Способ диагностики плацентарной недостаточности инфекционно-воспалительного генеза в сроке 34-36 недель беременности Российский патент 2019 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству, и может быть использовано для диагностики плацентарной недостаточности инфекционно-воспалительного генеза у беременных в сроке 34-36 недель.

Плацента, являющаяся взаимосвязывающим звеном между организмом матери и внутриутробно развивающимся плодом, представляет собой одну из наиболее сложных тканей млекопитающих. Этот орган с резко генерализованными обменными процессами, обладающий одновременно свойствами печени, почек, легких и в тоже время имеющий своеобразную характеристику собственного обмена веществ (Савельева Г.М. и соавт. // Акушерство и геникология. - 2010. - №6. - С. 4-9).

Развитие плаценты в условиях беременности, осложненной инфекционно - воспалительным процессом, сопровождается модификацией структурно - функционального состояния ее плазматических мембран (Погорелова Т.Н. и соавт. // Российский вестник акушера - гинеколога. - 2016. - 16 (2). - С 18-22). Отклонения в нормальном течении метаболических реакций плаценты в результате нарушения механизмов их регуляции, превышающие компенсаторно - приспособительные возможности органа, приводит к истощению последних и формированию плацентарной недостаточности.

Существенную роль в развитии плацентарной недостаточности играют изменения в составе и свойствах белков плаценты, а также в фонде низкомолекулярных азотистых оснований; свободных и связанных аминокислот, содержанием пуриновых оснований, изменяется активность и изоферментный спектр ряда ферментов аминокислотного, пуринового, нуклеозидного и нуклеотидного обменов. И самое главное - происходит модификация ее плазматических мембран, проявляющаяся в нарастании степени перекисного окисления мембранных липидов, изменения соотношений основных компонентов мембранных липидов, активности мембранных ферментов, увеличением микровязкости. Метаболические последствия таких изменений могут быть весьма существенными. Клетки плаценты обладают широким спектром синтетических и катаболических реакций, наличие сопряженных и шунтовых механизмов позволяет поддерживать на определенном уровне общий метаболический баланс органа и, тем самым, предохранять от различных вредных воздействий (Миронова А.В. и соавт. // Современная наука: Актуальные проблемы теории и практики. - 2016. - серия: Естественные и технические науки. - №2).

Универсальность мембранных повреждений при плацентарной недостаточности различного происхождения подтверждена экспериментальными исследованиями в условиях высотной гипоксии (Жапаралиева Ч.О. и соавт. // Ульяновский медико-биологический журнал. - 2012. - №1. - С. 57-63).

Возрастающие потребности плода, процессы его роста и дифференцировки обусловливают специализацию и ускоренное развитие функций плаценты.

Поскольку плацентарная недостаточность является важнейшим фактором для возможной преждевременной активации сократительной деятельности матки, то представляется важным поиск причин и элементов, обусловливающих недостаточность плаценты. На данном этапе развития научных исследований, касающихся плаценты, установлено, что ее роль в нарушениях плодово - материнского метаболизма велика потому, что провоспалительные цитокины, и в частности ФНО_α, вызывает ускоренный апоптоз ее клеток (Головин И.Ю. // Рациональная Фармако Терапия. - 2012. - 3(24). - С. 46-51).

Поскольку развитие апоптоза является одним из факторов в формировании плацентарной недостаточности, то представляется важным диагностика данного осложнения в течение беременности, что позволит своевременно восстановить ее функцию. Последнее будет способствовать предупреждению преждевременных родов и задержки роста плод (Рибони Ф. и соавт. // Репродуктивное здоровье. Восточная Европа: международный научно - практический журнал. - 2013. - №3. - С. 126-133).

В настоящее время, несмотря на многочисленные исследования и достигнутые успехи, сохраняются определенные трудности в точной и объективной диагностике плацентарной недостаточности на фоне инфекционно - воспалительного процесса у беременной женщины.

Среди известных в научно - медицинской и патентной литературе методов оценки плацентарной недостаточности можно отметить способ ранней диагностики формирующейся плацентарной недостаточности по биохимическому анализу крови с определением концентрации малонового диальдегида (МДА), общей антиоксидантной активности плазмы (АОА) и последующую оценку антиоксидантной защиты организма (АОЗ). При этом дополнительно определяют активность каталазы и концентрацию гидроперекисей липидов. По полученным данным рассчитывают коэффициент депрессии антиоксидантного потенциала крови (КДАС). При КДАСО равно 0,75 диагностируют плацентарную недостаточность (патент РФ №2180113, 27.02.2002).

Данный способ обладает рядом недостатков:

- Определение малонового диальдегида (МДА) при плацентарной недостаточности является неспецифичным и имеет место быть при многих патологических состояниях во время беременности.

- Требует сложного расчета с использованием общей антиокислительной активности плазмы (АОА) для расчета последующей антиокислительной защиты организма (АОЗ).

- Необходимо дополнительно определять активность каталазы и концентрацию гидроперекисей липидов.

Известным диагностическим методом исследования в практике акушера - гинеколога являются радиоиммунологический (РИА) и иммуноферментный (ИФА) анализ, которые позволяют определять в биологических жидкостях (плазма, сыворотка, моча, амниотическая жидкость и т.п.) количественное содержание гормонов - регуляторов репродуктивной функции. По снижению синтеза гормонов (эстрогенов, прогестерона и плацентарного лактогена), которые определяются в крови беременной в течение всего срока гестации, можно судить о наличии плацентарной недостаточности (Зяблицев С.В. и соавт, 2005).

Этот способ обладает рядом несовершенств:

- Уровень гормонов необходимо определять в динамике в разные сроки беременности до рождения ребенка.

- К недостаткам следует отнести также необходимость комплексного определения уровня указанных гормонов и расчет соответствующих коэффициентов.

- Отсутствуют указания на причину изменения уровня гормонов в крови женщины с плацентарной недостаточностью.

Прототипом данного изобретения избран способ диагностики плацентарной недостаточности путем исследования биологического материала, отличающийся тем, что в околоплодных водах женщин в 16-20 недель беременности определяют ДНК - связывающую активность транскрипционного фактора NF-kB и при ее значении от 2,9 до 3,7 ед/мг белка диагностируют компенсированную плацентарную недостаточность, а при значении 2,8 ед/мг белка и ниже диагностируют декомпенсированную плацентарную недостаточность (патент РФ №2463595, 10.10.2012).

Данный метод имеет недостатки:

- Определение ДНК связывающей активности NF - кВ проводят в околоплодных водах, а это связано со сложной манипуляцией - амниоцентезом; проведение которой может привести к прерыванию беременности.

- Получение околоплодных вод связано с наличием специалиста особо высокого класса.

Основными недостатками вышеописанных способов диагностики плацентарной недостаточности является, прежде всего, как травматичность, так длительность определения необходимых метаболитов, а также особенно сложные расчеты и низкий процент достоверности.

Задача заявляемого изобретения разработка нетрудоемкого специфического способа диагностики плацентарной недостаточности в сроке 34-37 недель беременности на фоне различного инфекционно - воспалительного процесса.

Поставленная задача решается следующим образом: у беременной с различным инфекционно - воспалительным процессом в 34-36 недель в сыворотке венозной крови определяют содержание толл - подобного рецептора 4 (TLR-4) и фактора роста опухоли (ФНО_α) и при величине TLR-4, равной 7,5 мкг/мл и более, а ФНО_α, равном 78,5 пкг/мл и более, диагностируют плацентарную недостаточность инфекционного генеза.

Технический результат, получаемый при использовании данного способа в клинической практике состоит в том, что заявленный способ обладает высокой точностью и является специфичным для определения инфекционной этиологии плацентарной недостаточности.

Предпосылками для выбора данного признака послужила особенность TLR-4 (толл - подобный рецептор - 4), обеспечивающий антиинфекционную защиту организма, то есть является основой врожденного иммунитета, представляющего собой наследственно закрепленную систему защиты от патогенов. TLR-4 при взаимодействии с патогенными микроорганизмами распознает бактериальные структуры (липополисахариды, липопротеины). При взаимодействии TLR-4 с лигандом происходит выработка адаптерного белка MyD 88, который активирует ядерный транскрипционный фактор NFkB, инициирующий в ядре транскрипцию гена провоспалительного цитокина ФНО_α (фактора некроза опухоли). ФНО_α - это внеклеточный белок, который практически отсутствует в крови здорового человека и активно вырабатывается при воспалении. Основная роль ФНО_α - участие в воспалительных и иммунных реакциях и на всех этапах выступает в качестве одного из основных регулирующих белков. При возникновении воспалительного процесса в организме, уже в течение 2-3 часов ФНО_α достигает максимальной концентрации. (Ахматова Н.К., Киссельский М.В. - Практическая медицина. - 2008. - 256 с.; Kawagoe Т. Et al. - Nat Immunol. - 2009. - P. 965-972; Лебедева О.П. и соавт. - 2012. - Иммунопатология, аллергология, инфектология. - №1. - С. 19-26; Коровкина Е.С., Кажарова С.В. - 2016. - Инфекция и иммунитет. - №2. - С. 109-116). Активация ФНО_α может привести к апоптозу клеток трофобласта во время беременности, что обусловливает плацентарную недостаточность (Голович И.Ю. // Рациональная Фармако Терапия. - 2012. - 3(24). - С. 46-51).

В ходе наших исследований выявлено, что содержание TLR-4 в сыворотке крови беременных в 34-36 недель на фоне инфекционного процесса, больше на 7,5 мкг/мл относительно контрольных данных, а ФНО_α - в 1,5 раза, что дало основание для разработки нового метода плацентарной недостаточности в 34-36 недель беременности. При величине TLR-4 равном 7,5 мкг/мл и более, а ФНО_α равном 78,5 пкг/мл и более в сыворотке крови беременной диагностируют плацентарную недостаточность инфекционной этиологии.

Под наблюдением находилось 89 женщин в возрасте 20-39 лет в сроке беременности 34-36 недель. Данный срок гестации в случае угрозы ее прерывания представляет большую опасность, так как дети, родившиеся недоношенными, составляют контингент ранней детской смертности и заболеваемости. Причиной преждевременных родов в большинстве случаев является плацентарная недостаточность, которая обусловливает нарушение маточно-плацентарного кровотока, вызывая страдания плода. Среди 89 женщин 42 пациентки были с различными инфекционно-воспалительным процессом (эндоцервицит 51,4%; кольпит 43,2%; инфекции передающиеся половым путем 30,5%; инфекции мочевыводящей системы 19,2%; респираторная бактериальная инфекция 8,5%) и 47 беременных женщин с отсутствием инфекционно-воспалительных факторов (27 женщин с физиологическим течением беременности и 20 женщин с экстрагенитальной патологией).

Подробное описание способа и примеры его клинического выполнения.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом: у беременных с выявленным инфекционно - воспалительным процессом в третьем триместре беременности (как правило, в период с 34-ой по 36-ю неделю беременности) однократно осуществляют взятие крови из локтевой вены в количестве 5 мл, центрифугируют и в сыворотке крови определяют содержание TLR-4 и ФНО_α по общепринятым методикам. Определение TLR-4 осуществляют иммуноферментным анализом типа «сэндвич», наборами фирмы Uscnk Life Science Inc. Количественная оценка проводится на многофункциональном программируемом счетчике для иммунологических исследований с компьютером и программным обеспечением Multilabel Counter Victor - 2 1420 (Финляндия), иммуноферментном анализаторе TECAN Sunrise (Австрия), автоматическом анализаторе Immulite 2000хр (Германия). Определение уровня ФНО_α в сыворотке крови проводят с помощью наборов фирмы BIOSOURCE (USA). Согласно инструкции к набору готовят промывочный буфер, раствор стандарта стрептавидин - пероксидазного конъюгата. В специальные лунки планшета, которые покрыли поликлональными антителами к ФНО_α, вносят 50 мкл инкубационного буфера. В лунку - бланка для разведения стандартов вносят 100 мкл раствора, а в лунки, предназначенные для построения стандартной крови, вносят приготовленные стандартные пробы - 100 мкл, в оставшиеся лунки - 100 мкл исследуемых проб. Накрывают планшет пленкой и в течение двух часов инкубируют при комнатной температуре. По окончании инкубации лунки планшета промывают четыре раза промывочным буфером с помощью промывочного устройства для микропланшетов ELISA WASHER HUMAN (USA). В последующем, 100 мкл раствора биотинилированных антител в ФНО_α вносят во все лунки. Пробы из планшета в течение 1 часа инкубируют при комнатной температуре. Промывочным буфером четыре раза промывают планшет (как было описано ранее). После внесения во все лунки планшета 100 мл раствора субстрата, последний инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Цветную реакцию останавливают добавлением в каждую лунку 100 мкл стоп - реагента. На фотометре MULTILABEL COUNTER 1420 (Финляндия) при 450 нм проводят измерение оптической плотности стандартных растворов и опытных образцов с последующим расчетом результатов в пг/мл.

Если выявляется, что в сыворотке крови беременной величина TLR-4 равна 7,5 мкг/мл и более, а ФНО_α равно 78,5 пкг/мл и более, то у данной беременной диагностируют плацентарную недостаточность инфекционно-воспалительного генеза и применяют адекватную терапевтическую тактику, направленную на устранение инфекционного воспалительного процесса.

Пример 1.

Пациентка С-ова, 27 лет. Поступила в отделение патологии беременных ФГБУ (РНИИАП) 14.06.17 года. Диагноз: Беременность 34 недели, угроза прерывания беременности. Обострение хронического пиелонефрита. В сыворотке крови пациентки проведено определение содержание TLR-4 и ФНО_α. Величина TLR-4 равна 7,5 мкг/мл, а ФНО_α составила 78,5 пкг/мл. Данные показатели свидетельствовали о наличии плацентарной недостаточности на фоне инфекционно - воспалительного процесса. Срочные действия врача, направленные на ликвидацию плацентарной недостаточности, с использованием противовоспалительной терапии способствовали сохранению беременности.

Пример 2.

Роженица П-ко, повторнобеременная, первородящая, 24 года, поступила в родильное отделение НИИ акушерства и педиатрии 04.11.2017 года с жалобами на боли внизу живота и пояснице. Диагноз: Беременность 35 недель, угроза прерывания беременности. Эндоцервицит. Проведено определение в сыворотке крови пациентки содержания TLR-4 и ФНО_α. Величина TLR-4 соответствовала 8,0 мкг/мл, ФНО_α равна 80,0 пкг/мл. Полученные показатели свидетельствовали о наличии плацентарной недостаточности на фоне инфекционно - воспалительного процесса. Назначенная терапия, соответствующая клиническим данным и биохимическим показателям, направленная на устранение инфекционного фактора плацентарной недостаточности, обусловила сохранение беременности.

Пример 3.

Пациентка Е-ва, 25 лет, первобеременная, первородящая, поступила в родильное отделение НИИ акушерства и педиатрии 24.05.2017 года. Диагноз: Беременность 36 недель, угроза прерывания беременности. Сахарный диабет 1 типа, декомпенсация. В сыворотке крови беременной проведено определение содержание TLR-4 и ФНО_α. Величина TLR-4 равна 7,0 мкг/мл, а ФНО_α соответствовала 78,0 пкг/мл. Полученные результаты биохимического исследования свидетельствовали об отсутствии инфекционно - воспалительного процесса. Наличие плацентарной недостаточности у данной пациентки обусловлено экстрагенитальной патологией (сахарный диабет 1 типа, декомпенсация), что существенно влияет на тактику лечения.

Таким образом, заявленный способ более эффективен по сравнению с известными и обладает рядом преимуществ:

1. Обладает высокой точностью и специфичностью определения этиологии плацентарной недостаточности инфекционно - воспалительного характера (98,6%).

2. Клиническое применение способа позволит своевременно применить специфическое лечение и тем самым предупредить рождение недоношенных детей.

Способ апробирован на достаточном клиническом материале и может быть рекомендован к применению в акушерских стационарах.

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству, и может быть использовано для диагностики плацентарной недостаточности у беременной в сроке 34-36 недель на фоне инфекционно-воспалительного процесса. Способ диагностики плацентарной недостаточности инфекционно-воспалительного генеза у беременных 34-36 недель путем исследования сыворотки крови беременной заключается в том, что в сыворотке крови определяют уровень TLR-4 (толл - подобный рецептор - 4) и ФНО_α (фактор некроза опухоли), и при величине TLR-4, равной 7,5 мкг/мл и более, а ФНО_α, равном 78,5 пкг/мл и более, диагностируют плацентарную недостаточность инфекционно-воспалительного генеза. 3 пр.

Способ диагностики плацентарной недостаточности инфекционно-воспалительного генеза у беременных 34-36 недель путем исследования сыворотки крови беременной, отличающийся тем, что в сыворотке крови определяют уровень TLR-4 (толл-подобный рецептор - 4) и ФНО_α (фактор некроза опухоли), и при величине TLR-4, равной 7,5 мкг/мл и более, а ФНО_α, равном 78,5 пкг/мл и более, диагностируют плацентарную недостаточность инфекционно-воспалительного генеза.