месяцев: СКФ по Шварцу - 135 мл/мин (гиперфильтрация), суточная протеинурия отрицательная, МАУ - 0,03 г/л, ОАМ без патологических изменений. На СМАД артериальной гипертензии на фоне эналаприла 5 мг/сут нет. На УЗИ почек, допплерография почечных сосудов: Vs (систолическая скорость кровотока) - 68,2 мм/сек, Vd (диастолическая скорость кровотока) 12,2 мм/сек, Ri (индекс резистентности) 0,55, Pi (пульсационный индекс) 0,87. Проведено определение показателей эндотелиальной дисфункции и профиброгенных медиаторов в крови и моче: эндотелина-1 крови - 370,17 пг/мл, эндотелина-1 мочи - 8,27 пг/мл, ТФРβ крови - 176,8 пг/мл, ТФРβ мочи - 64,9 пг/мл, гомоцистеин мочи - 415,2 нг/мл; MTR A2756G - генотип GG - патология (гомозигота).

Таким образом, у пациента при обследовании выявлены патогенетические факторы вторичных нефропатий: нарушение внутрипочечной гемодинамики, гиперфильтрация, микроальбуминурия в сочетании с повышением уровня показателей эндотелиальной дисфункции и наличием патологического генотипа гена MTR A2756G, что свидетельствует о вторичных нефропатиях у пациента с ревматическим заболеванием.

Клинический пример 2

Александр Ю., 16 лет, состоит на диспансерном учете у участкового врача педиатра, нефролога и ревматолога с диагнозом: Постваскулитный нефрит: изолированный мочевой синдром (микрогематурия). ХБП 1 ст. Геморрагический васкулит, реконвалесцент.

При обследовании диагностировано: гиперфильтрация (СКФ -139 мл/мин); микроальбуминурия положительная, 50 мг/л; УЗИ почек - диффузные изменения почек (повышенная эхогенность почек), линейные гиперэхосигналы в просвете почечного синуса; на допплерография почечных сосудов: Vs (систолическая скорость кровотока) - 105 мм/сек, Vd (диастолическая скорость кровотока) 8,12 мм/сек, Ri (индекс резистентности) 0,60, Pi (пульсационный индекс) 0,92. По данным СМАД -артериальной гипертензии нет. Проведено определение показателей эндотелиальной дисфункции в крови и моче: эндотелина-1 крови - 347,37 пг/мл, эндотелина-1 мочи - 6,243 пг/мл, ТФРβ крови - 118,5 пг/мл, ТФРβ мочи - 98,3 пг/мл; гомоцистеин мочи - 902,1 нг/мл; MTHFR A1298C - генотип CC - патология (гомозигота); MTR A2756G - генотип GG - патология (гомозигота); MTRR A66G - генотип GG - патология (гомозигота).

Таким образом, у пациента при обследовании выявлены повышение уровня показателей эндотелиальной дисфункции и определен патологический генотип гена MTR A2756G, MTHFR A1298C, MTRR A66G в сочетании с патогенетическими факторами повреждения почек: нарушение внутрипочечной гемодинамики, гиперфильтрация, микроальбуминурия, что свидетельствует о вторичных нефропатиях при ревматических заболеваниях у детей.

Клинический пример 3

Кирилл П., 10 лет, находился на стационарном обследовании и лечении на гематологических койках кардиологического отделения ОДКБ с диагнозом: Геморрагический васкулит, тяжелая форма с кожно-суставным, абдоминальным синдромом, острое течение. Нефрит при васкулите без нарушения функции почек.

При обследовании диагностировано: Суточный белок 0.795; в ОАМ эритроциты до 50 п/з; СКФ по пробе Реберга СКФ 141 мл в мин, канальциевая реабсорбция 99,3%. УЗИ почек - увеличение размеров почек, умеренные диффузные изменения паренхимы; на допплерографии почечных сосудов: Vs (систолическая скорость кровотока) - 85 мм/сек, Vd (диастолическая скорость кровотока) 19,3 мм/сек, Ri (индекс резистентности) 0,64, Pi (пульсационный индекс) 0,87. По данным СМАД - артериальной гипертензии нет. Проведено определение показателей эндотелиальной дисфункции в крови и моче: эндотелина-1 крови - 339,47 пг/мл, эндотелина-1 мочи - 11,1 пг/мл, ТФРβ крови - 111,2 пг/мл, ТФРβ мочи - 139,4 пг/мл; гомоцистеин мочи 725,1 нг/мл; MTHFR A1298C - генотип CC - патология (гомозигота); MTR A2756G - генотип GG - патология (гомозигота); MTRR A66G - генотип GG - патология (гомозигота).

При обследовании у пациента выявлены нарушение функции почек в сочетании с повышением уровня показателей эндотелиальной дисфункции и наличием патологического генотипа гена MTR A2756G, MTHFR A1298C, MTRR A66G что свидетельствует о вторичной нефропатии у пациента с ревматическим заболеванием.

Клинический пример 4

Лилианна К., 10 лет, находился на стационарном обследовании и лечении на гематологических койках кардиологического отделения ОДКБ с диагнозом: Геморрагический васкулит, кожно-суставная форма.

При обследовании: в ОАМ эритроцитов нет, белок отсутствует; СКФ по формуле Шварца 111 мл в мин, канальциевая реабсорбция 99,3%. УЗИ почек - форма обычная, контуры: ровные, кортико-медуллярная дифференциация прослеживается, паренхима: область ворот 10 mm, эхогенность обычная, ЧЛС: не дилатирован, Левая: расположение: норма, размеры: длина 71 mm, ширина 27 mm, форма обычная, контуры: ровные, кортико-медуллярная дифференциация прослеживается, паренхима: область ворот 11 mm, эхогенность обычная, ЧЛС: не дилатирован. Заключение: Без видимой патологии; на допплерографии почечных сосудов: кровоток до капсулы. По данным СМАД - артериальной гипертензии нет. Проведено определение показателей эндотелиальной дисфункции в крови и моче: эндотелина-1 крови - 233,3 пг/мл, эндотелина-1 мочи - 16,1 пг/мл, ТФРβ крови - 26,9 пг/мл, ТФРβ мочи - 58,9 пг/мл, гомоцистеин мочи 115,6 нг/мл; у пациентки не обнаружен патологический генотип MTHFR A1298C; MTR A2756G; MTRR A66G.

Таким образом, у данного пациента при обследовании не выявлены нарушение функции почек, уровни показателей эндотелиальной дисфункции не находятся в определенных диапазонах, отсутствуют патологический генотип генов MTR A2756G, MTHFR A1298C, MTRR A66G, что свидетельствует об отсутствии предрасположенности к развитию вторичной нефропатии при ревматическом заболевании у пациента. Следовательно, данный пациент не входит в группу риска по формированию вторичных нефропатий.

Список литературы

1. Арзиманова, Н.А. Иммуно-морфологические особенности гломерулярного и тубулоинтерстициального поражения почек у больных системной красной волчанкой / Н.А. Арзиманова, В.В. Марасаев, Т.О. Абиссова // Научно-практическая ревматология. - 2009. - Т. 47, № 2. - С. 17-22.

2. Берман, Ю.О. Фолиевая кислота в лечении больных геморрагическим васкулитом с наследственными нарушениями метаболизма гомоцистеина / Ю. О. Берман, И. Л. Давыдкин, С. П. Кривова // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2014. - Т. 16, № 5-4. - С. 77-81.

3. Валеева Ф.В. Значение мембранных нарушений в развитии и прогрессировании диабетической нефропатии: автореф. дис. … докт. мед. наук. - Казань, 2005. - 40 с.

4. Вельков В.В. Новые ренальные биомаркеры для неонатологии и педиатрии: цистатин с и ngal / В.В. Вельков //Педиатрия - 2014. - том 94 . -№3. - С.167-174.

5. Верещагина Т.Д. Вторичные нефропатии: Приглашение к дискуссии/Т.Д. Верещагина// Верхневолжский медицинский журнал. - 2014. - Т 12 (3). -С. 41-44.

6. Взаимосвязь аллельных вариантов генов системы гемостаза на развитие и течение волчаночного нефрита / Е.Н. Борисов, Л.В. Иваницкий, Л.М. Самоходская [и др.] // Нефрология. - 2019. - Т. 23, № 2. - С. 77-81.

7. Дедов И.И. Сахарный диабет и хроническая болезнь почек / И.И. Дедов, М.В. Шестакова. - М: ООО «Медицинское информационное агентство», 2009 - 482 с.

8. Диагностика и лечение болезней почек / Н.А. Мухин, И.Е. Тареева, Е.М. Шилов, Л.В. Козловская. - Москва: ГЭОТАР-медиа, 2011. - 384 с.

9. Игнатова М.С. CAKUT - синдром у детей/ М.С. Игнатова// Педиатрия.- 2012. - № 9 (6). - С. 141-144.

10. Jafari-Nakhjavani, M.R. Correlation of plasma interleukin-18 concentration and severity of renal involvement and disease activity in systemic lupus erythematosus / M. R. Jafari-Nakhjavani, S. Abedi-Azar, B. Nejati // Journal of nephropathology. - 2016. - V. 5, № 1. - P. 28-33.

11. Козыро, И.А. Генетический полиморфизм STAT4, PTPN22, VEGF, TGFB, PDCD1 и Pd-L1 у пациентов с первичными гломерулопатиями / И. А. Козыро, А. Г. Белькевич, А. В. Сукало // Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 2020. - Т. 65, № 4. - С. 275.

12. Комарова, О.В. Эндотелиальная дисфункции при хронической болезни почек у детей / О. В. Комарова, И. Е. Смирнов, А.Г. Кучеренко // Российский педиатрический журнал. - 2012. - № 5. - С. 23-26.

13. Кочуева М.Н. Нейроэндокринные механизмы развития нефропатии у больных эссенциальной артериальной гипертензией с ожирением/ М.Н. Кочуева, В.А. Гаврилюк // Схiдноєвропейський журнал внутрiшньої та сiмейної медицини. - 2014.

14. Макарова, Т.П. Эндотелиальная дисфункция при хронической болезни почек у детей / Т. П. Макарова, Ю. С. Мельникова // Медицина: теория и практика. - 2019. - Т. 4, № S. - С. 330.

15. Макарова Т.П. Эхокардиографические параметры сердца при хронической болезни почек у детей и подростков / Т.П. Макарова, Ю.С. Мельникова// Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 2017. - №5. С. 149-152.

16. Мингазова, Э. М. Связь полиморфизмов генов цитокинов (TNFα, IL-1β, IL-1RN) и индуцибельной синтазы оксида азота (NOS2a) с развитием осложнений у больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом / Э. М. Мингазова // Практическая медицина. - 2015. - Т. 88, № 3. - С. 86-90.

17. Особенности распределения полиморфных вариантов генов, ассоциированных с тромбофилией и артериальной гипертензией у детей с гемолитикоремическим синдромом / Е.А. Панков, К.А. Папаян, С.И. Капустин, Н.Д. Савенкова // Нефрология. - 2020. - Т. 24, № 3. - С. 90-94.

18. Основы клинической гемостазиологии: монография / И.Л. Давыдкин, В.А. Кондурцев, Т.Ю. Степанова, С.А. Бобылев. - Самара: Офорт, 2009. - 456 с.

19. Semidotskaya, Zh. D. The indices of endothelin-1 and fibronectin in patients with diabetic nephropathy / Zh. D. Semidotskaya, L. A. Pererva // Ukr ter journal. - 2004. - V. 1, № 1. - P. 66-68.

20. Сивцева, Е.М. Роль эндотелиальной дисфункции в прогрессировании хронических заболеваний почек у детей / Е.М. Сивцева // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2011. № 1. С. 47−53.

21. Степанова, А.А. Патология почек при ювенильном ревматоидном артрите / А. А. Степанова // Нефрология. - 2013. - Т. 17, № 3. - С. 33-45.

22. Смирнов И.Е. Новый способ определения объема функциональной активной ткани почек у детей / И.Е. Смирнов, Н.П. Герасимова, Н.Л. Комарова, В.И. Видюков// Российский педиатрический журнал. - 2011. - № 2.-С. 48-51.

23. Шмелева В.М., Смирнова О.А., Салтыкова Н.Б., Матвиенко О.Ю., Силина Н.Н., Гуржий А.А., Папаян Л.П. Гипергомоцистеинемия - фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний или маркер остроты процесса? // Тромбоз, гемостаз и реология. - 2010. - № 4 (44). - С. 67-74.

24. Sharma K. Obesity and diabetic kidney disease: role of oxidant stress and redox balance. / K. Sharma //Antioxid Redox Signal. - 2016 - Vol. 25 - Р. 208-216.

25. Шишкин А.Н. Дисфункция эндотелия и микроальбуминурия. Клиническое значение и терапевтические подходы / А.Н. Шишки// Передовые медицинские технологии практическому здравоохранению. Материалы научно-практической конференции, посвященной 50-летнему Юбилею городской больницы №20.- СПб. - 2008. - С. 193- 200.

26. Kidney disease: Improving Global outcomes (KdIGo) cKd Work Group. KdIGo 2012 clinical Practice Guideline for the Evaluation and Management of chronic Kidney disease.// Kidney int. - 2013. - Suppl. 3: 1-150.

27. Патент РФ на ИЗ № 2725850 от 06.07.2020, «Способ ранней диагностики хронического тубулоинтерстициального повреждения почек у пациентов с анкилозирующим спондилитом».

28. Патент РФ на ИЗ № 2333497 от 10.09.2008, «Способ прогнозирования хронической почечной недостаточности у больных с посткапилляротоксическим гломерулонефритом».

29. Патент РФ на ИЗ № 2753588 от 18.08.2021, «Способ диагностики доклинической стадии вторичных нефропатий у детей».

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической нефрологии, и может быть использовано для диагностики вторичных нефропатий при ревматических заболеваниях у детей. Методом иммуноферментного анализа определяют уровень маркеров эндотелиальной дисфункции и факторов роста: эндотелина-1 в крови и моче, трансформирующего фактора роста β в крови и моче, гомоцистеина в моче, определяют генотипы генов фолатного цикла: метилентетрагидрофолатредуктазы MTHFR A1298C, метионин-синтазы MTR A2756G, метионин-синтазы редуктазы MTRR A66G. При определении уровня хотя бы одного из маркеров в указанных диапазонах: эндотелина-1 в сыворотке 264,5-322,49 пг/мл, в моче 20,5-36,2 пг/мл; трансформирующего фактора роста β в сыворотке 53,7-97,57 пг/мл, в моче 69,9-143,17 пг/мл; гомоцистеина в моче 399,8-1500,6 нг/мл, и определении наличия хотя бы одного из патологических генотипов: СС - MTHFR A1298C, GG - MTR A2756G, GG - MTRR A66G, диагностируют вторичные нефропатии при ревматических заболеваниях у детей. Способ обеспечивает возможность информативной диагностики вторичных нефропатий у детей с ревматическими заболеваниями за счет оценки комплекса показателей эндотелиальной дисфункции: эндотелина-1, гомоцистеина, трансформирующего фактора роста β с учетом генетической предрасположенности: полиморфизмов генов фолатного цикла MTR A2756G, MTHFR A1298C, MTRR A66G. 2 табл., 4 пр.

Способ диагностики вторичных нефропатий при ревматических заболеваниях у детей, отличающийся тем, что методом иммуноферментного анализа определяют уровень маркеров эндотелиальной дисфункции и факторов роста: эндотелина-1 в крови и моче, трансформирующего фактора роста β в крови и моче, гомоцистеина в моче, определяют генотипы генов фолатного цикла: метилентетрагидрофолатредуктазы MTHFR A1298C, метионин-синтазы MTR A2756G, метионин-синтазы редуктазы MTRR A66G; и при определении уровня хотя бы одного из маркеров в указанных диапазонах: эндотелина-1 в сыворотке 264,5-322,49 пг/мл, в моче 20,5-36,2 пг/мл; трансформирующего фактора роста β в сыворотке 53,7-97,57 пг/мл, в моче 69,9-143,17 пг/мл; гомоцистеина в моче 399,8-1500,6 нг/мл, и определении наличия хотя бы одного из патологических генотипов: СС - MTHFR A1298C, GG - MTR A2756G, GG - MTRR A66G диагностируют вторичные нефропатии при ревматических заболеваниях у детей.