Изобретение относится к биотехнологии. Конкретно к способу контроля получения вакцины от гриппа. Изобретение позволяет получить ВПЧ вируса гриппа имеющего большую гемагглютинирующию активность. Также способ позволяет повысить выход антигена. Кроме того, при осуществлении способа сохраняется жизнеспособность и высокая продуктивность целевых белков без использования регулируемой экспрессии у клеток-продуцентов ВПЧ гриппа.

Грипп человека - высококонтагиозная болезнь. Передача вируса происходит воздушно-капельным путем, а также путем контакта с предметами, контаминированными патогеном (игрушки, дверные ручки и др.), с последующим попаданием в верхние дыхательные пути или конъюнктивальную слизистую [1].

Вирус гриппа имеет негативный геном, состоящий из 8 фрагментов одноцепочечной вирионной РНК (вРНК), кодирующих по крайней мере 11 белков. Если все фрагменты расположить в порядке убывания молекулярного веса, то первые три фрагмента кодируют белки полимеразного комплекса (РВ2, РВ1 и РА), четвертый - гемагглютинин (НА), пятый - нуклеопротеин (NP), шестой - нейраминидазу (NA), седьмой - матриксный белок (Ml) и неструктурный белок (М2), восьмой кодирует два белка (NS1 и NS2). Второй фрагмент РВ1 кодирует еще один белок PB1-F2, образующийся в результате альтернативного сплайсинга мРНК, этот белок вызывает апоптоз через нарушение структуры митохондрий [2]. В составе вириона все фрагменты вРНК находятся в виде рибонуклеопротеида (вРНП) - вРНК, ассоциированного с белком NP и белками полимеразного комплекса [3]. В состав полимеразного комплекса, проявляющего активность РНК-зависимой РНК-полимеразы, входят белки РВ1, РВ2 и РА. Проникновение вируса гриппа (ВГ) в клетку происходит путем эндоцитоза вирионов с последующим переносом всех 8 фрагментов в рибонуклеопротеид (РНП), сначала в цитоплазму, а затем в ядро инфицированной клетки [4, 5].

В процессе упаковки вируса важную роль играет взаимодействие вРНП, M1, НА и NA. Сегменты вирусных РНК содержат уникальные сигналы упаковки, которые частично перекрываются рамками считывания в определенных сегментах РНК, что позволяет координировать упаковку вирусного генома. НА и NA являются важными структурами для определения формы вириона, однако механизм селективного отбора фрагментов вРНП при упаковке их в вирионы до сих пор не известен [6, 7]. Наиболее важными антигенами ВГ типов А и В, изменчивость которых способствует появлению новых эпидемий, являются НА и NA. Первый ответствен за взаимодействие вируса с поверхностью клетки и в процессе размножения в организме вызывает индукцию нейтрализующих его антител. Фермент NA в антигенном отношении отличается от НА. Антитела к NA не нейтрализуют инфекционности вируса (кроме очень высоких концентраций), но сильно замедляют освобождение вируса из инфицированных клеток, и эти антитела могут играть важную роль в снижении репликации вируса in vivo и в предотвращении распространения инфекции [8].

Отличительной чертой ВГ является высокая изменчивость генома [9]. Одна из причин высокой изменчивости вируса связана с РНК-зависимой РНК-полимеразой [10], [11].

В настоящее время большинство исследователей разделяют точку зрения, что пандемические ВГ появляются в результате обмена генами между ВГ типа А человека и животных. Убедительное подтверждение эта гипотеза получила в 2009 г., когда молекулярно-генетический анализ показал, что новый пандемический штамм ВГ типа A(H1N1)pdm 09 - это тройной реассортант, несущий гены ВГ птиц, человека и свиньи [12].

НА - основной поверхностный гликопротеин ВГ. Он инициирует инфекцию, связываясь с клеточным рецептором, вызывает слияние вирусной и эндосомальной мембран, необходимое для выхода РНП в цитоплазму зараженной клетки. Рецепторная специфичность НА - важный фактор в определении круга хозяев. Роль рецептора ВГ на клетках хозяина выполняют сиаловые кислоты. Сиаловая кислота - это N-ацетил-производное нейраминовой кислоты, или аминосахар, прикрепленный ко множеству различных белков на поверхности клетки. Сиаловая кислота всегда является последним остатком в цепочке сахаров, который прикрепляется к белку; предпоследним является галактоза. ВГ человека преимущественно связываются с сиаловой кислотой, которая связана с галактозой связью а2-6 [13]. Эти рецепторы представлены в большом количестве на эпителиальных клетках в трахее человека.

Протеолитическая активация НА - определяющий фактор патогенности ВГ А [14]. НА низкопатогенных вирусов имеют сайт расщепления, обычно являющийся агригином, но иногда - лизином [15]. Разрезание молекулы происходит при помощи трипсиноподобных протеаз, представленных лишь в эпителиальных тканях дыхательных путей и кишечного тракта. Высокопатогенные ВГ птиц имеют сайт расщепления, состоящий из 4 аминокислотных остатков, разрезание молекулы НА происходит при помощи фурина, представителя семейства серин-эндопротеаз [16]. Повсеместность этого фермента в клетках объясняет способность ВГ птиц реплицироваться в различных тканях.

Ежегодно в мире гриппом болеют от 3 до 5 млн человек. Эпидемии гриппа возникают с периодичностью 1-3 года, но эпидемические вспышки отмечаются ежегодно и наносят большой ущерб здоровью населения, приводят к огромным финансовым затратам на лечение и реабилитацию больных, особенно среди групп риска.

Пандемия гриппа A(H1N1) в 1918-1920-х гг. («испанка»). Первая волна пандемии была относительно мягкой, в последующие две тяжесть возросла, и уровень смертности достиг 3 % (во время обычных вспышек он бывает менее 0,1 %). Основной причиной смерти была пневмония, часто осложненная бактериальной инфекцией [17].

Пандемия обошла земной шар трижды. Первая волна началась в конце апреля 1918 г. в Париже и почти сразу вспыхнула по всей Европе. В мае «испанка» появилась в северной Африке, а в июне - в Индии. Этим временно закончилось дальнейшее развитие эпидемии. Число случаев болезни, достигавшее довольно крупных цифр при очень малой смертности, стало убывать. В августе количество заболевших резко снизилось, что было принято за конец пандемии.

После нескольких месяцев затишья подошла вторая волна пандемии, во время которой заболеваемость была ниже, но смертность выше. Сначала болезнь появилась на западном побережье Африки в Сьерра-Леоне в конце августа 1918 г., откуда болезнь распространилась на все западное побережье Африки. В Северной Америке вторая волна началась в октябре 1918 г. в Бостоне, куда, как тогда считали, ее занесли возвратившиеся из Европы солдаты. К концу второй волны из населенных мест остались нетронутыми лишь Мадагаскар, Австралия и Новая Каледония, по-видимому, благодаря рациональным и строго проводимым мерам профилактики. Окончание второй волны относят на конец декабря 1918 г.

Третья волна пандемии началась в феврале - марте 1919 г., захватив на этот раз и уцелевшие до тех пор островные территории. Эта вспышка также отличалась высокой смертностью. Окончилась она в разных местностях не одновременно, и в отдельных районах фиксировалась до июня и даже до августа 1919 г. Пандемия полностью прекратилась только в 1920 г. Невозможно было определить точное количество людей, перенесших грипп. По-видимому, болело не меньше 550 млн человек, а погибло, по разным подсчетам, от 20 до 50 млн - более 2,5 % всей численности населения планеты того времени, составлявшей 1850 млн человек [17].

Пандемия «гонконгского гриппа» A(H3N2) (1968-1970 гг.). Эта пандемия развивалась тремя волнами (1968, 1969 и 1970 гг.) и была вызвана вирусом нового серотипа A(H3N2). Заболевание появилось в Сингапуре в начале августа 1968 г. и к сентябрю уже распространилось на другие сопредельные страны, в частности на Индию и северные территории Австралии, но в большинстве этих районов оно носило клинически легкую форму. Осенью 1968 г. новый вирус достиг Европы, но и там до начала зимы не было зарегистрировано ни одной большой вспышки. Наиболее опасной была вторая волна пандемии. Третья волна пандемии дала о себе знать в конце 1970 г. Затем эпидемические волны резко пошли на убыль. Что касается смертности, пандемия «гонконгского гриппа», как и предыдущая, была относительно мягкой [17].

Пандемия Русского гриппа A(H1N1) (1977-1978 гг.). В мае 1977 г. вирус A(H1N1) вновь вызвал вспышку в районе российско-китайской границы, которая достигла Северной Америки в 1978 г. Вирус по антигенным и молекулярно-биологическим характеристикам был близок к изолятам 1950-х гг. [18, 19]. Эта пандемия была необычной. В начале 1978 г. вирусы серотипа (H3N2) вызвали эпидемии в Западной Европе, Африке и Азии, а на Американском континенте (США и Канада) обосновался вирус гриппа серотипа A(H1N1), но уже к марту во многих странах, в том числе и в СССР, изолировали одновременно штаммы вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и гриппа В.

Подавляющее число заболевших в эпидемию 1977-1978 гг. приходилось на людей в возрасте до 20 лет, т. е. на ту часть населения, которая не имела контакта с вирусами гриппа серотипа (H1N1), исчезнувшими из циркуляции более 20 лет тому назад. Напротив, лица старше 30 лет составили только 20 % больных, хотя их доля в общей численности населения превышала 50 %, т. е., учитывая низкую заболеваемость в эту эпидемию вообще, люди зрелого и пожилого возраста, имевшие в прошлом контакт с вирусами гриппа H1N1, практически не болели.

Первая пандемия в XXI в. началась, как и прежде, неожиданно, хотя к ней готовились все последнее десятилетие. В двух образцах, независимо собранных в Южной Калифорнии в середине апреля, в Центре контроля заболеваемости (CDC), Атланта, США, идентифицировали вирус гриппа свиного происхождения, первоначально названный S- OIV(Swine-Origin Influenza Virus, который в последствии по предложению ВОЗ был назван A(H1N1)pdm09). Вирус распространился по планете с такой быстротой, что 11 июня 2009 г. ВОЗ подняла уровень готовности к пандемии гриппа до фазы 6, официально объявив первую пандемию гриппа в XXI в. [20]. К тому времени насчитывалось 30000 подтвержденных случаев заболевания в 74 странах. Менее чем через месяц ВОЗ подтвердила уже более 77000 случаев заболевания.

Антигенно пандемический вирус A(H1N1) pdm09 подобен классическому свиному вирусу и тройному реассортантному вирусу свиней A(H1N1), имеющему гены вирусов птиц и человека и циркулирующему в США более 10 лет. В то же время практически не было серологического перекреста пандемического вируса с вирусом сезонного гриппа A(H1N1). Характерной чертой пандемии 2009 г. было диспропорциональное поражение детей и молодых людей по сравнению со старшими возрастными группами [78; 79]. Вероятно, это возрастное распределение связано с наличием иммунитета к этому вирусу в популяции пожилых людей [82]. Так, показано, что в США 33 % людей старше 60 лет имеют антитела, перекрестно реагирующие с A(H1N1) pdm09 в РТГА и реакции нейтрализации [21].

Важнейшей мерой защиты от гриппозной инфекции и ограничения ее распространения является вакцинопрофилактика. Современные гриппозные вакцины индуцируют, как правило, образование антител к поверхностным антигенам вируса гриппа - гемагглютинину и нейраминидазе.

Существующие гриппозные вакцины можно разделить на два вида: аттенуированные (живые) и инактивированные, включая субъединичные. Все они достаточно широко применяются при вакцинации населения и хорошо зарекомендовали себя. Аттенуированные вакцины представляют собой вирусы гриппа с ослабленной вирулентностью. При приготовлении инактивированных субъединичных вакцин также используются эпидемически актуальные штаммы вируса, хотя применение высокопатогенных штаммов ограничено высокими требованиями к биологической безопасности производства. Традиционные способы получения вакцинных штаммов вируса гриппа А имеют ряд недостатков.

Одним из новых подходов к получению субъединичных вакцин против вирусов гриппа является применение различных систем экспрессии для быстрой продукции отдельных вирусных белков в препаративных количествах [22].

Вирусоподобные частицы (ВПЧ) представляют собой антигенные детерминанты вирионов без фрагментов геномной РНК. Благодаря отсутствию генетического материала ВПЧ не способны инфицировать клетки человека и животных, что обеспечивает их безопасность. Поверхностные белки гриппозных ВПЧ могут представлять конформационные эпитопы клеткам иммунной системы как нативные вирионы. В ряде исследований показано, что в формировании гриппозных ВПЧ ключевую роль играет участие внутреннего белка вируса гриппа - M1. Этот белок связывается с липидным участком апикального домена плазматической мембраны, взаимодействует с поверхностными гликопротеинами вируса гриппа и инициирует сборку и почкование ВПЧ, содержащих липидную мембрану клетки-хозяина с инкорпорированными в нее тремя трансмембранными белками вируса гриппа.

Гриппозные ВПЧ получены в различных системах экспрессии. Для эффективного освобождения из клеток млекопитающих гриппозных ВПЧ, содержащих НА, необходима либо одновременная экспрессия NA, либо добавление экзогенной NA. Это связано со способностью активной NA расщеплять сиаловые кислоты на поверхности клеточной мембраны. В клетках насекомых гриппозные ВПЧ, содержащие НА, можно получить даже в отсутствие экспрессии NA, так как в этих клетках сиаловые кислоты не связываются с N -гликанами в процессе посттрансляционной модификации.

Один из подходов к получению гриппозных ВПЧ в клетках насекомых предполагает использование рекомбинантных бакуловирусов. На животных моделях показано, что поверхностные гриппозные антигены в составе ВПЧ, полученные при помощи рекомбинантных бакуловирусов, индуцировали выработку как антигемагглютинирующих и вируснейтрализующих антител, так и эффекторов клеточного иммунного ответа. Кроме того, вакцина на основе гриппозных ВПЧ индуцировала протективный иммунитет против гомологичных и гетерологичных штаммов вируса гриппа А. Вакцина на основе ВПЧ, несущих антигены пандемичного вируса гриппа A H1N 1(2009), прошла вторую фазу клинических испытаний на 4563 здоровых взрослых добровольцах и показала безопасность и иммуногенность [23].

Таким образом, получение ВПЧ представляет перспективное направление при разработке гриппозных вакцин нового типа.

Вирусные векторы представляют собой рекомбинантные вирусы, в геном которых встроен целевой ген с набором регуляторных элементов. Среди существующих систем доставки антигенов вирусные векторы занимают особое место, поскольку обладают следующими свойствами: имеют природный механизм взаимодействия с клеткой и проникновения в нее; переносят чужеродный генетический материал в ядро клетки; способны обеспечивать длительную экспрессию антигена; вирусная оболочка защищает генетический материал, кодирующий антиген.

Вакцины на основе вирусных векторов эффективно активируют цитотоксические Т-лимфоциты, что особенно важно при вакцинации против внутриклеточных патогенов. Такие вакцины могут реализовать широкий спектр действия за счет индукции Т-клеточного ответа на консервативные эпитопы, потенциально способные обеспечить защиту от различных штаммов патогенов (в том числе, вируса гриппа).

Вирусные векторы обладают способностью активировать врожденный иммунитет путем связывания генетического материала или белков их оболочки с паттерн- распознающими рецепторами (TLR, RIG-1 и др.). Вирусные векторы распознаются такими TLR, как TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, TLR9.

При взаимодействии этих рецепторов с лигандами активируются различные факторы транскрипции, что приводит к формированию очага воспаления и быстрой активации защитных реакций организма.

При выборе вирусного вектора для генетической иммунизации необходимо руководствоваться следующими критериями: такая вакцина не должна вызывать симптомов заболевания, она должна быть безопасной для людей с ослабленным иммунитетом, пожилых и детей; собственные белки рекомбинантного вируса не должны вызывать сильного иммунного ответа; вирусный вектор должен быть простым для генетических манипуляций и позволять включать большие фрагменты чужеродной ДНК; полученные препараты должны иметь высокий титр и обеспечивать высокий уровень экспрессии целевых антигенов; при иммунизации ДНК вирусного вектора не должна интегрировать в геном клетки-хозяина, и сам вектор должен полностью выводиться из организма после индукции иммунного ответа. Кроме того, нежелательно наличие предсуществующего иммунного ответа к белкам вирусного вектора у иммунизируемых индивидов, так как он может существенно снизить уровень иммунного ответа на целевой антиген.

Не все вирусы обладают свойствами, необходимыми для создания эффективных векторов.

Лентивирусы индуцируют широкое разнообразие патологий у различных видов животных. Общей чертой этих вирусов является способность поражать неделящиеся и дифференцированные клетки - чрезвычайно полезное свойство для целей генной терапии. Название лентивирусов (лат. lenti = медленный) связано с длительным промежутком времени между инфицированием и завершением болезни, который может длиться нескольких месяцев или даже лет. Вирусы, принадлежащие к роду Lentivirus, представлены у приматов, копытных и кошачьих.

В целом, мишенями лентивирусов являются разнообразные типы клеток, что предполагает потенциально широкое использование этих вирусов: от противораковых стратегий до вакцинации и противовирусного иммунитета. Поскольку лентивирусы воздействуют на неделящиеся клетки, они должны обладать механизмом преодоления интактной ядерной мембраны - для доступа к клеточному геному. Среди ретровирусов лентивирусы приобрели наиболее эффективный механизм для достижения этой цели, и это свойство используется в генной терапии [24].

Жизненный цикл вируса разделяют на две основные фазы: первая - перенос вирусного генома в клетку хозяина, а вторая - его экспрессия и размножение вируса. Главный интерес для целей генной терапии представляет первая фаза вместе с ранними этапами вирусного жизненного цикла. Такой процесс определяют терминами генная трансдукция (в генной терапии) или однораундовая инфекция (в вирусологии). В случае ретровирусов инфекция начинается после связывания специфического клеточного рецептора с белками вирусной оболочки, а завершается интеграцией синтезированной ДНК в геном клетки хозяина. Связывание клеточного рецептора и вирусного Env-белка запускает слияние мембраны клетки и оболочки вирусной частицы, в результате в цитоплазму клетки-мишени попадает вирусный нуклеопротеиновый комплекс (вирусный геном в комплексе с вирусными и клеточными белками). Проблемой инфицирования неделящихся клеток является преодоление ядерной мембраны для доступа вирусного генома к ДНК хозяина. Этот этап, ключевой для целей генной терапии, назван ядерным импортом. При вирусной инфекции ядерная мембрана является дополнительным препятствием, которое вирусы преодолевают либо путем перемещения во время деления клетки, либо путем преодоления ядерных пор. Последний вариант является единственным в случае неделящихся клеток, впрочем, механизм до сих пор не ясен [24].

Несмотря на то, что большинство ретровирусов способны инфицировать неделящиеся клетки, именно лентивирусы наиболее эффективны для осуществления ядерного импорта [24].

В основе развития лентивирусных векторов лежит тенденция к оптимизации эффективности генного переноса и, в то же время, уменьшению потенциальной опасности, обусловленной использованием ретровирусных векторов. В ходе оптимизации были разработаны третье и четвертое поколения векторов, характеризующихся минимальным риском образования способных к репликации рекомбинантов. А введение SIN-мутаций не только уменьшает вероятность образования таких рекомбинантов, но и снижает неспецифическую активность энхансеров вирусного промотора [24].

Дальнейшие усилия оптимизации конструкции лентивирусных векторов направлены на улучшение интеграции целевого гена в геном клетки-мишени. Ретровирусы имеют необычную способность размещать гетерологичные оболочечные белки на своей оболочке, которая называется псевдотипированием, в результате чего вирусные частицы могут приобретать новый клеточный тропизм и внутриклеточное поведение. Псевдотипирование характерно для всех ретровирусов, но наибольший интерес представляет псевдотипирование лентивирусов, способных к транедукции неделящихся и дифференцированных клеток [25]. Лентивирусные псевдотипированные векторы нарабатываются на культуре клеток млекопитающих путем ко-трансфекции упаковочными и собственно векторной плазмидами.

Другое свойство псевдотипированных лентивирусных векторов - это способность воздействовать на внутриклеточное поведение вируса. Для достижения эффективного воздействия на клетки в отсутствие главных сигналов активации был разработан ряд стратегий, основанных на искусственно сконструированных оболочках, отличных от VSVg. Общей чертой этих стратегий являются использование особых молекул, расположенных на поверхности вирусной частицы и запускающих сигнал активации при связывании с клеточным рецептором. Сигнал временно активирует клетку и позволяет инфицировать ее. Эта стратегия была успешно применена для трансдукции покоящихся В- и Т-клеток с помощью оболочечных белков вируса кори и лентивирусов с цитокинами на поверхности [26, 27].

Описан пример успешного использования лентивирусных векторов для ретроградного транспорта VEGF на модельных мышах с боковым амиотрофическим склерозом (ALS, болезнь Шарко) [28]. Болезнь Шарко - это заболевание, характеризующееся прогрессирующей дегенерацией мотонейронов в головном и спинном мозге. При лечении этого заболевания одним из важнейших затруднений является доставка терапевтического агента к мотонейронам, для чего была разработана лентивирусная система доставки гена непосредственно к нейтронам за счет тропизма оболочечных белков вируса бешенства. В рассматриваемом исследовании был создан вектор на основе вируса инфекционной анемии лошадей (EIAV), псевдотипированный белком G вируса бешенства. Модельным мышам с нейродегенерацией проводили инъекции препарата лентивирусного вектора, обеспечивающего экспрессию VEGF, в различные мышечные ткани до начала и при прогрессирующей дегенерации нейронов. По результатам испытаний экспрессия репортерного гена была зафиксирована в спинном и головном мозге, и заметное продление развития заболевания установлено для обеих экспериментальных групп. Таким образом, было показано, что лентивирусные векторы на основе EIAV, псевдотипированные оболочечными гликопротеинами G вируса бешенства, представляют собой эффективную систему доставки генов к мотонейронам при внутримышечной инъекции. Исследование также показало терапевтическое действие VEGF на модельных мышах: даже на стадии гибели половины мотонейронов, соответствующей обычной постановке диагноза, применение вирусного вектора для переноса VEGF обеспечивало не только продление жизни экспериментальных животных, но частичное восстановление функции. А микроскопические и гистологические исследования не выявили каких-либо патологий спинного и головного мозга после инъекции препарата, в том числе, аномальной васкуляризации тканей. В дополнение, иммунный ответ на систему доставки наблюдался незначительный даже через пять недель после инъекции.

Таким образом, открытия и исследования в области вирусологии позволяют расширять применение технологию лентивирусных псевдотипированных векторов для получения широкого разнообразия клеток-продуцентов терапевтических препаратов и, в частности, для целей генной терапии.

В последнее время использование неинфекционных вирусоподобных частиц (ВПЧ), которые спонтанно само собираются благодаря взаимодействию вирусных структурных белков, создало хорошую перспективу для усовершенствования вакцин против широкого спектра вирусов, вызывающих заболевания у человека [29]. ВПЧ гриппа, экспрессируемая рекомбинантными бакуловирусами, которые представляют многокомпонентные антигены, включающими гемагглютинин и матриксный белок M1, совместно или без нейраминидазы, способны индуцировать иммунную реакцию против гомологичных или гетерологичных штаммов вируса гриппа, что подробно описано [30,31,32,33,34,35,36]. Кроме того, метод обратной генетики, лицензированный в Европе для создания вакцин против сезонного гриппа, использует систему культивирования на основе клеток млекопитающих, а не в РКЭ [37]. Использование культур клеток млекопитающих, таких как Vero или MDCK, адаптивных хозяев для вакцинных вирусов, имеет ряд преимуществ, не только в связи с увеличением гибкости и согласованности процесса производства, но и в связи с возможностью гликозилирования вирусных антигенов в естественной форме, чего не может быть достигнуто в РКЭ или бакуловирусных системах. В эукариотических клетках гликозилирование белков участвует в правильной сборке и ориентации вновь транслируемых белков, что играет важную роль в функции белка. Генерация ВПЧ гриппа в клетках млекопитающих ранее была получена в результате транзиентной ко-экспрессии гемагглютинина и нейраминидазы в клетках 293Т человека [38]. С целью улучшения производственных характеристик в состав ВПЧ гриппа были включены не только белки гемагглютинина и нейраминидазы, но и белки матрикса M1 и М2 поскольку они играют важную роль в сборке вирусных частиц и их почковании [39,40,41,42,43,44]. Включение белков M1 и М2 в ВПЧ гриппа, производимых в клетках млекопитающих, не только увеличивает выход продукции ВПЧ, но и дополняет антигенный портрет ВПЧ антигенами, с консервативными Т- и В-клеточными эпитопами, что позволяет индуцировать иммунитет не только против гомологичных, но и гетерологичных вирусов [45,46].

Подавляющее большинство известных на данный момент способов контроля качества вакцин, представляют из себя боилогические способы. Использование таких способов сопряжено с рядом известных специалистам проблем.

Из RU2089893 от 10.09.1997 известен способ технологического контроля качества вакцины. Указанный способ включает применение электрофоретического анализа.

В уровне техники отсутствуют способы контроля качества такого продукта как вакцина. Несмотря на очевидную необходимость иметь простой и эффективный способ контроля качества вакцинного продукта, в том числе и для гриппозной вакцины.

Заявленное изобретение обладает следующими техническими результатами:

- обладает эффективностью близкой к 100%;

- позволяет получать чистые, эффективные без посторонних примесей вакцинные препараты против гриппа, как типа А, так и типа В;

- снижет аллергенногенность получаемой вакцины;

- позволяет получать ВПЧ вируса гриппа имеющего большую гемагглютинирующию активность;

- позволяет повысить выход антигена;

- сохраняет жизнеспособность и высокую продуктивность целевых белков без использования регулируемой экспрессии у клеток-продуцентов ВПЧ гриппа, что является неожиданным.

Специалист в уровне технике, напротив, мог предполагать, что из-за гиперэкспрессии белков вируса гриппа клетки не смогут проходить большое количество пассажей, необходимое для получения рабочего банка. Кроме того, поскольку из уровня техники известно, что при использовании аденовирусных векторов, несущих ген НА A/PR/8/34 (H1N1), при этом инфицирование клеток MDCK вообще регистрировалось только при использовании вектора, несущего ген из штамма гриппа A/PR/8/34 (H1N1); жизнеспособность и продуктивность клеток MDCK ниже других типов клеток млекопитающих (см. RU 2565546), сохранение жизнеспособности на протяжении многих пассажей является неочевидным для специалиста при использовании MDCK клеток.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами.

На Фиг. 1 отображена лентивирусная векторная плазмида, несущая кассету генов гемагглютинина штамма B, нейраминидазы штамма A (H1N1) и M1 белка штамма A (H1N1).

На Фиг. 2 представлена лентивирусная векторная плазмида, несущая кассету генов гемагглютинина штамма A (H3N2), нейраминидазы штамма A (H1N1) и M1 белка штамма A (H1N1).

Фиг. 3 иллюстрирует лентивирусный вектор экспрессии кассеты генов pLenti6.3/TO/HA(H1N1)-M1-NA, несущий кассету генов гемагглютинина штамма A (H1N1), нейраминидазы штамма A (H1N1) и M1 белка штамма A (H1N1).

Фиг. 4 отображает результат электрофоретического разделения в 1,5% геле агарозы амплифицированных фрагментов генов НА и М1.

1 - ПЦР-продукт для полноразмерного матриксного белка (777 п.н.);

2 - ПЦР-продукт для полноразмерного гемагглютинина (1719 п.н.);