СПОСОБ СКРИНИНГА РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К НЕМУ Российский патент 2019 года по МПК A61B5/01 A61N5/02 G01N33/574 C12Q1/6851 C12Q1/6886 A61B6/00 A61B8/08 

Одной из ведущих онкологических нозологий в настоящее время является рак молочной железы. Данная патология занимает ведущие позиции по числу заболевших и по числу умерших. Решением данной проблемы является проведение научно обоснованного скрининга, которые представляют собой комплекс диагностических и лечебных мероприятий, направленных на раннее выявление онкопатологии молочных желез. Большим шагом вперед является создание шкалы BI-RADS, которая систематизировала все состояния молочной железы и оценила все изменения с позиции риска злокачественной трансформации ткани молочной железы.

BI-RADS 0 - оценка является неполной. Используется при скрининге рака молочной железы, когда необходимы дополнительные исследования (повторный вызов)

BI-RADS 1 - отрицательный результат (нет данных, подтверждающих наличие узлового образования). Диффузные изменения

BI-RADS-2 - Доброкачественные изменения, нет признаков злокачественного роста. Выявляются доброкачественные объемные образования, доброкачественные кальцинаты

BI-RADS-3 - вероятно доброкачественные изменения - требуется короткий интервал контроля (6 мес). Вероятность злокачественного процесса менее 2%. По истечении 6 месяцев контрольное исследование однозначно решит вопрос о доброкачественности или злокачественности процесса

BI-RADS-4 - Изменения, подозрительные на злокачественность. Вероятность злокачественного процесса от 2 до 95%, рекомендуется биопсия. Направление в онкологическое учреждение

BI-RADS-5 - Злокачественные изменения. Вероятность более 95%, рекомендуется биопсия. Направление в онкологическое учреждение

BI-RADS-6 - гистологически верифицированный рак молочной железы (Г.П Корженкова, 2016)

В настоящее время ведущим диагностическим методом скрининга является сочетание маммографии и (в меньшей степени) ультразвукового исследования молочных желез. Преимущества маммографии выражаются в том, что эта методика позволяет визуализировать все проявления известных разновидностей непальпируемых новообразований (скопление микрокальцинатов размером от 50 мкм, локальная тяжистая перестройка структуры, рак внутри протока. Высокое разрешение обеспечивает дифференциальную уточненную диагностику заболеваний молочной железы. Маммография позволяет определить характер роста опухоли (моно- или мультицентрический), степень распространенности процесса. Недостатком маммографии связан с дозовой нагрузкой - от 0,15 м3в до 1.0 м3в) является невозможность определения узловых образований менее 3 мм - предел метода. Данный метод так же неэффективен при высокой рентгенологической плотности. Высокая рентгенологическая плотность уменьшает эффективность метода на 50%-100%. (Каприн А.Д., Рожкова Н.И., 2019). Ультразвуковое обследование молочной железы позволяет компенсировать недостатки маммографии и в комплексном применении повышает уточненную диагностику до 95%, но невозможность использовать данный метод изолированно в плане скрининга оставляет ряд нерешенных проблем. Главной проблемой является то, что у вышеописанных методик есть предел метода - минимальный размер выявляемого образования составляет 3 мм. Учитывая тот факт, что 1 мм опухолевой массы содержит 100 миллионов онкологических клеток, можно говорить о ранней клинической, но поздней биологической патологии. Поэтому даже сочетание этих методов не решает проблему выявления агрессивных форм рака молочной железы малых размеров, которые и приводят к ранней смертности.

Выделяют несколько механизмов активации пролиферативной активности эпителиальных клеток при предопухолевой активности эпителиальных клеток при предопухолевых состояниях молочной железы. Первый механизм активации связан с воспалительными цитокинами (интерлейкин-1, фактор некроза опухоли), которые активизируют ядерный фактор транскрипции, определяющий активное клеточной деление. Постоянная низкодозовая продукция фактора некроза опухоли стимулирует активность циклооксигеназы 2-типа - основного фермента биосинтеза простагландина Е2, которые в свою очередь поддерживают высокую экспрессию EGF, FGF, VEGF, IGF.

Другой механизм стимуляции пролиферации эпителия осуществляется многочисленными факторами роста (EGF, FGF, VEGF, IGF)

Третий путь стимуляции пролиферации - взаимодействие стероидных гормонов с соответствующими рецепторами приводит к активации транскрипции с увеличением пролиферативной активности. Важно отметить, что риск развития онкологической трансформации ткани молочной железы положительно коррелирует с образованием очаговых пролифератов. Так при наличии более 3 фокусов атипии рак развивался в 47% случаев, а при наличии 1 фокуса только 25% наблюдений.

Анализ данных трех путей дает основание предположить о последовательно-параллельном развитии этих путей с выраженной аутокринной стимуляцией. То есть, если первый путь активируется и доходит до определенного уровня, то становится выраженным второй путь и уже начинается активация третьего (гормонального) пути). Ставится следующий вопрос: в какой период и при каких изменениях в ткани молочной железы начинаются те предраковые изменения, которые приведут к развитию рака молочной железы.

Анализ всех вышеописанных путей пролиферации тканей молочных желез позволяет отметить одно общее свойство: повышение температуры при активации пролиферативных процессов. Выявление роста температуры ткани молочной железы, оценка ее динамики позволяет находить те «зоны риска», в которых появляются неопластические изменения. Наилучшей технологией для измерения внутренней и поверхностной температуры ткани молочной железы является методика радиотермометрии (РТМ) (Веснин С.Г., 2000).

Данная технология основана на том, что все ткани человека обладают собственным электромагнитным излучением. Интенсивность излучения положительно коррелирует с температурой. Чем более выражена пролиферативная активность ткани, тем выше температура ткани. Данное теоретическое положение было обосновано французским ученым Готерье. Используя радиотермометрический комплекс, он провел исследование у 500 пациенток из Франции. Контрольной группой являлись пациентки из Великобритании, которым проводилось исследование по стандартной диагностической программе (ММГ+УЗИ молочных желез). В результате 10-летней работы было выявлено, что число диагностированных раков молочной железы во Франции в несколько раз превосходило выявленных раков молочной железы в Великобритании. Вместе с тем в ходе многочисленных научных исследований было установлено, что повышение температуры может быть не только при раке, но и при различных воспалительных заболеваниях молочной железы. Дифференциальная диагностика воспалительных и злокачественных заболеваний молочной железы крайне затруднительна.

С целью решения данной проблемы мы обратили внимание на следующие факты. Известно, что некоторые формы ФКМ ассоциированы с повышенным риском развития рака молочной железы в будущем (Degnim A.C., Dupont WD, Radisky D.C., Cancer. 2016 Oct: 122 (19): 2971-8. Соответственно, оптимизация диагностики и тактики ведения женщин с ДЗМЖ является частью стратегии снижения заболеваемости РМЖ

В.А. Хайленко (2018) установил, что основные мутации, приводящие к раку молочной железы, накапливаются в предраковом состоянии. Исследование мутаций в генах ТР53, PIK3CA, NCOA2, ABL2, PDE4DIP, AHNAK, RUNX1 показало, что вся «злокачественность» возникла уже в предраковом состоянии, до развития способности к инвазии. Это дало основание к изучению микро-РНК как предиктора неопластической трансформации ткани молочной железы. (К.А. Гришина, В.А. Хайленко, 2018) Наше внимание привлек такой класс биологических молекул как микро-РНК.

Выделение микроРНК по следующей методике: в образец добавляют 5 мкМ протеиназы К, инкубируют при 56 градусов Цельсия в течение 1 часа, затем используют колонки Exigon, для очистки микроРНК-образец наносят на колонку, после чего проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге Epprndorf 5104, затем колонку 3 раза промывают промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге Eppendorf 5104, потом на колонку наносятся 20 мкл безнуклеазной воды. Колонку оставляют на 10 минут при комнатной температуре, а потом центрифугируют при 3000 g на центрифуге Eppendorf 5104, после чего проводят реакцию обратной транскрипции при помощи обратной транскриптазы (Exigon), для этого к 8 мкл образца добавляют 8 мкл реагента и инкубируют в течение 1 часа при температуре 60 градусов цельсия, после чего реакцию останавливают нагреванием до 95 градусов цельсия в течение 5 минут. Затем проводят полимеразную цепную реакцию с детекцией в реальном времени на приборе 7500Applied Biosystems, с праймерами на следующие микро РНК: has-miR-199а-3р, has-miR-222-3р, hsa-let-7a-5p, микро PHК-196a-2, has-miR-106a-5р, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-137, hsa-miR - 155 результаты анализируют при помощи компьютерной программы GenEx qPCR software и оформляют в виде таблицы (см. фиг. 1 - распределение микроРНК, выделенной из ватного зонда с биологической жидкостью, с ФКМ и РМЖ) Концентрация представлена как log с основанием 2 копий микро РНК в микролитре.

Превышение нормы на 1,5-2 единицы - это незначительное повышение, на 2-5 - повышение, на 5 и более - значительное повышение.

Микро-РНК представляют собой «глобальные переключатели генома», регулирующие множественные метаболические пути и образование белковых продуктов. Доказано, что ряд микро-РНК имеют онкогенное действие, к которым относят микро-РНК-21, 155, 182, 10b, 27а, 9. Микро РНК 21 является одной из наиболее известных и изученных микроРНК в разных видах опухолей. Ее экспрессия резко повышена при РМЖ, что связывают с ростом опухоли, метастазами и плохим прогнозом течения заболевания. Гиперэкспрессия микроРНК-155 часто встречается в ткани опухоли молочной железы и негативно влияет на выживаемость и хемочувствительность (через ген FOXO3a) опухолевых клеток, в то время как пониженная экспрессия miR-155 может усилить клеточную хемочувствительность и апоптоз.

Уровни некоторых микро-РНК изучены при доброкачественной патологии. По данным J. Chan, экспрессия MiR-21 вызывает блокирование генов, связанных с апоптозом. MiR-221/222 относят к онкогенным микро-РНК, сверхэкспрессия которых в разных типах опухолей приводит к усилению клеточной пролиферации, ингибированию апоптоза, индукции ангиогенеза. Подавление и низкий уровень экспрессии MiR 221/222 в опухолях молочной железы коррелирует с положительным статусом эстрогеновых рецепторов и более благоприятным прогнозом заболевания.

Активность MiR-155 необходима для поддержания нормального функционирования клеток, увеличение экспрессии данной микро-РНК отмечено при аутоиммунных заболеваниях и при различных формах рака. Кроме того, данная микро-РНК ассоциируется с эстроген - позитивным статусом опухоли и потенциально может служить диагностическим маркером.

По данным ряда авторов (Чебанов Д.К., Михайлова И.Н., Абрамов А.А., Воробьева Н.С., 2016) MiR-205 индуцирует апоптоз и тормозит рост и инвазию клеток опухоли, а также является супрессором онкогенеза. Данная работа является аналогом нашего изобретения

Прототипом нашей работы является диссертация В.В. Козлова, в которой изучено несколько микро-РНК у пациенток с диагнозом: фиброаденома молочной железы. Изучались: Микро-РНК 21, 155, 221, 222, 205. Автором отмечено десятикратное увеличение микроРНК, индуцирующих апоптоз и клеточный рост. В отличии от данной работы, мы увеличили платформу исследуемых микро-РНК включив в нее микро РНК 108, -137, -199, роль которых отражается прежде всего в индикации противоопухолевых возможностей организма, что позволяет проводить более информативный анализ резистентности организма к опухолевой агрессии, что повышает диагностическую ценность скрининговых исследований по выявлению рака молочной железы.

Резидентом Сколково лабораторией Онкоюнайт - ген. Директор Чебанов Д.К. совместно с кафедрой превентологии Российской Академии Медико-Социальной Реабилитации к.м.н. Фишер Л.Н., и к.м.н. Фишер О.А разработана панель для определения микро-РНК для оценки риска развития рака молочной железы:

1 has-miR-199a-3p - ответственен за метастазирование. Стимуляция ангиогенеза через сверхэкспрессию АроЕ - повышение в опухоли

2. hsa-miR-222-3p - супрессор, усиление пролиферации, а так же дифференцировка и блокада апоптоза в клетках - повышение при риске

3. has-let-7a-5p - увеличение уровня интегрина В-3 - ассоциирован с ФНО - контроль пролиферации - снижен при риске заболевания

4. микро-РНК-196ф-2 - защитный фактор. Снижение роста и пролиферации, контроль миграции и инвазии - снижает риск опухоли

5. has-miR-106a-5p - индуцирует апоптоз, снижает пролиферацию - снижен при опухоли

6. hsa-miR-21-5p - активация PI-3K7 Akt пути - пролиферация и выживание клеток - повышается при риске

7. has-miR-21-137 - пролиферация, апоптоз - снижен при заболевании

8. has-miR-155 - снижение уровня таурина, повышение влияния оксидативного стресса - повышен при дефиците таурина.

9. miR-199а-5р - биомаркер, связанный с данной микро-РНК, подавлял подавляющую опухоль роль в раке молочной железе.

Таким образом, совместное использование радиотермометрии и панели вышеперечисленных микро-РНК позволяет выделить из массы дисгормональных заболеваний молочных желез группу тех патологий молочной железы, которая в обозримом будущем перейдет в рак. Это позволяет назначать разработанный на кафедре превентологии индивидуальный онкопрофилактический комплекс, добиваясь регресса предопухолевой патологии.

Описание методики:

В настоящее время при прохождении скрининга рака молочной железы пациентке в возрасте 39-65 лет проводится осмотр молочных желез и маммография. С целью уточнения диагноза проводится ультразвуковое исследование молочных желез. Если пациентка по шкале BI-RADS относится к группе 4, 5, 6, пациентка направляется на дообследование в онкологический диспансер. Если пациентка по данным обследования относится к 1 или 2 группе по данной шкале, то она наблюдается у гинеколога. Если пациентка относится к 3 группы шкалы BI-RADS, то так как данная группа относится к риску развития рака молочной железы с вероятностью менее 2%, требуются дополнительные диагностические мероприятия, так как нельзя исключить наличие агрессивной формы рака молочной железы, который за 6 месяцев будет бурно прогрессировать, а именно данная агрессивная форма рака молочной железы сопровождается повышенным метастазированием и смертностью. С целью решения данной проблемы нами предложена следующая методика:

1 этап: проведение радиотермометрического исследования. Проведение данного исследования у пациентки проводится по общепринятой методике С.Г Веснин (1998). Измеряется температура в блоке глубиной до 7 см и поверхностной температуры. Признаком риска развития рака молочной железы является очаговая термоасимметрия молочных желез. Расчет по алгоритму В.И Видюкова позволяет выделить группу пациенток, у которых высокий риск развития рака молочной железы. По алгоритму В.И Видюкова установлено наличие 3 групп пациенток: высчитывается 2 коэффициента. Если 1 коэффициент менее 2, а второй менее 2.5, то риск развития рака молочной железы составляет около 15%. Если один коэффициент более 2, а второй менее 2.5, или наоборот то риск развития рака молочной железы составляет 60%. Если 1 коэффициент составляет более 2, а второй более 2,5, то риск развития рака молочной железы более 85%.

2 этап: с целью уточнения диагноза у пациенток из группы риска берется на анализ выделения из соска молочной железы, пунктат кисты молочной железы или пунктат из очага молочной железы, слюна и проводится исследование панели микро-РНК: mir-199а, miR-222, miR-196a, mir-106a, miR-21, miR-137, miR-155. Данное дополнительное уточняющее обследование позволяет повысить эффективность скрининговых мероприятий по выявлению ранних форм рака молочной железы.

Пример №1 Пациентка П, 1957 года рождения обратилась с жалобами на скудные выделения из соска правой молочной железы в апреле 2018 года. При ММГ - картина выраженного аденоза, высокая рентгенологическая плотность breast density 5 При проведении УЗИ молочных желез без узловых образований, обнаружено множество микрокист диаметром 4-5 мм. Проведено радиотермометрическое обследование молочных желез. Установлено, что 1 коэффициент равнялся 1,7 (норма до 2), 2 коэффициент 1.9 (норма 2.5). С целью уточнение диагноза назначено определение микро-РНК. Приводим полученные результаты:

По шкале риска -0- популяционный риск, 0-3 - небольшое повышение; 4-7 - значительное повышение; 7-10 - существенный риск заболевания

Исходя из полученных данных шкалы риск развития рака молочной железы незначительно повышен - 3

Через 6 месяцев пациентка обратилась на контрольный осмотр с жалобами на появление узлового образования в правой молочной железе примерно 2 см, увеличение подмышечных л/узлов справа. ММГ - в правой молочной железе в в/нар квадранте определяется узловое полициклическое образование 2 см в диаметре, наличие сгруппированных микрокальцинатов. УЗИ молочных желез - в правой молочной железе в в/наружном квадранте гипоэхогенное образование неправильной формы 2 см, в правой подмышечной области увеличенные узлы до 2,5 см. проведение радиотермометрического исследования показало, что первый коэффициент составлял 2,45; второй коэффициент 3.2 (это соответствует вероятному развитию рака молочной железы более 85% контрольное измерение микро-РНК дало следующие результаты

В результате коэффициент по определению микро-РНК составлял 7, что характерно для высокого риска развития рака молочной железы. Проведенное гистологическое исследование подтвердило наличие инвазивной карциномы.

Список литературы

1. Degnim А.С., Dupont W.D., Radisky D.С. et al. Extent of atypical hyperplasia stratifies breast cancer risk in 2 independent cohorts of women. Cancer. 2016 Oct: 122 (19); 2971-8.

2. Мастопатии под ред. А.Д Каприна, Н.И. Рожковой, Москва изд. группа «Гэотар-Медиа» 2019.

3. К.А. Гришина, В.А. Хайленко. Роль микро-РНК в развитии рака молочной железы и их потециал в качестве биомаркеров этого заболевания, Опухоли женской репродуктивной системы, №3-2018, с. 40-45.

4. Д.К. Чебанов, И.Н. Михайлова, А.А. Абрамов, Н.С. Воробьева. Диагностика и прогноз течения рака молочной железы на основе профиля экспрессии микро-РНК опухолевых экзосом, Онкогинекология №2-2016, с. 4-12; - аналог.

5. Козлов В.В. Роль молекулярных маркеров в диагностике и лечении рака молочной железы, Автореферат дисс. на соискание ученой степени к.м.н., Новосибирск 2014 – прототип.

6. Рожкова Н.И., Каприн А.Д. Профилактика - приоритет клинической маммологии. М.: СИМК, 2015. 185 с.

7. Г.П. Корженкова. Опухоли женской репродуктивной системы 2016; том 2; с. 3-9.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для скрининга рака молочной железы и предрасположенности к нему. Проводят маммографию и УЗИ. Дополнительно проводят радиотермометрическое исследование молочных желез и выделяют панель микро-РНК из биологических жидкостей, включающую miR-199a, miR-222, let-7a, miR-196a, miR-106а, miR-21, miR-137, miR-155. Способ обеспечивает возможность выделить из массы дисгормональных заболеваний молочных желез группу патологий молочной железы, которая в обозримом будущем перейдет в рак, за счет совместного использования радиотермометрии и панели микро-РНК. 1 ил., 2 табл., 1 пр.

Способ скрининга рака молочной железы и предрасположенности к нему, включающий маммографию и УЗИ, отличающийся тем, что дополнительно проводят радиотермометрическое исследование молочных желез и выделяют панель микро-РНК из биологических жидкостей, включающую miR-199a, miR-222, let-7a, miR-196a, miR-106а, miR-21, miR-137, miR-155.