ПОВЫШЕНИЕ РЕАКЦИОННОЙ СПОСОБНОСТИ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ С ПОМОЩЬЮ АЛЬДЕГИДА Российский патент 2024 года по МПК C12N9/88 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0001]

Родственная заявка

Спецификация включает содержание спецификации патентной заявки Японии № 2021-19409 (подана 10 февраля 2021 г.), на основании которой испрашивается приоритет по настоящей заявке.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу получения амидного соединения с помощью нитрилгидратазы. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу повышения скорости реакции нитрилгидратазы, способу подавления инактивации нитрилгидратазы и способу получения амидного соединения в состоянии, при котором скорость реакции (нитрилгидратазы) повышена.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002]

Амидные соединения нашли широкое применение как вещества, имеющие промышленное значение. Например, акриламид используют в широком спектре продуктов, включая коагулянт для очистки сточных вод, усилитель прочности бумаги и реагент для извлечения нефти, тогда как метакриламид широко используют в таких продуктах, как краска и клей.

[0003]

В качестве способа получения амидного соединения использовали промышленный способ получения амидного соединения путем гидратации соответствующего нитрильного соединения в присутствии меди в восстановленном состоянии, обычно используемой в качестве катализатора.

[0004]

Недавно в микробных ферментах была обнаружена нитрилгидратаза, обладающая активностью гидратации нитрила, то есть, активностью гидратации нитрильной группы и превращения ее в амидную группу, и был разработан способ получения амидного соединения из соответствующего нитрильного соединения с использованием фермента или бактериальных клеток, содержащих фермент.

[0005]

Этот способ получения считается способом, превосходящим в промышленном отношении обычный способ с использованием металлического катализатора по той причине, что условия реакции являются мягкими; нитрильное соединение превращается в соответствующее амидное соединение с высокой скоростью превращения и с высокой избирательностью, в результате чего производственный процесс может быть существенно упрощен.

[0006]

При промышленном производстве амидного соединения с использованием нитрилгидратазы важно, чтобы амидное соединение могло быть эффективно получено из соответствующего нитрильного соединения. Сообщалось, что эффективность получения амидного соединения повышается за счет повышения ферментативной активности нитрилгидратазы (патентный документ 1), подавления температурной инактивации и повышения устойчивости амидного соединения (патентный документ 2).

[0007]

В патентных документах 3-5 описаны другие способы, в которых производительность повышается за счет выявления органических примесей, влияющих на активность нитрилгидратазы и содержащихся в нитрильном соединении, и тем самым подавления инактивации нитрилгидратазы. Например, в патентном документе 3 сообщается о способе эффективного получения амидного соединения путем снижения концентрации бензола, присутствующего в нитрильном соединении. Способ снижения концентрации синильной кислоты, присутствующей в нитрильном соединении, описан в патентных документах 4 и 5.

Список литературы

Патентные документы

[0008]

Патентный документ 1: Выложенный патент Японии № 2005-295815

Патентный документ 2: Выложенный патент Японии № 2010-172295

Патентный документ 3: Международная патентная публикация № WO 2007-043466

Патентный документ 4: Выложенный патент Японии № H11-123098

Патентный документ 5: Выложенный патент Японии № 2001-288156

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая проблема

[0009]

У способа, описанного в патентном документе 4, существует проблема. Добавление соединения металла может влиять на ферментативную реакцию и качество получаемого амидного соединения. Кроме того, после завершения реакции необходима стадия удаления соединения металла и тому подобного, что приводит к увеличению стоимости производства. В другом случае, когда нитрильное соединение очищают с помощью ионообменной смолы, количество стадий увеличивается, что приводит к увеличению стоимости.

[0010]

В способе, описанном в патентном документе 5, к исходному нитрильному соединению добавляют щелочное соединение. Перед ферментативной реакцией требуется дополнительная стадия регулирования рН нитрильного соединения (раствора), и щелочное соединение может влиять на качество получаемого амидного соединения.

[0011]

В данных обстоятельствах основной целью настоящего изобретения является создание способа повышения производительности амидного соединения более простым путем за счет добавления альдегидного соединения.

Решение проблемы

[0012]

В связи с недостатками традиционной технологии авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования. В результате они обнаружили, что добавление альдегидного соединения в реакцию получения амидного соединения из нитрильного соединения с использованием биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью, повышает скорость реакции превращения нитрильного соединения в амидное соединение и может подавлять инактивацию нитрилгидратазы. На основании этого открытия было выполнено настоящее изобретение.

[0013]

Более конкретно, настоящее изобретение относится к следующим пунктам [1] - [10].

[1] Способ получения амидного соединения из нитрильного соединения в присутствии биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью, где

реакцию получения амидного соединения из нитрильного соединения проводят в присутствии альдегидного соединения, и нитрильное соединение представляет собой по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из акрилoнитрила, ацетонитрила, метакрилoнитрила, цианопиридина, гликолoнитрила и аланиннитрила.

[2] Способ повышения скорости реакции, которая превращает нитрильное соединение в амидное соединение при получении амидного соединения из нитрильного соединения в присутствии биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью, включающий

стадию добавления альдегидного соединения в реакционный раствор, содержащий нитрильное соединение,

где нитрильное соединение представляет собой по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из акрилoнитрила, ацетонитрила, метакрилoнитрила, цианопиридина, гликолoнитрила и аланиннитрила.

[3] Способ подавления инактивации биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью, при получении амидного соединения из нитрильного соединения в присутствии биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью, включающий

стадию добавления альдегидного соединения в реакционный раствор, содержащий нитрильное соединение,

где нитрильное соединение представляет собой по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из акрилoнитрила, ацетонитрила, метакрилoнитрила, цианопиридина, гликолoнитрила и аланиннитрила.

[4] Способ по любому из пунктов [1] - [3], где отношение концентрации альдегидного соединения к концентрации цианового соединения в нитрильном соединении составляет от 0,9 до 15 в молярном соотношении.

[5] Способ по любому из пунктов [1] - [5], где биокатализатор, обладающий нитрилгидратазной активностью, представляет собой нитрилгидратазу, полученную из представителей рода Rhodococcus или Pseudonocardia; или клетки, бактериальные клетки, или их переработанный материал, содержащий нитрилгидратазу.

[6] Способ по любому из пунктов [1] - [4], где альдегидное соединение представляет собой по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из формальдегида, ацетальдегида, пропиональдегида, бутиральдегида, изобутиральдегида, диальдегида щавелевой кислоты, малондиальдегида, пентаналя, изовалеральдегида, акролеина, кротональдегида, тиглинового альдегида, глицеральдегида, гликольальдегида, фурфурола, бутандиальдегида, транс-2-гексеналя, глутаральдегида, гексаналя, гептаналя, октаналя, нонаналя, деканаля, паральдегида, бензальдегида, коричного альдегида, перилальдегида, ванилина, 1-нафтоальдегида, фталевого альдегида, метионаля, (Z)-7-гексадеценаля, глиоксаля (диальдегида щавелевой кислоты), параформальдегида, ацетальдегид-аммиака и гексаметилентетрамина.

[7] Композиция для получения амидного соединения, содержащая:

альдегидное соединение; и

по меньшей мере одно нитрильное соединение, выбранное из группы, состоящей из акрилoнитрила, ацетонитрила, метакрилoнитрила, цианопиридина, гликолoнитрила и лактонитрила.

[8] Композиция катализатора для получения амидного соединения, содержащая альдегидное соединение и биокатализатор, обладающий нитрилгидратазной активностью.

[9] Композиция амидного соединения, содержащая альдегидное соединение и амидное соединение, содержащее циановое соединение, где концентрация цианового соединения в амидном соединении перед добавлением альдегидного соединения составляет 0,2 промилле или более.

[10] Композиция амидного соединения, содержащая амидное соединение и соединение, содержащее циановое соединение и альдегидное соединение, связанные друг с другом.

Полезные эффекты изобретения

[0014]

В соответствии с настоящим изобретением возможно увеличивать скорость реакции, которая превращает нитрильное соединение в амидное соединение в присутствии биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью, путем добавления альдегидного соединения в реакционный раствор, содержащий нитрильное соединение. В соответствии с настоящим изобретением также возможно подавлять инактивацию биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью. Иными словами, в соответствии с настоящим изобретением может быть эффективно получено амидное соединение.

Описание вариантов осуществления

[0015]

Далее описаны варианты осуществления изобретения.

(1) Биокатализатор, обладающий нитрилгидратазной активностью.

Используемый в настоящем документе термин «нитрилгидратаза» относится к ферменту, обладающему способностью гидролизовать нитрильное соединение, с образованием соответствующего амидного соединения. Биокатализатор, обладающий нитрилгидратазной активностью, может представлять собой сам белок нитрилгидратазы, но можно использовать животную клетку, растительную клетку, органеллу или бактериальную клетку, содержащую нитрилгидратазу, а также их переработанный материал.

[0016]

Примеры переработанного материала включают измельченный материал животной клетки, растительной клетки, органеллы или бактериальной клетки; фермент, экстрагированный из бактериальной клетки (неочищенный фермент или очищенный фермент); а также животную клетку, растительную клетку, органеллу, бактериальную клетку или сам фермент, иммобилизованные на носителе.

[0017]

Примеры переработанного материала также включают животную клетку, растительную клетку, органеллу или бактериальную клетку, которые подвергают химической обработке для потери способности к пролиферации.

[0018]

Примеры метода иммобилизации включают метод покрытия, метод сшивания и метод связывания носителя. Метод покрытия представляет собой метод покрытия полимерной мембраной. Метод сшивания представляет собой метод сшивания фермента реагентом, имеющим две или более функциональных групп (полифункциональным сшивающим реагентом). Метод связывания носителя представляет собой метод связывания фермента с нерастворимым в воде носителем.

[0019]

Примеры носителя для иммобилизации (иммобилизирующего носителя) включают стеклянные гранулы, силикагель, полиуретан, полиакриламид, поливиниловый спирт, каррагинан, альгиновую кислоту, агар и желатин.

[0020]

Репрезентативные примеры бактериальной клетки (микроорганизма), упомянутой выше, включают микроорганизмы, обладающие нитрилгидратазной активностью и принадлежащие к роду Rhodococcus, Gordona, Pseudomonas, Pseudonocardia, Geobacillus, Bacillus, Bacteridium, Micrococcus, Brevibacterium, Corynebacterium, Nocardia, Microbacterium, Fusarium, Agrobacterium, Acinetobacter, Xanthobacter, Streptomyces, Rhizobium, Klebsiella, Enterobacter, Erwinia, Pantoea, Candida, Aeromonas, Citrobacter и Achromobacter.

[0021]

Более конкретно, примеры бактериальной клетки включают Nocardia sp. N-775, описание приведено в патентной публикации Японии № 56-17918; Rhodococcus rhodochrous J-1, описание приведено в патентной публикации Японии № 06-55148; штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB41164, описание приведено в международной патентной публикации № WO 2005/054456: Klebsiella sp. MCI2609, описание приведено в выложенном патенте Японии № H05-30982; Aeromonas sp. MCI2614, описание приведено в выложенном патенте Японии № H05-30983; Citrobacter freundii MCI2615, описание приведено в выложенном патенте Японии № H05-30984; Agrobacterium rhizogenes IAM13570 и Agrobacterium faciens, описание приведено в выложенном патенте Японии № H05-103681; Xanthobacter flavas JCM1204 и Erwinia nigrifluens MAFF03-01435, описание приведено в выложенном патенте Японии № H05-161495; Enterobacter sp. MCI2707, описание приведено в выложенном патенте Японии № H05-236975; Streptomyces sp. MCI2691, описание приведено в выложенном патенте Японии № H05-236976; Rhizobium sp. MCI2610, Rhizobium sp. MCI2643, Rhizobium loti IAM13588, Rhizobium leguminosarum, IAM12609 и Rhizobium merioti IAM12611, описание приведено в выложенном патенте Японии № H05-236977; Candida guilliermondii NH-2, Pantoea agglomerans, NH-3 и Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae NH-26T2, описание приведено в выложенном патенте Японии № H05-15384; Agrobacterium radiobacter SC-C15-1, описание приведено в выложенном патенте Японии № H06-14786; Bacillus smithii SC-J05-1, описание приведено в выложенном патенте Японии № H07-25494; Pseudonocardia thermophila ATCC19285, описание приведено в выложенном патенте Японии № H08-56684; и Pseudonocardia thermophila JCM3095, описание приведено в выложенном патенте Японии № H09-275978.

[0022]

Штамм Rhodococcus rhodochrous J-1, раскрытый в патентной публикации Японии № 06-55148, был депонирован в Национальном институте технологии и оценки, Центр патентных биологических депозитов (Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan (то же самое применимо и далее в спецификации)) под регистрационным номером «FERM BP-1478» 18 сентября 1987 г.

[0023]

Штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB41164, раскрытый в международной патентной публикации № WO 2005/054456, был депонирован в Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий, ООО (NCIMB) (NCIMB Ltd Ferguson Building Craibstone Estate Buksburn Aberdeen AB21 9YA) под регистрационным номером NCIMB41164 5 марта 2003 г.

[0024]

Штамм Pseudonocardia thermophila JCM3095, раскрытый в выложенном патенте Японии № H09-275978, был депонирован в Национальном институте технологии и оценки, Центр патентных биологических депозитов (Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) под регистрационным номером «FERM BP-5785» 7 февраля 1996 г.

[0025]

По настоящему изобретению можно использовать один или два, или более микроорганизмов, выбранных из вышеперечисленных микроорганизмов (отдельно или в сочетании).

[0026]

Ген, кодирующий нитрилгидратазу, может быть введен в бактериальную клетку и экспрессирован обычным методом молекулярной биологии (что касается метода молекулярной биологии, смотри Sambrook, Fritsch and Maniatis, «Molecular Cloning: A Laboratory Manual», 2-е издание (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press). Более конкретно, по настоящему изобретению может быть использован фермент, полученный путем экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей природную нитрилгидратазу (дикого типа) или модифицированную нитрилгидратазу (мутантного типа), в бактериальной клетке. По настоящему изобретению можно использовать ферменты одного, двух или более типов, выбранные из вышеупомянутых ферментов (в отдельности или в сочетании).

[0027]

Аминокислотная последовательность нитрилгидратазы дикого типа доступна в общедоступной базе данных NCBI, такой как GenBank (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/).

[0028]

Например, регистрационным номером α-субъединицы, полученной из Rhodococcus rhodochrous J1 (FERM BP-1478), является «P21219», и регистрационным номером соответствующей β-субъединицы является «P21220». Регистрационным номером α-субъединицы, полученной из Rhodococcus rhodochrous M8 (SU1731814), является «ATT79340», и регистрационным номером соответствующей β-субъединицы является «AAT79339». Регистрационным номером α-субъединицы, полученной из Pseudomonas thermophila JCM3095, является «1IREA», и регистрационным номером соответствующей β-субъединицы является «1IREB».

[0029]

Примеры трансформанта, в который введен ген нитрилгидратазы дикого типа, включают, но не ограничиваются ими, Escherichia coli MT10770 (FERM P-14756) (выложенный патент Японии № H8-266277), трансформированную нитрилгидратазой (геном) представителя рода Achromobacter, Escherichia coli MT10822 (FERM BP-5785) (выложенный патент Японии № H9-275978), трансформированную нитрилгидратазой (геном) представителя рода Pseudonocardia, или микроорганизм, трансформированный нитрилгидратазой (геном) (выложенный патент Японии № H4-211379), полученным от Rhodococcus rhodochrous.

[0030]

Известны модифицированные (мутантные) нитрилгидратазы, полученные путем замены аминокислот нитрилгидратазы дикого типа (например, выложенный патент Японии № 2010-172295, выложенный патент Японии № 2007-143409, выложенный патент Японии № 2007-143409, № 2007-043910, выложенный патент Японии № 2008-253182, выложенный патент Японии № 2019-088326, выложенный патент Японии № 2019-088327, WO 05/116206, WO 12/164933, WO 12/169203, WO 15/186298). В способе по настоящему изобретению можно использовать микроорганизм, имеющий любую из этих модифицированных нитрилгидратаз (ген), введенных в него.

[0031]

Каждый из упомянутых выше микроорганизмов, обладающих нитрилгидратазной активностью, или их переработанных материалов можно использовать в реакции синтеза амида сразу после получения бактериальных клеток, а также хранить после получения бактериальных клеток и использовать в реакции синтеза амида по мере необходимости. Способ культивирования микроорганизма для получения бактериальных клеток может быть надлежащим образом выбран в зависимости от типа микроорганизма. Перед культивированием основной культуры можно проводить культивирование посевной культуры.

[0032]

Бактериальную клетку, обладающую нитрилгидратазной активностью, или ее переработанный материал можно использовать для периодической реакции и непрерывной реакции. В качестве реакционной системы может быть выбрана подходящая система, в которой используют, например, псевдоожиженный слой, неподвижный слой или суспендированный слой. Температура катализатора в реакционном растворе не имеет конкретных ограничений при условии, что она не препятствует операции смешивания водной среды и нитрильного соединения.

[0033]

(2) Нитрильное Соединение

В способе получения по настоящему изобретению нитрильное соединение, используемое в качестве исходного материала, не имеет конкретных ограничений при условии, что его можно превращать в амидное соединение с помощью катализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью. Примеры нитрильного соединения включают насыщенные алифатические нитрилы, такие как ацетонитрил, пропионитрил, сукцинонитрил, адипонитрил, гликолонитрил и лактонитрил; алифатические ненасыщенные нитрилы, такие как акрилонитрил и метакрилонитрил; ароматические нитрилы, такие как бензонитрил и фталодинитрил; а также гетероциклические нитрилы, такие как цианопиридин. Нитрильное соединение по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой такое нитрильное соединение, как ацетонитрил, пропионитрил, акрилонитрил, метакрилонитрил, н-бутиронитрил, изобутиронитрил, цианопиридин, глюконитрил и лактонитрил; и, в частности, более предпочтительно акрилонитрил, метакрилонитрил, ацетонитрил, цианопиридин, гликолонитрил и лактонитрил.

[0034]

Нитрильное соединение становится доступным в качестве коммерческого продукта, как правило, после стадии очистки. Например, акрилонитрил получают в промышленных масштабах методом аммоксидирования пропилена; циановое соединение, такое как синильная кислота, удаляют вместе с другими побочными продуктами путем дистилляции (очистки), проводимой после реакции.

[0035]

Однако в продукте содержится циановое соединение, которое не может быть полностью удалено путем дистилляции. Биокатализатор, обладающий нитрилгидратазной активностью, может быть поврежден циановым соединением, содержащимся в нитрильном соединении, в результате чего активность и скорость реакции нитрилгидратазы могут снижаться.

[0036]

По настоящему изобретению добавление (присутствие) альдегидного соединения в реакционный раствор, содержащий нитрильное соединение, может уменьшать количество цианового соединения, содержащегося в нитрильном соединении, и предотвращать повреждение циановым соединением биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью. Иными словами, скорость реакции превращения нитрильного соединения в амидное соединение, проводимой в присутствии биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью, повышается. Кроме того, инактивация биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью, при воздействии нитрильного соединения предположительно может быть подавлена.

[0037]

(3) Получение амидного соединения

По настоящему изобретению амидное соединение получают из нитрильного соединения с использованием биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью.

[0038]

Тип амидного соединения, получаемого по настоящему изобретению, не имеет конкретных ограничений, и амидное соединение может быть получено в соответствии с запланированным применением. В качестве исходного материала можно использовать нитрильное соединение, соответствующее желаемому амидному соединению.

[0039]

Примеры амидного соединения включают акриламид, никотинамид и метакриламид. Предпочтительно, используют акриламид.

[0040]

Если в качестве нитрильного соединения используют акрилонитрил, получают акриламид. Если в качестве нитрильного соединения используют метакрилонитрил, то получают метакриламид. Если в качестве нитрильного соединения используют цианопиридин, то получают никотинамид.

[0041]

Способ получения амидного соединения с использованием биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью, не имеет конкретных ограничений; например, можно использовать непрерывный реакционный процесс для непрерывного получения амидного соединения или периодический реакционный процесс для периодического получения амидного соединения.

[0042]

В случае непрерывного реакционного процесса амидное соединение может быть получено непрерывно без извлечения всей реакционной смеси из реактора путем непрерывного или периодического введения в реактор биокатализатора, воды и реагента, содержащего нитрильное соединение, одновременно с непрерывным или периодическим удалением из реактора реакционной смеси, содержащей образовавшееся амидное соединение.

[0043]

В случае периодического реакционного процесса амидное соединение может быть получено путем одновременной подачи всех реагентов в реактор и последующего проведения реакции, или подачи части реагентов в реактор и непрерывной или периодической подачи оставшейся части в реактор, с последующим проведением реакции.

[0044]

Примеры типа реактора включают различные типы реакторов, такие как реактор с мешалкой, реактор с неподвижным слоем, реактор с псевдоожиженным слоем, реактор с подвижным слоем, трубчатый реактор и башенный реактор. Эти реакторы могут быть использованы в отдельности или в сочетании. В случае использования нескольких реакторов, чем дальше в цепи реакторов размещен реактор, тем выше концентрация амидного соединения в выводимой реакционной смеси. Благодаря этому концентрацию получаемого в итоге амидного соединения можно регулировать количеством реакторов.

[0045]

В случае непрерывного проведения реакции с использованием множества реакторов, реактор, в который должны быть введены биокатализатор, обладающий нитрилгидратазной активностью, и нитрильное соединение, не ограничивается только реактором, расположенным в самом начале цепи реакторов, если, например, эффективность реакции существенно не снижается; другими словами, биокатализатор и нитрильное соединение могут быть введены в реакторы, расположенные после реактора в самом начале цепи реакторов.

[0046]

Из реагентов в качестве реагента используют воду для реакции гидратации нитрильного соединения, с получением амидного соединения.

[0047]

Примеры воды в качестве реагента включают воду или водный раствор, содержащий кислоту или соль, растворенную в воде. Примеры кислоты включают фосфорную кислоту, уксусную кислоту, лимонную кислоту и борную кислоту. Примеры соли включают натриевую соль, калиевую соль, аммониевую соль любой из кислот, упомянутых выше. Примеры воды в качестве реагента включают, но не ограничиваются этим, чистую воду, водопроводную воду, трис-буфер, фосфатный буфер, ацетатный буфер, цитратный буфер и боратный буфер. Значение pH (25°C) используемой в качестве реагента воды не имеет конкретных ограничений при условии, что реакция в присутствии биокатализатора может протекать эффективно. Например, значение рН может быть установлено в диапазоне от 4 до 10, предпочтительно от 5 до 9. Если значение рН составляет 4 или более, ферментативная активность биокатализатора может быть значительно повышена. При значении pH 10 или меньше инактивация биокатализатора может быть подавлена.

[0048]

Количество используемого биокатализатора может быть соответствующим образом выбрано в зависимости, например, от типа используемого биокатализатора и условий реакции. Например, активность биокатализатора, вводимого в реактор, предпочтительно регулируют таким образом, чтобы она находилась в диапазоне примерно от 50 до 500 ЕД на сухую клетку (1 мг) при температуре реакции 10°С. Единица «Ед» относится к количеству фермента для получения одного микромоля амидного соединения из нитрильного соединения в минуту и представляет собой величину, измеряемую с использованием нитрильного соединения, используемого для производства.

[0049]

К реагенту, используемому в реакции гидратации акрилонитрила, или к реакционной смеси во время или после реакции гидратации может быть добавлена водорастворимая соль монокарбоновой кислоты по меньшей мере одного типа, имеющая два или более атомов углерода, в качестве поддерживающей меры для стабилизации. Водорастворимая соль монокарбоновой кислоты может представлять собой либо соль насыщенной монокарбоновой кислоты, либо соль ненасыщенной монокарбоновой кислоты. Примеры насыщенной карбоновой кислоты включают уксусную кислоту, пропионовую кислоту и н-капроновую кислоту. Примеры ненасыщенной карбоновой кислоты включают акриловую кислоту, метакриловую кислоту и винилацетат. Иллюстративные примеры соли включают соль натрия, соль калия и соль аммония. Добавляемое количество водорастворимой соли монокарбоновой кислоты предпочтительно составляет от 20 до 5000 мг/кг в пересчете на кислоту относительно акриламида в реакционной смеси (водного раствора акриламида), которую необходимо получить в итоге.

[0050]

Количество используемого нитрильного соединения может быть соответствующим образом выбрано в зависимости, например, от типа используемого биокатализатора и условий реакции, масштаба реакции, а также непрерывного или периодического характера реакции.

[0051]

Температура реакции не имеет конкретных ограничений при условии, что биокатализатор может эффективно стимулировать реакцию. Температура составляет, например, 5-50°С, предпочтительно 10-40°С и более предпочтительно 15-35°С. Если температура реакции составляет 10°С или выше, реакционная активность биокатализатора может быть значительно повышена. Если температура реакции составляет 50°С или ниже, инактивация биокатализатора может быть подавлена.

[0052]

Время реакции не имеет конкретных ограничений и может быть соответствующим образом выбрано в зависимости, например, от процесса реакции, например, периодической реакции (порционной реакции) и непрерывной реакции, и масштаба реакции. Время реакции может составлять, например, 0,1-60 часов, 1-50 часов, и более предпочтительно 2-40 часов.

[0053]

В случае, когда амидное соединение получают с помощью непрерывного реакционного процесса, скорость жидкости при выводе реакционной смеси из реактора можно определять в соответствии со скоростями введения нитрильного соединения и биокатализатора, так чтобы продукт мог быть произведен непрерывно, без извлечения всего количества реакционной смеси из реактора.

[0054]

Для стабилизации реакции в нитрильное соединение или в реакционный раствор можно вносить добавки.

[0055]

Концентрация амидного соединения в водном растворе амидного соединения, получаемого по настоящему изобретению, может быть соответствующим образом выбрана в зависимости, например, от предполагаемого использования получаемого амидного соединения. Концентрация амидного соединения по отношению к общей массе водного раствора получаемого амидного соединения может составлять, например, 25-65%масс, предпочтительно 30-60%масс и более предпочтительно 35-55%масс. Если концентрация амидного соединения составляет 65%масс или менее, можно предотвращать осаждение кристаллов амидного соединения при нормальной температуре. Если концентрация амидного соединения составляет 25%масс или более, можно уменьшать объем резервуара для хранения или консервации, а также стоимость транспортировки.

[0056]

Амидное соединение, получаемое по настоящему изобретению, можно непосредственно использовать в реакции полимеризации или хранить до использования. Альдегидное соединение можно удалять по мере необходимости. При хранении амидного соединения в случае необходимости амидное соединение можно использовать путем внесения добавки, включающей ингибитор полимеризации и инициатор полимеризации.

[0057]

(4) Альдегидное соединение

По настоящему изобретению в способе получения амидного соединения из нитрильного соединения в присутствии биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью, реакцию превращения нитрильного соединения в амидное соединение проводят в присутствии альдегидного соединения.

[0058]

Альдегидное соединение по настоящему изобретению не имеет конкретных ограничений при условии, что может быть достигнут вышеупомянутый эффект. Примеры альдегидного соединения включают формальдегид, ацетальдегид, пропиональдегид, бутиральдегид, изобутиральдегид, малондиальдегид, пентаналь, изовалеральдегид, акролеин, кротональдегид, тиглиновый альдегид, глицеральдегид, гликольальдегид, фурфурол, бутандиаль, транс-2-гексеналь, глутаральдегид, гексаналь, гептаналь, октаналь, нонаналь, деканаль, паральдегид, бензальдегид, коричный альдегид, перилальдегид, ванилин, 1-нафтальдегид, фталевый альдегид, метиональ и (Z)-7-гексадеценаль.

[0059]

Примеры альдегидных соединений включают не только соединения, имеющие альдегидную группу (-CHO), но также соединения, образующие альдегидное соединение в воде или в растворе. Примеры таких альдегидных соединений включают глиоксаль (диальдегид щавелевой кислоты), параформальдегид, ацетальдегид, аммиак и гексаметилентетрамин.

[0060]

Из них предпочтительным является альдегидное соединение с молекулярной массой примерно 200 или менее, и более предпочтительным является альдегидное соединение с молекулярной массой примерно 100 или менее.

[0061]

Особенно предпочтительным альдегидным соединением является, например, формальдегид, ацетальдегид, пропиональдегид и бутиральдегид.

Следует отметить, что в спецификации термин «добавление» к реакционному раствору включает «обеспечение присутствия» в реакционном растворе.

[0062]

По настоящему изобретению количество альдегидного соединения, добавляемого в реакционный раствор, содержащий нитрильное соединение, не имеет конкретных ограничений при условии, что скорость реакции превращения нитрильного соединения в амидное соединение в присутствии биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью, может быть увеличена, или может быть подавлена инактивация биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью, когда катализатор подвергается воздействию нитрильного соединения.

[0063]

Количество (молярное соотношение) альдегидного соединения, добавляемого в реакционный раствор, относительно содержания цианового соединения в реакционном растворе составляет 0,9-15, предпочтительно 1,5-10,0 и более предпочтительно 2,0-6,0.

[0064]

Содержание цианового соединения в акрилонитриле можно определять, экстрагируя его щелочным раствором и подвергая экстракт титрованию азотнокислым серебром, или можно измерять методом абсорбционной фотометрии.

[0065]

Если количество (молярное соотношение) альдегида, которое может присутствовать в реакционном растворе, относительно содержания цианового соединения установлено равным 0,9 или более, скорость реакции превращения нитрильного соединения в амидное соединение в присутствие биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью, может быть повышена, или может быть подавлено снижение активности биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью, когда катализатор подвергается воздействию нитрильного соединения.

[0066]

Напротив, количество (молярное соотношение) альдегида, которое может присутствовать в реакционном растворе, относительно содержания цианового соединения устанавливают равным 15 или менее. Это связано с тем, что даже если альдегидное соединение добавляют в количестве (молярном соотношении) более 15, трудно улучшить эффект (добавления).

[0067]

Следует отметить, что в спецификации примеры цианового соединения включают соединения, содержащие циан или высвобождающие циан или ион циана в условиях реакции, такие как синильная кислота (HCN), цианид-ион (CN-), цианид натрия и цианид калия.

[0068]

Момент времени, в котором альдегидное соединение добавляют в реакционный раствор, содержащий нитрильное соединение, не имеет конкретных ограничений при условии, что может быть достигнут указанный выше эффект. Момент времени может быть до, в процессе (одновременно) и после воздействия нитрильного соединения на биокатализатор, обладающий нитрилгидратазной активностью (более конкретно, после инициирования ферментативной реакции нитрильного соединения биокатализатором).

[0069]

Предпочтительно, альдегидное соединение добавляют до того, как биокатализатор, обладающий нитрилгидратазной активностью, подвергается воздействию нитрильного соединения. Когда альдегидное соединение добавляют после начала ферментативной реакции, его следует добавлять не слишком поздно после начала реакции (чем раньше добавляют альдегидное соединение, тем лучше) для достижения более эффективных результатов.

[0070]

Способ добавления альдегидного соединения в реакционный раствор не имеет конкретных ограничений при условии, что альдегидное соединение желаемой концентрации присутствует в реакционном растворе. Альдегидное соединение может быть добавлено, например, в твердом состоянии или в состоянии раствора, когда альдегидное соединение растворено, например, в растворителе или воде для использования в реакции.

[0071]

(5) Повышение скорости реакции превращения нитрильного соединения в амидное соединение

Настоящее изобретение относится к способу повышения скорости ферментативной реакции, которая превращает нитрильное соединение в амидное соединение (при преобразовании нитрильного соединения в амидное соединение) в присутствии биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью, отличающемуся включением стадии добавления альдегидного соединения в реакционный раствор, содержащий нитрильное соединение. В качестве нитрильного соединения можно использовать по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из акрилонитрила, ацетонитрила, метакрилонитрила, цианопиридина, гликолонитрила и аланиннитрила.

[0072]

Сообщалось, что альдегид используют для предотвращения полимеризации акриламида (стабилизации) (WO 2011/102510), но впервые авторами настоящего изобретения было обнаружено, что альдегидное соединение предотвращает повреждение биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью, и повышает скорость реакции.

[0073]

В настоящем документе «повышение скорости реакции» означает, что скорость реакции является высокой в сравнении со случаем, когда альдегидное соединение отсутствует.

[0074]

Примеры способа измерения скорости реакции включают способ измерения количества нитрильного соединения, присутствующего в реакционной системе и уменьшенного в системе за определенное время, и способ измерения количества амидного соединения, увеличенного в реакционной системе за определенное время. В качестве метода измерения нитрильного соединения или амидного соединения можно использовать метод, широко известный в данной области, такой как газохроматографический анализ.

[0075]

(6) Подавление инактивации биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью

Предложен способ подавления инактивации биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью, отличающийся включением стадии добавления альдегидного соединения в реакционный раствор, содержащий нитрильное соединение, при получении амидного соединения из нитрильного соединения в присутствии биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью. В качестве нитрильного соединения можно использовать по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из акрилонитрила, ацетонитрила, метакрилонитрила, цианопиридина, гликолонитрила и аланиннитрила.

[0076]

Как указано выше, активность нитрилгидратазы чувствительна к воздействию примесей в реакционном растворе и к условиям реакции. В соответствии со способом по настоящему изобретению можно легко подавлять инактивацию нитрилгидратазы, без необходимости в дополнительной стадии или без влияния на качество амидного соединения.

[0077]

(7) Композиция для получения амидного соединения

Настоящее изобретение относится к композиции для получения амидного соединения, содержащей альдегидное соединение и по меньшей мере одно нитрильное соединение, выбранное из группы, состоящей из акрилoнитрила, ацетонитрила, метакрилoнитрила, цианопиридина, гликолoнитрила и лактонитрила.

[0078]

В композиции для получения амидного соединения по настоящему изобретению можно использовать альдегидное соединение, указанное в разделе (4) «Альдегидное соединение», в соответствии с описанием в этом разделе. Композицию используют в способе получения амидного соединения, описанном в разделе (3), и она обеспечивает эффективное получение амидного соединения.

[0079]

(8) Композиция катализатора для получения амидного соединения

Настоящее изобретение относится к композиции катализатора для получения амидного соединения, содержащей альдегидное соединение и биокатализатор, обладающий нитрилгидратазной активностью.

[0080]

В композиции катализатора для получения амидного соединения по настоящему изобретению альдегидное соединение и биокатализатор, обладающий нитрилгидратазной активностью, являются такими, как описано в разделе (4) «Альдегидное соединение» и разделе (1) «Биокатализатор, обладающий нитрилгидратазной активностью», соответственно.

[0081]

(9) Композиция амидного соединения

Настоящее изобретение относится к композиции амидного соединения, содержащей альдегидное соединение и циановое соединение.

[0082]

В первом варианте осуществления композиция амидного соединения содержит амидное соединение и альдегидное соединение, и отличается тем, что концентрация цианового соединения, содержащегося в амидном соединении, составляет 0,2 промилле или более. Циановое соединение и амидное соединение могут присутствовать отдельно или быть связанными друг с другом. Концентрацию цианового соединения определяют как концентрацию до добавления альдегидного соединения.

[0083]

Во втором варианте осуществления композиция амидного соединения содержит амидное соединение и соединение, в котором циановое соединение связано с альдегидным соединением.

ПРИМЕРЫ

[0084]

Далее настоящее изобретение будет более подробно описано посредством примеров, но настоящее изобретение не ограничивается этими примерами.

Следует отметить, что «%» в спецификации означает «%масс».

[0085]

Пример 1

Получение бактериальных клеток Rhodococcus rhodochrous J-1 (FERMBP-1478)

Штамм Rhodococcus rhodochrous J-1 (FERMBP-1478), обладающий нитрилгидратазной активностью, культивировали в аэробных условиях в среде (рН 7,0), содержащей глюкозу (2,0%), мочевину (1,0%), пептон (0,5%), дрожжевой экстракт (0,3%) и хлорид кобальта (0,05%), при 30°С. Среду промывали 50 мМ фосфатным буфером (рН 7,0), с получением бактериальной суспензии (3% в пересчете на сухие клетки).

[0086]

Получение акрилонитрила, содержащего синильную кислоту в заданной концентрации

Стандартный раствор циана с концентрацией 1000 промилле (производства Hayashi Pure Chemical Ind., Ltd.) добавляли к акрилонитрилу категории «для промышленного использования» (производства Mitsubishi Chemical Corporation) таким образом, чтобы концентрация синильной кислоты становилась равной 2,1 промилле по массе.

[0087]

Метод измерения концентрации синильной кислоты

В пробирку добавляли 9,6 г чистой воды и 0,4 г акрилонитрила (производства Mitsubishi Chemical Corporation), и смесь выдерживали при 25°С в течение 30 минут. Затем добавляли CyaniVer.3, содержащийся в наборе для анализа HACH. Смесь встряхивали на вихревой мешалке в течение 30 секунд и оставляли на 30 секунд. Добавляли CyaniVer.4, и смесь встряхивали на вихревой мешалке в течение 10 секунд. Добавляли CyaniVer.5, и смесь встряхивали на вихревой мешалке в течение 2 минут.

[0088]

После отстаивания смеси при 25°С в течение 30 минут измеряли оптическую плотность смеси на абсорбционном фотометре (DR500001) (компании HACH). Измеренная концентрация синильной кислоты составляла 2,1 промилле.

[0089]

Получение акрилoнитрила, содержащего ацетальдегид

К акрилонитрилу категории «для промышленного использования» (производства Mitsubishi Chemical Corporation) добавляли ацетальдегидный реагент (производства FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) до достижения концентрации 10 промилле по массе.

[0090]

Реакция образования амида

В стеклянную емкость (внутренний объем: 13,5 мл) с крышкой вносили 3,15 г фосфатного буфера (pH 7,0) и 3,15 г разбавленного раствора бактериальных клеток, приготовленного путем разбавления бактериальных клеток, описанных выше, фосфатным буфером (рН 7,0) так, чтобы их исходная активность в реакционном растворе составляла 1460 Ед. Смесь перемешивали, поддерживая температуру на уровне 20°C. К смеси добавляли акрилонитрил (4,8 мл), содержащий 10 промилле ацетальдегида, полученный, как описано выше, для инициирования реакции. Через четыре часа собирали реакционный раствор и измеряли концентрацию акрилонитрила методом газовой хроматографии (колонка: PoraPack-PS (производство Waters Corporation), 1 м, 210°C, газ-носитель: гелий, детектор: ПИД).

[0091]

Пример 2

Повторяли ту же процедуру, что и в примере 1, за исключением того, что концентрация ацетальдегида в акрилонитриле была определена как 6,0 промилле.

[0092]

Пример 3

Повторяли ту же процедуру, что и в примере 1, за исключением того, что концентрация ацетальдегида в акрилонитриле была определена как 3,0 промилле.

[0093]

Пример 4

Повторяли ту же процедуру, что и в примере 1, за исключением того, что концентрация синильной кислоты в акрилoнитриле была определена как 1,1 промилле.

[0094]

Сравнительный пример 1

Повторяли ту же процедуру, что и в примере 1, за исключением того, что в акрилонитрил не добавляли ацетальдегид.

[0095]

Сравнительный пример 2

Повторяли ту же процедуру, что и в примере 1, за исключением того, что концентрация синильной кислоты в акрилoнитриле была определена как 1,1 промилле, и в акрилонитрил не добавляли ацетальдегид.

[0096]

В Таблице 1 приведено соотношение концентрации акрилонитрила через 4 часа после начала реакции и концентрации в случае без добавления альдегидного соединения. Соотношение концентраций можно определять по следующей формуле:

Соотношение концентраций [%]=(концентрация акрилонитрила в случае добавления альдегида/концентрация акрилонитрила без добавления альдегида) × 100

Следует отметить, что в случае соединения, образующего альдегидное соединение в воде или водном растворе, соотношение альдегид/циан рассчитывали на основе молярного числа альдегидного соединения, образующегося в воде или водном растворе.

[0097]

Таблица 1 Концентрация синильной кислоты в акрилoнитриле Концентрация ацетальдегида в акрилoнитриле Ацетальдегид/циан
[моль/моль] Соотношение концентраций
(4 час) [промилле] [промилле] [-] [%] Пример 1 2,1 10 2,9 38,8 Пример 2 2,1 6 1,8 76,1 Пример 3 2,1 3 0,9 92,5 Пример 4 1,1 10 5,6 9,8

[0098]

В примерах, где добавляли ацетальдегид, в сравнении со сравнительным примером, где ацетальдегид не добавляли, даже если концентрация синильной кислоты составляла 2,1 промилле или 1,1 промилле, концентрация акрилонитрила была низкой. Это послужило доказательством того, что скорость реакции превращения акрилонитрила в амидное соединение является высокой.

[0099]

Экспериментальный пример 1

Влияние следующих соединений на реакцию образования амидного соединения оценивали в соответствии с примером 1.

№1: формальдегид (30,03), №2: ацетальдегид (44,05), №3: пропиональдегид (58,08), №4: бутиральдегид (72,11), №5: гексаналь (100,16), №6: гептаналь (114,18), №7: октаналь (128,21), №8: нонаналь (142,24), №9: деканаль (156,27), №10: муравьиная кислота (46,03), №11: диальдегид щавелевой кислоты (58,04), №12: мезоэритрит (122,12), №13: паральдегид (132,16), №14: параформальдегид (30,03 x n), №15: бензальдегид (106,12), №16: коричный альдегид (132,16), № 17: перилальдегид (150,22), № 18: ванилин (152,15), № 19: ацетальдегид-аммиак (183,25), № 20: гексаметилентетрамин (140,19).

Значение в скобках представляет молекулярную массу. (г/моль).

Соединения №№ 11, 14, 19, 20: альдегидное соединение образуется в воде.

[0100]

Акрилонитрил был получен таким образом, чтобы концентрация синильной кислоты составляла 2,0 промилле.

[0101]

В стеклянную емкость (внутренний объем: 13,5 мл) с крышкой вносили 1,00 г разбавленного раствора бактериальных клеток, приготовленного путем разбавления бактериальных клеток, описанных выше, фосфатным буфером (рН 7,0) так, чтобы их исходная активность в реакционном растворе составляла 1840 Ед. Добавляли разбавленный раствор, содержащий альдегидное соединение, разбавленное фосфатным буфером (рН 7,0) для получения концентрации 5 или 10 промилле в реакционном растворе, и, наконец, добавляли фосфатный буфер (рН 7,0) для достижения общего количества 6,2 г. Полученный раствор перемешивали, поддерживая его температуру на уровне 25°С. К этому раствору добавляли акрилонитрил (4,8 мл (эквивалент акриламида 50%, 38%масс)) для инициирования реакции. Через 3,5, 4,5, 5,0 и 6,0 часов реакционный раствор собирали и измеряли концентрацию акрилонитрила методом газовой хроматографии (колонка: PoraPack-PS (производство Waters Corporation), 1 м, 210°С, газ-носитель: гелий, детектор: ПИД).

[0102]

В Таблице 2 приведено соотношение концентрации акрилонитрила через 3,5 часа и 6 часов после начала реакции и концентрации в случае без добавления альдегидного соединения. Соотношение концентраций можно определять по следующей формуле:

Соотношение концентраций [%]=(концентрация акрилонитрила в случае добавления альдегида/концентрация акрилонитрила без добавления альдегида) × 100

Следует отметить, что в случае соединения, образующего альдегидное соединение в воде или водном растворе, соотношение альдегид/циан рассчитывали на основе молярного числа альдегидного соединения, образующегося в воде или водном растворе.

[0103]

[0104]

Что касается альдегидных соединений, за исключением муравьиной кислоты, мезоэритрита и паральдегида, было подтверждено, что концентрация акрилонитрила снижается, а скорость реакции превращения нитрильного соединения в амидное соединение повышается в случае добавления альдегидного соединения по сравнению со случаем без добавления альдегидного соединения.

[0105]

Пример 5

Получение трансформанта, содержащего нитрилгидратазу из штамма Rhodococcus Rhodochrous M8

(1) Получение хромосомной ДНК из штамма Rhodococcus Rhodochrous M8 (далее именуемого штаммом M8)

Штамм М8 (SU1731814) доступен в Российской коллекции микроорганизмов ИБФМ (ВКПМ S-926).

[0106]

Культуру штамма М8 встряхивали в среде (рН 7,0) из 100 мл MYK (0,5% полипептона, 0,3% дрожжевого экстракта Bacto, 0,3% солодового экстракта Bacto, 0,2% K₂HPO₄, 0,2% K₂HPO₄) при 30°C в течение 72 часов. Культуральный раствор центрифугировали. Собранные бактериальные клетки суспендировали в 4 мл солевого раствора-ЭДТА (0,1 М ЭДТА, 0,15 М NaCl (рН 8,0)). К суспензии добавляли лизоцим (8 мг). После встряхивания при 37°С в течение одного-двух часов суспензию замораживали при -20°С.

[0107]

Затем к суспензии при встряхивании осторожно добавляли 10 мл раствора Трис-SDS (1% SDS, 0,1 М NaCl, 0,1 М Трис-HCl (pH 9,0)). Далее к суспензии добавляли протеиназу К (производства Merck) (конечная концентрация 0,1 мг), и смесь встряхивали при 37°С в течение одного часа. Затем добавляли равное количество ТЭ-насыщенного фенола. После перемешивания смеси (ТЭ: 10 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТА (pH 8,0)) ее центрифугировали. Собирали верхний слой и добавляли двойной объем этанола. ДНК скручивали (собирали) стеклянной палочкой. Затем ДНК последовательно центрифугировали с 90%, 80% и 70% этанолом для удаления фенола.

[0108]

Затем ДНК растворяли в 3 мл ТЭ-буферного раствора и добавляли туда раствор рибонуклеазы А (обработанный нагреванием при 100°С в течение 15 минут) до получения концентрации 10 мкг/мл. Смесь встряхивали при 37°С в течение 30 минут. Далее добавляли протеиназу К (производства Merck), и смесь встряхивали при 37°С в течение 30 минут. К этой смеси добавляли равный объем ТЭ-насыщенного фенола. После центрифугирования смеси верхний слой и нижний слой разделяли.

[0109]

К верхнему слою дополнительно добавляли равный объем ТЭ-насыщенного фенола. После центрифугирования смеси верхний слой и нижний слой разделяли. Эту процедуру повторяли еще раз. После этого к верхнему слою добавляли такой же объем хлороформа (содержащего 4% изоамилового спирта). После центрифугирования смеси извлекали верхний слой. Затем к верхнему слою добавляли двойной объем этанола и извлекали ДНК, собирая ее на стеклянную палочку, для получения хромосомной ДНК.

[0110]

(2) Получение плазмиды, экспрессирующей нитрилгидратазу из штамма М8

Ген нитрилгидратазы (SEQ ID NO: 5), полученный из штамма М8, описан в не патентной литературе (Veiko, V.P. et al., Cloning, nucleotide sequence of nitrile hydratase gene from Rhodococcus rhodochrous M8, Biotekhnologiia (Mosc.) Аминокислотные последовательности субъединицы β, субъединицы α и активатора приведены в SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, соответственно. Используя следующие праймеры (SEQ ID NO: 1, 2), которые были синтезированы на основе этой информации о последовательности, и геномную ДНК штамма М8, используемую в качестве матрицы, проводили ПЦР в следующих условиях реакции.

[0111]

Праймеры:

M8-1: 5'-GGTCTAGAATGGATGGTATCCACGACACAGGC-3' (SEQ ID NO: 1)

M8-2: 5'-cccctgcaggtcagtcgatgatggccatcgattc-3' (SEQ ID NO: 2)

[0112]

Состав реакционного раствора:

ДНК-матрица (геномная ДНК штамма M8) 1 мкл Праймер M8-1 (SEQ ID NO: 15) 0,5 мкл Праймер M8-2 (SEQ ID NO: 16) 0,5 мкл Стерилизованная вода 8 мкл PrimeSTAR (Takara Bio Inc.) 10 мкл Общее количество 20 мкл

[0113]

Температурный цикл:

Цикл, состоящий из реакции при 98°С в течение 10 секунд, реакции при 55°С в течение 5 секунд и реакции при 72°С в течение 30 секунд, повторяли 30 раз.

[0114]

Полученную плазмидную ДНК расщепляли рестриктазами XbaI и Sse8387I и подвергали электрофорезу в 0,7% агарозном геле. Фрагмент гена нитрилгидратазы (SEQ ID NO: 5) длиной 1,6 т.п.н. извлекали и вводили в сайт XbaI-Sse8387I плазмиды pSJ042. Полученная плазмида была обозначена как pSJ-N01A. Следует отметить, что pSJ042 была получена в виде плазмиды, экспрессирующей нитрилгидратазу штамма J1 в Rhodococcus в соответствии со способом, раскрытым в выложенном патенте Японии № 2008-154552. Плазмида pSJ023, использованная для получения pSJ042, была депонирована в виде трансформанта ATCC12674/pSJ023 (FERM BP-6232) в Национальном институте передовой промышленной науки и технологии, Центр патентных биологических депозитов (Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) 4 марта 1997 года.

[0115]

(3) Получение трансформанта ATCC12674

Бактериальные клетки штамма Rhodococcus rhodochrous ATCC12674 в фазе логарифмического роста собирали центрифугированием, трижды промывали стерилизованной водой, охлажденной на льду, и суспендировали в стерилизованной воде для получения компетентных клеток.

[0116]

Плазмидную ДНК (pSJ-N01A) (1 мкл), полученную, как указано выше, и компетентные клетки ATCC12674 (10 мкл) смешивали и охлаждали на льду в течение 30 минут. Суспензию ДНК и бактериальных клеток помещали в кюветы и подвергали воздействию электрического импульса Gene Pulser (BIO RAD) при 20 кВ/см, 200 Ом. Суспензию, обработанную электрическим импульсом, выдерживали при охлаждении льдом в течение 10 минут и подвергали тепловому шоку при температуре 37°С в течение 10 минут. К полученной суспензии добавляли 500 мкл среды MYK (0,5% полипептона, 0,3% дрожжевого экстракта Bacto, 0,3% солодового экстракта Bacto, 0,2% K₂HPO₄, 0,2% K₂HPO₄). Смесь выдерживали при 30°С в течение 24 часов, наносили на агаровую среду MYK, содержащую 10 мкг/мл канамицина, и культивировали при 30°С в течение трех дней.

[0117]

Проверяли наличие плазмиды в колониях для получения трансформанта (ATCC12674/pSJ-N01A).

[0118]

(4) Культивирование рекомбинантной бактерии

Трансформант (ATCC12674/pSJ-N01A), полученный на описанной выше стадии, инокулировали в среду MYK (50 мкг/мл канамицина) и культивировали со встряхиванием при 30°C в течение двух дней. Культивируемый трансформант (1%) инокулировали в среду GGPK (1,5% глюкозы, 1% глутамата натрия, 0,1% дрожжевого экстракта, 0,05% K₂HPO₄, 0,05% KH₂PO₄, 0,05% Mg₂O₄·7H₂O, 1% CoCl₂, 0,1% мочевины, 50 мкг/мл канамицина, рН 7,2). Встряхивание культуры проводили при 30°C в течение трех дней, и бактериальные клетки собирали центрифугированием. Затем бактериальные клетки промывали 100 мМ фосфатным буфером (рН 7,0) и готовили бактериальную суспензию.

[0119]

(5) Оценка влияния на реакцию образования амидного соединения

В соответствии с примером 1 оценивали влияние пропиональдегида на реакцию образования амидного соединения трансформантом, полученным из штамма М8 (ATCC12674/pSJ-N01A).

[0120]

Акрилонитрил получали таким образом, чтобы концентрация синильной кислоты составляла 2,0 промилле.

[0121]

В стеклянную емкость (внутренний объем: 13,5 мл) с крышкой вносили 1,00 г разбавленного раствора бактериальных клеток, приготовленного путем разбавления бактериальных клеток, описанных выше, фосфатным буфером (pH 7,0) таким образом, чтобы исходное количество бактериальных клеток в реакционном растворе составляло 5,6 мг; и добавляли разбавленный раствор, полученный путем разбавления каждого альдегидного соединения фосфатным буфером (рН 7,0) для достижения концентрации 10 промилле, 25 промилле или 50 промилле в реакционном растворе; и, наконец, добавляли фосфатный буфер (рН 7,0) до общего количества 9,0 г. Полученный раствор перемешивали, поддерживая его температуру на уровне 25°С. К этому раствору добавляли акрилонитрил (1,0 г) для инициирования реакции. Через шесть часов реакционный раствор собирали и измеряли концентрацию акрилонитрила методом газовой хроматографии (колонка: PoraPack-PS (производства Waters Corporation), 1 м, 210°C, газ-носитель: гелий, детектор: ПИД).

[0122]

В Таблице 3 приведено соотношение концентрации акрилонитрила через 6 часов после начала реакции и концентрации в случае без добавления альдегидного соединения. Соотношение концентраций можно определять по следующей формуле:

Соотношение концентраций [%]=(концентрация акрилонитрила в случае добавления альдегида/концентрация акрилонитрила без добавления альдегида) × 100

Следует отметить, что в случае соединения, образующего альдегидное соединение в воде или водном растворе, соотношение альдегид/циан рассчитывали на основе молярного числа альдегидного соединения, образующегося в воде или водном растворе.

[0123]

Таблица 3 Концентрация пропиональдегида в реакционном растворе [промилле] Пропиональдегид/циан [моль/моль] Соотношение концентраций (6 час) [-] [%] 10 22,9 82,7 25 57,1 70,4 50 114,3 60,0

[0124]

В трансформанте, полученном из штамма М8 (ATCC12674/pSJ-N01A), концентрация акрилонитрила ниже в случае добавления альдегидного соединения по сравнению со случаем, когда альдегидное соединение не добавляли. На основании этого было подтверждено, что скорость реакции превращения нитрильного соединения в амидное соединение повышается при добавлении альдегидного соединения.

[0125]

Пример 6

(1) Получение трансформанта DN1, экспрессирующего нитрилгидратазу из штамма Pseudonocardia Thermophila JCM3095

Плазмида pPT-DB1 представляет собой плазмиду, содержащую ген нитрилгидратазы из штамма Pseudonocardia thermophila JCM3095 (далее именуемого штаммом JCM3095), которая описана в выложенном патенте Японии № H9-275978 и депонирована в виде трансформанта, полученного в Escherichia coli HB101 (штамм MT-10822), в Национальном институте передовой промышленной науки и технологии (Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan).

[0126]

Ген нитрилгидратазы (SEQ ID NO: 9) из штамма JCM3095 раскрыт в выложенном патенте Японии № H9-275978. Аминокислотные последовательности β-субъединицы, α-субъединицы и активатора приведены в SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12 соответственно. Используя следующие праймеры (SEQ ID NO: 3, 4), синтезированные на основе этой информации о последовательности, и pPT-DB1 в качестве матрицы, проводили ПЦР в следующих условиях реакции. pRT-DB1, используемый в качестве матрицы, был получен из штамма MT-10822 общепринятым способом.

[0127]

Праймеры:

PSN-1: 5'-GGTCTAGAATGAACGGCGTGTACGACGTCGGC-3' (SEQ ID NO: 3)

PSN-2: 5'-ccCCTGCAGGTCAGGACCGCACGGCCGGGTGGAC-3' (SEQ ID NO: 4)

[0128]

Состав реакционного раствора:

ДНК-матрица (pPT-DB1) 1 мкл Праймер PSN-1 (SEQ ID NO: 17) 0,5 мкл Праймер PSN-2 (SEQ ID NO: 18) 0,5 мкл Стерилизованная вода 8 мкл PrimeSTAR (Takara Bio Inc.) 10 мкл Общее количество 20 мкл

[0129]

Температурный цикл:

Цикл, состоящий из реакции при 98°С в течение 10 секунд, реакции при 55°С в течение 5 секунд и реакции при 72°С в течение 30 секунд, повторяли 30 раз.

[0130]

Плазмиду получали с использованием ПЦР-продукта (SEQ ID NO: 10), полученного таким же образом, как в примере 5 (2), и обозначали как pSJ-N02A. Полученную плазмиду вводили в ATCC12674 так же, как в примере 5 (3), с получением трансформанта (ATCC12674/pSJ-N02A).

[0131]

(4) Культивирование рекомбинантной бактерии

Трансформант (ATCC12674/pSJ-N02A), полученный на описанной выше стадии, инокулировали в среду MYK (50 мкг/мл канамицина) и культивировали со встряхиванием при 30°C в течение двух дней. Культивируемый трансформант (1%) инокулировали в среду GGPK (1,5% глюкозы, 1% глутамата натрия, 0,1% дрожжевого экстракта, 0,05% K₂HPO₄, 0,05% KH₂PO₄, 0,05% Mg₂O₄·7H₂O, 1% CoCl₂, 0,1% мочевины, 50 мкг/мл канамицина, рН 7,2). Встряхивание культуры проводили при 30°C в течение трех дней, и бактериальные клетки собирали центрифугированием. Затем бактериальные клетки промывали 100 мМ фосфатным буфером (рН 7,0) и готовили бактериальную суспензию.

[0132]

(5) Оценка влияния на реакцию образования амидного соединения

В соответствии с примером 1 оценивали влияние пропиональдегида на реакцию образования амидного соединения трансформантом (ATCC12674/pSJ-N02A).

[0133]

Акрилонитрил получали таким образом, чтобы концентрация синильной кислоты составляла 2,0 промилле.

[0134]

В стеклянную емкость (внутренний объем: 13,5 мл) с крышкой вносили 1,00 г разбавленного раствора бактериальных клеток, приготовленного путем разбавления бактериальных клеток, описанных выше, фосфатным буфером (pH 7,0) таким образом, чтобы исходное количество бактериальных клеток в реакционном растворе составляло 4,1 мг; и добавляли разбавленный раствор, полученный путем разбавления каждого альдегидного соединения фосфатным буфером (рН 7,0) для достижения концентрации 7 промилле в реакционном растворе; и, наконец, добавляли фосфатный буфер (рН 7,0) до общего количества 8,5 г. Полученный раствор перемешивали, поддерживая его температуру на уровне 25°С. К этому раствору добавляли акрилонитрил (1,5 г) для инициирования реакции. Через шесть часов реакционный раствор собирали и измеряли концентрацию акрилонитрила методом газовой хроматографии (колонка: PoraPack-PS (производства Waters Corporation), 1 м, 210°C, газ-носитель: гелий, детектор: ПИД).

[0135]

В Таблице 4 приведено соотношение концентрации акрилонитрила через 6 часов после начала реакции и концентрации в случае без добавления альдегидного соединения. Соотношение концентраций можно определять по следующей формуле:

Соотношение концентраций [%]=(концентрация акрилонитрила в случае добавления альдегида/концентрация акрилонитрила без добавления альдегида) × 100

Следует отметить, что в случае соединения, образующего альдегидное соединение в воде или водном растворе, соотношение альдегид/циан рассчитывали на основе молярного числа альдегидного соединения, образующегося в воде или водном растворе.

[0136]

Таблица 4 Концентрация пропиональдегида в реакционном растворе [промилле] Пропиональдегид/циан [моль/моль] Соотношение концентраций (6 час) [-] [%] 7 10,7 33,3

[0137]

Концентрация акрилонитрила ниже в случае добавления альдегидного соединения по сравнению со случаем, когда альдегидное соединение не добавляли. На основании этого было подтверждено, что скорость реакции превращения нитрильного соединения в амидное соединение повышается при добавлении альдегидного соединения.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

[0138]

Настоящее изобретение применимо в биологическом промышленном производстве амидного соединения, такого как акриламид и метакриламид, из нитрильного соединения.

[0139]

Все публикации, патенты и патентные заявки, цитированные в спецификации, включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0140]

SEQ ID NO: 1: праймер M8-1

SEQ ID NO: 2: праймер M8-2

SEQ ID NO: 3: праймер PSN-1

SEQ ID NO: 4: праймер PSN-2

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Mitsubishi Chemical Corporation

<120> Повышение реакционной способности нитрилгидратазы с помощью альдегида

<130> PMC-9027WO

<150> JP2021-19409

<151> 2021-02-10

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер M8-1

<400> 1

ggtctagaat ggatggtatc cacgacacag gc 32

<210> 2

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер M8-2

<400> 2

cccctgcagg tcagtcgatg atggccatcg attc 34

<210> 3

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер PSN-1

<400> 3

ggtctagaat gaacggcgtg tacgacgtcg gc 32

<210> 4

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер PSN-2

<400> 4

cccctgcagg tcaggaccgc acggccgggt ggac 34

<210> 5

<211> 1626

<212> ДНК

<213> Rhodococcus rhodochrous M8

<400> 5

atggatggta tccacgacac aggcggcatg accggatacg gaccggtccc ctatcagaag 60

gacgagccct tcttccacta cgagtgggag ggtcggaccc tgtcgattct gacctggatg 120

catctcaagg gcatgtcgtg gtgggacaag tcgcggttct tccgggagtc gatggggaac 180

gaaaactacg tcaacgagat tcgcaactcg tactacaccc actggctgag tgcggcagaa 240

cgtatcctcg tcgccgacaa gatcatcacc gaagaagagc gaaagcaccg tgtgcaggag 300

atcctcgagg gtcggtacac ggacaggaac ccgtcgcgga agttcgatcc ggccgagatc 360

gagaaggcga tcgaacggct tcacgagccc cactccctag cacttccagg agcggagccg 420

agtttctccc tcggtgacaa ggtcaaagtg aagaatatga acccgctggg acacacacgg 480

tgcccgaaat atgtgcggaa caagatcggg gaaatcgtca cctcccacgg ctgccagatc 540

tatcccgaga gcagctccgc cggcctcggc gacgatcccc gcccgctcta cacggtcgcg 600

ttttccgccc aggaactgtg gggcgacgac ggaaacggga aagacgtagt gtgcgtcgat 660

ctctgggaac cgtacctgat ctctgcgtga aaggaatacg atagtgagcg agcacgtcaa 720

taagtacacg gagtacgagg cacgtaccaa ggcaatcgaa actttgctgt acgagcgagg 780

gctcatcacg cccgccgcgg tcgaccgagt cgtttcgtac tacgagaacg agatcggccc 840

gatgggcggt gccaaggtcg tggcgaagtc ctgggtggac cctgagtacc gcaagtggct 900

cgaagaggac gcgacggccg cgatggcgtc attgggctat gccggtgagc aggcacacca 960

aatttcggcg gtcttcaacg actcccaaac gcatcacgtg gtggtgtgca ctctgtgttc 1020

gtgctatccg tggccggtgc ttggtctccc gcccgcctgg tacaagagca tggagtaccg 1080

gtcccgagtg gtagcggacc ctcgtggagt gctcaagcgc gatttcggtt tcgacatccc 1140

cgatgaggtg gaggtcaggg tttgggacag cagctccgaa atccgctaca tcgtcatccc 1200

ggaacggccg gccggcaccg acggttggtc cgaggacgag ctggcgaagc tggtgagtcg 1260

ggactcgatg atcggtgtca gtaatgcgct cacaccccag gaagtgatcg tatgagtgaa 1320

gacacactca ctgatcggct cccggcgact gggaccgccg caccgccccg cgacaatggc 1380

gagcttgtat tcaccgagcc ttgggaagca acggcattcg gggtcgccat cgcgctttcg 1440

gatcagaagt cgtacgaatg ggagttcttc cgacagcgtc tcattcactc catcgctgag 1500

gccaacggtt gcgaggcata ctacgagagc tggacaaagg cgctcgaggc cagcgtggtc 1560

gactcggggc tgatcagcga agatgagatc cgcgagcgca tggaatcgat ggccatcatc 1620

gactga 1626

<210> 6

<211> 229

<212> БЕЛОК

<213> Rhodococcus rhodochrous M8

<400> 6

Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val

1 5 10 15

Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg

20 25 30

Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Met Ser Trp Trp

35 40 45

Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val

50 55 60

Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu

65 70 75 80

Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His

85 90 95

Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Asn Pro Ser

100 105 110

Arg Lys Phe Asp Pro Ala Glu Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His

115 120 125

Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu

130 135 140

Gly Asp Lys Val Lys Val Lys Asn Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg

145 150 155 160

Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys Ile Gly Glu Ile Val Thr Ser His

165 170 175

Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp

180 185 190

Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly

195 200 205

Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro

210 215 220

Tyr Leu Ile Ser Ala

225

<210> 7

<211> 203

<212> БЕЛОК

<213> Rhodococcus rhodochrous M8

<400> 7

Met Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys

1 5 10 15

Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala

20 25 30

Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly

35 40 45

Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys

50 55 60

Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala

65 70 75 80

Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr

85 90 95

His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val

100 105 110

Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg

115 120 125

Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp

130 135 140

Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile

145 150 155 160

Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser

165 170 175

Glu Asp Glu Leu Ala Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val

180 185 190

Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val

195 200

<210> 8

<211> 104

<212> БЕЛОК

<213> Rhodococcus rhodochrous M8

<400> 8

Met Ser Glu Asp Thr Leu Thr Asp Arg Leu Pro Ala Thr Gly Thr Ala

1 5 10 15

Ala Pro Pro Arg Asp Asn Gly Glu Leu Val Phe Thr Glu Pro Trp Glu

20 25 30

Ala Thr Ala Phe Gly Val Ala Ile Ala Leu Ser Asp Gln Lys Ser Tyr

35 40 45

Glu Trp Glu Phe Phe Arg Gln Arg Leu Ile His Ser Ile Ala Glu Ala

50 55 60

Asn Gly Cys Glu Ala Tyr Tyr Glu Ser Trp Thr Lys Ala Leu Glu Ala

65 70 75 80

Ser Val Val Asp Ser Gly Leu Ile Ser Glu Asp Glu Ile Arg Glu Arg

85 90 95

Met Glu Ser Met Ala Ile Ile Asp

100

<210> 9

<211> 1747

<212> ДНК

<213> Pseudonocardia thermophila JCM3095

<400> 9

atgaacggcg tgtacgacgt cggcggcacc gatgggctgg gcccgatcaa ccggcccgcg 60

gacgaaccgg tcttccgcgc cgagtgggag aaggtcgcgt tcgcgatgtt cccggcgacg 120

ttccgggccg gcttcatggg cctggacgag ttccggttcg gcatcgagca gatgaacccg 180

gccgagtacc tcgagtcgcc gtactactgg cactggatcc gcacctacat ccaccacggc 240

gtccgcaccg gcaagatcga tctcgaggag ctggagcgcc gcacgcagta ctaccgggag 300

aaccccgacg ccccgctgcc cgagcacgag cagaagccgg agttgatcga gttcgtcaac 360

caggccgtct acggcgggct gcccgcaagc cgggaggtcg accgaccgcc caagttcaag 420

gagggcgacg tggtgcggtt ctccaccgcg agcccgaagg gccacgcccg gcgcgcgcgg 480

tacgtgcgcg gcaagaccgg gacggtggtc aagcaccacg gcgcgtacat ctacccggac 540

accgccggca acggcctggg cgagtgcccc gagcacctct acaccgtccg cttcacggcc 600

caggagctgt gggggccgga aggggacccg aactccagcg tctactacga ctgctgggag 660

ccctacatcg agctcgtcga cacgaaggcg gccgcggcat gaccgagaac atcctgcgca 720

agtcggacga ggagatccag aaggagatca cggcgcgggt caaggccctg gagtcgatgc 780

tcatcgaaca gggcatcctc accacgtcga tgatcgaccg gatggccgag atctacgaga 840

acgaggtcgg cccgcacctc ggcgcgaagg tcgtcgtgaa ggcctggacc gacccggagt 900

tcaagaagcg tctgctcgcc gacggcaccg aggcctgcaa ggagctcggc atcggcggcc 960

tgcagggcga ggacatgatg tgggtggaga acaccgacga ggtccaccac gtcgtcgtgt 1020

gcacgctctg ctcctgctac ccgtggccgg tgctggggct gccgccgaac tggttcaagg 1080

agccgcagta ccgctcccgc gtggtgcgtg agccccggca gctgctcaag gaggagttcg 1140

gcttcgaggt cccgccgagc aaggagatca aggtctggga ctccagctcc gagatgcgct 1200

tcgtcgtcct cccgcagcgc cccgcgggca ccgacgggtg gagcgaggag gagctcgcca 1260

ccctcgtcac ccgcgagtcg atgatcggcg tcgaaccggc gaaggcggtc gcgtgagcgc 1320

cgaggcgaag gtccgcctga agcactgccc cacggccgag gaccgggcgg cggccgacgc 1380

gctgctcgcg cagctgcccg gcggcgaccg cgcgctcgac cgcggcttcg acgagccgtg 1440

gcagctgcgg gcgttcgcgc tggcggtcgc ggcgtgcagg gcgggccggt tcgagtggaa 1500

gcagctgcag caggcgctga tctcctcgat cggggagtgg gagcgcaccc acgatctcga 1560

cgatccgagc tggtcctact acgagcactt cgtcgccgcg ctggaatccg tgctcggcga 1620

ggaagggatc gtcgagccgg aggcgctgga cgagcgcacc gcggaggtct tggccaaccc 1680

gccgaacaag gatcaccatg gaccgcatct ggagcccgtc gcggtccacc cggccgtgcg 1740

gtcctga 1747

<210> 10

<211> 233

<212> БЕЛОК

<213> Pseudonocardia thermophila JCM3095

<400> 10

Met Asn Gly Val Tyr Asp Val Gly Gly Thr Asp Gly Leu Gly Pro Ile

1 5 10 15

Asn Arg Pro Ala Asp Glu Pro Val Phe Arg Ala Glu Trp Glu Lys Val

20 25 30

Ala Phe Ala Met Phe Pro Ala Thr Phe Arg Ala Gly Phe Met Gly Leu

35 40 45

Asp Glu Phe Arg Phe Gly Ile Glu Gln Met Asn Pro Ala Glu Tyr Leu

50 55 60

Glu Ser Pro Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Thr Tyr Ile His His Gly

65 70 75 80

Val Arg Thr Gly Lys Ile Asp Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln

85 90 95

Tyr Tyr Arg Glu Asn Pro Asp Ala Pro Leu Pro Glu His Glu Gln Lys

100 105 110

Pro Glu Leu Ile Glu Phe Val Asn Gln Ala Val Tyr Gly Gly Leu Pro

115 120 125

Ala Ser Arg Glu Val Asp Arg Pro Pro Lys Phe Lys Glu Gly Asp Val

130 135 140

Val Arg Phe Ser Thr Ala Ser Pro Lys Gly His Ala Arg Arg Ala Arg

145 150 155 160

Tyr Val Arg Gly Lys Thr Gly Thr Val Val Lys His His Gly Ala Tyr

165 170 175

Ile Tyr Pro Asp Thr Ala Gly Asn Gly Leu Gly Glu Cys Pro Glu His

180 185 190

Leu Tyr Thr Val Arg Phe Thr Ala Gln Glu Leu Trp Gly Pro Glu Gly

195 200 205

Asp Pro Asn Ser Ser Val Tyr Tyr Asp Cys Trp Glu Pro Tyr Ile Glu

210 215 220

Leu Val Asp Thr Lys Ala Ala Ala Ala

225 230

<210> 11

<211> 204

<212> БЕЛОК

<213> Pseudonocardia thermophila JCM3095

<400> 11

Met Thr Glu Asn Ile Leu Arg Lys Ser Asp Glu Glu Ile Gln Lys Glu

1 5 10 15

Ile Thr Ala Arg Val Lys Ala Leu Glu Ser Met Leu Ile Glu Gln Gly

20 25 30

Ile Leu Thr Thr Ser Met Ile Asp Arg Met Ala Glu Ile Tyr Glu Asn

35 40 45

Glu Val Gly Pro His Leu Gly Ala Lys Val Val Val Lys Ala Trp Thr

50 55 60

Asp Pro Glu Phe Lys Lys Arg Leu Leu Ala Asp Gly Thr Glu Ala Cys

65 70 75 80

Lys Glu Leu Gly Ile Gly Gly Leu Gln Gly Glu Asp Met Met Trp Val

85 90 95

Glu Asn Thr Asp Glu Val His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser

100 105 110

Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Asn Trp Phe Lys Glu

115 120 125

Pro Gln Tyr Arg Ser Arg Val Val Arg Glu Pro Arg Gln Leu Leu Lys

130 135 140

Glu Glu Phe Gly Phe Glu Val Pro Pro Ser Lys Glu Ile Lys Val Trp

145 150 155 160

Asp Ser Ser Ser Glu Met Arg Phe Val Val Leu Pro Gln Arg Pro Ala

165 170 175

Gly Thr Asp Gly Trp Ser Glu Glu Glu Leu Ala Thr Leu Val Thr Arg

180 185 190

Glu Ser Met Ile Gly Val Glu Pro Ala Lys Ala Val

195 200

<210> 12

<211> 144

<212> БЕЛОК

<213> Pseudonocardia thermophila JCM3095

<400> 12

Met Ser Ala Glu Ala Lys Val Arg Leu Lys His Cys Pro Thr Ala Glu

1 5 10 15

Asp Arg Ala Ala Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gln Leu Pro Gly Gly Asp

20 25 30

Arg Ala Leu Asp Arg Gly Phe Asp Glu Pro Trp Gln Leu Arg Ala Phe

35 40 45

Ala Leu Ala Val Ala Ala Cys Arg Ala Gly Arg Phe Glu Trp Lys Gln

50 55 60

Leu Gln Gln Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Glu Trp Glu Arg Thr His

65 70 75 80

Asp Leu Asp Asp Pro Ser Trp Ser Tyr Tyr Glu His Phe Val Ala Ala

85 90 95

Leu Glu Ser Val Leu Gly Glu Glu Gly Ile Val Glu Pro Glu Ala Leu

100 105 110

Asp Glu Arg Thr Ala Glu Val Leu Ala Asn Pro Pro Asn Lys Asp His

115 120 125

His Gly Pro His Leu Glu Pro Val Ala Val His Pro Ala Val Arg Ser

130 135 140

<---

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения амидного соединения из нитрильного соединения в присутствии биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью, включающий стадию воздействия на биокатализатор, обладающий нитрилгидратазной активностью, нитрильным соединением, и стадию добавления альдегидного соединения в реакционный раствор, содержащий нитрильное соединение, где альдегидное соединение добавляют в реакционный раствор до, после или одновременно с первой стадией. Причем нитрильное соединение представляет собой по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из акрилoнитрила, ацетонитрила, метакрилoнитрила, цианопиридина, гликолoнитрила и аланиннитрила, и биокатализатор, обладающий нитрилгидратазной активностью, представляет собой бактериальные клетки, содержащие нитрилгидратазу. Изобретение позволяет подавить инактивацию биокатализатора и повысить скорость реакции превращения нитрильного соединения в амидное соединение. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 4 табл., 6 пр.

1. Способ получения амидного соединения из нитрильного соединения в присутствии биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью, включающий

а) стадию воздействия на биокатализатор, обладающий нитрилгидратазной активностью, нитрильным соединением, и

b) стадию добавления альдегидного соединения в реакционный раствор, содержащий нитрильное соединение,

где альдегидное соединение добавляют в реакционный раствор до, после или одновременно со стадией а),

где нитрильное соединение представляет собой по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из акрилoнитрила, ацетонитрила, метакрилoнитрила, цианопиридина, гликолoнитрила и аланиннитрила, и где биокатализатор, обладающий нитрилгидратазной активностью, представляет собой бактериальные клетки, содержащие нитрилгидратазу.

2. Способ повышения скорости реакции, которая превращает нитрильное соединение в амидное соединение при получении амидного соединения из нитрильного соединения в присутствии биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью, включающий

а) стадию воздействия на биокатализатор, обладающий нитрилгидратазной активностью, нитрильным соединением, и

b) стадию добавления альдегидного соединения в реакционный раствор, содержащий нитрильное соединение, где альдегидное соединение добавляют в реакционный раствор до, после или одновременно со стадией а),

где нитрильное соединение представляет собой по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из акрилoнитрила, ацетонитрила, метакрилoнитрила, цианопиридина, гликолoнитрила и аланиннитрила, и где биокатализатор, обладающий нитрилгидратазной активностью, представляет собой бактериальные клетки, содержащие нитрилгидратазу.

3. Способ подавления снижения активности биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью, при получении амидного соединения из нитрильного соединения в присутствии биокатализатора, обладающего нитрилгидратазной активностью, включающий

а) стадию воздействия на биокатализатор, обладающий нитрилгидратазной активностью, нитрильным соединением, и

b) стадию добавления альдегидного соединения в реакционный раствор, содержащий нитрильное соединение,

где альдегидное соединение добавляют в реакционный раствор до, после или одновременно со стадией а),

где нитрильное соединение представляет собой по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из акрилoнитрила, ацетонитрила, метакрилoнитрила, цианопиридина, гликолoнитрила и аланиннитрила, и где биокатализатор, обладающий нитрилгидратазной активностью, представляет собой бактериальные клетки, содержащие нитрилгидратазу.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где отношение концентрации альдегидного соединения к концентрации цианового соединения в нитрильном соединении составляет 0,9-15 в молярном соотношении.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где биокатализатор, обладающий нитрилгидратазной активностью, представляет собой бактериальные клетки, содержащие нитрилгидратазу, полученную из представителя рода Rhodococcus или Pseudonocardia.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где альдегидное соединение представляет собой по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из формальдегида, ацетальдегида, пропиональдегида, бутиральдегида, изобутиральдегида, диальдегида щавелевой кислоты, малондиальдегида, пентаналя, изовалеральдегида, акролеина, кротональдегида, тиглинового альдегида, глицеральдегида, гликольальдегида, фурфурола, бутандиальдегида, транс-2-гексеналя, глутаральдегида, гексаналя, гептаналя, октаналя, нонаналя, деканаля, паральдегида, бензальдегида, коричного альдегида, перилальдегида, ванилина, 1-нафтоальдегида, фталевого альдегида, метионаля, (Z)-7-гексадеценаля, глиоксаля (диальдегида щавелевой кислоты), параформальдегида, ацетальдегид-аммиака и гексаметилентетрамина.

7. Способ по любому из пп. 1-6, который осуществляют путем применения композиции для получения амидного соединения, содержащей:

альдегидное соединение; и по меньшей мере одно нитрильное соединение, выбранное из группы, состоящей из акрилoнитрила, ацетонитрила, метакрилoнитрила, цианопиридина, гликолoнитрила и аланиннитрила.

8. Способ по любому из пп. 1-4, который осуществляют путем использования композиции катализатора для получения амидного соединения, содержащей альдегидное соединение и биокатализатор, обладающий нитрилгидратазной активностью.

9. Способ по любому из пп. 1-4, где клетки или бактериальные клетки представляют собой клетки или бактериальные клетки, химически обработанные для потери ими пролиферативной способности.