ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus subtilis Б 93 ВИЗР ДЛЯ ЗАЩИТЫ КАРТОФЕЛЯ ОТ БОЛЕЗНЕЙ ПРИ ХРАНЕНИИ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 C12R1/125 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и представляет собой штамм, продуцирующий комплекс биологически активных веществ, обладающих фунгицидным и бактерицидным действием, может использоваться для получения биопрепарата против грибных и бактериальных болезней картофеля при хранении.

Картофель относится к числу наиболее ценных сельскохозяйственных культур. Однако его сохранение в свежем виде от урожая до урожая связано с определенными трудностями, связанными с поражением клубней фитопатогенными микроорганизмами, вызывающими значительные поражения картофеля даже при холодильном хранении.

В настоящее время ведущее место в защите плодов и овощей от фитопатогенов при выращивании и хранении занимает химический метод. Однако глобальное использование химических средств защиты приводит к ряду отрицательных последствий - нарушениям структуры биоценозов, снижению их способности к саморегуляции, накоплению пестицидов в почве, воде и продуктах питания. Кроме того, возрастает устойчивость к ним в популяциях вредителей и возбудителей болезней, снижающих эффективность их применения.

Анализ отечественной и зарубежной научно-технической литературы показал, что биологический контроль может успешно конкурировать с химическими средствами защиты, не обладая в то же время их недостатками. Микробиометод также обладает значительными преимуществами в плане экономии материалов, энергии и использования возобновляемых ресурсов. Сравнительно новое направление в развитии биоконтроля - применение биопрепаратов на основе активных штаммов антагонистов при хранении продукции растениеводства.

Известны штаммы Bacillus subtilis - продуценты ряда биологических фунгицидов - Алирина-Б, Гамаира, Бактофита, Альбита и т.д. («Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных для применения на территории РФ», 2013). Однако они обладают низкой биологической эффективностью в условиях овощехранилищ и не обеспечивают эффективной защиты растениеводческой продукции от болезней при хранении. В «Государственном каталоге пестицидов и агрохимикатов, разрешенных для применения на территории РФ» отсутствуют биопрепараты, рекомендованные для защиты картофеля от болезней в условиях хранилища.

Научно обосновано применение Bacillus subtilis штамм 413 для снижения потерь моркови от инфекционных заболеваний и улучшения показателей качества продукции при длительном холодильном хранении (Самусенко, 2001).

Наиболее близкий предлагаемому - В. subtilis штамм В-10 ВИЗР - продуцент препарата Алирин-Б для защиты сельскохозяйственных культур от грибных и бактериальных болезней («Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных для применения на территории РФ», 2013). Но этот штамм имеет более узкий спектр действия и недостаточную биологическую эффективность в отношении фитопатогенных грибов и бактерий в условиях низкой температуры при длительном хранении растениеводческой продукции. Алирин-Б рекомендован к применению на картофеле только в период вегетации против «черной ножки», ризоктониоза, фитофтороза и альтернариоза.

Задача изобретения - создание штамма, обладающего широким спектром действия и высокой антагонистической активностью в отношении возбудителей грибных и бактериальных болезней картофеля и перспективного для защиты клубней от болезней при хранении.

Задача была выполнена путем отбора штамма Bacillus subtilis И5-12/23, продуцирующего комплекс биологически активных веществ, обладающего высокой антагонистической активностью в отношении возбудителей грибных и бактериальных болезней картофеля при хранении. Штамм депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов, патогенных для растений и их вредителей ГНУ ВИЗР под № Б-93 ВИЗР. Штамм выделен из почв Индии (Дели) по признакам антагонистической активности в отношении фитопатогенных грибов и бактерий. Идентификация штамма проведена по определителю бактерий Берджи (Хоулт Д., Криг Н. и др. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. 9-е издание. Издательство «Мир». 1997).

ХАРАКТЕРНЫЕ ПРИЗНАКИ

1. Морфология: Прямые палочки с закругленными концами, часто образуют цепочки.

2. Размер: 0,8-0,9×2,5-3,5 мкм.

3. Клеточная стенка и окраска по Граму: грамположительные, клеточная стенка толстая грамположительного типа (метод анализа - окраска генциановым красителем и йодистым раствором по Граму). Капсулы не образует.

4. Спорообразование: эндоспоры овальные, с центральным положением, термоустойчивые, высокоустойчивые ко многим неблагоприятным условиям окружающей среды. В клетке образуется не более одной споры. Эндоспоры эллипсоидные, расположены центрально и не выходят из размеров спорангия. Околоспоральных включений не обнаружено. Спорообразование не подавляется на воздухе.

5. Тип деления: поперечное бинарное.

6. Простеки: отсутствуют.

7. Подвижность: подвижные.

8. Жгутикование: перитрихиальные жгутики.

9. Пигментация колоний: колонии кремовые, матовые, плоские, с неровным краем, быстро распространяющиеся по поверхности питательной среды, в дальнейшем колонии уплотняются, становятся блестящими и приобретают коричневато-бежевый оттенок.

10. Пигмент в среду не выделяется.

11. Селективных сред нет.

12. Оксидаза: положителен.

13. Каталаза: положителен.

14. Отношение к кислороду: аэроб. В анаэробном агаре не растет.

15. Хемоорганотроф, метаболизм дыхательного типа. Используемые источники углерода при аэробном росте: глюкоза, сахароза, маннит, мальтоза и лактоза. При использовании глюкозы, арабинозы, ксилозы и маннита образует кислоту и ацетоин, газа не образует. Образует гидролазы. Гидролизует крахмал и казеин. Восстанавливает нитрат до нитритов.

16. В аэробных условиях на сорбите и инозите не растет.

17. Неорганические субстраты не окисляет.

18-20. В анаэробных условиях не растет.

21. Отношение к рН: штамм растет в диапазоне рН от 4,5 до 8,5. Оптимальный рН 6,5-7,5.

23. Отношение к NaCl: культура не растет при 10% NaCl.

24. Отношение к температуре: максимальная температура роста - 45-50°С, минимальная - 2-4°С, оптимальная - 22-26°С.

25. Отношение к антибиотикам: образует полипептидные и полиеновые антибиотики.

26. Цитохромы: не определяли.

27. Менахиноны: не определяли.

28. % ГЦ: не определяли.

29. Потребность в факторах роста или специальных добавках: не требуются.

30. Дополнительные сведения: штамм-продуцент биопрепарата для защиты клубней картофеля от фитопатогенных грибов и бактерий - возбудителей болезней при длительном хранении. Способ определения активности продукта: биологический по подавлению роста тест-культур фитопатогенных грибов и бактерий.

31. Способ хранения штамма:

а) косяки со средой СПА или МПА,

б) в лиофилизированном состоянии.

32. Сроки хранения: пересевы через 6 месяцев.

33. Отношение к фагам: фаг не выделяли.

34. Генетические особенности: проведено генотипирование штамма методом ДРИМ (двойное расщепление, избирательное мечение).

Антимикробный спектр: подавляет рост фитопатогенных грибов и бактерий.

Зоны задержки роста тест-культур фитопатогенных грибов и бактерий (радиус в мм):

Alternaria brassicicola - 20.0

Colletotrichum atrawenta - 15.0

Verticillium dahliae - 24.5

Sclerotinia sclerotiorum - 22.0

Phoma exigua -20.5

Fusarium oxysporum - 20.5

Bipolaris sorokiniana - 19.0

Helmintosporium solani - 25.0

Pythium debarianum - 15.0

Ascochyta melonis - 14.0

Septoria nodorum - 20.5

Rhizoctonia solani - 25.0

Phytophthora infestans - 20.5

Clavibacter. michiganensis var. sepedonicum - 22.0

По сравнению с прототипом предложенный штамм обладает не только более широким спектром действия в отношении возбудителей грибных заболеваний, но и высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенных бактерий (табл.1).

Методы использования штамма описаны в примерах, а результаты представлены в таблицах.

Пример 1. Культивирование штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР проводили в глубинных условиях в колбах Эрленмейера в течение 72 часов на круговой качалке при 28°С до завершения фазы споруляции.

Состав жидкой питательной среды (г/л) (практикум по микробиологии под ред. Егорова Н.С., 1976):

Панкреатический гидролизат кильки - 10,05

Натрия хлорид - 4,95

Глюкоза - 10,0

Вода - до 1 литра

рН 7,1±0,2

0,5/30 мин

Определение антагонистической активности 3-суточной культуральной жидкости, полученной при глубинном выращивании штамма, проводили стандартным микробиологическим методом лунок (Практикум по микробиологии под ред. Н.С. Егорова, 1976; Руководство к практическим занятиям по микробиологии под ред. Н.С. Егорова, 1995). Диаметр зоны задержки роста измеряли через 3-5 суток в зависимости от скорости роста тест-культуры. Эффективность в отношении фитопатогенных грибов и спектр действия по сравнению с прототипом представлены в табл.1.

Таблица 1 Сравнительная характеристика спектра антагонистической активности штаммов В. subtilis В-10 ВИЗР и В. subtilis Б 93 ВИЗР (культуральная жидкость) № Виды фитопатогенных микроорганизмов Диаметр зоны лизиса тест-культуры, мм     В. subtilis Б 93 ВИЗР В. subtilis В-10 (прототип) 1 Clavibacter michiganense subsp. michiganense 24 0 2 Clavibacter.michiganensis var. sepedonicum 22 0 3 Xanthomonas campestris pv. vesicatoria 18 0 4 Pseudomonas corrugata 24 0 5 P. syringae pv. tomato 30 0 6 Erwinia carotovora subsp. carotovora 24 0 7 Alternaria solani 20 18 8 Alternaria brassicicola 22 10-15 9 Fusarium graminearum 34 25-30 10 Fusarium oxysporum 20 20-30 11 Ascochyta fabae 18 18 12 Colletotrichum lagenarium 24 20 13 Rhizoctonia solani 24 18 14 Bipolaris sorokiniana 24 5-7 15 Sclerotinia libertiana 24 5-7 16 Septoria nodorum 15-20 18-20 17 Phytophthora infestans 10-20 20-21 18 Phoma exigua 14-21 20-22 19 Helmintosporium solani 15-20 25-28

Как видно из таблицы 1, штамм В. subtilis Б 39 ВИЗР, в отличие от прототипа, обладает не только антигрибной, но и высокой антибактериальной активностью. Существенно выше у предлагаемого штамма антагонистическая активность в отношении фитопатогенных грибов Colletotrichum lagenarium, Rhizoctonia solani, Bipolaris sorokiniana и Sclerotinia libertiana.

Пример 2. Культуральную жидкость штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР получали так же, как в примере 1. Изучение биологической эффективности в модельных опытах и в картофелехранилище осуществляли в соответствии со стандартными методиками, изложенными в следующих пособиях: «Методика исследований по культуре картофеля», М., 1967; «Методика полевого опыта», М., 1985; «Методические указания по государственным испытаниям фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур», М., 1965; «Методика исследований по защите картофеля от болезней, вредителей, сорняков и иммунитету», М., 1995; «Методические указания по регистрационным испытаниям фунгицидов в сельском хозяйстве», Санкт-Петербург, 2009.

Лабораторные опыты были заложены с учетом динамики развития заболеваний в насыпи клубней в картофелехранилище в основной период хранения. Для проведения опытов были отобраны по 10 клубней на повторность с признаками болезней. Клубни были обработаны соответственно схеме опыта и заложены во влажные камеры.

В лабораторных опытах для определения влияния штамма на развитие спороношения серебристой парши клубни обрабатывали разведениями культуральной жидкости с титром жизнеспособных клеток 10⁸ и 10⁹ КОЕ/мл. В стандарте клубни обрабатывали фунгицидом Максим, КС (0,2 л/т), в контроле - водой. После обработки клубни были заложены во влажные камеры. По истечении 2-7 дней были проведены учеты интенсивности спороношения гриба, вызывающего серебристую паршу картофеля (Helmintosporium solani Dur.ex.Mont).

Экспериментальные данные статистически обработаны посредством дисперсионного анализа.

Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования отобранного штамма для снижения пораженности картофеля болезнями при хранении (таблица 2).

В борьбе с паршой серебристой (табл.2) штамм показал более высокую биологическую активность в сравнении с прототипом и стандартом. При проведении 1-го учета ни в одном из вариантов опыта спороношения Helmintosporium solani Dur.ex.Mont отмечено не было. Результаты второго учета показали, что развитие болезни при использовании штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР при обеих концентрациях рабочего раствора было в 2 раза ниже по сравнению со штаммом В. subtilis В-10 (прототип) и в 4,5 раз - по сравнению с контролем. Биологическая эффективность в этих вариантах опыта достигла 77.8%, показатель биологической эффективности превышал эффективность химического стандарта.

Таблица 2 Биологическая эффективность штамма B. subtilis Б 93 ВИЗР в отношении спороношения серебристой парши на клубнях картофеля Варианты опыта, титр клеток в разведениях культуральной жидкости штамма, КОЕ/мл Второй учет (28.12.2012) Биологическая эффективность, % количество клубней со спороношением, Р,% развитие болезни, R,% Р, % R, % Контроль, вода 90.0 36.0 0 0 В. subtilis В-10, 10⁹ (прототип) 70.0 16.0 22.2 55.6 В. subtilis Б 93 ВИЗР 10⁹ 40.0 8.0 55.6 77.8 B. subtilis Б 93 ВИЗР, 10⁸ 40.0 8.0 55.6 77.8 Максим, КС, стандарт, 0,2 л/т 60.0 12.0 33.3 67.7 НСР_0,5 8.0 2.2    

Пример 3. Культуральную жидкость штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР получали так же, как в примере 1 и 2. Закладка образцов клубней картофеля на длительное хранение с целью оценки биологической эффективности штамма в отношении комплекса болезней была проведена в картофелехранилище ГНУ ВНИИКХ (Московская область, Люберецкий район, п. Красково, микрорайон Коренево).

В опыте использовали клубни сорта Сантэ (среднеранний, универсального использования). Урожайность высокая. Сорт устойчив к раку картофеля (возбудитель Synchytrium endobioticum), золотистой картофельной цистообразующей нематоде (Globodera rostochiensis), вирусным болезням, восприимчив по ботве к фитофторозу. Среднеустойчив к обыкновенной парше, восприимчив к ризоктониозу и фомозу. Набор материала для проведения опытов был произведен через 3 дня после уборки урожая. Перед обработкой и закладкой на хранение проводили клубневой анализ с целью определения фитопатологического состояния картофеля. Перед закладкой на хранение клубни обрабатывали разведениями культуральной жидкости штамма с титром жизнеспособных клеток 10⁸ и 10⁹ КОЕ/мл. В стандарте клубни обрабатывали фунгицидом Максим, КС (0,2 л/т), в контроле - водой. Расход рабочей жидкости - 3 л/т. Масса образца клубней картофеля составляла 5 кг. Повторность опыта - 10-кратная. Общая масса клубней каждого варианта - 50 кг. Место размещения образцов: в насыпи картофеля на глубине 20-30 от поверхности.

Анализ результатов опыта, проведенного в условиях картофелехранилища ГНУ ВНИИКХ, подтвердили данные лабораторных опытов об эффективности отобранного штамма для защиты клубней картофеля. По окончании периода хранения в марте 2013 года был проведен клубневой анализ и определены пораженность болезнями и потери массы картофеля при хранении (таблицы 3-5).

Таблица 3 Влияние штаммов бацилл на поражение клубней картофеля болезнями в период хранения (06.09.2012-26.03.2013) Варианты опыта, титр клеток в разведениях культуральной жидкости штамма, КОЕ/мл Количество клубней, % здоровых пораженных возбудителями   всего в том числе     парши обыкновенной (S. scabies) кольцевой гнили (C. michiganensis var. sepedonicum) фитофтороза (P. infestans) сухой гнили (Phomaexigua) Контроль, вода 13.3 86.7 52.3 7.4 11.8 15.2 В. subtilis В-10 ВИЗР, 10⁹ (прототип) 30.4 69.6 47.3 4.8 8.5 9.0 В. subtilis Б 93 ВИЗР, 10⁹ 32.4 67.6 53.8 2.6 8.2 3.0 B.subtilis Б 93 ВИЗР, 10⁸ 35.5 64.5 55.7 2.9 4.4 1.5 Максим, КС, стандарт, 0,2 л/т 30.0 70.0 54.1 3.5 8.3 4.1 НСР_0,5 2.3 5.4 6.6 0.4 1.4 0.2

Отмечено существенное снижение развития болезней на клубнях семенного картофеля после обработки штаммом В. subtilis Б 93 ВИЗР и стандартом Максим, КС по сравнению с контролем. Количество здоровых клубней после применения штамма достигало 32.4-35.5%, в то время как в прототипе этот показатель составлял 30.4%, в контроле не превышал 13.3%. Таким образом, по сравнению с контролем выход здоровой продукции увеличился в 2.7 раза. Обработка штаммом эффективно снижала пораженность клубней всеми проявившимися заболеваниями, за исключением парши обыкновенной. Наибольший эффект штамм проявил в отношении возбудителей кольцевой и сухой гнилей картофеля. В варианте с применением штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР распространенность кольцевой гнили составила 2.6-2.9%, сухой гнили - 1.5-3.0%, что значительно ниже этих показателей у штамма В. subtilis В-10 (прототип) и стандарта фунгицида Максим, КС (4.8 и 3.5%; 9.0 и 4.1% соответственно).

Таким образом, анализ результатов опыта показал, что обработка клубней штаммом В. subtilis Б 93 ВИЗР перед закладкой на хранение в картофелехранилище уменьшало количество больных грибными и бактериальными болезнями клубней и повышало выход здорового картофеля в 2.6-2.7 раза. Биологическая эффективность штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР в отношении кольцевой гнили, сухой гнили и фитофтороза достигала 80-90% и была существенно выше эффективности прототипа (28.0-40.8%) и стандартного фунгицида Максим, КС (29.7-73.0%) (табл.4).

Таблица 4 Биологическая эффективность штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР в отношении возбудителей болезней клубней картофеля в период хранения (06.09.2012-26.03.2013) Варианты опыта, титр клеток в разведениях культуральной жидкости штамма, КОЕ/мл Биологическая эффективность (%) в отношении возбудителей   кольцевой гнили (Clavibacter michiganensis var. sepedonicum) фитофтороза (Phytophthora infestans) сухой гнили (Phoma exigua) Контроль, вода - - - В. subtilis В-10 ВИЗР, 10⁹ (прототип) 35.1 28.0 40.8 В. subtilis Б 93 ВИЗР, 10⁹ 64.9 30.5 80.3 В. subtilis Б 93 ВИЗР, 10⁸ 60.8 62.7 90.1 Максим, КС, стандарт, 0,2 л/т 52.7 29.7 73.0

Таблица 5 Влияние штаммов бацилл на сохранность клубней картофеля в период хранения (06.09.2012-26.03.2013) Варианты опыта, титр клеток в разведениях культуральной жидкости, КОЕ/мл Масса клубней Хозяйственная эффективность % здоровых потери массы, % кг % всего в том числе технические отходы абсолютная гниль естественная убыль Контроль, вода 3.66 73.2 26.8 8.0 8.4 10.4 100 В. subtilis В-10, 10⁹ (прототип) 3.04 60.7 39.3 6.2 18.3 14.8 83.1 В. subtilis Б 93 ВИЗР, 10⁹ 3.92 78.5 21.5 7,3 4.2 10.0 107.1 B. subtilis Б 93 ВИЗР, 108 4.06 81.3 18.7 4.6 7.7 6.4 110.9 Максим, КС, стандарт, 0,2 л/т 3.69 73.9 26.1 5.3 7.2 13.6 100 НСР_0,5 0.02   1.3 1.1 2.1 0.9  

Сохранность клубней после их обработки штаммом В. subtilis Б 93 ВИЗР была существенно выше по сравнению с прототипом и стандартом - фунгицидом Максим, КС (78.5-81.3%, 60.7% и 73.9% соответственно). Хозяйственная эффективность в вариантах с применением штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР в обеих концентрациях культуральной жидкости достигала 107.1-110.9%, что существенно превышало этот показатель у прототипа. Эти варианты опыта характеризовались самыми низкими потерями массы клубней в период хранения (18.7-21.5%). В варианте с прототипом потери массы клубней достигли 39.3%. Естественная убыль массы клубней была в 1.5-2.3 раза ниже, чем у прототипа, в 1.4-2 раза ниже, чем в стандарте, и 1.5 раза ниже, чем в контроле (табл.5).

Таким образом, проведенные исследования показали высокую эффективность отобранного штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР и перспективность его использования в качестве продуцента биопрепарата для защиты клубней картофеля от комплекса болезней при хранении.

Литература

1. Н.В. Самусенко. Научное обоснование применения бактерий-антагонистов при длительном холодильном хранении корнеплодов моркови. Дис. к.т.н., Санкт-Петербург, 2001.

2. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных для применения на территории РФ, 2013. http://www.mcx.ru.

3. Методика исследований по культуре картофеля. М., ВАСХНИП, НИИКХ, 1967, 189 с.

4. Б.А. Доспехов. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). - 5-е изд., доп. и перераб.: Агропромиздат, 1985. - 351 с.

5. Методические указания по государственным испытаниям фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур. М, 1985. 130 с.

6. Методика исследований по защите картофеля от болезней, вредителей, сорняков и иммунитету. М., ВНИИКХ, 1995. - 105 с.

7. Методические указания по регистрационным испытаниям фунгицидов в сельском хозяйстве. - Санкт-Петербург. - 2009. - 377 с.

8. Практикум по микробиологии / Под ред. Егорова Н.С. - М.: МГУ, 1976. - 308 с.

9. М.Н. Пименова, Н.Н. Гречушкина, Л.Г. Азова, А.И. Нетрусов, Е.В. Семенова, Н.Н. Колотилова, Л.М. Захарчук, В.В. Зинченко, С.И. Мыльникова, М.В. Нефедова, И.В. Ботвинко. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Учеб. пособие / Под ред. Н.С. Егорова. - 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Изд-во МГУ, 1995. - 224 с.

10. Хоулт Д., Криг Н. и др. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. 9-е издание. Издательство «Мир». 1997.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Bacillus subtilis - И5-12/23 обладает антагонистической активностью в отношении фитопатогенных грибов и бактерий. Штамм депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов ГНУ ВИЗР под регистрационным номером Bacillus subtilis 93 ВИЗР и может быть использован для защиты картофеля от болезней при хранении. Изобретение позволяет повысить сохранность клубней. 5 табл.

Штамм бактерий Bacillus subtilis Б 93 ВИЗР для защиты картофеля от болезней при хранении.