Способ морфологической оценки агрегации эритроцитов, индуцированной высокомолекулярными полимерами Российский патент 2019 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к исследованию реологических свойств крови и может быть использовано для оценки агрегатного состояния эритроцитов.

Известен фотометрический способ оценки агрегации эритроцитов (Schmid-Schonbein et al., Microvasc. Res. 1973. Vol. 6. P. 366- 376), включающий выделение эритроцитов из крови, смешивание с аутоплазмой или с высокомолекулярным декстраном, помещение в кювету реоскопа и регистрацию записи агрегатограммы.

С помощью фотометрического метода можно определить степень агрегации эритроцитов в виде «монетных столбиков». Однако практически не изученной остается прижизненная морфология агрегатного состояния эритроцитов при большом увеличении светового микроскопа.

Известны методы изучения морфологии агрегатов эритроцитов в аутологичной плазме и сыворотке крови при большом увеличении светового микроскопа (Шереметьев Ю.А., Успенский А.Н. Способ микроскопической оценки агрегатного состояния эритроцитов в аутоплазме. Патент RU 2605843, 2016; Шереметьев Ю.А., Успенский А.Н. Способ оценки агрегатного состояния эритроцитов в аутологичной сыворотке крови. Патент RU 2590985, 2016). В связи с тем, что высокомолекулярные полимеры (декстран, поливинилпирролидон) нашли широкое применение в качестве агрегирующих агентов как для изучения механизмов взаимодействия эритроцитов, так и оценки их агрегационной способности при патологиях различного генеза, представляется важным разработать способ морфологической оценки агрегации эритроцитов, индуцированной высокомолекулярными полимерами, при большом увеличении светового микроскопа.

За прототип взят способ микроскопической оценки агрегатного состояния эритроцитов в аутоплазме (Шереметьев Ю.А., Успенский А.Н. Способ микроскопической оценки агрегатного состояния эритроцитов в аутоплазме. Патент RU 2605843, 2016), включающий забор крови, выделение эритроцитов, смешивание плазмы крови с эритроцитами в соотношении 2:1, помещение смеси на предметное стекло, перемешивание, опускание в каплю смеси объектива ×100, осуществление микрофотосъемки.

Известно, что нормальные эритроциты трансформируются в эхиноциты при контакте двух стеклянных поверхностей (Wong P. A basis of echinocytosis and stomatocytosis in disc-sphere transformation of the erythrocyte. J. Theor. Biol. 1999. V. 196. P. 343-361). Это называется «эффектом стекла». Эффект стекла, в частности, происходит, когда в суспензию эритроцитов, помещенных на предметное стекло, опускают объектив 100^х (Шереметьев Ю.А., Поповичева А.Н., Успенский А.Н., Александров А.А., Успенская О.А. Способ прижизненной оценки действия реагентов на образование стоматоцитов. Патент RU 2629609, 2017). В способе, взятом за прототип, эффект стекла устраняется за счет того, что плазма содержит белок альбумин, предотвращающий трансформацию клеток в эхиноциты (Wong P. A basis of echinocytosis and stomatocytosis in disc-sphere transformation of the erythrocyte. J. Theor. Biol. 1999. V.196. P. 343-361). Растворы полимеров не содержат белков плазмы, поэтому при контакте двух стеклянных поверхностей в их присутствии эритроциты трансформируются в эхиноциты.

Задачей предполагаемого изобретения является создание несложного, быстро реализуемого способа микроскопической оценки агрегатного состояния эритроцитов в присутствии высокомолекулярных полимеров.

Поставленная задача решается за счет того, что раствор высокомолекулярного полимера в присутствии 0.1% альбумина смешивают с отмытыми эритроцитами в соотношении 2:1, смесь помещают на предметное стекло, перемешивают, опускают в нее объектив (×100) светового микроскопа и после достижения фокуса (×1000) наблюдают через окуляр микроскопа. Для микроскопической оценки агрегатного состояния эритроцитов производят микрофотосъемку.

Способ осуществляется следующим образом. Кровь забирают в вакуумные пробирки, содержащие 3.8% цитрат натрия (соотношение 9:1). Пробирки центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин. Плазму и клетки белой крови убирают, после чего эритроциты трижды промывают физиологическим раствором. В качестве высокомолекулярных полимеров используют 3% раствор декстрана 70 (м. в. 70 кДа, Sigma, США) или 0.5% раствор поливинилпирролидона (м. в. 360 кДа, Sigma, США). Декстран или поливинилпирролидон приготавливают на забуференном физиологическом растворе (10 мМ Трис - HCl, 150 мМ NaCl, рН 7.4), содержащем 0.1% альбумин. Раствор декстрана или поливинилпирролидона, содержащий 0.1% альбумин, смешивают с эритроцитами в соотношении 2:1, каплю смеси помещают на предметное стекло, перемешивают, опускают в нее объектив (×100) светового микроскопа и после достижения фокуса (×1000), производят микрофотосъемку.

На рисунке 1 видно образование «монетных столбиков» из эритроцитов здоровых доноров после добавления к ним 3% раствора декстрана, содержащего 0.1% альбумина. Наблюдается отсутствие эхиноцитов.

На рисунке 2 видно образование «монетных столбиков» из эритроцитов здоровых доноров после добавления к ним 0.5% раствор поливинилпирролидона, содержащего 0.1% альбумина. Наблюдается отсутствие эхиноцитов.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет проводить морфологическую оценку агрегации эритроцитов при большом увеличении светового микроскопа не только в аутологичной плазме и сыворотке крови, но и в растворе высокомолекулярного полимера.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для морфологической оценки агрегации эритроцитов, индуцированной высокомолекулярными полимерами. Для этого выделенные из крови эритроциты отмывают. Затем их смешивают в соотношении 2:1 с раствором высокомолекулярного полимера (декстран или поливинилпирролидон), который содержит 0,1% альбумин. После чего указанную смесь помещают на предметное стекло, перемешивают, опускают в каплю смеси объектив ×100. Производят микрофотосъемку эритроцитов. Изобретение позволяет проводить оценку агрегации эритроцитов с помощью световой микроскопии. 2 ил.

Способ морфологической оценки агрегации эритроцитов, индуцированной высокомолекулярными полимерами, включающий забор крови и микроскопическое изучение агрегации эритроцитов, отличающийся тем, что раствор высокомолекулярного полимера, выбранный из декстрана или поливинилпирролидона, который содержит 0,1% альбумин, смешивают с отмытыми эритроцитами в соотношении 2:1, помещают на предметное стекло, перемешивают, опускают в каплю смеси объектив ×100, производят микрофотосъемку.