Штамм гриба Alternaria sonchi Г-52 ВИЗР, обладающий гербицидной активностью против осота полевого (Sonchus arvensis L.) Российский патент 2019 года по МПК C12N1/14 A01N63/04 C12R1/645 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к области микробиологической защиты растений, а именно для борьбы с нежелательной растительностью Может быть использовано для получения микогербицида для борьбы с осотом полевым (Sonchus arvensis L).

Осот полевой (Sonchus arvensis L) - многолетнее корнеотпрысковое сорное растение из семейства Asteraceae, которое широко распространено в РФ и других странах мира с умеренным климатом. Наряду с бодяком полевым оно является трудноискоренимым сорняком, для борьбы с которым требуются затратные защитные мероприятия, включающие многократную обработку почвы и регулярное применение химических пестицидов (Березкин, Скоролупова, 1987 |1]). Осот полевой включен в списки целевых растений для разработки биологических средств борьбы с ним в Канаде и Австралии (McClay, Peschken, 2002 [2]; Scott, McCarren, 2012 [3]) Применение химических гербицидов оправдано уже при плотности их произрастания 2-3 шт. /кв.м. (Ульянова, 2005 [4])

В качестве продуцентов микогербицидов для борьбы с осотом полевым ранее были предложены несколько видов фитопатогенных грибов, которые имеют ряд недостатков для применения в качестве микогербицидов, например: ржавчинный гриб Miyagia pseudosphaeria (McCarren, Scott, 2008 [5]) и возбудители пятнистостей листьев Ascochyta sonchi (Evidente et al., 2006 [6]) и Phoma macrostoma (Hynes, 2018 [7]). Ржавчинный гриб Miyagia pseudosphaeria поражает растения рода Sonchus, однако этот гриб - паразит, и его невозможно получать на искусственных питательных средах (McCarren, Scott, 2017 [8]). Грибы A. sonchi (=Phoma exigua var. exigua) и Phoma macrosloma, наоборот, обладают широкой специализацией, поражая широкий круг двудольных растений, включая салат и другие культуры (Мельник, 1977 [9]; Boerema et al., 2004 [10]; Bailey et al., 2011 [11]). Таким образом, среди патогенов осота полевого штаммы фитопатогенных грибов, которые можно получать на искусственных или недорогих природных питательных субстратах и имеющих и узкую специализацию, неизвестны. Задачей изобретения является получение штамма, превосходящего указанные выше микроорганизмы, сочетая следующие свойства: рост и спороношение на искусственных или природных питательных субстратах, патогенность в отношении осота полевого, а также узкую специализацию.

Поставленная задача была решена путем получения штамма гриба Alternaria sonchi Davis с указанными выше характеристиками. По данным литературы данный вид встречается только на растениях рода Sonchus (Simmons, 2007 [12]), но ранее не был исследован как-потенциальный микогербицид

Из больных пятнистостью листьев осота полевого (Sonchus arvensis L.) при помощи стандартного метода, включающего поверхностную стерилизацию пораженной ткани 70%-ным этанолом и высев небольших ее кусочков на агаризованную питательную среду с антибиотиком (Методы экспериментальной микологии, 1982 [13]), была выделена чистая культура гриба Alternaria sonchi. Культивирование гриба осуществляли на стандартной картофельно-глюкозной среде (КГА), на этой же среде получали его спороношение через 1-2 недели инкубации при 24°С. Его видовую идентификацию проводили при помощи определителя грибов рода Alternaria (Simmons, 2007 [12]). Патогенность гриба была подтверждена путем искусственного заражения растений осота полевого и последующей его реизоляцией в чистую культуру. Для этого растения в фазе розетки опрыскивали конидиальной суспензией гриба (50 тыс.конидий/мл, 2 мл суспензии/растение), выдерживали 48 ч во влажной камере при 24°С, а затем инкубировали 7 суток до появления симптомов при переменном искусственном освещении (16 ч в сутки) и температуре 22С. Для реизоляции гриба кусочек пораженной ткани (размером примерно 1×1 см) помещали на 1 сутки в стерильную влажную камеру (чашка Петри с увлажненной фильтровальной бумагой) при 24°С. После появления спороношения A. sonchi кусочек пораженной ткани вынимали из влажной камеры, скотчем приклеивали к стерилизованной верхней крышке чашки Петри и накрывали чашку со средой КГА. Через сутки инкубации при 24С крышку чашки Петри с кусочком зараженной ткани листа осота, предварительно постучав по ней (это вызвало опадение конидий гриба с крышки на поверхность среды), сменили на чистую стерильную крышку, и чашку со средой инкубировали при 24°С Через неделю инкубации на КГА выросли моноконидиальные колонии гриба. Один моноконидиальный реизолят с морфологией, типичной для A. sonchi (Берестецкий и др., 2013 [14]), был депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов ФГБНУ ВИЗР как штамм Г-52 ВИЗР

Происхождение и систематическое положение.

Штамм Г-52 ВИЗР Alternaria sonchi выделен из больных листьев S. arvensis, собранных в Краснодарском крае в 2004 году. Этот вид относится к отделу Ascomycota, подотделу Pezizomycotina, классу Dothideomycetes. подклассу Pleosporomycetidae, порядку Pleosporales, семейству Pleosporaceae

Физиолого-биохимические признаки.

Гриб обладает медленным ростом (около 1 мм/сут) при температуре 24°С на стандартных агаризованных питательных средах, например, картофельно-глюкозном агаре и агаре Чапека (Методы экспериментальной микологии, 1982 [13]). При культивировании на этих средах гриб образует колонии темно-оливкового цвета, с бархатистой текстурой. Цвет реверса темно-оливковый, практически черный. Конидии одиночные, обратногрушевидные, темно-бурые. Длина конидий 60±10 мкм, ширина - 16±3 мкм, с 4±1 поперечными перегородками Хранение штамма осуществляется в пробирках на скошенном картофельно-глюкозном агаре в бытовом холодильнике при температуре 5°С, а также при -80°С в 10%-ном стерильном растворе глицерина.

Пример 1. Рост и спороношение на доступных агаризованных питательных средах.

Культивирование штамма проводили на агаризованных (1.5% агар-агара) питательных средах (на 1 л воды): среда Чапека (сахароза - 15 г, NaNO₃ - 3 г, K₂НРО₄- 1 г, KCL - 0,5, MgSO₄⋅7Н₂О - 0,5 г, FeSO₄⋅7Н₂О - 0,01 г), картофельно-сахарозный агар (КСА - отвар 200 г картофеля, 20 г сахарозы) и модифицированная среда V8 (200 мл овощного сока «J7», СаСО₃ - 3 г). Засев среды осуществляли в центр чашки Петри агаровым блоком (диаметром 5 мм), вырезанным пробочным сверлом из активно растущей культуры гриба. Инкубацию осуществляли при температуре 24°С в течение 2 недель.

Испытанные агаризованные питательные среды оказались пригодными для роста штамма A. sonchi Г-52 ВИЗР. Максимальный суточный прирост наблюдали на среде КСА, который составлял 1.6 мм/сут (табл. 1). Спороношение A sonchi формировалось на всех испытанных искусственных (среда Чапека) и полусинтетических (V8 и КСА) питательных средах Высокая интенсивность спороношения гриба (около 300 тыс. конидий/см²) была отмечена на среде Чапека и среде V-8 (табл. 1).

*После среднего значения указана стандартная ошибка

Пример 2. Рост и спороношение на доступных сыпучих субстратах.

Одним из основных экономичных способов наработки грибного инокулюма для микогербицидов является культивирование грибов на зерновых субстратах.

В экспериментах использовали широкодоступные зерновые субстраты (ячмень, пшено, рис и перловая крупа). Крупу (10 г) и воду (7 мл) смешивали в 100-мл конических колбах и стерилизовали автоклавированием в течение 15 мин при 121°С. Инокуляцию субстрата проводили агаровым блоком, вырезанным из края растущей колонии Alternaria sonchi Г-52 ВИЗР на среде КСА. Культивирование гриба проводили при температуре 24°С в темноте при периодическом встряхивании культур для предотвращения комкования и улучшения их аэрации. Через 2 недели инкубации отбирали точную навеску (около 1 г) обросшего грибом субстрата, помещали в пробирку с 10 мл 0.01%-ного раствора Твин-80, встряхивали и при помощи камеры Горяева определяли титр конидий в суспензии, после чего пересчитывали уровень споропродуктивности гриба на 1 г субстрата. Кроме того, помимо свежего биоматериала использовали и высушенный: навеску твердофазной культуры высушивали током воздуха при комнатной температуре в течение суток, а затем помещали во влажную камеру (чашку Петри, выстланную влажной фильтровальной бумагой), инкубировали при температуре 24°С в темноте двое суток, а затем определяли выход конидий как описано выше.

Интенсивность спороношения при двухнедельном культивировании A. sonchi Г-52 ВИЗР на пшене, рисе и перловой крупе составляла 5.1, 5.9 и 6.6 тыс. конидий/г, соответственно (таблица 2). На зерне ячменя гриб развивался плохо и не спороносил. После последовательного высушивания колонизированного грибом субстрата и помещения его во влажную камеру выход конидий гриба увеличился в 10-40 раз. Максимальный выход конидий отметили на пшене - на уровне 200 тыс. конидий/г субстрата (таблица 2).

Пример 3. Патогенность Alternaria sonchi Г-52 ВИЗР

Растения осота получали из отрезков подземных побегов в условиях теплицы. Выращивание растений проводили в сосудах объемом 0.5 л в искусственной почвенной смеси (торф-песок 1:1, рН 6) в течение месяца в тепличных условиях. Типично на один сосуд приходилось в среднем 3 растения. Их заражение проводили в фазе розетки.

Конидии гриба смывали с чашек Петри с двухнедельными колониями штамма А. sonchi Г-52 ВИЗР, полученными на среде V8 Полученную суспензию доводили до концентрации 1 тыс. конидий/мл, 10 тыс. конидий/мл, 100 тыс. конидий/мл в 0.01%-ном растворе Твин-80. Полученную конидиальную суспензию распыляли на растения по 2 мл на растение и ставили во влажную камеру на 24 ч или 48 ч при температуре 24°С. Затем растения инкубировали при контролируемых условиях: 16 ч день (24°С), 8 ч ночь (20°С). Учет развития болезни (площадь пораженной ткани) через 7 дней после инокуляции

Инокуляция растений осота конидиями гриба приводила к появлению симптомов заболевания в виде бурых некрозов с темной иногда бордовой каймой. При этом симптомы заболевания проявлялись сильнее всего на листьях нижнего яруса и приводили к их усыханию. На верхних листочках появлялись многочисленные мелкие разбросанные пятна

Среди трех испытанных концентрациях наиболее эффективной оказалась максимальная - 100 тыс. конидий/мл. В этом случае степень поражения листьев в зависимости от периода увлажнения составила 45 - 60%. При более низких концентрациях степень поражения листьев осота была существенно ниже и варьировала в пределах от 0 до 55%. При всех испытуемых концентрациях уровень поражения растений при 48-часовом периоде увлажнения листьев был существенно выше в сравнении с периодом увлажнения 24 часа. Различия в проявлении заболевания по этому показателю составляли 10 - 15% (Таблица 3)

Пример 4. Специализация Alternaria sonchi.

Узкая специализация штамма (в пределах рода или нескольких родов растений) -одно из условий для создания селективного микогербицида.

Для исследования специализации A sonchi провели искусственное заражение 6 видов растений (бодяк, осот, цикорий, салат, томат, пшеница) конидиями гриба. Растения выращивали в тепличных условиях высевом семян в описанную выше почвенную смесь. Получение растений осота описаны выше. Каждый вариант опыта был представлен 5 повторностями (горшками).

Заражение трехнедельных растений проводили конидиальной суспензией гриба в концентрации 50 тыс. конидий/мл способом, описанным в Примере 3 Полученную конидиальную суспензию распыляли на растения по 6 мл на культуральный сосуд и ставили во влажную камеру на 24 ч при температуре 24°С. Затем растения инкубировали при контролируемых условиях: 16 ч день (24°С), 8 ч ночь (20°С). Учет развития болезни (площадь пораженной ткани) через 7 дней после инокуляции

Наиболее восприимчивым к Alternaria sonchi Г-52 ВИЗР видом растений оказался осот полевой, на котором некрозы достигали около 40% листовой поверхности. На других видах сложноцветных растений (цикорий и бодяк полевой) развитие болезни было несущественным: был поражено не более 5% листовой поверхности. Листья салата (Lactuca saliva L.) были невосприимчивыми к заболеванию. Представители семейств пасленовые (томат) и злаковые (пшеница) оказались иммунными. Эти результаты подтверждают наблюдения о встречаемости гриба только на растениях рода Sonchus (Simmons, 2007 [12]; Берестецкий и др., 2013 [14]).

Таким образом, штамм Г-52 ВИЗР Alternaria sonchi превосходит аналоги (фитопатогенные грибы Miyagia pseudosphaeria, Ascochyta sonchi и Phoma macrostoma) no следующим параметрам одновременно: во-первых, способностью к спороношению на искусственных (среда Чапека) и полусинтетических (среда V8) агаризованных питательных средах или недорогих природных субстратах (пшено), во-вторых, узкой специализацией в пределах рода Sonchus.

Литература

1 Березкин Ю.Н., Скоролупова Т.Б. Двудольные многолетние корнеотпрысковые

сорняки // Защита растений, 1987, №8. С. 22.

2. McClay A.S., Peschken D P. // Biological Control Programmes in Canada, 1981-2000 /

Ed P.G Mason, J. Theodore Oxon, NY: CABI International, 2002. P 416-424

3 Scott J K, McCarren K. // Biological Control of Weeds in Australia / Ed. M.H. Julien, R.E. McFadyen, J. Cullen. Melbourn: CSIRO Publishing, 2012. P. 563-568.

4 Ульянова Т.Н. Сорные растения во Флоре России и сопредельных государств. Барнаул. 2005. С. 296.

5. McCarren K.L, Scott J.K. Two biological control options for Sonchus oleraceus in Australia // Proceedings of the 16th Australian Weeds Conference, Cairns Convention Centre, North Queensland, Australia, 18-22 May, 2008. Queensland Weed Society Queensland Australia. 2008. P. 259-261.

6. Evidente A., Berestetskiy A., Andolfi A., Zonno M.C, Cimmino A, Vurro M. Relation between in vitro production of ascosonchine and virulence of strains of the potential mycoherbicide Ascochyta sonchi: a method for its quantification in complex samples // Phytochem. Analysis. 2006 Volume 17, Issue5 Pages 357-364

7. Hynes R.K. Phoma macrostoma: as a broad spectrum bioherbicide for turfgrass and agricultural applications// CAB Reviews 2018. Vol. 13, N. 5. P. 1-9

8 McCarren K.L., Scott J.K. Host range and potential distribution of the rust fungus, Miyagia pseudosphaeria, a biological control agent for Sonchus species // Australasian Plant Pathol. (2017) Vol. 46, №5. p. 473-482. "

9. Мельник В.А. Определитель грибов рода Ascochyta Lib. Л, Наука, 1977. 246 с

10. Boerema G.H, Gruyter J, Noordeloos M.E, Harriers M.A. Phoma Identification Manual Differentiation of

specific and infraspecific taxa in culture Cambridge: CABI Publishing, 2004 448 pp

11. Bailey, K.L., Pitt, W.M., Falk, S., & Derby,.1 (2011). The effects of Phoma macrostoma

on nontarget plant and target weed species. Biological Control, 58(3), 379-386.

12. Simmons E.G. Alternaria: an identification manual. Utrecht. CBS. CBS Biodiversity

Series. 2007. Vol. 6. 775 pp.

13. Методы экспериментальной микологии. (Ред. Билай В.И.) Справочник Киев, "Наукова думка", 1982. - 550 с.

14. Берестецкий А.О., Терлецкий В.М, Ганнибал Ф.Б., Казарцев И.А, Ходорковский М.А. Характеристика евразийских изолятов Alternaria sonchi по морфолого-культуральным, молекулярным и физиолого-биохимическим признакам // Микология и фитопатология, 2013. Том. 47, №2. С. 120-128.

Изобретение относится к микробиологии. Штамм гриба Alternaria sonchi S-102-15, депонированный в Государственной коллекции микроорганизмов ВИЗР под номером Г-52 ВИЗР, обладает гербицидной активностью в отношении осота полевого (Sonchus arvensis L.). Штамм может быть использован для биологической борьбы с этим трудноискоренимым сорным растением. 4 табл., 4 пр.

Штамм гриба Alternaria sonchi Г-52 ВИЗР, обладающий гербицидной активностью в отношении осота полевого (Sonchus arvensis L.).