Способ тестирования на заражение вирусами посадочного материала картофеля, выращенного in vitro Российский патент 2019 года по МПК C12N7/00 

Изобретение предназначено для использования в сельском хозяйстве для контроля при получении безвирусного посадочного материала картофеля и в фитопатологии при тестировании растений на вирусы.

Появляется все больше данных, свидетельствующих об участии лектинов в таких неспецифических иммунных реакциях, как агглютинация, опсонизация и лизис. Взаимодействуя с углеводными структурами на поверхности бактерий, лектины агглютинируют их в сгустки, которые впоследствии лизируются.

В качестве способа тестирования на заражения вирусами известен способ тестирования на древесных индикаторах (Патент РФ N 2016509 кл. А01Н 1/04, A01G 7/00 Способ диагностики заражения черной смородины реверсией // Атрощенко Г.П. - опубл. 1994, Б.И. N 14) [1].

Известен также способ на травянистых индикаторах (Технология производства безвирусного посадочного материала плодовых, ягодных культур и винограда // М.: ГПО "Союзплодопитомник". - 1989. - С. 6-7.) [2].

Недостатком описанных выше методов тестирования на заражение вирусами является их высокая трудоемкость и высокая стоимость расходных материалов, а так же длительность проведения анализа.

Задачей изобретения является снижение трудоемкости и стоимости расходных материалов а также ускорение процесса тестирования при выявлении заражения вирусами в посевном материале картофеля выращенного в условиях in vitro.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в способе тестирования растений на вирусы, включающем получение концентрата вирусов с посадочного материала и проводят агглютинацию полученных вирусов белковым лектинсодержащим экстрактом корней подорожника большого Plantago major в концентрации 0,03%, при этом если происходит агглютинация, то исследуемый посадочный материал заражен вирусами, а отсутствие агглютинации показывает, что посадочный материал не заражен вирусами.

Для проведения тестирования на заражение вирусами посадочного материала картофеля применяли белковые лектинсодержащие экстракты в концентрации 0,03%, выделенные из семян сои Glycine max, корней лопуха большого Arctium lappa L., из корней одуванчика лекарственного Taraxacum officinale, полыни горькой Artemisia absinthium L., чистотела Chelidonium majus L и корней подорожника большого Plantago major.

Белковые лектинсодержащие экстракты получали из гомогенизированной муки размолотых семян, корней или зеленой массы растений 0,9%-ным раствором хлористого натрия настаиванием в течение 24 часов в соотношении 1:6. Гомогенаты центрифугировали и доводили до pH 4,0, вновь центрифугировали и супернотант нейтролизовали до pH 7,0. Осадок удаляли центрифугированием. Белок высаливали 70% сульфатом аммония. Неочищенный сырой лектин собирали на фильтр и растворяли в дистиллированной воде. Полученные экстракты хранили в холодильнике при температуре 4°C. Выход белковых лектинсодержащих экстрактов из семян сои составляет 32 мг/100 г, из корней одуванчика составляет 44 мг/100 г., корней лопуха 38 мг/100., корней подорожника 32 мг/100 г., составляет 40 мг/100 г, чистотела 27 мг/100 г.

Для выделения вирусов исследуемый растительный материал гомогенизировали в 0,02 М фосфатном буфере, pH 6,8, содержащем 0,2 М сахарозу, и 2 мМ ЭДТА, при соотношении навески и буфера 1:4 (г/мл). Для разрушения растительных тканей использовали лабораторный блендер или керамические ступку с пестиком. Гомогенат осветляли низкоскоростным центрифугированием 2000 об/мин 15 мин при температуре 4°C и фильтровали. Вирус осаждали центрифугированием при 12000 об/мин 20 мин и получали концентрат.

Концентрат вирусов адсорбировали на планшете для ИФА, затем вносили экстракты лектинов с пероксидазной меткой, т.е. к спиртовому раствору бензидина добавляли перекись водорода в соотношении 1:10.

Для сравнения агглютинирующей активности белковых лектинсодержащих экстрактов использовался контроль из стабилизированных эритроцитов человека. Для дифференцирования реакции агглютинации белковыми лектинсодержащими экстрактами вирусов, а не компонентов среды стабилизатора, в котором они находятся, использовался контроль из пробы этой среды, свободной от штаммов микроорганизмов. Оценку степени агглютинации проводили визуально.

Изучение действия белковых лектинсодержащих экстрактов на вирусы подтвердило их способность к агглютинации некоторых из них. Агглютинация белковыми лектинсодержащими экстрактами компонентов среды контроля отсутствовала (среда свободная от вирусов) (Таблица 1).

Приведенные в таблице 1 данные свидетельствуют о том, что белковые лектинсодержащие экстракты корней лопуха большого Arctium lappa L. и лектины чистотела Chelidonium majus L используемых в эксперименте не комплементарны углеводным детерминантам вирусам.

- - Отрицательный результат;

+ - Малая зараженность;

++ - Средняя зараженность;

+++ - Сильная зараженность.

Тестирование на заражение вирусами посадочного материала картофеля выращенного in vitro по тест- системе с применением белковых лектинсодержащих экстрактов, в частности экстрактов из семян сои Glycine max, выявило сильное заражение у картофеля сортов Удача, Лабадиа и Невский. Среднее у сортов Жуковский ранний, Снегирь, Романо и Голубизна. Малая зараженность у сорта Эффект. У сортов Крепыш, Розара, Красавчик, Эффект - заражение вообще не выявлено.

При использовании белковых лектинсодержащих экстрактов корней лопуха большого Arctium lappa L. малая зараженность выявлена только на сортах картофеля Розара, Красавчик и Эффект при том, что на других сортах заражение не выявлено.

Белковые лектинсодержащие экстракты из корней одуванчика лекарственного Taraxacum officinale выявили сильное проявление зараженности у сорта Жуковский ранний, Удача, Невский. Малая зараженность у сортов Крепыш, Розара, Красавчик и Голубизна, В то время, как у сортов Снегирь, Инноватор, Лабадиа, Романо и Эффект заражения не выявлено.

Применение белковых лектинсодержащих экстрактов полыни горькой Artemisia absinthium L. выявило заражение средней степени у сортов картофеля: Удача, Невский и Романо. У сортов Розара, Снегирь, Красавчик и Лабадиа заражения не обнаружено.

Белковые лектинсодержащие экстракты чистотела Chelidonium majus L обнаружили заражение средней степени на сорте Жукоский ранний и слабая степень заражения у сорта Лабадиа, во всех остальных сортах заражение не выявлено.

Изучение зараженности на белковых лектинсодержащих экстрактов из корней подорожника большого Plantago major идентифицировано сильное заражение у сортов Жуковский ранний, Удача и Невский. Средняя степень заражения у сортов Снегирь, Лабадиа, Эффект и Голубизна. Малая степень у сортов Крепыш, Розара, Инноватор, Красавчик и Романо.

Таким образом, при проведении исследований выявлено, что белковые лектинсодержащие экстракты корней подорожника большого Arctium major в концентрации 0,03% являются универсальными для тестирования на заражение вирусами посевного материала картофеля выращенного in vitro.

Тестирование на наличие вирусов в посадочном материале картофеля, выращенном in vitro проводится в течение 3-х часов, и имеет низкую стоимость расходных материалов. Для тестирования другими способами требуется не менее 8 часов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ тестирования на заражение вирусами посадочного материала картофеля, выращенного in vitro, заключающийся в том, что получают белковый лектинсодержащий экстракт корней подорожника большого Plantago major из гомогенизированной муки размолотых корней растений 0,9%-ным раствором хлористого натрия настаиванием в течение 24 часов в соотношении 1:6, после чего гомогенат центрифугируют и доводят до рН 4,0, вновь центрифугируют и супернотант нейтролизуют до рН 7,0, удаляют осадок центрифугированием, белок высаливают 70% сульфатом аммония, поле чего неочищенный сырой лектин собирают на фильтр и растворяют в дистиллированной воде, затем получают концентрат вирусов с посадочного материала и проводят агглютинацию полученных вирусов белковым лектинсодержащим экстрактом корней подорожника большого Plantago major в концентрации 0,03%, при этом если происходит агглютинация, то посадочный материал не заражен вирусами, а отсутствие агглютинации показывает, что посадочный материал заражен вирусами. Изобретение позволяет ускорить процесс тестирования посевного материала картофеля. 2 табл.

Способ тестирования на заражение вирусами посадочного материала картофеля, выращенного in vitro, заключающийся в том, что получают белковый лектинсодержащий экстракт корней подорожника большого Plantago major из гомогенизированной муки размолотых корней растений 0,9%-ным раствором хлористого натрия настаиванием в течение 24 часов в соотношении 1:6, после чего гомогенат центрифугируют и доводят до рН 4,0, вновь центрифугируют и супернотант нейтролизуют до рН 7,0, удаляют осадок центрифугированием, белок высаливают 70% сульфатом аммония, поле чего неочищенный сырой лектин собирают на фильтр и растворяют в дистиллированной воде, затем получают концентрат вирусов с посадочного материала и проводят агглютинацию полученных вирусов белковым лектинсодержащим экстрактом корней подорожника большого Plantago major в концентрации 0,03%, при этом если происходит агглютинация, то посадочный материал не заражен вирусами, а отсутствие агглютинации показывает, что посадочный материал заражен вирусами.