СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДНОГО РАСТВОРА АКРИЛАМИДА С НИЗКОЙ КОНЦЕНТРАЦИЕЙ АКРИЛОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2019 года по МПК C12P13/02 C08F20/52 C08L33/26 

Настоящее изобретение относится к способам получения водных растворов акриламида с низкой концентрацией акриловой кислоты, водным растворам акриламида, получаемым такими способами, и акриламидным гомополимерам или сополимерам, получаемыми полимеризацией такого акриламида. Кроме того, настоящее изобретение также относится к способам снижения концентрации акриловой кислоты в водных растворах акриламида.

Полиакриламид широко используется в качестве флокулянтов, в качестве загустителя в бумажной промышленности, в качестве добавки в третичном методе нефтедобычи и многих других областях. Сырьем для полиакриламида обычно является мономер акриламид. В принципе существуют два разных способа получения акриламида в промышленных масштабах: химический синтез и биологический синтез, причем методы биологического синтеза все более преобладают из-за более мягких условий реакции и присущей биологическим методам технологической безопасности. Из-за более мягких условий реакции, отсутствия медного катализатора и количественной конверсии нитрила в биологическом синтезе можно избежать дорогостоящих последующих стадий обработки, таких как дистилляция или ионный обмен, что приводит к более дешевым установкам с резко уменьшенным размером площади, занимаемой установкой.

Оба метода синтеза используют акрилонитрил в качестве исходного вещества. В то время как в способе химического синтеза используют медные катализаторы (например, US 4048226, US 3597481), в способе биологического синтеза (также известном как способ на основе биотехнологий) используют биокатализаторы для гидратирования (то есть превращения) акрилонитрила для получения акриламида.

Как правило, такие биокатализаторы представляют собой микроорганизмы, которые способны продуцировать (т.е. кодировать) фермент нитрилгидратазу (номенклатура IUBMB по состоянию на 30 сентября 2014 г.: ЕС 4.2.1.84. CAS-№2391-37-5. также называемый. например, NHase). Микроорганизмы, продуцирующие нитрилгидратазу. в основном распределены в окружающей среде и включают, среди прочего, представителей видов Rhodococcus rhodochrous. Rhodococcus pyridinovorans, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus equi, Rhodococcus ruber, Rhodococcus opacus, Aspergillus niger, Acidovorax avenae, Acidovorax facilis, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Bacillus subtilis, Bacillus pallidus, Bacillus smithii, Bacillus sp BR449, Bradyrhizobium oligotrophicum, Bradyrhizobium diazoefficiens, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cenocepacia, Burkholderia gladioli, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumonia, Klebsiella variicola, Mesorhizobium ciceri, Mesorhizobium opportunistum, Mesorhizobium sp F28, Moraxella, Pantoea endophytica, Pantoea agglomerans, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas putida, Rhizobium, Rhodopseudomonas palustris, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Amycolatopsis, Arthrobacter, Brevibacterium sp CH1, Brevibacterium sp CH2, Brevibacterium sp R312, Brevibacterium imperiale, Corynebacterium nitrilophilus, Corynebacterium pseudodiphteriticum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium hoffmanii, Microbacterium imperiale, Microbacterium smegmatis, Micrococcus luteus, Nocardia globerula, Nocardia rhodochrous, Pseudonocardia thermophila, Trichoderma, Myrothecium verrucaria, Aureobasidium pullulans, Candida famata, Candida guilliermondii, Candida tropicalis, Cryptococcus flavus, Cryptococcus sp UFMG- Y28, Debaryomyces hanseii, Geotrichum candidum, Geotrichum sp JR1, Hanseniaspora, Kluyveromyces thermotolerans, Pichia kluyveri, Rhodotorula glutinis, Comomonas testosteroni, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus furiosus, and Pyrococcus horikoshii. (см, например, Prasad, Biotechnology Advances (2010), 28(6): 725-741; FR2835531). Фермент нитрилгидратаза бывает либо железо-зависимой, либо от кобальт-зависимой (т.е. он включает либо железо, либо кобальт, координированный в его активном центре), который особенно характеризуется своей способностью катализировать превращение акрилонитрила в акриламид путем гидратации акрилонитрила (Kobayashi, Nature Biotechnology (1998), 16: 733-736).

Продукт биосинтетического способа превращения акрилонитрила в акриламид. представляет собой раствор акриламида в воде. Однако, как правило, полученный водный раствор акриламида дополнительно содержит акриловую кислоту, которая образуется в качестве побочного продукта в процессе биоконверсии.

Акриламид используется в качестве мономера для получения полимеров акриламида. Для реакций полимеризации могут быть использованы водные растворы акриламида, которые были получены методом биологического синтеза.

Однако было обнаружено, что акриловая кислота, присутствующая в водных растворах акриламида, используемых для реакций полимеризации, приводит к снижению эксплуатационных качеств полученных акриламидных полимеров. Более конкретно, присутствие акриловой кислоты может значительно ухудшать физические свойства акриламидного полимерного материала, что, например, приводит к уменьшению растворимости и снижению потребительских качеств в различных областях применения, таких как водоподготовка, производство бумаги, добыча нефти или добыча полезных ископаемых.

Таким образом, существует потребность в биокаталитических способах получения водных растворов акриламида с низкой концентрацией акриловой кислоты.

Эта объективная техническая проблема была преодолена настоящим изобретением, как определено в формуле изобретения и как описано и приведено в качестве примеров ниже.

Настоящее изобретение относится к способу получения водного раствора акриламида, в котором способ включает следующие стадии:

(а) добавления следующих компонентов (i)-(iii) в реактор для получения композиции для биоконверсии:

(i) биокатализатор, способный превращать акрилонитрил в акриламид;

(ii) акрилонитрил:

(iii) вода: и

(b) проведение биоконверсии композиции, полученной на стадии (а);

(c) дополнительного акрилонитрила и поддержание содержания акрилонитрила в ходе стадии (b) при 0,3 мас./мас. % или более в течение от 10 минут до 48 часов, предпочтительно от 15 минут до 24 часов, более предпочтительно от 30 минут до 18 часов и наиболее предпочтительно от 1 часа до 12 часов, причем указание мас./мас. %. относится к общей массе композиции в реакторе.

Кроме того, настоящее изобретение также относится к способу получения водного раствора акриламида, где способ включает следующие стадии:

(a) добавления следующих компонентов (i)-(iii) в реактор для получения композиции для биоконверсии:

(i) биокатализатор, способный превращать акрилонитрил в акриламид;

(ii) акрилонитрил;

(iii) вода; и

(b) проведение биоконверсии композиции, полученной на стадии (а);

(c) добавление дополнительного акрилонитрила и поддержание содержания акрилонитрила в ходе стадии (b) при 0,3 мас./мас. % или более до тех пор, пока содержание акриламида не достигнет, по меньшей мере, 20 мас./мас. %, предпочтительно не менее 25 мас./мас. %, более предпочтительно по меньшей мере 30 мас./мас. %, еще более предпочтительно по меньшей мере 35 мас./мас. %, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 мас./мас. %. еще более предпочтительно, по меньшей мере, 42,5 мас./мас. %, еще более предпочтительно от по меньшей мере 45 мас./мас. %. еще более предпочтительно по меньшей мере 47.5 мас./мас. % и наиболее предпочтительно по меньшей мере 50 мас./мас. %. причем данные мас./мас. % относятся к общей массе композиции в реакторе.

Кроме того, настоящее изобретение охватывает способ уменьшения концентрации акриловой кислоты в водном растворе акриламида, где водный раствор акриламида получают способом, в котором акрилонитрил превращают в акриламид с применением биокатализатора, и способ включает следующие стадии:

(a) добавления следующих компонентов (i)-(iii) в реактор для получения композиции для биоконверсии:

(i) биокатализатор, способный превращать акрилонитрил в акриламид;

(ii) акрилонитрил;

(iii) воды; а также

(b) проведение биоконверсии композиции, полученной на стадии (а);

(c) добавление дополнительного акрилонитрила и поддержание содержания акрилонитрила в ходе стадии (b) при 0,3 мас./мас. % или более, причем указание мас./мас. % относится к общей массе композиции в реакторе.

Принимая во внимание эти способы получения водного раствора акриламида, авторы настоящего изобретения обнаружили, что при поддержании содержания акрилонитрила в ходе биоконверсии на стадии (b) при 0,3 мас./мас. % или более в течение от 10 минут до 48 часов или при поддержании содержания акрилонитрила в ходе биоконверсии на стадии (b) при 0,3 мас./мас. % или более до достижения содержания акриламида по меньшей мере 20 мас./мас. %. концентрация акриловой кислоты в полученном водном растворе акриламида уменьшается. Кроме того, изобретатели нашли способ уменьшения концентрации акриловой кислоты в водном растворе акриламида. причем. при поддержании содержания акрилонитрила в ходе стадии (b) при 0,3 мас./мас. % или более, концентрация акриловой кислоты в водном растворе акриламида уменьшается. Что касается любого из способов, описанных в настоящем документе для получения водного раствора акриламида, или для уменьшения концентрации акриловой кислоты в водном растворе акриламида, такое уменьшение концентрации акриловой кислоты в водном растворе акриламида означает, что полученный водный раствор акриламида в соответствии с любым из способов по настоящему изобретению, где содержание акрилонитрила в ходе биоконверсии на стадии (b) поддерживается на уровне 0,3 мас./мас. % или более, имеет более низкую концентрацию акриловой кислоты по сравнению с водным раствором акриламида, который получают, используя способ, в котором содержание акрилонитрила в ходе биоконверсии не поддерживается на уровне 0,3 мас./мас. % или более.

Используемый в настоящем документе термин «биоконверсия» в контексте любого из способов настоящего изобретения в общем обозначает реакцию, в которой акрилонитрил превращается в акриламид в присутствии воды и биокатализатора. Акриламид растворяют в воде таким образом, что при любом из способов, описанных и представленных в настоящем документе, образуется водный раствор акриламида. Используемый в настоящем документе термин «композиция» включает все компоненты, присутствующие в реакторе, такие как, например, биокатализатор, акрилонитрил, акриламид и вода.

Используемый в отношении любого из способов, описанных в настоящем документе, термин «биокатализатор» включает, в частности, микроорганизмы (например, бактерии или протозойные эукариоты) и ферменты, которые способны превращать акрилонитрил в акриламид. Способы определения способности данного биокатализатора (например, микроорганизма или фермента) превращать акрилонитрил в акриламид хорошо известны в данной области техники. В качестве примера, в контексте любого из способов настоящего изобретения, активность данного биокатализатора, которая может быть способна превращать акрилонитрил в акриламид в смысле настоящего изобретения, может быть определена следующим образом: сначала реагирование 100 мкл клеточной суспензии, клеточного лизата. растворенного ферментного порошка или любого другого препарата, содержащего предполагаемый биокатализатор, с 875 мкл 50 мМ калий фосфатного буфера и 25 мкл акрилонитрила при 25°С на шейкере пробирок Эппендорфа при 1000 об/мин в течение 10 минут. Через 10 минут времени реакции образцы могут быть удалены и сразу же реакция останавливается посредством добавления равного объема 1,4%-ной соляной кислоты. После смешивания образца клетки могут быть удалены посредством центрифугирования в течение 1 минуты при 10000 об/мин, и количество образованного акриламида определяли посредством анализа прозрачного супернатанта с помощью ВЭЖХ. Для подтверждения того, что биокатализатор способен превращать акрилонитрил в акриламид в контексте настоящего изобретения, концентрация акриламида должна составлять от 0,25 до 1,25 ммоль/л - если необходимо, образец должен быть разбавлен соответствующим образом, и превращение должно быть повторено. Затем активность может быть вычислена из концентрации акриламида посредством деления концентрации акриламида, полученной при анализе ВЭЖХ, на время реакции, которое составляет 10 минут, и путем умножения этого значения на коэффициент разбавления между образцом ВЭЖХ и исходным образцом. Активности > 5 Ед/мг массы сухих клеток, предпочтительно > 25 Ед/мг массы сухих клеток, более предпочтительно > 50 Ед/мг массы сухих клеток, наиболее предпочтительно > 100 Ед/мг массы сухих клеток, указывают на присутствие функционального биокатализатора и рассматривается как биокатализатор, способный превращать акрилонитрил в акриламид в контексте настоящего изобретения.

Более конкретно, при использовании любого из способов по настоящему изобретению концентрация акриловой кислоты в композиции в конце биоконверсии может составлять 1500 частей на миллион или менее, предпочтительно 1200 частей на миллион или менее, более предпочтительно 1000 частей на миллион или менее, более предпочтительно 750 частей на миллион или менее, еще более предпочтительно 500 частей на миллион или менее, еще более предпочтительно 300 частей на миллион или менее, еще более предпочтительно 200 частей на миллион или менее и наиболее предпочтительно 100 частей на миллион или менее, причем каждое указание частей на миллион относится к массовым частям и относится к общей массе композиции в конце биоконверсии. В этом отношении термин «конец биоконверсии» означает в любом из способов, описанных в настоящем документе, что достигается практически полная конверсия акрилонитрила в акриламид. «По существу полная конверсия акрилонитрила в акриламид» означает, в частности, что содержание акрилонитрила в композиции составляет 1000 частей на миллион или менее, предпочтительно 500 частей на миллион или менее, более предпочтительно 200 частей на миллион или менее и наиболее предпочтительно 100 частей на миллион или менее, при этом каждое указание частей на миллион относятся к массовым частям и относятся к общей массе композиции. Концентрацию акриловой кислоты в композиции в конце биоконверсии и/или содержание акрилонитрила можно определить с помощью ВЭЖХ. Предпочтительно используют метод ВЭЖХ, как изложено ниже в примерах.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к способу получения водного раствора акриламида, в котором способ включает следующие стадии:

(a) добавления следующих компонентов (i)-(iii) в реактор для получения композиции для биоконверсии:

(i) биокатализатор, способный превращать акрилонитрил в акриламид;

(ii) акрилонитрил;

(iii) вода; и

(b) проведение биоконверсии композиции, полученной на стадии (а);

(c) добавление дополнительного акрилонитрила и поддержание содержания акрилонитрила в ходе стадии (b) при 0,3 мас./мас. % или более, где указание мас./мас. % относится к общей массе композиции в реакторе: и

(d) получение композиции, в которой концентрация акриловой кислоты в композиции в конце биоконверсии составляет 1500 частей на миллион или менее, предпочтительно 1200 частей на миллион или менее, более предпочтительно 1000 частей на миллион или менее, более предпочтительно 750 частей на миллион или менее, еще более предпочтительно 500 частей на миллион или менее, еще более предпочтительно 300 частей на миллион или менее, еще более предпочтительно 200 частей на миллион или менее и наиболее предпочтительно 100 частей на миллион или менее, причем каждое указание частей на миллион относятся к массовым частям и относятся к общей массе композиции в конце биоконверсии.

В частности, авторы изобретения обнаружили, что при осуществлении любого из способов настоящего изобретения, как описано в настоящем документе, концентрация акриловой кислоты может быть уменьшена по меньшей мере на 10%, предпочтительно, по меньшей мере на 15%, более предпочтительно, по меньшей мере на 20%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 25% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 35% по сравнению с контрольным способом. В этом контексте уменьшение концентрации акриловой кислоты, как определено в способах по настоящему изобретению, связано с конечной концентрацией акриловой кислоты, содержащейся в водном растворе акриламида, полученного способом по настоящему изобретению (т.е. с поддержанием содержания акрилонитрил в ходе стадии (b) при 0,3 мас./мас. % или более) по сравнению с конечной концентрацией акриловой кислоты, содержащейся в водном растворе акриламида, полученного способами отличными от способов настоящего изобретения (т.е. без поддержания содержания акрилонитрила в ходе стадии (b) при 0,3 мас./мас. % или более, как описано в настоящем документе).

В любом из способов, описанных и представленных в настоящем документе, акрилонитрил (компонент (ii)) добавляют в реактор на стадии (а). В контексте любого из способов настоящего изобретения акрилонитрил можно добавлять в реактор до добавления воды, после добавления воды или вместе с водой.

В соответствии с любым из способов, описанных в настоящем документе, на стадии (с) добавляют еще акрилонитрил. В этом отношении акрилонитрил может добавляться непрерывно или периодически. Добавление акрилонитрила может быть при постоянной или переменной подаче или в периодическом режиме. Акрилонитрил можно добавлять в чистом виде или в растворе. Например, может быть использован водный раствор акрилонитрила.

Кроме того, в любом из способов, описанных и представленных в настоящем документе, воду (компонент (iii) добавляют в реактор на стадии (а)). Вода может быть добавлена как таковая, быть частью биокатализатора, как описано в настоящем документе, быть частью раствора акрилонитрила, как описано в настоящем документе, или добавляться иначе. В случае, когда воду добавляют как таковую, обычно можно использовать водопроводную воду или деионизированную воду. Вода также может быть частью водной композиции, такой как водный раствор соли. В частности, может использоваться буфер.

Для стадии (а) любого из способов, описанных и представленных в настоящем документе, не имеет значения, в какие компоненты (i)-(iii) в каком порядке добавляют в реактор.

Что касается количеств добавляемых компонентов, биокатализатор, акрилонитрил и вода могут быть добавлены на стадиях (а)-(с) любого из способов, описанных в настоящем документе, в массовом отношении от 0,001 до 0,5 мас./мас. % биокатализатора, от 22 до 45 мас./мас. % акрилонитрила, и остальную часть до 100 мас./мас. % составляет вода; предпочтительно от 0,005 до 0,2 мас./мас. % биокатализатора, от 26 до 42 мас./мас. % акрилонитрила, и остальную часть до 100 мас./мас. % составляет вода; более предпочтительно от 0,01 до 0,1 мас./мас. % био катализатора, от 30 до 40 мас./мас. % акрилонитрила остальное вода до 100 мас./мас. %; наиболее предпочтительно от 0,015 до 0,065 мас./мас. % био катализатора, от 35 до 39 мас./мас. % акрилонитрила, и остальную часть до 100 мас./мас. % составляет вода, причем в каждом случае указание мас./мас. % относится к общей массе (100 мас./мас. %) объединенных масс биокатализатора, акрилонитрила и воды, добавляемых в ходе стадий (а)-(с). Например, в случае акрилонитрила. который добавляется на стадии (а) и стадии (с), это означает, что для расчета отношения используют комбинированные количества акрилонитрила. добавленного на стадиях (а) и (с). Значения мас./мас. % соотношения биокатализатора могут в каждом случае обозначать отношение биокатализатора к сухой массе биокатализатора, в частности, в пересчете на массу сухих клеток биокатализатора. Вода, которая дает баланс до 100 мас./мас. %, специально не специфицируется. Например, вода может быть водной композицией, такой как водный раствор соли. В частности, может использоваться буфер. Однако предпочтительно, чтобы вода была водопроводной или деионизированной.

Стадия (b) любого из описанных и представленных в настоящем документе способов представляет собой стадию биоконверсии, в ходе которой акрилонитрил превращается в акриламид с помощью биокатализатора, как описано и приведено в качестве примеров в настоящем описании. Более конкретно, в любом из способов, описанных в настоящем документе, биоконверсию на стадии (b) можно проводить при температуре от 5 до 40°С в течение от 10 минут до 48 часов, предпочтительно при температуре от 5 до 35°С в течение 10 минут до 48 часов, более предпочтительно при от 15 до 30°С в течение от 10 минут до 48 часов и наиболее предпочтительно при температуре от 20 до 28°С в течение от 10 минут до 48 часов. В частности, такие температуры реакции являются предпочтительными с точки зрения высокой активности биокатализатора и разумного времени реакции. Фактический период времени, применяемый для стадии (b), также зависит от желаемого содержания акриламида в водном растворе акриламида, который должен быть получен.

В дополнение или независимо от этих температурных и временных условий в любом из способов по настоящему изобретению содержание акрилонитрила на стадии (b) может поддерживаться на уровне 0,3 мас./мас. % или более в течение от 10 минут до 48 часов, предпочтительно в течение от 15 минут до 24 часов, более предпочтительно в течение от 30 минут до 18 часов и наиболее предпочтительно в течение от 1 часа до 12 часов. В частности, содержание акрилонитрила может поддерживаться на уровне 0,3 мас./мас. % или более в течение от 2 часов до 12 часов, в течение от 4 часов до 12 часов, в течение от 6 часов до 12 часов, в течение от 8 часов до 12 часов или в течение от 10 часов до 12 часов в ходе стадии (b).

В соответствии с любым из способов, описанных в настоящем документе, содержание акрилонитрила может поддерживаться в ходе стадии (b) при 0,3 мас./мас. % или более до тех пор, пока содержание акриламида не составит по меньшей мере 20 мас./мас. %, предпочтительно не менее 25 мас./мас. %, более предпочтительно по меньшей мере 30 мас./мас. %, еще более предпочтительно по меньшей мере 35 мас./мас. %, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 мас./мас. %, еще более предпочтительно по меньшей мере 42,5 мас./мас. %, еще более предпочтительно по меньшей мере 45 мас./мас. %, еще более предпочтительно по меньшей мере 47,5 мас./мас. % и наиболее предпочтительно по меньшей мере 50 мас./мас. %, причем все указания мас./мас. % относятся к общей массе композиции в реакторе. После достижения такого содержания акриламида добавление акрилонитрила может быть прекращено. В любом из описанных в настоящем документе способов содержание акриламида в композиции в реакторе может быть измерено с помощью инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR).

Как указано выше, в любом из способов по настоящему изобретению содержание акрилонитрила в ходе биоконверсии на стадии (b) поддерживается на уровне 0,3 мас./мас. % или более. Предпочтительно содержание акрилонитрила в ходе стадии (b) поддерживают на уровне 0,4 мас./мас. % или более, более предпочтительно 0,5 мас./мас. % или более, еще более предпочтительно 0,6 мас./мас. % или более, еще более предпочтительно 0,8 мас./мас. % или более мас./мас. % или более и наиболее предпочтительно 1,0 мас./мас. % или более, где все указания мас./мас. % относятся к общей массе композиции в реакторе. В этом отношении авторы изобретения обнаружили, что путем увеличения содержания акрилонитрила в ходе стадии (b) концентрацию акриловой кислоты можно дополнительно снизить.

В дополнение к поддержанию минимального значения содержания акрилонитрила в любом из способов, описанных в настоящем описании, содержание акрилонитрила предпочтительно поддерживают в течение стадии (b) при 6 мас./мас. % или менее, предпочтительно при 5 мас./мас. % или менее, более предпочтительно при 4 мас./мас. % или менее, наиболее предпочтительно при 3 мас./мас. % или менее, в котором каждое указание мас./мас. %, относится в расчете на общую массу композиции в реакторе. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что поддержание содержания акрилонитрила ниже такого верхнего предела способствует превосходной активности биокатализатора и эффективному уменьшению концентрации акриловой кислоты в полученном водном растворе акриламида. Более того, потеря активности биокатализатора может происходить в том случае, если содержание акрилонитрила превышает 6 мас./мас. %. В частности, содержание акрилонитрила можно поддерживать в ходе стадии (b) в диапазоне от 0,3 мас./мас. % до 6 мас./мас. %, предпочтительно от 0,4 мас./мас. % до 5 мас./мас. %, более предпочтительно от 0,5 мас./мас. % до 4 мас./мас. %, еще более предпочтительно от 0,6 мас./мас. % до 3 мас./мас. %, еще более предпочтительно от 0,8 мас./мас. % до 3 мас./мас. % наиболее предпочтительно от 1,0 до мас./мас. % до 3 мас./мас. %, где каждое указание мас./мас. % относится к общей массе композиции в реакторе.

В соответствии с вариантом выполнения любого из способов настоящего изобретения, в частности любого из способов получения водного раствора акриламида, содержание акрилонитрила составляет не 2 мас./мас. % в ходе добавления акрилонитрила, где указание мас./мас. % относится к общей массе композиции в реакторе. Это, в частности, справедливо для добавления акрилонитрила в соответствии со стадией (с).

Как указано выше, активность биокатализатора может уменьшаться в случае сохранения высокого содержания акрилонитрила в ходе биоконверсии на стадии (b). С этой точки зрения изобретателями было обнаружено, что потеря активности биокатализатора в ходе биоконверсии уменьшается, если после поддержания содержания акрилонитрила в первом диапазоне в ходе первого периода времени содержание акрилонитрила уменьшается до второго диапазона и сохраняется во втором диапазоне в ходе второго периода времени. Соответственно, чтобы достичь высокой активности биокатализатора и, следовательно, разумного времени реакции, в любом из способов, описанных в настоящем документе, поддержание акрилонитрила при 0,3 мас./мас. % или более в ходе стадии (b) может включать:

(i) поддержание содержания акрилонитрила в первом диапазоне в ходе первого периода времени;

(ii) уменьшение содержания акрилонитрила до второго диапазона; и

(iii) поддержание содержания акрилонитрила во втором диапазоне в ходе второго периода времени.

В частности, при использовании такого протокола, который включает уменьшение содержания акрилонитрила в ходе биоконверсии, может быть достигнута практически полная конверсия акрилонитрила в акриламид в описанных в настоящем документе способах.

Предпочтительно, стадия (b) любого из способов по настоящему изобретению, в которой содержание акрилонитрила поддерживается в первом диапазоне в ходе первого периода времени, содержание акрилонитрила уменьшается до второго диапазона и содержание акрилонитрила сохраняется во втором диапазоне в ходе второго периода времени, включает:

(i) поддержание содержания акрилонитрила в первом диапазоне от 1,2 мас./мас. % до 6 мас./мас. % в ходе первого периода времени от 30 минут до 4 часов;

(ii) уменьшение содержания акрилонитрила до второго диапазона; и

(iii) поддержание содержания акрилонитрила во втором диапазоне от 0,3 мас./мас. % до 1,2 мас./мас. % в ходе второго периода времени от 30 минут до 24 часов,

где указание мас./мас. % относится к общей массе композиции в реакторе.

Более предпочтительно, стадия (b) любого из описанных в настоящем документе способов включает:

(i) поддержание содержания акрилонитрила в первом диапазоне от 1,2 мас./мас. % до 4 мас./мас. % в ходе первого периода времени от 30 минут до 3 часов;

(ii) уменьшение содержания акрилонитрила до второго диапазона; и

(iii) поддержание содержания акрилонитрила во втором диапазоне от 0,5 мас./мас. % до 1,1 мас./мас. % в ходе второго периода времени от 30 минут до 12 часов,

где указания мас./мас. % в каждом случае относятся к общей массе композиции в реакторе.

Наиболее предпочтительно, стадия (b) любого из способов настоящего изобретения включает:

(i) поддержание содержания акрилонитрила в первом диапазоне от 1,3 мас./мас. % до 3 мас./мас. % в ходе первого периода времени от 30 минут до 2 часов;

(ii) уменьшение содержания акрилонитрила до второго диапазона; и

(iii) поддержание содержания акрилонитрила во втором интервале от 0,6 мас./мас. % до 1,0 мас./мас. % в ходе второго периода времени от 1 до 8 ч, предпочтительно от 1 до 5 ч.

где указания мас./мас. % в каждом случае относятся к общей массе композиции в реакторе.

Любой из описанных в настоящем документе способов может быть выполнен с применением непрерывного процесса. В частности, используемый в настоящем документе термин «непрерывный процесс» относится к способу, в котором водный раствор акриламида получают непрерывным способом без сбора всей реакционной смеси в реакторе. Это означает, что исходные материалы для реакции, которые могут содержать биокатализатор, воду и акрилонитрил, подают в реактор непрерывно или периодически и что полученный продукт извлекают из реактора непрерывно или периодически.

В качестве альтернативы, любой из способов настоящего изобретения может быть выполнен с применением полупериодического процесса. В частности, используемый в настоящем документе термин «полупериодический процесс» может включать в себя то, что водный раствор акриламида получается прерывистым образом. В соответствии с неограничивающим примером выполнения такой полупериодического процесса воду, определенное количество акрилонитрила и биокатализатора помещают в реактор. Затем в ходе биоконверсии добавляют акрилонитрил до тех пор, пока не будет достигнуто требуемое содержание акриламида в композиции. После достижения такого желаемого содержания акриламида полученную композицию полностью извлекают из реактора до того, как в него вводят новые реагенты.

Что касается подачи акрилонитрила в ходе стадии биоконверсии (b), в соответствии с неограничивающим вариантом выполнения любого из способов настоящего изобретения, акрилонитрил можно подавать таким образом, чтобы содержание акрилонитрила в ходе стадии (b) поддерживалось в пределах диапазона ± 10 мас./мас. %, предпочтительно ± 5 мас./мас. %, более предпочтительно ± 2 мас./мас. %, наиболее предпочтительно ± 1 мас./мас. % предварительно определенного значения содержания акрилонитрила, мас./мас. % относится к общей массе акрилонитрила в реакторе. В частности, в любом из способов по настоящему изобретению акрилонитрил можно подавать таким образом, чтобы содержание акрилонитрила в ходе стадии (b) поддерживалось по существу постоянным при заданном значении.

В общем, в любом из способов настоящего изобретения содержание акрилонитрила и/или содержание акриламида в ходе стадии (b) можно измерить с помощью инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR). В частности, содержание акрилонитрила и/или содержание акриламида могут быть измерены в режиме онлайн с применением FTIR.

В соответствии с любым из способов настоящего изобретения биокатализатор, способный превращать акрилонитрил в акриламид, может представлять собой микроорганизм, который кодирует фермент нитрилгидратазу. В этом отношении для настоящего изобретения не имеет значения, является ли этот микроорганизм кодирующим нитрилгидратазу естественным образом или он генетически модифицирован для кодирования указанного фермента или микроорганизм, кодирующий нитрилгидратазу естественным образом, модифицирован например, чтобы он был способен производить больше нитрилгидратазы и/или более активную нитрилгидратазу. Как используется в настоящем документе, выражение «биокатализатор (например, микроорганизм), кодирующий (фермент) нитрилгидратаза», или тому подобное обычно означает, что такой микроорганизм обычно также способен продуцировать и стабильно поддерживать нитрилгидратазу. То есть, как используется в данном описании и как легко понятно специалисту в данной области техники, биокатализатор (например, микроорганизм), который должен использоваться в соответствии с настоящим изобретением, который (естественно или неестественно) кодирует нитрилгидратазу, как правило, также способен продуцировать и стабильно поддерживать нитрилгидратазу. Однако в соответствии с настоящим изобретением также возможно, что такие микроорганизмы производят только нитрилгидратазу в ходе культивирования (или ферментации) микроорганизма -таким образом, содержащего нитрилгидратазу - перед добавлением в реактор в соответствии со стадией (а) любого из способов, описанных и представленных в настоящем документе. В таком случае, возможно, что микроорганизмы не продуцируют нитрилгидратазу в описанных и обеспечиваемых в настоящем документе способах, но они действуют только через молекулы нитрилгидратазы, которые они продуцировали ранее и которые они все еще содержат. Как легко понятно специалисту в данной области техники, также возможно, что некоторые молекулы нитрилгидратазы могут покидать микроорганизм (например, вследствие лизиса микроорганизма) и свободно действовать в растворе в качестве биокатализатора. По существу, также возможно, что используемый в настоящем документе термин «биокатализатор» охватывает собственно фермент нитрилгидратазу, если только он способен превращать акрилонитрил в акриламид, как описано и приведено в качестве примеров в настоящем документе. В контексте настоящего изобретения также возможно непосредственно использовать нитрилгидратазу в качестве биокатализатора.

В контексте настоящего изобретения микроорганизмы, кодирующие естественным образом нитрилгидратазу, которые могут быть использованы в качестве биокатализатора в любом из описанных в настоящем документе способов, содержат виды, принадлежащие к роду, выбранному из группы, состоящей из Rhodococcus, Aspergillus, Acidovorax, Agrobacterium, Bacillus, Bradyrhizobium, Burkholderia, Escherichia, Geobacillus, Klebsiella, Mesorhizobium, Moraxella, Pantoea, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Serratia, Amycolatopsis, Arthrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Micrococcus, Nocardia, Pseudonocardia, Trichoderma, Myrothecium, Aureobasidium, Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Geotrichum, Hanseniaspora, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Comomonas и Pyrococcus. В предпочтительных вариантах выполнения изобретения биокатализатор выбирают из бактерий рода Rhodococcus, Pseudomonas, Escherichia и Geobacillus.

Предпочтительные биокатализаторы, используемые в контексте с любым из способов по настоящему изобретению, включают представителей рода Rhodococcus. Виды, подходящие в качестве биокатализатора для использования в контексте любого из способов по настоящему изобретению, могут содержать, например, Rhodococcus rhodochrous (например, NCIMB 41164, Jl/FERM-BP 1478, М33 или М8), Rhodococcus pyridinovorans, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus equi, Rhodococcus ruber, Rhodococcus opacus, Aspergillus niger, Acidovorax avenae, Acidovorax facilis. Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Bacillus subtilis, Bacillus pallidus, Bacillus smithii, Bacillus sp BR449, Bradyrhizobium oligotrophicum, Bradyrhizobium diazoefficiens, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cenocepacia, Burkholderia gladioli. Escherichia coli, Geobacillus sp. RAPc8, Klebsiella oxytoca. Klebsiella pneumonia. Klebsiella variicola. Mesorhizobium ciceri. Mesorhizobium opportunistum, Mesorhizobium sp F28. Moraxella, Pantoea endophytica, Pantoea agglomerans, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas putida, Rhizobium, Rhodopseudomonas palustris, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Amycolatopsis, Arthrobacter, Brevibacterium sp CH1, Brevibacterium sp CH2, Brevibacterium sp R312, Brevibacterium imperiale, Brevibacterium casei, Corynebacterium nitrilophilus, Corynebacterium pseudodiphteriticum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium hoffmanii, Microbacterium imperiale, Microbacterium smegmatis, Micrococcus luteus, Nocardia globerula, Nocardia rhodochrous, Nocardia sp 163, Pseudonocardia thermophila, Trichoderma, Myrothecium verrucaria, Aureobasidium pullulans, Candida famata, Candida guilliermondii, Candida tropicalis, Cryptococcus flavus, Cryptococcus sp UFMG- Y28, Debaryomyces hanseii, Geotrichum candidum, Geotrichum sp JR1, Hanseniaspora, Kluyveromyces thermotolerans, Pichia kluyveri, Rhodotorula glutinis, Comomonas testosteroni, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus furiosus или Pyrococcus horikoshii.

Согласно одному варианту выполнения любого из способов настоящего изобретения используемый биокатализатор относится к виду Rhodococcus rhodochrous. Конкретные примеры для штаммов, принадлежащих Rhodococcus rhodochrous, которые могут быть использованы в контексте любого из описанных в настоящем документе способов, включают NCIMB 41164, J1 (FERM-BP 1478), М33 и М8.

Альтернативно или в дополнение к Rhodococcus rhodochrous, биокатализатор, используемый в любом из описанных в настоящем документе способов, может быть Rhodococcus pyridinovorans.

В контексте настоящего изобретения, кодирующие нитрилгидратазу микроорганизмы, которые не кодируют естественным образом нитрилгидратазу, могут быть генетически сконструированными микроорганизмами, которые, естественно, не содержат ген, кодирующий нитрилгидратазу, но которые были обработаны таким образом, чтобы содержать полинуклеотид. кодирующий нитрилгидратазу (например. посредством трансформации. трансдукции. трансфекции. конъюгации или других способов, подходящих для переноса или вставки полинуклеотида в клетку, как известно в данной области техники; см. Sambrook and Russell 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA), что позволяет микроорганизмам вырабатывать и стабильно поддерживать фермент нитрилгидратазу. Для этой цели может также потребоваться введение дополнительных полинуклеотидов, которые могут быть необходимы для обеспечения транскрипции и трансляции гена нитрилгидратазы или мРНК, соответственно. Такие дополнительные полинуклеотиды могут включать, среди прочего, промоторные последовательности, polyT- или polyU-хвосты или точку начала репликации или другие последовательности, контролирующие плазмиды. В этом контексте такие генетически модифицированные микроорганизмы, которые, в природе, не содержат ген, кодирующий нитрилгидратазу, но которые были обработаны таким образом, чтобы содержать полинуклеотиды, кодирующие нитрилгидратазу, могут быть прокариотическими или эукариотическими микроорганизмами. Примерами таких прокариотических микроорганизмов являются, например, представители вида Escherichia coli. Примеры таких эукариотических микроорганизмов включают, например, дрожжи (например, Saccharomyces cerevisiae).

В контексте настоящего изобретения термин «нитрилгидратаза» (также обозначаемый в настоящем документе, как NHase) обычно означает фермент, который способен катализировать превращение (то есть гидратацию) акрилонитрила в акриламид. Такими ферментами могут быть, например, фермент, зарегистрированный в номенклатуре IUBMB по состоянию на 30 сентября 2014 г.: ЕС 4.2.1.84; CAS-№. 2391-37-5. Однако используемый в настоящем документе термин «нитрилгидратаза» также включает модифицированные или более активные ферменты, которые, например, способны быстрее превращать акрилонитрил в акриламид или могут быть получены с более высоким соотношением выход/время или которые являются более стабильными, до тех пор, пока они способны катализировать превращение (т.е. гидратацию) акрилонитрила в акриламид. Способы определения способности данного биокатализатора (например, микроорганизма или фермента) для каталитического превращения акрилонитрила в акриламид, известны в данной области техники. В качестве примера, в контексте настоящего изобретения активность данного биокатализатора действовать в качестве нитрилгидратазы в смысле настоящего изобретения может быть определена следующим образом: Сначала проводят реакцию 100 мкл клеточной суспензии, клеточного лизата, растворенного ферментного порошка или любого другого препарата, содержащего предполагаемую нитрилгидратазу, с 875 мкл 50 мМ калий-фосфатного буфера и 25 мкл акрилонитрила при 25°С на шейкере Эппендорфа при 1000 об/мин в течение 10 минут. Через 10 минут времени проведения реакции могут быть отобраны образцы, и реакцию в них немедленно останавливают посредством добавления равного объема 1,4%-ной соляной кислоты. После перемешивания образца, клетки могут быть удалены с помощью центрифугирования в течение 1 минуты при 10000 об/мин, и количество образованного акриламида определяют посредством анализа прозрачного супернатанта с помощью ВЭЖХ. Для подтверждения того, что фермент является нитрилгидратазой в контексте настоящего изобретения, концентрация акриламида должна быть в пределах от 0,25 до 1,25 ммоль/л - если необходимо, образец должен быть разбавлен соответствующим образом, и превращение должно быть повторено. Активность фермента затем может быть вычислена из концентрации акриламида путем деления концентрации акриламида, полученной при анализе ВЭЖХ, на время реакции, которое составляет 10 минут, и посредством умножения этого значения на коэффициент разбавления между образцом ВЭЖХ и исходным образцом. Активности > 5 Ед/мг массы сухих клеток, предпочтительно > 25 Ед/мг массы сухих клеток, более предпочтительно > 50 Ед/мг массы сухих клеток, наиболее предпочтительно > 100 Ед/мг массы сухих клеток, указывает на присутствие функционально экспрессированной нитрилгидратазы и рассматриваются в качестве нитрилгидратазы в контексте настоящего изобретения.

В контексте настоящего изобретения нитрилгидратаза может быть полипептидом, кодируемым полинуклеотидом, который содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая составляет по меньшей мере 70%. предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%. более предпочтительно по меньшей мере 97%. более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, более предпочтительно по меньшей мере 99,5% и наиболее предпочтительно 100% идентичной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 (альфа-субъединица нитрилгидратазы R. rhodochrous: и/или нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3 (бета-субъединица нитрилгидратазы R. rhodochrous): при условии, что полипептид, кодируемый указанным полинуклеотидом. способен катализировать гидратацию акрилонитрила в акриламид (то есть имеет нитрилгидратазную активность), как описано и приведено в качестве примеров в данном описании. Также в контексте настоящего изобретения нитрилгидратаза может быть полипептидом, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая составляет по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, более предпочтительно по меньшей мере 99,5%, и наиболее предпочтительно на 100% идентичности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 (альфа-субъединицей нитрилгидратазы P. rhodochrous: и/или к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 (бета-субъединица нитрилгидратазы R. rhodochrous: , при условии, что указанный полипептид способен катализировать гидратацию акрилонитрила в акриламид, как описано и подтверждено примерами в данном описании.

Степень идентичности между двумя или более последовательностями (например, последовательностями нуклеиновой кислоты или аминокислотными последовательностями) может быть легко определена с помощью методов, известных в данной области техники, например, с помощью анализа BLAST. В общем случае в контексте настоящего изобретения, если две последовательности (например, полинуклеотидные последовательности или аминокислотные последовательности), которые должны сравниваться, например, при сравнении последовательностей, отличаются по идентичности, тогда термин «идентичность» может относиться к более короткой последовательности, а та часть более длинной последовательности, соответствует указанной более короткой последовательности. Поэтому, когда сравниваемые последовательности различаются по длине, степень идентичности может предпочтительно либо относиться к проценту нуклеотидных остатков в более короткой последовательности, которая идентична остаткам нуклеотидов в более длинной последовательности, либо к процентному содержанию нуклеотидов в более длинной последовательности, которая идентична нуклеотидной последовательности в более короткой последовательности. В этом контексте специалист в данной области техники легко может определить ту часть более длинной последовательности, которая соответствует более короткой последовательности. Кроме того, как используется в настоящем документе, уровни идентичности последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей могут относиться ко всей длине соответствующей последовательности и, предпочтительно, оцениваться в паре, при этом каждый гэп должен учитываться как одно несоответствие. Эти определения для сравнений последовательностей (например, установления значений «идентичности») должны применяться для всех описанных и раскрытых в настоящем документе последовательностей.

Кроме того, используемый в настоящем документе термин «идентичность» означает, что существует функциональная и/или структурная эквивалентность между соответствующими последовательностями. Последовательности нуклеиновой кислоты/ аминокислотные последовательности, имеющие заданные уровни идентичности с описанными в настоящем документе конкретными последовательностями нуклеиновой кислоты/аминокислотными

последовательностями, могут представлять производные/варианты этих последовательностей, которые, предпочтительно имеют одну и ту же биологическую функцию. Они могут быть либо природными вариациями, например, последовательностями из других вариететов, видов и т.д., либо мутациями, и указанные мутации могут образоваться естественным путем или могут быть продуцированы преднамеренным мутагенезом. Кроме того, вариации могут быть синтетически полученными последовательностями. Варианты могут быть встречающимися в природе вариантами или синтетически полученными вариантами или вариантами, полученными методами рекомбинантной ДНК. Отклонения от вышеописанных последовательностей нуклеиновой кислоты могут быть получены, например, путем делеции, замены, присоединения, инсерции и/или рекомбинации. Термин «присоединение» относится к присоединению по меньшей мере одного остатка нуклеиновой кислоты/аминокислоты к концу данной последовательности, тогда как «инсерция» относится к вставке по меньшей мере одного остатка нуклеиновой кислоты/аминокислоты в пределах данной последовательности. Термин «делеция» относится к делетированию или удалению по меньшей мере, одного остатка нуклеиновой кислоты или аминокислотного остатка в данной последовательности. Термин «замена» относится к замене, по меньшей мере, одного остатка нуклеиновой кислоты/аминокислотного остатка в данной последовательности. Опять-таки, эти определения, используемые в настоящем документе, применяются, с необходимыми изменениями, для всех последовательностей, предусмотренных и описанных в настоящем документе.

Как правило, в контексте настоящего описания термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота» или «молекула нуклеиновой кислоты» должны толковаться как синонимы. Как правило, молекулы нуклеиновых кислот могут содержать, среди прочего, молекулы ДНК, молекулы РНК, олигонуклеотидные тиофосфаты, замещенные рибо-олигонуклеотиды или молекулы ПНК. Кроме того, термин «молекула нуклеиновой кислоты» может относиться к ДНК или РНК или их гибридам или любой их модификации, которая известна в данной области техники (см., например, US 5525711, US 4711955, US 5792608 или ЕР 302175 в качестве примеров модификаций). Эта полинуклеотидная последовательность может быть одно- или двухцепочечной, линейной или кольцевой, природной или синтетической и без каких-либо ограничений по размеру. Например, полинуклеотидная последовательность может представлять собой геномную ДНК, кДНК, митохондриальную ДНК. мРНК, антисмысловую РНК. рибозимную РНК или ДНК. кодирующую такие РНК или химеропласты (Gamper. Nucleic Acids Research, 2000, 28, 4332-4339). Указанная полинуклеотидная последовательность может быть в форме вектора, плазмиды или вирусной ДНК или РНК. Также в настоящем документе описаны молекулы нуклеиновых кислот, которые являются комплементарными молекулам нуклеиновых кислот, описанных выше, и молекулам нуклеиновых кислот, которые способны гибридизоваться с молекулами нуклеиновых кислот, описанными в настоящем документе. Молекула нуклеиновой кислоты, описанная в настоящем документе, также может быть фрагментом молекул нуклеиновой кислоты в контексте настоящего изобретения. В частности, такой фрагмент является функциональным фрагментом. Примерами таких функциональных фрагментов являются молекулы нуклеиновых кислот, которые могут служить в качестве праймеров.

При добавлении биокатализатора в реактор в любом из способов по настоящему изобретению биокатализатор может быть взят непосредственно из ферментационного бульона. Кроме того, предусматривается, что биокатализатор может быть использован в форме ферментационного бульона в способах, раскрытых в настоящем документе. Таким образом, биокатализатор не нужно выделять из ферментационного бульона, и ферментационный бульон, содержащий биокатализатор, может быть использован для биоконверсии. Например, ферментационный бульон, содержащий биокатализатор, может быть добавлен в реактор на стадии (а) способов по настоящему изобретению. Альтернативно, в соответствии с любым из способов, описанных в настоящем документе, биокатализатор может быть высушен перед добавлением в реактор. В этом контексте термин «до» не обязательно означает, что биокатализатор был высушен и затем непосредственно добавлен в реактор. Достаточно, чтобы биокатализатор прошел стадию сушки в любое время до его добавления в реактор независимо от того, выполняются ли дополнительные стадии между сушкой и добавлением или нет. В качестве неограничивающих примеров такие дополнительные стадии между стадией сушки и добавлением в реактор могут быть хранение или восстановление влагосодержания. Однако также возможно добавлять биокатализатор в реактор непосредственно после сушки. Авторы неожиданно обнаружили, что при использовании биокатализатора, который прошел стадию сушки, концентрация акриловой кислоты в водном растворе акриламида, полученном любым из способов, описанных в настоящем документе, далее снижается по сравнению со случаем, когда используется биокатализатор, который не подвергался сушке до использования в биоконверсии.

Что касается способа сушки, то в любом из способов, описанных в настоящем документе, может быть использован биокатализатор, который был высушен с применением лиофильной сушки, распылительной сушки, термической сушки, вакуумной сушки, сушки в псевдоожиженном слое и/или распылительной грануляции. С этой точки зрения предпочтительной является сушка распылением и сушка лиофилизацией, поскольку, как правило, при использовании биокатализатора, который был подвергнут распылительной или лиофильной сушке, достигается более высокое уменьшение концентрации акриловой кислоты в полученных водных растворах акриламида по сравнению с применением биокатализатора, который был высушен другими способами.

В соответствии с любым из способов настоящего изобретения в реактор может быть добавлен высушенный биокатализатор. Это означает, что биокатализатор добавляется в реактор в высушенной форме. В частности, биокатализатор может иметь форму порошка или гранул. В качестве альтернативы добавлению высушенного биокатализатора в реактор высушенный биокатализатор может быть восстановлен перед добавлением в реактор. Например, биокатализатор может быть восстановлен суспендированием в водной композиции. В этом отношении водная композиция может быть водой или буфером. В качестве дополнительной альтернативы в реактор может быть добавлен биокатализатор в форме связанного с матрицей микроорганизма.

Используемый в настоящем документе термин «высушенный биокатализатор» относится к биокатализатору, который был подвергнут стадии сушки. Высушенный биокатализатор обычно имеет содержание влаги менее, чем около 20 мас./мас. %. более предпочтительно менее, чем около 15 мас./мас. %. еще более предпочтительно менее, чем около 14 мас./мас. %, наиболее предпочтительно от около 5 до около 10 мас./мас. % в расчете на общую массу образца биокатализатора. Специалисту в данной области техники известны методы определения содержания влаги. Например, в контексте настоящего изобретения содержание влаги в образце высушенного биокатализатора может быть определено с помощью термогравиметрического анализа. В начале термогравиметрического анализа определяется начальная масса образца. Затем образец нагревается, и влага испаряется. Нагревание продолжается до тех пор, пока масса образца не станет постоянной. Разница между постоянной массой в конце анализа и исходной массой представляет собой количество воды, испаренное в ходе анализа, что позволяет рассчитывать содержание влаги в образце. Для определения содержания влаги с помощью термогравиметрического анализа образец биокатализатора можно анализировать, например, на анализаторе влажности «Mettler Toledo HB43-S Halogen», работающем при 130°С до тех пор, пока масса образца не будет оставаться постоянной в течение по меньшей мере 30 секунд.

При выполнении любого из описанных в настоящем документе способов вместе с биокатализатором может быть получен водный раствор акриламида. Соответственно, биокатализатор может быть отделен от полученного водного раствора акриламида. Такое разделение биокатализатора может быть выполнено в отношении желаемых применений, которые могут, например, включать гомополимеризацию или сополимеризацию акриламида. Подходящие способы отделения биокатализатора известны в данной области и включают, например, центрифугирование, седиментацию (например, флокуляцию), мембранное разделение и фильтрацию.

Настоящее изобретение также относится к водным растворам акриламида, которые могут быть получаемы или получены любым из способов, описанных и представленных в настоящем документе.

Водный раствор акриламида, в частности водный раствор акриламида, получаемый или полученный любым из способов, описанных в настоящем документе, может содержать от 35 до 65 мас./мас. % акриламида и может иметь концентрацию акриловой кислоты не более 1500 частей на миллион, предпочтительно не более 1000 частей на миллион, более предпочтительно не более 750 частей на миллион, более предпочтительно не более 500 частей на миллион, еще более предпочтительно не более 300 частей на миллион, еще более предпочтительно не более 200 частей на миллион и наиболее предпочтительно не более чем 100 частей на миллион, причем указания мас./мас. % и частей на миллион в каждом случае относятся к общей массе раствора, и частей на миллион каждая относится к массовым частям.

Предпочтительно водный раствор акриламида содержит от 40 до 60 мас./мас. % акриламида и имеет концентрацию акриловой кислоты не более 1500 частей на миллион, предпочтительно не более 1000 частей на миллион, более предпочтительно не более 750 частей на миллион, еще более предпочтительно не более 500 частей на миллион, еще более предпочтительно не более 300 частей на миллион, еще более предпочтительно не более 200 частей на миллион и наиболее предпочтительно не более 100 частей на миллион, причем указания мас./мас. % и частей на миллион в каждом случае относятся к общей массе раствора, и указание частей на миллион каждый относится к массовым частям.

Более предпочтительно водный акриламид содержит 45-55 мас./мас. % акриламида и имеет концентрацию акриловой кислоты не более 1500 частей на миллион, предпочтительно не более 1000 частей на миллион, более предпочтительно не более 750 частей на миллион, еще более предпочтительно не более 500 частей на миллион, еще более предпочтительно не более 300 частей на миллион, еще более предпочтительно не более 200 частей на миллион и наиболее предпочтительно не более 100 частей на миллион, причем каждое указание мас./мас. % и частей на миллион относится к общей массе раствора, и каждое указание частей на миллион относится к массовым частям.

Наиболее предпочтительно водный раствор акриламида содержит от 50 до 54 мас./мас. % акриламида и имеет концентрацию акриловой кислоты не более 1500 частей на миллион, предпочтительно не более 1000 частей на миллион, более предпочтительно не более 750 частей на миллион, еще более предпочтительно не более 500 частей на миллион, еще более предпочтительно не более 300 частей на миллион, еще более предпочтительно не более 200 частей на миллион и наиболее предпочтительно не более 100 частей на миллион, причем каждое указание мас./мас. % и частей на миллион относятся к общей массе раствора, и каждое указание частей на миллион относится к массовым частям.

В любом из водных растворов акриламида содержание акриламида и/или концентрация акриловой кислоты могут быть определены с помощью ВЭЖХ. Предпочтительно используют метод ВЭЖХ, как изложено ниже в примерах.

Кроме того, настоящее изобретение относится к акриламидному гомополимеру или сополимеру, получаемому или полученному полимеризацией акриламида водного раствора, как описано в настоящем документе. В этом отношении в случае гомополимера термин «полимеризация» относится к реакции гомополимеризации, тогда как в случае сополимера термин «полимеризация» относится к реакции сополимеризации. Гомополимеризацию или сополимеризацию можно проводить, используя водный раствор акриламида, получаемому или полученному любым из способов, описанных в настоящем документе. В частности, может быть использован водный раствор акриламида, от которого биокатализатор был отделен перед полимеризацией. Альтернативно, акриламид можно выделять из водного раствора акриламида перед гомополимеризацией или сополимеризацией.

Акриламидные гомополимер или сополимер, в частности акриламидный гомополимер или сополимер, получаемый или полученный полимеризацией акриламида водного раствора, как описано в настоящем документе, может иметь содержание акриловой кислоты 60000 частей на миллион или менее, предпочтительно 20000 частей на миллион или менее, более предпочтительно 10000 частей на миллион или менее, а наиболее предпочтительно 2000 частей на миллион или менее, причем каждое указание частей на миллион относится к массовым частям и относятся к общей массе твердого акриламидного гомополимера или сополимера.

Высокое содержание акриловой кислоты в растворах акриламида может привести к снижению эффективности получаемых полиакриламидных гомополимеров и сополимеров, особенно для катионных полиакриламидных продуктов, то есть сополимеров акриламида с катионными сомономерами. Это очень наглядно для катионных сополимеров с низким содержанием катионного сомономера. Не желая связывать себя какой-либо теорией, молярные эквивалентные количества анионной акриловой кислоты и катионных сомономеров в цепи сополимера приводят к образованию зарядовых комплексов. Это может значительно ухудшить физические свойства полиакриламидного материала, снизить растворимость и эксплуатационные свойства в таких областях, как водоподготовка, производство бумаги, добыча нефти или добыча полезных ископаемых.

Что касается этого воздействия акриловой кислоты, то акриламидный гомополимер или сополимер, описанный и представленный в настоящем документе, предпочтительно представляет собой катионный полиакриламид. Как хорошо известно специалисту в данной области техники, термин «катионный полиакриламид» обозначает сополимер, который в дополнение к акриламидным мономерам содержит катионные сомономеры, такие как, например, сомономеры, которые содержат четвертичные аммониевые группы. Особенно предпочтительным является катионный полиакриламид, имеющий содержание акриловой кислоты 60000 частей на миллион или менее, предпочтительно 20000 частей на миллион или менее, более предпочтительно 10000 частей на миллион или менее и наиболее предпочтительно 2000 частей на миллион или менее, где каждое указание частей на миллион относится к массовой доле и относится к общей массе твердого акриламидного гомополимера или сополимера.

В общем случае содержание акриловой кислоты в любом полимере или сополимере, описанном в настоящем документе, может быть определено с применением способов, известных в данной области техники, например ЯМР-спектроскопии. как описано в European Polymer Journal (2007), 43 (3): 824-834.

Акриламидные гомополимеры и/или сополимеры используются, например, в нефтепромыслах. В частности, использование акриламидных гомополимеров и/или сополимеров осуществляется в третичной добыче нефти, которая также обозначается как добыча нефти усовершенствованными методами. В этом отношении в способах третичной добыче нефти водный раствор полимера может быть введен в породу для того, чтобы способствовать вытеснению нефти и, следовательно, увеличению выхода сырой нефти. Следовательно, настоящее изобретение также относится к водному раствору любого акриламидного гомополимера и/или сополимера, описанного в настоящем документе. В качестве воды для водного раствора может использоваться морская вода.

Это описание включает в себя информацию, которая может быть полезной для понимания настоящего изобретения. Это не является признанием того, что какая-либо информация, представленная в настоящем документе, является предшествующим уровнем техники или имеет отношение к заявленным в настоящее время изобретениям, или что любая публикация, специально или неявно упомянутая, является предшествующим уровнем техники.

Следует отметить, что как используется в настоящем документе форма единственного числа включает ссылки на форму множественного числа, если контекст явно не указывает иное. Так, например, ссылка на «реагент» включает один или несколько таких различных реагентов, и ссылка на «способ» включает ссылку на эквивалентные стадии и способы, известные специалистам в данной области техники, которые могут быть изменены или заменены для описанных в настоящем документе.

Специалисты в данной области техники поймут или смогут установить, используя не более чем рутинные эксперименты, многие эквиваленты конкретных вариантов выполнения изобретения, описанных в настоящем документе. Предполагается, что такие эквиваленты охватываются настоящим изобретением.

Если не указано иное, термин «по меньшей мере», предшествующий ряду элементов, следует понимать как относящийся к каждому элементу ряда. Специалисты в данной области техники признают или смогут установить, используя не более чем рутинное экспериментирование, многие эквиваленты конкретных вариантов выполнения способов и применений, описанных в настоящем документе. Предполагается, что такие эквиваленты охватываются настоящим изобретением.

В тексте настоящего описания приводятся несколько документов. Каждый из упомянутых в настоящем описании документов (включая все патенты, заявки на патенты, научные публикации, спецификации изготовителя, инструкции и т.д.), приведенные выше или ниже, включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей их полноте. В той мере, в какой материал, включенный посредством ссылки, противоречит или не соответствует этой спецификации, спецификация заменяет любой такой материал. Ничто в настоящем документе не должно истолковываться как признание того, что изобретение не имеет права передавать такое раскрытие в силу предшествующего изобретения.

В настоящем описании и последующих пунктах формулы изобретения, если контекст не требует иного, слово «содержать» и варианты, такие как «содержит» и «содержащий», будут пониматься как подразумевающие включение указанного целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий, но не исключая какого-либо другого целого числа или стадии или группы целого числа или стадии. При использовании в настоящем документе термин «содержащий» может быть заменен термином «состоящий из» или иногда используемым в настоящем документе термином «имеющий».

При использовании в настоящем описании термин «состоящий из» исключает любой элемент, стадию или ингредиент, не указанные в элементе формулы изобретения. При использовании в настоящем документе термин «состоящий в основном из» не исключает материалы или стадии, которые существенно не влияют на основные и новые характеристики формулы изобретения. В каждом случае в настоящем документе любое из терминов «содержащий», «состоящий в основном из» и «состоящий из» может быть заменен любым из двух других терминов.

В используемом в настоящем документе союз «и/или» в сочетании между множественными перечисляемыми элементами понимается, как охватывающий как индивидуальные, так и комбинированные варианты. Например, когда два элемента соединены «и/или», первый вариант относится к применимости первого элемента без второго. Второй вариант относится к применимости второго элемента без первого. Третий вариант относится к применимости первого и второго элементов вместе. Подразумевается, что любой из этих вариантов попадает в значение и, следовательно, удовлетворяет требованию термина «и/или», как используется в настоящем документе. Параллельная применимость более чем одного из вариантов также понимается как подпадающая под значение и, следовательно, удовлетворяющая требованию термина «и/или», как используется в настоящем документе.

Используемое в настоящем документе слово «около» относится к значению, находящемуся в допустимом диапазоне погрешностей для конкретного значения, определенного специалистом обычной квалификации в данной области техники, которое будет частично зависеть от того, как измеряется или определяется значение, т.е. ограничениями измерительной системы. Например, «около» может означать в пределах 1 или более 1 стандартного отклонения в соответствии с практикой в данной области техники. Термин «около» также используется, чтобы указать, что указанные количество или значение могут быть обозначенным значением или некоторым другим значением, которое приблизительно такое же. Эта фраза предназначена для того, чтобы показать, что аналогичные значения приводят к эквивалентным результатам или эффектам в соответствии с изобретением. В этом контексте «около» может относиться к диапазону выше и/или ниже до 10%. Слово «около» относится в некоторых вариантах выполнения к диапазону выше и ниже определенного значения, которое составляет до 5%, например до 2%. до 1% или до 0.5% выше или ниже этого значения. В одном варианте выполнения «около» относится к диапазону до 0,1% выше и ниже заданного значения.

В общем, настоящее изобретение относится ко всем описанным в настоящем документе вариантам выполнения, а также ко всем перестановкам и их комбинациям. Любые конкретные аспекты или варианты выполнения, описанные в настоящем документе, не должны истолковываться как ограничивающие объем настоящего изобретения в отношении таких аспектов или вариантов выполнения.

Следующие примеры дополнительно описывают и иллюстрируют предлагаемое изобретение без ограничения изобретения любыми спецификациями или вариантами выполнения, определенными в нем.

Примеры

Пример 1:

В полупериодическом процессе акрилонитрил и 2446 г воды помещали в стеклянный реактор, в который акрилонитрил в каждом опыте добавляли таким образом, чтобы достичь концентрации акрилонитрила в реакторе, как указано ниже в таблице 1. Затем высушенный биокатализатор Rhodococcus rhodochrous, штамм NCIMB 41164 добавляли для инициирования биоконверсии. В ходе биоконверсии добавляли акрилонитрил с регулируемой скоростью, при этом содержание акрилонитрила постоянно поддерживали на начальном уровне, указанном в таблице 1. С этой точки зрения содержание акрилонитрила и акриламида измеряли в режиме онлайн в ходе биоконверсии с применением инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR). В целом 1553 г акрилонитрила, который представляет собой общее количество акрилонитрила, помещенного в реактор перед началом биоконверсии и добавленного в ходе реакции, был превращен в акриламид. По окончании реакции получали 4 кг водного раствора акриламида, имеющего содержание 52 мас./мас. % акриламида в расчете на общую массу композиции в реакторе.

Следующая таблица 1 показывает различные опыты настоящего способа, как описано в предыдущем абзаце, при температурах 20°С и 26°С соответственно, где использовались различные количества биокатализатора, и содержание акрилонитрила поддерживалось при разных значениях в ходе биоконверсии.

* измеряется в режиме онлайн в ходе биоконверсии, с применением инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR)

** определяется с применением ВЭЖХ в соответствии со способом, представленным ниже

Результаты, приведенные в таблице 1, показывают, что при поддержании содержания акрилонитрила в ходе биоконверсии при 0,3 мас./мас. % или более водные растворы акриламида получают с низкой концентрацией акриловой кислоты. В частности, результаты показывают, что при увеличении содержания акрилонитрила, которое поддерживается в ходе биоконверсии, концентрация акриловой кислоты в полученных водных растворах акриламида уменьшается.

Пример 2:

Опыты биоконверсии акрилонитрила в акриламид проводили в тех же условиях, что и в примере 1, за исключением:

(i) более высокое содержание акрилонитрила поддерживалось с начала биоконверсии в течение 1 часа;

(ii) через 1 час от начала биоконверсии содержание акрилонитрила уменьшалось до более низкого содержания акрилонитрила; а также

(iii) более низкое содержание акрилонитрила поддерживали до конца биоконверсии, то есть до превращения 1553 г акрилонитрила в 4 кг водного раствора акриламида, имеющего содержание 52 мас./мас. % акриламида в расчете на общую массу композиции в реакторе.

Конкретные условия и результаты приведены в таблице 2.

* измеряется в режиме онлайн в ходе биоконверсии, с применением инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR)

** определяется с применением ВЭЖХ в соответствии со способом, представленным ниже

В опыте 1 таблицы 2 содержание акрилонитрила поддерживалось на уровне 0,8 мас./мас. % в течение всей биоконверсии. В опытах 2 и 3 более высокое содержание 1,5 и 2 мас./мас. % акрилонитрила, соответственно, поддерживалось до одного часа с начала биоконверсии. Спустя один час содержание акрилонитрила уменьшалось до 0,8 мас./мас. % и поддерживалось в этом значении до конца биоконверсии.

Результаты показывают, что в сопоставимые периоды времени, требуемые для окончания биоконверсии, концентрация акриловой кислоты в полученных водных растворах акриламида дополнительно уменьшается в случае, если более высокое содержание акрилонитрила поддерживается в течение определенного периода времени, тогда содержание акрилонитрила уменьшается до более низкого содержания акрилонитрила, и это более низкое содержание акрилонитрила сохраняется до конца биоконверсии.

Пример 3:

Воду и 18 г акрилонитрила помещали в реактор. Количество воды регулировали таким образом, чтобы общее количество воды и биокатализатора составляло 1835 г. В независимых испытаниях использовались две различные формы (i) и (ii) биокатализатора, как указано в нижеследующем:

(i) ферментационный бульон, содержащий клетки Rhodococcus rhodochrous, штамм Jl (FERM-BP 1478), с активностью NHase 1512 кЕ/кг и содержанием воды 96,1 мас./мас. %; а также

(ii) сухой порошок, полученный концентрированием (i) центрифугированного до содержания воды 83,6 мас./мас. % и последующей сублимационной сушкой концентрата. Содержание воды в сухом порошке составляло 13 мас./мас. %, а активность NHase составляла 211 кЕ/кг.

Биокатализатор добавляли в реактор, в результате чего начиналась реакция. В ходе биоконверсии добавляли 1147 г дополнительного акрилонитрила, так что общий размер реакционной партии в конце составлял 3000 г. В ходе реакции температуру поддерживали постоянной при 23°С. Содержание акрилонитрила измеряли в режиме онлайн в ходе биоконверсии с применением инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR), и скорость добавления акрилонитрила регулировали так, чтобы содержание акрилонитрила в реакционной смеси поддерживалась постоянной при 1,0 ± 0,1 мас./мас. % или 0,3 мас./мас. % до тех пор, пока в реактор не был добавлен весь акрилонитрил. Реакцию останавливали после того, как содержание акрилонитрила уменьшилось до < 100 частей на миллион за счет конверсии. По окончании реакции концентрация акриламида в каждом опыте составляла ≥ 51 мас./мас. %.

Условия и результаты показаны в таблице 3 ниже.

* измеряется в режиме онлайн в ходе биоконверсии, с применением инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR)

** определяется с применением ВЭЖХ в соответствии со способом, представленным ниже

Результаты таблицы 3 показывают, что при использовании высушенного биокатализатора в биоконверсии, в которой содержание акрилонитрила поддерживается постоянным, концентрация акриловой кислоты в полученных водных растворах акриламида уменьшается по сравнению с применением биокатализатора, который не подвергался сушке.

В вышеприведенных примерах концентрацию акриловой кислоты в полученных водных растворах акриламида определяли с помощью ВЭЖХ. Для определения содержания акриламида, акриловой кислоты и акрилонитрила применялись следующие условия:

Колонка: Aqua С18, 250 * 4,6 мм (Phenomenex)

Защитная колонка: С18 Aqua

Температура: 40°С

Скорость потока: 1,00 мл/мин

Объем пробы: 1,0 мкл

Обнаружение: УФ-детектор, длина волны 210 нм

Время остановки: 8,0 минут

Время восстановления колонки после анализа: 0,0 минут

Максимальное давление: 250 бар

Элюент А: 10 мМ KH₂PO₄, рН 2.5

Элюент В: ацетонитрил

Градиент:

Аналиты:

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены способ уменьшения концентрации акриловой кислоты в водном растворе акриламида, способ получения водного раствора акриламида (варианты). Каждый из предложенных способов включает добавление в реактор способного превращать акрилонитрил в акриламид биокатализатора, акрилонитрила и воды, проведение биоконверсии полученной композиции с добавлением дополнительного акрилонитрила и поддержанием содержания акрилонитрила при 0,3 мас./мас.% или более. Причём сначала содержание акрилонитрила поддерживают в первом диапазоне от 1,2 до 6 мас./мас.% в ходе первого периода времени от 30 минут до 4 часов, далее уменьшают содержание акрилонитрила до второго диапазона и поддерживают содержание акрилонитрила во втором диапазоне от 0,3 до 1,2 мас./мас.% в ходе второго периода времени от 30 минут до 24 часов. При этом в одном варианте способ получения водного раствора акриламида включает поддержание содержания акрилонитрила в ходе биоконверсии до тех пор, пока содержание акриламида не составит 20 мас./мас.%, а в другом варианте получают композицию, в которой концентрация акриловой кислоты в композиции в конце биоконверсии составляет 1500 частей на миллион или менее. Изобретения обеспечивают получение водного раствора акриламида с низкой концентрацией акриловой кислоты. 4 н. и 20 з.п. ф-лы, 3 табл., 3 пр.

1. Способ получения водного раствора акриламида, причем указанный способ включает следующие стадии:

(a) добавление следующих компонентов (i)-(iii) в реактор для получения композиции для биоконверсии:

(i) биокатализатор, способный превращать акрилонитрил в акриламид;

(ii) акрилонитрил;

(iii) вода; и

(b) проведение биоконверсии композиции, полученной на стадии (а);

(c) добавление дополнительного акрилонитрила и поддержание содержания акрилонитрила в ходе стадии (b) при 0,3 мас./мас.% или более,

в котором поддержание содержания акрилонитрила в ходе стадии (b) при 0,3 мас./мас.% или более включает:

(i') поддержание содержания акрилонитрила в первом диапазоне от 1,2 до 6 мас./мас.% в ходе первого периода времени от 30 минут до 4 часов;

(ii') уменьшение содержания акрилонитрила до второго диапазона; и

(iii') поддержание содержания акрилонитрила во втором диапазоне от 0,3 до 1,2 мас./мас.% в ходе второго периода времени от 30 минут до 24 часов,

где указания мас./мас.% в каждом случае относятся к общей массе композиции в реакторе.

2. Способ получения водного раствора акриламида, причем указанный способ включает следующие стадии:

(а) добавление следующих компонентов (i)-(iii) в реактор для получения композиции для биоконверсии:

(i) биокатализатор, способный превращать акрилонитрил в акриламид;

(ii) акрилонитрил;

(iii) вода; и

(b) проведение биоконверсии композиции, полученной на стадии (а);

(c) добавление дополнительного акрилонитрила и поддержание содержания акрилонитрила в ходе стадии (b) при 0,3 мас./мас.% или более до тех пор, пока содержание акриламида не составит по меньшей мере 20 мас./мас.%,

в котором поддержание содержания акрилонитрила в ходе стадии (b) при 0,3 мас./мас.% или более включает:

(i') поддержание содержания акрилонитрила в первом диапазоне от 1,2 до 6 мас./мас.% в ходе первого периода времени от 30 минут до 4 часов;

(ii') уменьшение содержания акрилонитрила до второго диапазона; и

(iii') поддержание содержания акрилонитрила во втором диапазоне от 0,3 до 1,2 мас./мас.% в ходе второго периода времени от 30 минут до 24 часов,

где указания мас./мас.% в каждом случае относятся к общей массе композиции в реакторе.

3. Способ по п.2, в котором содержание акрилонитрила в ходе стадии (b) поддерживают до тех пор пока, содержание акриламида не составит по меньшей мере 25 мас./мас.%, предпочтительно по меньшей мере 30 мас./мас.%, более предпочтительно по меньшей мере 35 мас./мас.%, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 мас./мас.%, еще более предпочтительно по меньшей мере 42,5 мас./мас.%, еще более предпочтительно по меньшей мере 45 мас./мас.%, еще более предпочтительно по меньшей мере 47,5 мас./мас.% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 50 мас./мас.%.

4. Способ уменьшения концентрации акриловой кислоты в водном растворе акриламида, в котором указанный водный раствор акриламида получают способом, в котором акрилонитрил превращают в акриламид с применением биокатализатора, причем указанный способ включает следующие стадии:

(a) добавление следующих компонентов (i)-(iii) в реактор для получения композиции для биоконверсии:

(i) биокатализатор, способный превращать акрилонитрил в акриламид;

(ii) акрилонитрил;

(iii) вода; и

(b) проведение биоконверсии композиции, полученной на стадии (а);

(c) добавление дополнительного акрилонитрила и поддержание содержания акрилонитрила в ходе стадии (b) при 0,3 мас./мас.% или более,

в котором поддержание содержания акрилонитрила в ходе стадии (b) при 0,3 мас./мас.% или более включает:

(i') поддержание содержания акрилонитрила в первом диапазоне от 1,2 до 6 мас./мас.% в ходе первого периода времени от 30 минут до 4 часов;

(ii') уменьшение содержания акрилонитрила до второго диапазона; и

(iii') поддержание содержания акрилонитрила во втором диапазоне от 0,3 до 1,2 мас./мас.% в ходе второго периода времени от 30 минут до 24 часов,

где указания мас./мас.% в каждом случае относятся к общей массе композиции в реакторе.

5. Способ по любому из пп.1-4, в котором концентрация акриловой кислоты в композиции в конце биоконверсии составляет 1500 частей на миллион или менее, предпочтительно 1200 частей на миллион или менее, более предпочтительно 1000 частей на миллион или менее, более предпочтительно 750 частей на миллион или менее, еще более предпочтительно 500 частей на миллион или менее, еще более предпочтительно 300 частей на миллион или менее, еще более предпочтительно 200 частей на миллион или менее и наиболее предпочтительно 100 частей на миллион или менее, причем указания частей на миллион в каждом случае относятся к массовым частям и в каждом случае относятся к общей массе композиции в конце биоконверсии.

6. Способ получения водного раствора акриламида, причем указанный способ включает следующие стадии:

(а) добавление следующих компонентов (i)-(iii) в реактор для получения композиции для биоконверсии:

(i) биокатализатор, способный превращать акрилонитрил в акриламид;

(ii) акрилонитрил;

(iii) вода;

(b) проведение биоконверсии композиции, полученной на стадии (а);

(c) добавление дополнительного акрилонитрила и поддержание содержания акрилонитрила в ходе стадии (b) при 0,3 мас./мас.% или более, где указание мас./мас.% относится к общей массе композиции в реакторе; и

(d) получение композиции, в которой концентрация акриловой кислоты в композиции в конце биоконверсии составляет 1500 частей на миллион или менее, причем указания частей на миллион в каждом случае относятся к массовым частям и в каждом случае относятся к общей массе композиции в конце биоконверсии,

в котором поддержание содержания акрилонитрила в ходе стадии (b) при 0,3 мас./мас.% или более включает:

(i') поддержание содержания акрилонитрила в первом диапазоне от 1,2 до 6 мас./мас.% в ходе первого периода времени от 30 минут до 4 часов;

(ii') уменьшение содержания акрилонитрила до второго диапазона; и

(iii') поддержание содержания акрилонитрила во втором диапазоне от 0,3 до 1,2 мас./мас.% в ходе второго периода времени от 30 минут до 24 часов,

где указания мас./мас.% в каждом случае относятся к общей массе композиции в реакторе.

7. Способ по п.6, в котором концентрация акриловой кислоты композиции в конце биоконверсии составляет 1200 частей на миллион или менее, предпочтительно 1000 частей на миллион или менее, более предпочтительно 750 частей на миллион или менее, еще более предпочтительно 500 частей на миллион или менее, еще более предпочтительно 300 частей на миллион или менее, еще более предпочтительно 200 частей на миллион или менее и наиболее предпочтительно 100 частей на миллион или менее.

8. Способ по любому из пп.1-4, 6 и 7, в котором биокатализатор, акрилонитрил и воду добавляют в ходе стадий (а)-(с) указанного способа в массовом соотношении от 0,001 до 0,5 мас./мас.% биокатализатора, от 22 до 45 мас./мас.% акрилонитрила, и остальную часть до 100 мас./мас.% составляет вода; предпочтительно от 0,005 до 0,2 мас./мас.% биокатализатора, от 26 до 42 мас./мас.% акрилонитрила, и остальную часть до 100 мас./мас.% составляет вода; более предпочтительно от 0,01 до 0,1 мас./мас.% биокатализатора, от 30 до 40 мас./мас.% акрилонитрила, и остальную часть до 100 мас./мас.% составляет вода; наиболее предпочтительно от 0,015 до 0,065 мас./мас.% биокатализатора, от 35 до 39 мас./мас.% акрилонитрила, и остальную часть до 100 мас./мас.% составляет вода, причем в каждом случае указания мас./мас.% относятся к общей массе (100 мас./мас.%) объединенных масс биокатализатора, акрилонитрила и воды, добавляемых в ходе стадий (а)-(с).

9. Способ по любому из пп.1-4, 6 и 7, в котором содержание акрилонитрила поддерживается в ходе стадии (b) при 6 мас./мас.% или менее, предпочтительно при 5 мас./мас.% или менее, более предпочтительно при 4 мас./мас.% или менее, наиболее предпочтительно при 3 мас./мас.% или менее, причем указания мас./мас.% в каждом случае относятся к общей массе композиции в реакторе.

10. Способ по любому из пп.1-4, 6 и 7, в котором стадия (b) включает:

(i) поддержание содержания акрилонитрила в первом диапазоне от 1,2 до 4 мас./мас.% в ходе первого периода времени от 30 минут до 3 часов;

(ii) уменьшение содержания акрилонитрила до второго диапазона; и

(iii) поддержание содержания акрилонитрила во втором диапазоне от 0,5 до 1,1 мас./мас.% в ходе второго периода времени от 30 минут до 12 часов,

где указания мас./мас.% в каждом случае относятся к общей массе композиции в реакторе.

11. Способ по п.10, в котором стадия (b) включает:

(i) поддержание содержания акрилонитрила в первом диапазоне от 1,3 до 3 мас./мас.% в ходе первого периода времени от 30 минут до 2 часов;

(ii) уменьшение содержания акрилонитрила до второго диапазона; и

(iii) поддержание содержания акрилонитрила во втором диапазоне от 0,6 до 1,0 мас./мас.% в ходе второго периода времени от 1 до 8 ч, предпочтительно от 1 до 5 ч,

где указания мас./мас.% в каждом случае относятся к общей массе композиции в реакторе.

12. Способ по любому из пп.1-4, 6 и 7, в котором способ осуществляют с применением полупериодического способа.

13. Способ по любому из пп.1-4, 6 и 7, в котором содержание акрилонитрила и/или содержание акриламида в ходе стадии (b) измеряют, применяя инфракрасную спектроскопию с Фурье-преобразованием (FTIR).

14. Способ по любому из пп.1-4, 6 и 7, в котором указанный биокатализатор кодирует фермент нитрилгидратазу.

15. Способ по любому из пп.1-4, 6 и 7, в котором биокатализатор выбирают из группы, состоящей из Rhodococcus, Aspergillus, Acidovorax, Agrobacterium, Bacillus, Bradyrhizobium, Burkholderia, Escherichia, Geobacillus, Klebsiella, Mesorhizobium, Moraxella, Pantoea, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Serratia, Amycolatopsis, Arthrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Micrococcus, Nocardia, Pseudonocardia, Trichoderma, Myrothecium, Aureobasidium, Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Geotrichum, Hanseniaspora, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Comomonas и Pyrococcus.

16. Способ по п.15, в котором биокатализатор выбирают из группы, состоящей из Rhodococcus, Pseudomonas, Escherichia и Geobacillus.

17. Способ по любому из пп. 1-4, 6 и 7, в котором биокатализатор выбирают из группы, состоящей из Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus pyridinovorans, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus equi, Rhodococcus ruber, Rhodococcus opacus, Aspergillus niger, Acidovorax avenae, Acidovorax facilis, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Bacillus subtilis, Bacillus pallidus, Bacillus smithii, Bacillus sp BR449, Bradyrhizobium oligotrophicum, Bradyrhizobium diazoefficiens, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cenocepacia, Burkholderia gladioli, Escherichia coli, Geobacillus sp. RAPc8, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumonia, Klebsiella variicola, Mesorhizobium ciceri, Mesorhizobium opportunistum, Mesorhizobium sp F28, Moraxella, Pantoea endophytica, Pantoea agglomerans, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas putida, Rhizobium, Rhodopseudomonas palustris, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Amycolatopsis, Arthrobacter, Brevibacterium sp CH1, Brevibacterium sp CH2, Brevibacterium sp R312, Brevibacterium imperiale, Brevibacterium casei, Corynebacterium nitrilophilus, Corynebacterium pseudodiphteriticum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium hoffmanii, Microbacterium imperiale, Microbacterium smegmatis, Micrococcus luteus, Nocardia globerula, Nocardia rhodochrous, Nocardia sp 163, Pseudonocardia thermophila, Trichoderma, Myrothecium verrucaria, Aureobasidium pullulans, Candida famata, Candida guilliermondii, Candida tropicalis, Cryptococcus flavus, Cryptococcus sp UFMG- Y28, Debaryomyces hanseii, Geotrichum candidum, Geotrichum sp JR1, Hanseniaspora, Kluyveromyces thermotolerans, Pichia kluyveri, Rhodotorula glutinis, Comomonas testosteroni, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus furiosus и Pyrococcus horikoshii.

18. Способ по п.17, в котором биокатализатором является Rhodococcus rhodochrous.

19. Способ по п.17, в котором биокатализатором является Rhodococcus pyridinovorans.

20. Способ по любому из пп.1-4, 6, 7, 11, 16, 18 и 19, в котором биокатализатор высушен перед добавлением в реактор.

21. Способ по п.20, в котором биокатализатор высушен с применением лиофильной сушки, распылительной сушки, термической сушки, вакуумной сушки, сушки в псевдоожиженном слое и/или распылительного гранулирования, где распылительная сушка и лиофильная сушка являются предпочтительными.

22. Способ по п.20, в котором высушенный биокатализатор добавляют в реактор.

23. Способ по п.20, в котором высушенный биокатализатор восстанавливают перед добавлением в реактор.

24. Способ по п.23, в котором биокатализатор восстанавливают суспендированием в водной композиции.