ШТАММ БАКТЕРИЙ RHODOCOCCUS AETHERIVORANS BKM AC-2610D - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ, СПОСОБ ЕГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКРИЛАМИДА Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C12N9/78 C12P13/00 C12R1/01 

Группа изобретений относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и касается:

- нового штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans с высокой активностью фермента нитрилгидратазы;

- способа его культивирования;

- способа получения концентрированных растворов акриламида с использованием клеток штамма в качестве биокатализатора.

Способность микроорганизмов трансформировать нитрилы карбоновых кислот в соответствующие амиды была описана в литературе еще в начале 70 годов XX века. Фермент нитрилгидратаза, катализирующий подобные реакции, присущ широкому кругу бактерий, относящихся к различным таксономическим группам. Практический интерес по рассматриваемой в данной заявке теме имеют представители рода Rhodococcus [патенты на изобретения ЕР №1689861, ЕР №0362829, US №5179014, JP №63137688, JP №1074996, JP №1171478, SU №1731814, RU №2053300, RU №2196822, RU №2223316, RU №2304165, RU №2385932, CN №101186911, CN №101892228, заявка на изобретение JP №2001069978]. Крупные химические и биотехнологические компании Японии, Кореи, Франции, России, Германии, США и Китая в качестве эффективных биокатализаторов в технологиях получения акриламида используют, в том числе, клетки штаммов данного рода.

Известен штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous М8, ВКПМ S-926 [авторское свидетельство на изобретение SU 1731814], выделенный из почвы производства акрилонитрила, с использованием в качестве селектирующего агента изобутиронитрила. Штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous М8, BRUM S-926 обладал активностью нитрилгидратазы, достигающей 140 ед/мг в отношении изобутиронитрила, 220 ед/мг в отношении ацетонитрила и 150 ед/мг в отношении акрилонитрила.

При культивировании на среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу, а в качестве индуктора - мочевину, данный штамм показывал нитрилгидратазную активность 357 ед/мг. Максимальная концентрация акриламида при использовании биомассы штамма в качестве биокатализатора не превышала 38%, что ограничивает его применение.

Несмотря на глубокие исследования процесса ферментного гидролиза нитрилов до соответствующих амидов и значительные успехи в области селекции штаммов-продуцентов нитрилгидратазы, потребность промышленности в новых биокатализаторах не уменьшается. Это связано, с одной стороны, с эффективностью и экологической безопасностью биотехнологий получения амидов, прежде всего акриламида, с другой - обусловлено высокой стоимостью уже ранее запатентованных штаммов и технологий. В связи с этим в последние годы были выделены новые микроорганизмы - продуценты фермента нитрилгидратазы.

Известен также штамм бактерий Rhodococcus erythropolis Е84 [патент на изобретение RU №2196822], который при выращивании на среде, не содержащей дорогостоящих компонентов, проявлял при 20-25°С активность фермента нитрилгидратазы 240-265 ед/мг, но урожай биомассы был невысоким (3.6 ед оптической плотности при длине волны 540 нм).

Известен также штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 - продуцент фермента нитрилгидратазы [патент на изобретение RU №2403280], активность фермента нитрилгидратазы которого составила 140 ед/мг при 25°С.

Недостатком данного штамма является наличие в среде его культивирования дорогостоящих, нестабильных по составу компонентов, таких как пептон и дрожжевой экстракт, и невысокая нитрилгидратазная активность. Для повышения активности требовалась дополнительная стадия удаления кислорода из культуральной жидкости и активация фермента в течение нескольких суток.

Наиболее близким заявляемому изобретению на новый штамм является штамм бактерий Rhodococcus ruber GT [патент изобретение RU №2223316]. Штамм бактерий Rhodococcus ruber GT отличается быстрым ростом на органоминеральной среде при высокой активности нитрилгидратазы, достигающей 330 ед/мг при 25°С в отношении акрилонитрила. Нитрилгидратаза штамма бактерий Rhodococcus ruber GT термостабильна, применяется для биотехнологического синтеза акриламида гидратацией акрилонитрила в водных растворах.

Однако в питательной среде для культивирования данного штамма содержатся токсичные компоненты.

В данной заявке патентуется также способ культивирования штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D.

Известен способ культивирования штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous J1 - продуцента нитрилгидратазы [патент на изобретение SU №1838408], который одним из первых стал использоваться в промышленности для получения акриламида. В культуральную среду добавляют мочевину или ее производные, используемые в качестве индуктора фермента, а также источник ионов кобальта - хлористый кобальт в концентрации от 5 до 15 мг/л.

При культивировании на данной среде, содержащей ионы кобальта и мочевину в качестве индуктора, штамм проявлял высокую удельную активность фермента нитрилгидратазы - 578 ед/мг.

Однако данный штамм при его культивировании требовал внесения в ростовую среду дорогостоящих компонентов, таких как витамины и пептон.

Известен также способ культивирования мутантного штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous М33, BRUM S-1268, описанный в патенте на изобретение RU №2053300. Данный штамм используют во многих странах как промышленный биокатализатор в процессах получения 30-45% растворов акриламида. Штамм при культивировании на среде без индуктора обладал активностью фермента нитрилгидратазы 457 ед/мг. Однако рост клеток был низким (0.8 г/л по сухой массе). Для получения значительных урожаев (39.5 г/л) активной биомассы (315 ед/мг) потребовалось внесение в питательную среду в процессе культивирования не только мочевины, но и кукурузного экстракта. Однако растительные экстракты, как правило, имеют нестабильный состав, что может приводить к колебанию нитрилгидратазной активности.

Кроме того, для промышленного получения растворов акриламида с концентрацией выше 45% требовалось увеличивать расход биокатализатора на 30% и более.

Наиболее близким к заявляемому изобретению на способ культивирования штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D является способ культивирования штамма бактерий Rhodococcus ruber GT, описанный в патенте на изобретение RU №2223316. Индукция нитрилгидратазы при осуществлении данного способа достигается при выращивании клеток Rhodococcus ruber GTm на минеральной среде, содержащей в качестве индуктора нитрилы или амиды органических кислот, например ацетонитрил или ацетамид, а в качестве источника углерода - глюкозу или другие коммерчески доступные субстраты.

Однако в среде культивирования данного штамма может присутствовать в качестве индуктора - ацетонитрил, который является токсичным, летучим, легко воспламеняемым соединением, имеющим значительную стоимость.

В данной заявке патентуется также способ получения акриламида.

Известен «Биотехнологический способ получения акриламида» [патент на изобретение RU №2468084]. Способ осуществляют путем гидратации акрилонитрила под действием водной суспензии биокатализатора - штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous М-8, ВКПМ S-926, обладающего нитрилгидратазной активностью. Водная суспензия биокатализатора содержит стабилизирующую добавку, в качестве которой используют полиакриловую кислоту в количестве 0.0015-0.015 мас.% и динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты в количестве 0.0005-0.003 мас.%.

Известен также «Усовершенствованный биотехнологический способ получения акриламида» [патент на изобретение RU №2146291]. Для осуществления способа часть акрилонитрила растворяют в водопроводной или дистиллированной воде с рН 6,8-7,8. Затем прибавляют часть биокатализатора, представляющего собой концентрированную водную суспензию биомассы штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous М8, BRUM S-926 или Rhodococcus rhodochrous М33, ВКПМ S-1268. Каждую следующую порцию акрилонитрила растворяют в реакционной смеси после того, как ранее добавленный субстрат полностью или почти полностью вступит в реакцию. Затем добавляют очередную порцию биокатализатора. Процесс проводят при постоянном перемешивании, поддерживая температуру реакции в интервале 20-32°С. Время реакции 4-8 ч. Расход катализатора в пересчете на исходный объем воды 0,25-0,51 г/л. По окончании процесса получают растворы с концентрацией акриламида до 330 г/л.

Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению на способ получения акриламида является способ, описанный в патенте на изобретение RU №2077588. Гидратацию проводят с использованием биомассы штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous М33 ВКПМ 1268 при исходной концентрации акрилонитрила не более 0,1% и поддерживают ее на этом уровне в течение всего процесса. Затем выделяют конечный продукт - акриламид.

Задачей заявляемой группы изобретений является создание нового штамма бактерий, обладающего высокой нитрилгидратазной активностью, для использования в промышленности с целью получения продуктов высокого спроса.

Задачей заявляемого способа культивирования штамма является разработка технологии наработки биомассы заявляемого штамма без излишних затрат, более того, по-возможности, снижение этих затрат по сравнению с существующими аналогичными способами, находящимися в промышленной эксплуатации.

Задачей заявляемого способа получения названного продукта с помощью нового штамма является разработка технологии получения акриламида с гарантированной концентрацией с помощью нового штамма без повышения стоимости процесса и без дополнительной сложности проведения процесса.

Сущность первого заявляемого изобретения: получение нового штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D - продуцента нитрилгидратазы.

Сущность заявляемого способа культивирования штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D характеризуется тем, что клетки штамма засевают на скошенный мясопептонный агар и выращивают в течение 24-48 часов, затем биомассу смывают стерильным физиологическим раствором, рН 7.0-7.4, полученной суспензией засевают первую емкость с питательной средой состава, г/л:

Na₂HPO₄·12H₂O 6.06 КН₂РO₄ 1.3 глюкоза 10.0-20.0 карбамид 2.0-6.0 MgSO₄·7H₂O 1.0 ZnSO₄·7H₂O 0.08-0.2 СаС1₂·2Н₂O 0.2 СоС1₂·6Н₂O 0.01-0.02 FeSO₄·7H₂O в виде хелатного комплекса 0.01-0.025 дистиллированная вода до 1 л

рН 7.0-7.4;

и ведут процесс в течение 24-48 часов при температуре 28-30°С, круговом перемешивании со скоростью 140-160 об/мин до достижения величин оптической плотности суспензии 2-16 единиц при длине волны 540 нм, величине оптического слоя 5 мм, затем полученной суспензией засевают вторую емкость, объем которой в 10-100 раз больше первой емкости, с новой питательной средой состава, г/л:

Na₂HPO₄·12H₂O 6.20 КН₂РO₄ 1.65 глюкоза 20.0-60.0 карбамид 10.0-24.0 MgSO₄·7H₂O 0.8-1.0 ZnSO₄·7H₂O 0.08-0.4 соль кальция 0.2-0.6 соль кобальта 0.04-0.085 FeSO₄·7H₂O в виде хелатного комплекса 0.025-0.05 дистиллированная вода до 1 л

рН 7.0-7.4,

доводя величину оптической плотности во второй емкости до 0.1-0.3; продолжают процесс в течение 48-120 часов при температуре 26-31°С, аэрации 0.5-1.0 объем воздуха/объем среды в минуту до достижения величин оптической плотности суспензии 36-40 и рН 7.5-7.8; после чего отделяют полученную биомассу.

Кроме того, заявляется усовершенствование вышеописанного способа культивирования штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D, которое характеризуется тем, что в состав питательной среды во второй емкости в качестве соли кальция может входить на выбор одна из ряда солей:

СаНРO₄·2H₂О,

Са(Н₂РO₄)₂·2Н₂O,

Са₃(РO₄)₂,

СаС1₂·2Н₂O,

СаСО₃,

CaSO₄,

Са(С₃Н₅O₃)₂·3Н₂O,

Са(НОСН₂(СНОН)₄СОО)₂ Н₂O;

в качестве соли кобальта - одна из солей:

СоС1₂·6Н₂O,

CoSO₄·7H₂O.

Сущность заявляемого способа получения акриламида, заключающегося в гидратации акрилонитрила с использованием биомассы штамма рода Rhodococcus, обладающей нитрилгидратазной активностью, с последующим выделением конечного продукта - акриламида, характеризуется тем, что гидратацию проводят при рабочей концентрации акрилонитрила, не превышающей 0,5%, с использованием биомассы штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D из расчета порядка 400-500 г по сухой массе штамма на 1 тонну конечного продукта - акриламида с концентрацией 45-49%.

Технический результат заявляемой группы изобретений.

Штамм бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D отличается ростом на простой органоминеральной среде при высокой нитрилгидратазной активности, достигающей 332 ед/мг при 20°С или 521 ед/мг при 25°С. Нитрилгидрагаза штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D термостабильна.

Штамм выделен из сточных вод производства акриламида и полиакриламида и не подвергался никаким генетическим модификациям. Это особенно важно при его использовании в качестве промышленного биокатализатора, так как законодательства многих стран ограничивают применение генно-модифицированных микроорганизмов.

Разработанный способ культивирования штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D позволяет получить большой урожай с высокой активностью клеток на простой органоминеральной питательной среде, не содержащей в своем составе дорогостоящих индукторов, витаминов, аминокислот и растительных экстрактов. Все компоненты питательной среды коммерчески доступны, что снижает себестоимость промышленного биокатализатора, получаемого на основе заявляемого штамма.

Заявляемый в данной заявке способ получения акриламида путем его синтеза с использованием штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D экономически выгодный. Оптимизированы условия синтеза концентрированных растворов акриламида.

Подробное описание изобретений.

Заявляемый штамм выделен из сточных вод производства акриламида и полиакриламида методом прямого высева на селективной среде.

Заявляемый штамм бактерий Rhodococcus aetherivorans депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ Ac-2610D и характеризуется следующими морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами.

Морфологические свойства: грамположительный штамм с жизненным циклом родококков, неподвижный, спор и капсул не образует, некислотоустойчив, аэроб.

Культуральные свойства: на мясопептонном агаре образует круглые гладкие колонии от желто-оранжевого до красно-оранжевого цвета диаметром 1-2 мм (72-96 часов). При росте на специальных средах диссоциирует на R-,S-, М-формы.

Физиологические свойства: Штамм оксидазаотрицательный, каталаза- и фосфатазаположительный, редуцирует нитраты в нитриты. Гидролизует крахмал, твин 60 и твин 80; целлюлозу, эскулин и ДНК не гидролизует. Растет при рН 5.5-9.5, оптимальное значение рН 7.2±0.2; при температуре 5-45°С, оптимальное значение 29±1°С. В качестве единственного источника углерода использует: целлобиозу, фруктозу, галактозу, глюкозу, мальтозу, маннозу, сахарозу, трегалозу, рибозу, глицерин, маннит, сорбит, но не дульцит и инозит. Штамм растет на салицине, инулине, цитрате, пирувате, сукцинате, фумарате, но не глюконате. Утилизирует мета- и парагидроксибензоевые кислоты, изобутанол, 2,3-бутиленгликоль, моноэтаноламин. Лейцин и ацетамид использует в качестве единственного источника азота.

Патогенность: штамм непатогенный.

На основании перечисленных выше свойств в соответствии с определителем бактерий Берджи. (Определитель бактерий Берджи, М.: Мир, 1997) и анализом полиморфизма длин фрагментов рестрикции для гена 16S рибосомальной рибонуклеиновой кислоты штамм отнесен к роду Rhodococcus виду aetherivorans.

Способ культивирования штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D осуществляют следующим образом.

Клетки штамма Rhodococcus aetherivorans, хранящиеся при температуре 4°С в столбиках с 0.4% агаризованной LB-средой или мясопептонным бульоном, засевают на скошенный мясопептонный агар и выращивают в течение 24-48 часов. Полученную биомассу смывают стерильным физиологическим раствором с рH 7.0-7.4. Полученной суспензией засевают первую емкость, например колбу, с питательной средой состава, г/л:

Na₂HPO₄·12H₂O 6.06 КН₂РO₄ 1.3 глюкоза 10.0-20.0 карбамид 2.0-6.0 MgSO₄·7H₂O 1.0 ZnSO₄·7H₂O 0.08-0.2 СаС1₂·2Н₂O 0.2 СоС1₂·6Н₂O 0.01-0.02 FeSO₄·7H₂O в виде хелатного комплекса 0.01-0.025 дистиллированная вода до 1 л

рН 7.0-7.4;

Процесс ведут в течение 24-48 часов при температуре 28-30°С, круговом перемешивании 140-160 об/мин до достижения величин оптической плотности суспензии 2-16 единиц, измеренной на фотоэлектроколориметре в кювете с толщиной оптического слоя 5 мм при длине волны 540 нм.

Затем полученной суспензией засевают вторую (большую) емкость, объем которой на несколько порядков больше первой емкости, например колбу больших размеров или ферментер, с новой питательной средой состава, г/л:

Na₂HPO₄·12H₂O 6.20 КН₂РO₄ 1.65 глюкоза 20.0-60.0 карбамид 10.0-24.0 MgSO₄·7H₂O 0.8-1.0 ZnSO₄·7H₂O 0.08-0.4 соль кальция 0,2-0.6 соль кобальта 0.04-0.085 FeSO₄·7H₂O в виде хелатного комплекса 0.025-0.05 дистиллированная вода до 1 л

рН 7.0-7.4,

В состав питательной среды во второй емкости в качестве соли кальция входит одна из ряда солей: СаНРO₄·2Н₂O; Са(Н₂РO₄)₂·2Н₂O; Са₃(РO₄)₂; СаС1₂·2Н₂O; СаСO₃; CaSO₄; Са(С₃Н₅О₃)₂·3Н₂O; Са(НОСН₂(СНОН)₄СОО)₂ Н₂O; а в качестве соли кобальта - одна из солей: СоСl₂·6H₂О; CoSO₄·7H₂O.

Глюкозу, карбамид и соли кобальта можно вносить в питательную среду в один этап или порциями в процессе роста клеток.

При этом доводят величину оптической плотности во второй емкости до 0,1-0,3 единицы. Продолжают процесс в течение 48-120 часов при температуре 26-31°С, аэрации 0.5-1.0 объем воздуха/объем среды в минуту до достижения величин оптической плотности суспензии 36-40 и рН 7.5-7.8. После окончания процесса биомассу отделяют любым известным способом: центрифугированием, флокуляцией, флотацией, отстаиванием с последующей фильтрацией. В результате осуществления данного способа культивирования штамма Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D урожай клеток составляет 10-18 г/л с активностью фермента нитрилгидратазы 250-332 ед/мг. Биомасса в дальнейшем может быть использована в процессах получения акриламида.

Тест для оценки активности фермента нитрилгидратазы проводят следующим образом: в 0.01 М фосфатном буфере, рН 7.6, готовят суспензию клеток с концентрацией 0.04-0.06 мг клеток (по сухой массе)/мл. В 1 мл суспензии вносят субстрат - акрилонитрил в количестве 25 мкл. Реакцию трансформации проводят на водяной бане при температуре 20-25°С и перемешивании в течение 10 мин. Реакцию останавливают добавлением 50 мкл 6н. HCI. Бактериальные клетки отделяют центрифугированием. Концентрацию акриламида в надосадочной жидкости определяют спектрофотометрическим методом или методом газовой хроматографии.

За единицу удельной нитрилгидратазной активности (ед/мг) принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкМ акриламида в единицу времени (1 минута), содержащееся в 1 мг клеток (по сухой массе). За единицу общей нитрилгидратазной активности (ед/мл) принимали количество единиц фермента, содержащееся в 1 мл культуральной жидкости.

Подробно способ получения акриламида осуществляют следующим образом.

Клетки штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D, полученные, как описано в способе культивирования, отделяют от культурального бульона любым известным методом, промывают обессоленной водой, рН 7,0-7,6. Количество воды, необходимой для промывки, составляет 1-10 объемов/объем клеток. Промытые клетки суспендируют в водопроводной или дистиллированной воде, рН 6.8-8.4, из расчета порядка 400-500 г клеток по сухой массе на 1 тонну конечного продукта - 45-49% раствора акриламида в зависимости от планируемой концентрации конечного продукта и времени синтеза. В термостатируемый реактор помещают водную суспензию клеток. Реакцию синтеза акриламида проводят в интервале рН 6,8-8,4. Акрилонитрил вносят в реакционный раствор по мере трансформации так, чтобы его концентрация в растворе не превышала 0.5%. Реакционную массу постоянно перемешивают. Температуру реакционного раствора поддерживают в интервале 10-23°С. Время реакции 5-8 часов. Акриламид и акрилонитрил в реакционном растворе анализируют любым известным методом, например: жидкостной или газовой хроматографией, спектрофотометрией, рефрактометрией. Анализ осуществляют не реже одного раза в час. Процесс останавливают после резкого падения скорости гидролиза акрилонитрила. По окончании процесса клетки биокатализатора отделяют от реакционной массы любым известным способом, например: флокуляцией, фильтрацией, флотацией, центрифугированием. В результате процесса получают растворы с концентрацией акриламида 45-49%.

Пример 1. Выделение штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D - продуцента фермента нитрилгидратазы

Штамм выделен из сточной воды производства акриламида и полиакриламида.

Состав сточной воды:

Акриламид 6.0 г/л Акрилонитрил 3.3 г/л Сu²⁺ 1.25 мг/л Zn²⁺ 1.93 мг/л Fe³⁺ 0.43 мг/л Сорбиталь С-20 следы

Для выделения штамма была использована селективная среда, представляющая собой агаризованную сточную воду приведенного выше состава с добавлением 0.9 г/л Na₂HPO₄·12H₂O, 0.5 г/л КН₂РO₄, 1.0 г/л MgSO₄·7H₂O, 0.5 г/л дрожжевого экстракта. На чашки с селективной средой засевали газоном 0.1 мл сточной воды и культивировали в течение 72-96 часов. Выросшие колонии дважды рассевали на мясопептонном агаре для проверки на чистоту, после чего анализировали на способность трансформировать акрилонитрил в акриламид. Для этого исследуемые штаммы выращивали в бактериологических пробирках, объемом 40 мл, заполненных на 1/8 часть средой состава, г/л:

Na₂HPO₄·12H₂O 0.9 КН₂РO₄ 0.5 Глюкоза 20.0 Карбамид 12.0 СоС1₂·6Н₂O 0.02 MgSO₄·7H₂O 1.0 Дрожжевой экстракт 1.0

рН 7.0-7.4

Культивирование проводили в течение 2 суток при перемешивании, температуре 28-30°С. Полученную суспензию клеток центрифугировали в течение 1 минуты при 15000 об/мин. Клетки отмывали 0.01 М фосфатным буфером, рН 7.6, ресуспендировали в 1 мл такого же буфера, затем измеряли нитрилгидратазную активность, как описано в тесте. В результате был выделен штамм с активностью нитрилгидратазы 95 ед/мг.

Пример 2. Способ культивирования штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D в лабораторных условиях в колбах Эрленмейера.

Клетки штамма выращивали на скошенном мясопептонном агаре в течение 36 часов при 28°С. Полученную биомассу смывали стерильным физиологическим раствором, рН 7.0-7.4, и засевали для предкультивирования в жидкую питательную среду следующего состава, г/л:

Na₂HPO₄·12H₂O 6.06 КН₂РO₄ 1.3 Глюкоза 12.0 Карбамид 4.0 MgSO₄·7H₂O 1.0 ZnSO₄·7H₂O 0.1 СаС1₂·2Н₂O 0.2 СоС1₂·6Н₂O 0.02 FeSO₄·7H₂O 0.025 Аскорбиновая кислота 0.05 Вода дистиллированная до 1 л

рН 7,0-7.4.

Предкультивирование проводили в колбах Эрленмейера при 28-30°С, круговом перемешивании 120-160 об/мин в течение 24-48 часов. В результате получали клеточную суспензию с оптической плотностью 4.6 единиц при λ 540 нм, 1=5 мм. Полученную суспензию в количестве 2 мл стерильно засевали в среду для культивирования следующего состава, г/л:

Na₂HPO₄·12H₂O 6.20 КН₂РO₄ 1.65 Глюкоза 40.0 Карбамид 24.0 MgSO₄·7H₂O 1.0 ZnSO₄·7H₂O 0.3 СаНРO₄·2Н₂O 0.24 СоС1₂·6Н₂O 0.06 FeSO₄·7H₂O 0.05 Аскорбиновая кислота 0.10 Вода дистиллированная до 1 л

рН 7,0-7.4.

Культивирование проводили в колбах Эрленмейера объемом 300 мл, заполненных средой на 1/6 часть, в течение 4 суток при круговом перемешивании (160 об/мин), температуре 28-30°С. По окончании культивирования в образцах определяли концентрацию клеток и нитрилгидратазную активность. Урожай клеток за 96 часов культивирования составил 16.0 г/л, удельная нитрилгидратазная активность 332 ед/мг при 20°С и 521 ед/мг при 25°С, общая нитрилгидратазная активность 5312 ед/мл при 20°С и 8336 ед/мл при 25°С. Тест определения активности при 25°С был выполнен для сравнения со штаммом Rhodococcus ruber GT, как наиболее близким к заявляемому.

Для подтверждения масштабируемости процесса культивирования и возможности промышленного использования штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D было проведено его культивирование в ферментере, объемом 3 л.

Пример 3. Культивирование штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D в ферментере.

Посевной материал, представляющий собой суспензию клеток в культуральной среде, готовили в течение 28 часов. Для этого клетки выращивали при круговом перемешивании (160 об/мин), температуре 28-30°С в колбах Эрленмейера объемом 300 мл, заполненных на 1/6 объема средой состава, г/л:

Na₂HPO₄·12H₂O 6.06 КН₂РO₄ 1.3 Глюкоза 12.0 Карбамид 4.0 MgSO₄·7H₂O 1.0 ZnSO₄·7H₂O 0.1 СаС1₂·2Н₂O 0.2 СоС1₂·6Н₂O 0.02 FeSO₄·7H₂O 0.025 ЭДТА 0.05 Вода дистиллированная до 1 л.

рН 7,0-7.4.

В результате была получена клеточная суспензия с оптической плотностью 6 единиц при λ 540 нм, 1=5 мм. Для засева лабораторного ферментера объемом 3 л (заполнение средой 1.5 л) использовали 100 мл полученной клеточной суспензии.

Состав среды для ферментера, г/л:

Na₂HPO₄·12H₂O 6.20 КН₂РO₄ 1.65 Глюкоза 40.0 Карбамид 22.0 MgSO₄·7H₂O 1.0 ZnSO₄·7H₂O 0.25 СаНРO₄·2Н₂O 0.24 СоС1₂·6Н₂O 0.05 FeSO₄·7H₂O 0.05 ЭДТА 0.10 вода дистиллированная до 1 л

рН 7,0-7.4.

Культивирование проводили при температуре 28°С, аэрации 0.5-1.0 объем воздуха/объем среды в минуту, постоянном перемешивании 560 об/мин. Периодически, один раз в шесть часов, из ферментера отбирали пробы культуральной жидкости для определения рН, урожая клеток и их нитрилгидратазной активности. Полученные данные представлены в таблице.

Продолжительность ферментации, час 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 70 рН 7.1 1 6.95 6.91 6.88 6.87 6.88 6.87 6.86 6.85 6.92 6.97 7.06 7.51 Урожай клеток, г/л (по сухой массе) 0.1 0.4 1.3 2.4 3.7 5.5 7.1 8.2 9.9 12.6 13.9 16.4 18.1 Удельная активность нитрилгидратазы, ед/мг   40 34 55 126 185 219 236 249 256 267 274 280

Урожай клеток за 70 часов культивирования составил 18.1 г/л, удельная нитрилгидратазная активность клеток достигла 280 ед/мг (при 20°С) или 440 ед/мг при 25°С, общая нитрилгидратазная активность 5058 ед/мл (при 20°С) или 7964 ед/мл при 25°С.

Пример 4. Получение концентрированного раствора акриламида в лабораторном реакторе с использованием клеток, наработанных культивированием в колбах

В термостатируемый реактор объемом 150 мл, снабженный магнитной мешалкой и термометром, вносили 66.2 г суспензии клеток штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D в водопроводной воде с активностью нитрилгидратазы 270 ед/мг; таким образом, в реакторе содержалось 30 мг (по сухой массе) клеток биокатализатора. Клетки были получены, как описано в примере 2. рН реакционного раствора 7.6. В реактор при постоянном перемешивании и температуре 17-22°С на протяжении всего синтеза подавали 24.2 г акрилонитрила так, чтобы его концентрация в растворе не превышала 0.3%. Акриламид и акрилонитрил в растворе анализировали методом газовой хроматографии с периодичностью один раз в час. Через 7.0 часов синтеза реакцию останавливали из-за падения скорости гидролиза акрилонитрила. Клетки отделяли от реакционного раствора центрифугированием. Концентрация акриламида в растворе составляла 49%, остаточный акрилонитрил отсутствовал.

Для подтверждения возможности использования штамма Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D в процессе промышленного получения акриламида и масштабируемости заявляемой технологии были проведены синтезы акриламида в аппарате, объемом 3 л, являющимся аналогом промышленного реактора.

Пример 5. Синтез концентрированного раствора акриламида в реакторе объемом 3 л с использованием клеток, наработанных культивированием в колбах. В реактор объемом 3 л, снабженный механической мешалкой и рубашкой для съема тепла, термостатируемый в интервале температур 20-22°С, вносили 1.4 л суспензии клеток штамма Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D в обессоленной воде с активностью фермента нитрилгидратазы 254 ед/мг; таким образом, в реакторе содержался 1 г (по сухой массе) клеток биокатализатора. Клетки были получены, как описано в примере 2. рН реакционного раствора 7,4. Акрилонитрил вносили в реакционный раствор по мере трансформации так, чтобы его концентрация, начальная и текущая, не превышала 0.5%. За 5 часов реакции получали раствор акриламида с концентрацией 47%. Далее реакцию останавливали из-за резкого падения скорости гидролиза акрилонитрила.

Пример 6. Получение концентрированного раствора акриламида в реакторе объемом 3 л с использованием клеток, наработанных культивированием в ферментере.

В реактор объемом 3 л, снабженный механической мешалкой и рубашкой для съема тепла, термостатируемый в интервале температур 14-23°С, вносили 1.4 л суспензии клеток штамма Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D в обессоленной воде с активностью нитрилгидратазы 280 ед/мг; таким образом, в реакторе содержался 1 г (по сухой массе) клеток биокатализатора. Клетки были получены, как описано в примере 3. рН реакционного раствора 7,8. Акрилонитрил вносили в реакционный раствор по мере трансформации так, чтобы его концентрация, начальная и текущая, не превышала 0.1%. Акриламид и акрилонитрил в растворе анализировали методом газовой хроматографии с периодичностью один раз в час. Через 7 часов реакцию останавливали из-за падения скорости гидролиза акрилонитрила. Концентрация акриламида в растворе составляла 49%. Остаточный акрилонитрил в растворе отсутствовал.

Настоящая группа изобретений проиллюстрирована более детально вышеописанными примерами, однако из этого не следует, что оно ограничено только этими примерами.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен штамм бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D. Штамм бактерий отличается ростом на простой органоминеральной среде при высокой нитрилгидратазной активности, достигающей 332 ед/мг при 20°С или 521 ед/мг при 25°С. Нитрилгидратаза штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D термостабильна. Также предложен способ культивирования данного штамма. Клетки штамма засевают на скошенный мясопептонный агар и выращивают течение 24-48 ч. Затем биомассу смывают стерильным физиологическим раствором с рН 7.0-7.4. Полученной суспензией засевают первую емкость с питательной средой. Процесс ведут в течение 24-48 ч при 28-30°С, круговом перемешивании со скоростью 140-160 об/мин до достижения величин оптической плотности суспензии 2-16 единиц при 540 нм и величине оптического слоя 5 мм. Полученной суспензией засевают вторую емкость, объем которой в 10-100 раз больше первой емкости. Величину оптической плотности во второй емкости доводят до 0,1-0,3. Культивируют штамм в течение 48-120 ч при 26-31°С, аэрации 0,5-1,0 объем воздуха/объем среды в минуту до достижения величин оптической плотности 36-40 и рН 7,5-7,8. Отделяют полученную биомассу. Также предложен способ получения акриламида. Осуществляют гидратацию акрилонитрила при концентрации акрилонитрила, не превышающей 0,5%. Гидратацию проводят с использованием биомассы штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D из расчета порядка 400-500 г по сухой массе штамма на 1 тонну конечного продукта - акриламида с концентрацией 45-49%. Изобретения позволяют получить урожай клеток Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D 10-18 г/л с активностью фермента нитрилгидратазы 250-332 ед/мг. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 6 пр., 1 табл.

1. Штамм бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D - продуцент нитрилгидратазы.

2. Способ культивирования штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D, характеризующийся тем, что клетки штамма засевают на скошенный мясопептонный агар и выращивают в течение 24-48 часов, затем биомассу смывают стерильным физиологическим раствором с рН 7.0-7.4, полученной суспензией засевают первую емкость с питательной средой состава, г/л:
Na₂HPO₄·12H₂O 6.06 КН₂РO₄ 1.3 глюкоза 10.0-20.0 карбамид 2.0-6.0 MgSO₄·7H₂O 1.0 ZnSO₄·7H₂O 0.08-0.2 СаС1₂·2Н₂O 0.2 СоС1₂·6Н₂O 0.01-0.02 FeSO₄·7H₂O в виде хелатного комплекса 0.01-0.025 дистиллированная вода до 1 л

рН 7.0-7.4,
и ведут процесс в течение 24-48 часов при температуре 28-30°С, круговом перемешивании со скоростью 140-160 об/мин до достижения величин оптической плотности суспензии 2-16 единиц при длине волны 540 нм, величине оптического слоя 5 мм, затем полученной суспензией засевают вторую емкость, объем которой в 10-100 раз больше первой емкости, с новой питательной средой состава, г/л:
Na₂HPO₄·12H₂O 6.20 КН₂РO₄ 1.65 глюкоза 20.0-60.0 карбамид 10.0-24.0 MgSO₄·7H₂O 0.8-1.0 ZnSO₄·7H₂O 0.08-0.4 соль кальция 0.2-0.6 соль кобальта 0.04-0.085 FeSO₄·7H₂O в виде хелатного комплекса 0.025-0.05 дистиллированная вода до 1 л
рН 7.0-7.4,
доводя величину оптической плотности во второй емкости до 0.1-0.3; продолжают процесс в течение 48-120 часов при температуре 26-31°С, аэрации 0.5-1.0 объем воздуха/объем среды в минуту до достижения величин оптической плотности суспензии 36-40 и рН 7.5-7.8; после чего отделяют полученную биомассу.

3. Способ культивирования штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D по п.2, характеризующийся тем, что в состав питательной среды во второй емкости в качестве соли кальция входит одна из ряда солей:
СаНРO₄·2Н₂O,
Са(Н₂РO₄)₂·2Н₂O,
Са₃(РO₄)₂,
СаСl₂·2Н₂O,
СаСО₃,
CaSO₄Са(С₃Н₅O₃)₂·3Н₂O,
Са(НОСН₂(СНОН)₄СОО)₂ Н₂O;
в качестве соли кобальта - одна из солей:
СоСl₂-6Н₂O,
CoSO₄-7H₂O.

4. Способ получения акриламида гидратацией акрилонитрила с использованием биомассы штамма рода Rhodococcus, обладающей нитрилгидратазной активностью, с последующим выделением конечного продукта - акриламида, отличающийся тем, что гидратацию проводят при рабочей концентрации акрилонитрила, не превышающей 0,5%, с использованием биомассы штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D из расчета порядка 400-500 г по сухой массе штамма на 1 тонну конечного продукта - акриламида с концентрацией 45-49%.

5. Способ получения акриламида по п.4, характеризующийся тем, что гидратацию акрилонитрила проводят при температуре 10-23°С и рН 6.8-8.4.