Антистеатозное средство Российский патент 2019 года по МПК A61K31/19 A61K31/196 A61P1/16 

Изобретение относится к медицине и фармации и касается нового антистеатозного средства 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия формулы I, которое может быть использовано в медицине в качестве потенциального средства для лечения неалкогольной жировой болезни печени.

Известно само соединение и его антиатеросклеротическое, антиалкогольное, антиоксидантное и гипотензивное свойства [А. с. 1773234 СССР, A61K 31/19; А. с. 1787030 СССР, A61K 31/19].

В настоящее время наблюдается неуклонное увеличение частоты заболеваний, в основе которых лежат ассоциированные нарушения углеводного и жирового обменов (метаболический синдром, сахарный диабет 2 типа, ожирение, дислипидемия, неалкогольная жировая болезнь печени). По данным Российского исследования DIREG 2 у 37,3% пациентов, обратившихся за помощью к терапевту, обнаружена неалкогольная жировая болезнь печени (НЖБП), в результате чего она заняла первое место среди заболеваний печени - 71,6% [В.Т. Ивашкин, О.М. Драпкина, И.В. Маев и др. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2015, 25(6), 31-38].

НЖБП представляет собой полиэтиологичное заболевание, в основе которого лежат нарушения углеводного и жирового обмена, как в самом органе, так и в организме в целом в рамках метаболического синдрома, ожирения, сахарного диабета. Проявляется НЖБП в виде стеатоза или стеатогепатита с исходами в цирроз или гепатоцеллюлярную карциному.

Эффективная фармакотерапия жирового гепатоза до настоящего времени не разработана. В качестве антистеатозных препаратов интерес представляют производные малоновой (метандикарбоновой) кислоты. 4,4'-(Пропандиамидо)дибензоат натрия, как производное малоновой кислоты, имеет определенное сходство с сукцинатом и благодаря чему может конкурентно препятствовать избыточному сукцинилированию регуляторных белков, наблюдающемуся при широком спектре метаболических заболеваний (ожирение, метаболический синдром, сахарный диабет, жировая болезнь печени).

Задачей предлагаемого изобретения является расширение арсенала антистеатозных средств, имеющих низкую токсичность.

Указанная задача достигается применением 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в качестве антистеатозного средства.

Изобретение иллюстрируется примерами синтеза и исследования фармакологических свойств, описание включает одну таблицу и сопровождается двумя схемами синтеза.

Пример 1. Получение 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия (I).

Синтез проходит в две стадии.

Стадия 1. Получение N,N'-малонил-ди-п-аминобензойной кислоты (МПАБК).

Стадия является ключевой и заключается в N-ацилировании ПАБК малоновым эфиром с образованием целевой МПАБК. Процесс протекал в среде о-ксилола при температуре 145-150° в течение 8-10 часов.

Стадия 2. Получение натриевой соли МПАБК

Химизм процесса получения из МПАБК соответствующей натриевой соли под действием гидроксида натрия описывается следующей схемой:

Способ получения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоат натрия изучен и проведен в лабораторных условиях на стандартном товарном сырье.

Состав синтезированного соединения подтвержден элементным анализом.

Брутто-формула: C₁₇H₁₂N₂O₆Na₂. Найдено, %: С - 52.62, Н - 3.07, N -7.19. Вычислено %: С - 52.86, Н - 3.13, N - 7.25.

Строение синтезированного вещества было доказано спектральными методами анализа ЯМР ¹Н и ¹³С, ИК-спектроскопией.

Пример 2. Определение острой токсичности.

Определение LD50 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия проводили при однократном внутривенном введении в различных экспериментальных дозах самцам и самкам лабораторных мышей и определения класса токсичности заявляемого вещества при однократном внутрижелудочном введении самцам и самкам лабораторных аутбредных крыс [Прозоровский В.Б. Статистическая обработка результатов фармакологических исследований // Психофармакология и биологическая наркология. 2007. - Т. 7. - №3-4. - С. 2090-2120].

Установлено, что при определении по методу Прозоровского 1ЛЭ50 заявляемого соединения при введении мышам внутривенно составляет 2060±160 мг/кг для самцов и 1900±170 мг/кг для самок. При определении острой токсичности по методике ОЭСР Тест №423 «Острая пероральная токсичность - метод определения класса острой токсичности» доза 2000 мг/кг не вызывала летального исхода при применении у животных обоих полов, что позволяет отнести заявляемое средство к классу токсичности «5 класс токсичности или не классифицируется».

Пример 3. Влияние заявляемого средства на содержание общих липидов в печени мышей с экспериментальным стеатозом.

Все эксперименты проводили в соответствии с Приказом Минздрава РФ от 01.04.16 г. №199н "Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики". Животных содержали в стандартных условиях вивария на обычном пищевом рационе со свободным доступом к воде.

Эвтаназию животных осуществляли путем усыпления углекислым газом в CO₂-боксе THF3481-V01 (Bioscape, Германия).

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программ «Statistica 6.0». Значимость различий при нормальном распределении количественных признаков оценивали с помощью t-критерия Стьюдента (для независимых выборок). Числовые данные представлены в виде: среднее арифметическое (М) ± стандартное отклонение (SD). Уровень доверительной вероятности был задан равным 95%.

Изучение содержания липидов в печени выполнены на 36 линейных мышах самцах C57bl/6 весом 20-28 г, полученных из питомника «Рапполово» (Ленинградская область). Для моделирования стеатоза печени была использована гиперкалорийная высокожировая диета при избытке легкоусваиваемых углеводов, которая создавалась путем добавления к стандартному корму (63%) топленого свиного жира (19%), сахарозы (10%) и изолированного соевого белка (8%) [Хи В.L. et al. Effects of caloric intake on learning and memory function in juvenile C57BL/6J mice // BioMed research international. - 2015. - T. 2015]. Такая диета способствует развитию у животных стеатоза печени и формированию дисгликемии. Животные были поделены на три группы по 12 мышей в каждой:

1. Интактная группа, получавшая стандартный корм и перорально воду очищенную;

2. Контрольная группа, получавшая высококалорийную высокожировую диету и перорально воду очищенную;

3. Опытная группа, получавшая высококалорийную высокожировую диету и перорально 4,4'-(пропандиамидо)дибензоат натрия в дозе 10 мг/кг.

Через 24 недели моделирования патологии животных выводили из эксперимента и в ткани печени количественно определяли общие липиды по методу Фолча [Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен): Учебное пособие / под ред. М. Прохоровой. - Л.: изд-во ЛГУ, 1982. - 272 с. - С. 54-57].

В результате установлено, что гиперкалорийная высокожировая диета приводит к достоверному увеличению содержания липидов в ткани печени на 6,3%. Под влиянием 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия наблюдалось достоверное (р<0,05) уменьшение общих липидов в печени на 16% (табл.).

Обозначения: * - достоверные отличия от соответствующего показателя интактной группы (р<0,05); **- достоверные отличия от соответствующего показателя контрольной группы (р<0,05).

На фоне гиперкалорийной высокожировой диеты увеличивается приток свободных жирных кислот в печень. Это создает не только предпосылки к развитию стеатоза, но и митохондриальной дисфункции, приводящей к потере клеточного контроля за процессами липопероксидации и активации перекисного окисления липидов, что в конечном итоге проводит к гибели гепатоцитов по механизму апоптоза или некроза, развитию воспалительной инфильтрации и фиброза печени [Черкашина Е.А., Петренко Л.В. Евстигнеева А.Ю. Неалкогольная жировая болезнь печени: патогенез, диагностика, лечение // Ульяновский медико-биологический журнал. - 2014. - №1. - С. 35-47]. Следовательно, даже небольшое уменьшение стеатоза печени является фактором, улучшающим прогноз течения заболевания.

Пример 4. Гистологическое исследование печени животных с экспериментальным стеатозом на фоне заявляемого средства.

Гистологическое исследование печени - современный «золотой стандарт» диагностики стеатоза, воспаления и оценки стадии фиброза при поражении в рамках жировой болезни печени [В.Т. Ивашкин, О.М. Драпкина, И.В. Маев и др. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2015, 25(6), 31-38]. Исследование влияния 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия на гистологическую картину печени проводили аналогично вышеописанному эксперименту. Дополнительно в качестве препарата сравнения использовали метформин (Sigma, США) в дозе 300 мг/кг/сут.

Образцы печени фиксировали 10% нормальным (рН-7,4) раствором формальдегида в течение 24 часов. Фиксированные образцы ткани последовательно инкубировали в изопропаноле с последующей имбибицией парафином на автоматическом гистопроцессоре ExelsiorES (Thermo, Великобритания). Обезвоженные и пропитанные парафином образцы ткани заливали парафином. Из приготовленных парафиновых блоков изготавливали срезы толщиной 4 мкм с использованием полуавтоматического ротационного микротома НМ340Е (Thermo, Германия) и окрашивали гематоксилином и эозином. Морфологические изменения изучали в проходящем свете с использованием исследовательского микроскопа AxioImagerA2 (Thermo, Германия), оснащенным цифровой цветной камерой и программным обеспечением для получения изображений при суммарном увеличении ×100, ×200, ×400.

Гистологическое исследование печени животных контрольной группы с экспериментальным стеатозом, показало сохранение структуры печеночной ткани, портальные тракты без фиброза, с разной степени выраженности лимфоцитарной или лимфо-макрофагальной инфильтрацией стромы. В перипортальных отделах печеночных долек выявлена преимущественно мелкоочаговая лимфо-гистиоцитарная инфильтрация, расположенная среди групп гепатоцитов с некробиотическими изменениями. Цитоплазма гепатоцитов, преимущественно в центролобулярных отделах печеночных долек, с явлениями выраженной белковой дистрофии в виде неравномерной просветленности, неоднородности, комковатости, часть гепатоцитов содержат в цитоплазме мелкие или средних размеров вакуоли.

В некоторых образцах, кроме того, имеются крупные очаги некроза, обильно инфильтрированные лимфоцитами, нейтрофильными и эозинофильными гранулоцитами, расположенные в паренхиме печени, преимущественно в непосредственной близости от стенок центральных (печеночных) вен. Помимо некротически-воспалительных изменений в цитоплазме гепатоцитов определялись мелкие капли жира.

Заявляемое соединение на фоне гиперкалорийной диеты позволило сохранить структуру печеночной ткани, портальные тракты без фиброза и преимущественно без патологической клеточной инфильтрации. Строма единичных портальных трактов очагово инфильтрирована лимфоцитами. Перипортальной некровоспалительной активности нет. Балочное строение паренхимы печени сохранено. Цитоплазма гепатоцитов с явлениями слабо выраженной белковой зернистой дистрофии. Внутри печеночных долек неравномерная распространенная, в целом - слабой степени выраженности, пролиферация купферовских клеток и мелкоочаговая лимфо-гистиоцитарная с примесью эозинофильных гранулоцитов инфильтрация. В некоторых образцах имеются мелкие фокусы пролиферации гепатоцитов в зонах повреждения паренхимы. Скудная неравномерная полиморфно-клеточная инфильтрация вокруг центральных (печеночных) вен.

В группе животных, получавших на фоне диеты метформин, структура печеночной ткани сохранена, портальные тракты без фиброза. Строма части портальных трактов инфильтрирована лимфоцитами. Балочное строение паренхимы печени сохранено. Ядра гепатоцитов умеренно полиморфны, чаще с просветленными ядрами и неравномерным размещением в них хроматина, с отчетливыми гиперхромными ядрышками. Цитоплазма гепатоцитов с явлениями слабо выраженной белковой дистрофии. Внутри печеночных долек неравномерная распространенная, в целом - слабой степени выраженности пролиферация купферовских клеток и мелкоочаговая лимфо-гистиоцитарная или с примесью эозинофильных гранулоцитов инфильтрация, расположенная преимущественно в непосредственной близости от центральных вен.

Таким образом, в группе животных, получавших высококалорийный корм преобладают явления повреждения паренхимы печени и более выраженная патологическая клеточная реакция, в то время как в группе мышей, получавших наряду с высококалорийным кормом 4,4'-(пропандиамидо)дибензоат натрия преобладают проявления текущей организации (с макрофагальной продуктивной реакцией), а также регенераторные изменения гепатоцитов при очевидно менее выраженных явлениях повреждения паренхимы печени. Кроме того, следует отметить уменьшение жировой инфильтрации гепатоцитов при использовании фармакологического агента. По всей видимости (при прочих равных условиях), 4,4'-(пропандиамидо)дибензоат натрия обладает протективными и регенераторными свойствами, обусловливая существенно более выраженное и раннее репаративное и регенераторное воздействие на печень. В отличие от заявляемого соединения, в группе, получавшей метформин, регенераторных изменений выявлено не было.

Таким образом, доказано наличие антистеатозной активности у 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия при моделировании экспериментального стеатоза печени у животных на основании изучения содержания общих липидов в печени и гистологического исследования органа. Установлено, что заявляемое соединение уменьшает количество общих липидов в ткани печени на 16% по сравнению с контролем. Сравнение имеющихся морфологических изменений позволяет предполагать преобладание продуктивных и пролиферативных (отражающих процессы репарации и регенерации) изменений в группе, получавшей на фоне высокожировой нагрузки заявляемое соединение над альтеративно-экссудативными изменениями (отражающими повреждение) в группе с экспериментальным стеатозом печени. По фармакологической активности заявляемое средство (4,4'-(пропандиамидо)дибензоат натрия) превосходит препарат сравнения метформин. При однонаправленных результатах проведенных исследований 4,4'-(пропандиамидо)дибензоат натрия работает в эффективной дозе 10 мг/кг, в то время как для метформина требуется доза 300 мг/кг.

Областью применения заявляемого средства может быть лечение неалкогольной жировой болезни печени.

Настоящее изобретение относится к применению 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в качестве антистеатозного средства, поддерживающего балочное строение паренхимы печени, сохраняющего портальные тракты без фиброза, предупреждающего перипортальную некровоспалительную активность. Технический результат – расширение арсенала антистетозных средств, имеющих низкую токсичность, обладающих протективными и регенеративными свойствами, обуславливая существенно более выраженное и раннее репаративное и регенераторное воздействие на печень. 1 табл., 4 пр.

Применение 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в качестве антистеатозного средства, поддерживающего балочное строение паренхимы печени, сохраняющего портальные тракты без фиброза, предупреждающего перипортальную некровоспалительную активность.